BR112019022369A2

BR112019022369A2 - Controle da densidade estomática em plantas

Info

Publication number: BR112019022369A2
Application number: BR112019022369-0A
Authority: BR
Inventors: Elizabeth Gray Julie; Hunt Lee; paul quick William
Original assignee: The University Of Sheffield
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2018-04-26
Publication date: 2020-05-26
Also published as: EP3615558A1; AU2018258016B2; AU2018258016A1; WO2018197878A1; CA3061313A1; US11535859B1; GB201706755D0

Abstract

a presente invenção se refere à modificação da expressão gênica em plantas, a fim de manipular o número estomático, em particular à modificação da expressão em plantas do fator de padronização epidérmica (epf). a invenção também se refere a plantas ou partes de plantas geneticamente modificadas com padrão estomático alterado em comparação com plantas ou partes de plantas do tipo selvagem correspondentes, em que o desenvolvimento estomático da planta é alterado pela modificação da expressão de epf.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: CONTROLE DA DENSIDADE ESTOMÁTICA EM PLANTAS

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere à modificação da expressão gênica em plantas, a fim de manipular o crescimento e/ou a estrutura de uma planta através da modulação do número estomático. Mais particularmente, a invenção se refere à modificação da expressão em plantas do fator de padronização epidérmica (EPF). A invenção também se refere a plantas geneticamente modificadas ou partes de plantas com padrão estomático alterado em comparação com plantas ou partes de plantas selvagens correspondentes, em que o desenvolvimento estomático de plantas é alterado pela modificação da expressão de EPF. As referidas plantas têm melhor resistência à seca e/ou melhor resistência à infecção por patógenos para se adequar ao crescimento em uma variedade de condições.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Com o aumento da população global para mais de 9 bilhões de habitantes até 2050 e a instabilidade prevista nos padrões climáticos globais, os temores sobre a segurança alimentar global continuam a crescer (Godfray et al., 2010, Science 327: 812-818). Espera-se que os períodos prolongados de seca e as zonas expandidas de desertificação se tornem cada vez mais predominantes à medida gue este século avança (IPCC, 2014: Climate Change 2014: Synthesis Report. 151). A

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2/156 necessidade de expandir a agricultura para áreas de terras marginais, onde a seca é um severo inibidor da agricultura sustentável (Fita et al., 2015, Frontiers in Plant Science 6: 978), continua a aumentar. 70% da água doce global já é utilizada para irrigação e a agricultura alimentada por chuva é hoje o maior consumidor mundial de água (Foley et al. 2011, Nature 478: 337-342) . Um caminho potencial para a prova do futuro contra as mudanças climáticas e para expandir a produção agrícola em áreas marginais limitadas pela água seria através de melhorias na tolerância à seca e na eficiência do uso da água (WUE do inglês Water Use Efficiency, a proporção de carbono ganho por água perdida).

[003] A grande maioria da água é perdida nas colheitas por transpiração e a redução dessa perda fornece uma rota potencial para melhorar o WUE e conservar os níveis de água no solo (Hepworth et al., 2015, New Phytologist 208: 336341) . Para esse fim, muita pesquisa sobre o uso de antitranspirantes foi realizada nas décadas de 1960 e 1970 (Davenport et al., 1972, Plant Physiology 49: 722-724). No entanto, embora sejam eficazes para melhorar o status da água e aumentar o tamanho dos frutos, essas soluções químicas nunca foram economicamente viáveis em escala agrícola.

[004] A maior parte da perda de água das plantas ocorre por transpiração através dos poros epidérmicos conhecidos como estômatos, tornando essas estruturas celulares um alvo

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3/156 atraente na batalha para evitar a perda de água. Recentemente, vários estudos de laboratório demonstraram que é possível melhorar a tolerância à seca e a WUE, reduzindo a frequência de estômatos nas folhas; usando manipulação genética ou a mutação para reduzir a densidade estomática (SD), foi alcançada uma melhor eficiência no uso da água em várias espécies-modelo de dicotiledôneas, incluindo Arabidopsis (Yoo et ai., 2010, The Plant Cell Online 22: 4128-4141; Franks et ai., 2015, New Phytologist 207: 188195; Hepworth et ai., 2015, New Phytologist 208: 336-341), álamo (Lawson et ai., 2014, Genes & Genomics 36: 427-441) e tabaco (Yu et al., 2008, The Plant Cell 20: 1134-1151). Além disso, a expressão ectópica de um fator putativo de transcrição no milho levou à redução da densidade estomática e das trocas gasosas em uma monocotiledônea (Liu et al., 2015, Journal of Applied Genetics 56: 427-438) .

[005] A manipulação do SD foi facilitada por estudos microscópicos que caracterizaram os estágios celulares da linhagem estomática e estudos moleculares que revelaram os mecanismos de desenvolvimento que controlam sua progressão (Zhao & Sack, 1999, Am J Bot 86: 929-939; Han & Torii, 2016, Development 143: 1259-1270). A maioria desses estudos foi realizada usando a espécie-modelo geneticamente tratável de Arabidopsis. Durante o desenvolvimento inicial das folhas de Arabidopsis, um subconjunto de células epidérmicas

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4/156 conhecidas como células-mãe meristemóides (MMCs) torna-se preparado para entrar na linhagem estomática. Cada MMC passa então por uma divisão inicial de entrada assimétrica para produzir um meristemóide, além de uma célula filha maior, conhecida como célula terrestre de linhagem estomática (SLGC). As SLGCs se diferenciam diretamente nas células epidérmicas do pavimento ou passam por outras divisões assimétricas para produzir meristemóides secundários. Alguns meristemóides podem, eles próprios, passar por outras divisões assimétricas, cada uma das quais reforma um meristemóide e cria um SLGC adicional. Cada meristemóide eventualmente se diferencia em uma célula mãe de guarda, pequena e de forma arredondada, antes de sofrer uma divisão simétrica para formar o par de células de guarda do complexo estomático maduro. Essas transições e divisões de destino celular, que finalmente controlam o número e as proporções de estômatos e células de pavimento na epiderme foliar madura, são controladas por um subgrupo de fatores de transcrição básicos relacionados à hélice-loop-hélice (bHLH); SPCH, MUTE e FAMA (Ohashi-Ito & Bergmann, 2006, Cell Cell 18: 2493-2505; MacAlister et al., 2007, Nature 445: 537-540; Pillitteri & Torii, 2007, BioEssays 29: 861-870) . O SPCH direciona principalmente a expressão de genes que controlam a formação de meristemóides, incluindo membros da familia do FATOR DE PADRÃO EPIDÉRMICO ricos em cisteina (EPF)

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5/156 de peptídeos de sinalização secretados, que por sua vez ativam uma via que regula a estabilidade do bHLH, formando um loop de feedback que regula o número de células entrando na linhagem estomática (Adrian et al. 2015, Dev Cell 33: 107-118; Simmons & Bergmann, 2016, Current Opinion in Plant Biology 29: 1-8). Os reguladores negativos mais bem caracterizados da densidade estomática nessa família de peptídeos são o EPF1 e o EPF2, numerados em ordem de descoberta (Hara et al., 2007, Genes & Development 21: 17201725; Hara et al., 2009, Plant Cell Physiol 50: 1019-1031; Hunt & Gray, 2009, Curr Biol 19: 864-869) . Ambos os peptídeos agem extracelularmente dentro da camada celular epidérmica aérea para suprimir o desenvolvimento estomático através da ativação de uma via de sinalização intracelular de MAP quinase (Bergmann et al., 2004, Science 304: 1494-1497; Wang et al. , 2007 Plant Cell 19: 63- 73; Lampard et al., 2008 Science 322: 1113-1116) . Embora suas funções se sobreponham, o EPF2 atua mais cedo no desenvolvimento estomático para restringir a entrada de células na linhagem estomática, enquanto o EPF1 atua posteriormente para orientar as divisões subsequentes das células meristemóides e reforçar o espaçamento estomático através da regra do espaçamento de uma célula (Hara et al., 2007, Genes & Development 21: 17201725) . A manipulação dos níveis de expressão desses peptídeos em Arabidopsis levou a melhorias significativas na

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6/156 tolerância à seca e no WUE em experimentos conduzidos em salas de crescimento de plantas em ambiente controlado (Doheny-Adams et ai., 2012, Philosophical Transactions da Royal Society of London B: Biological Sciences 367: 547-555; Hepworth et al., 2015, New Phytologist 208: 336-341).

[006] As gramineas são um grupo de plantas economicamente importante, sendo as gramineas de importância crucial para a produção de alimentos e energia. Considerando os cenários climáticos futuros previstos, a criação de cereais tolerantes à seca é uma área prioritária para o aprimoramento das culturas e para a pesquisa cientifica. Em contraste com o sistema modelo de Arabídopsís, nosso conhecimento do desenvolvimento estomático nas culturas é relativamente limitado (Raissig et ai., 2016, PNAS 113: 83268331) . Embora as gramineas incluam muitas de nossas principais culturas mundiais, nosso entendimento molecular de seus mecanismos de controle transpiracional e, mais especificamente, a regulação do desenvolvimento estomático permanecem extremamente limitados.

[007] A forma e os padrões estomáticos são marcadamente diferentes entre monocotiledôneas e dicotiledôneas, tal como Arabídopsís. Sabe-se, a partir de observações microscópicas, que os estômatos da grama são formados por uma única divisão celular assimétrica que forma uma célula precursora estomática (uma célula mãe de guarda) e uma célula epidérmica

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7/156 do pavimento (Stebbins & Jain, 1960) . Não há mais divisões assimétricas das células da linhagem estomática análogas às repetidas divisões possíveis que os meristemóides sofrem em Arabidopsis (Serna, 2011, Int J Dev Biol 55: 5-10) . O complexo estomático de grama madura é formado pela divisão de duas células vizinhas que dão origem a células subsidiárias, e uma divisão simétrica da mãe-guarda que produz duas células-guarda em forma de haltere - em vez das células-guarda caracteristicamente em forma de rim da maioria das dicotiledôneas. (Hetherington & Woodward, 2003, Nature 424: 901-908; Serna, 2011, Int J Dev Biol 55: 5-10) . Ao contrário das dicotiledôneas, todo o desenvolvimento estomático da grama inicia na base foliar. O padrão de estômatos dentro da epiderme foliar também difere nas gramíneas, com estômatos formando-se em limas retas paralelas à veia foliar, em oposição à distribuição 'dispersa' observada em Arabidopsis (Stebbins & Khush, 1961, Variação na organização do complexo estomático na epiderme foliar das monocotiledôneas e sua influência na filogenia, American Journal of Botany: 51-59; Geisler & Sack, 2002, New Phytologist 153: 469-476; Serna, 2011, Int J Dev Biol 55: 510) .

[008] A rede molecular subjacente ao desenvolvimento estomático em monocotiledôneas não é clara. Além disso, até agora não se sabia se algum EPF funciona no controle do

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8/156 desenvolvimento estomático em gramíneas. Trabalhos recentes usando telas genéticas e edição direcionada de genoma identificaram ortólogos funcionais de genes que codificam fatores de transcrição de bHLH envolvidos no desenvolvimento estomático de Arabídopsís em gramíneas, incluindo; arroz, milho (Liu et ai., 2009, Development 136: 2265-2276) e Brachypodium (Raissig et ai., 2016, PNAS 113: 8326-8331) e nos musgos não vasculares divergentes no início (Chater et ai., 2016, Nature Plants 2: 16179). A identificação dos fatores de transcrição do núcleo estomático da bHLH como reguladores principais da iniciação estomática no Brachypodium relativo do trigo, levou a esses fatores de transcrição da bHLH serem propostos como excelentes alvos de criação para melhorar o desempenho em gramíneas.

[009] Os patógenos vegetais também são uma das principais fontes de perda de safra. As dificuldades no monitoramento e registro das causas precisas da perda de safra em algumas áreas contribuíram para a escassez de dados globais confiáveis sobre o assunto, no entanto, os dados disponíveis indicam que as perdas diretas devido a doenças, pragas e ervas daninhas representam 20-40% da produtividade global agrícola (Savary et ai., 2012, Food Security DOI 10.1007/sl2571-012-0200-5) em proporções aproximadamente iguais, com perdas devido a doenças de plantas que variam de 10% da produção potencial na América do Norte a 16% na África

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9/156 (Oerke et al., 1994, Produção agrícola e proteção de culturas: perdas estimadas nas principais culturas alimentícias e comerciais, ISBN: 978-0- 444-82095-2) . As maiores perdas de produtividade são observadas nas monoculturas de cereais, tais como arroz e trigo; principais culturas mundiais de alimentos. Portanto, o desenvolvimento de culturas resistentes a patógenos também é provavelmente um componente-chave de estratégias destinadas a melhorar a segurança do suprimento global de alimentos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A invenção se refere à manipulação da expressão de EPF a fim de modificar a densidade estomática de plantas de monocotiledôneas. A invenção baseia-se na descoberta de que o EPF está envolvido na supressão do desenvolvimento estomático nas plantas, e particularmente que o EPF está envolvido na supressão do desenvolvimento estomático nas plantas monocotiledôneas. A função do gene, que é expressa em baixos níveis durante o desenvolvimento de tecidos aéreos (IBSC 2012. International Barley Genome Sequencing Consortium: Nature Publishing Group. 711-716) permaneceu desconhecida até agora.

[0011] No entanto, os inventores descobriram surpreendentemente que, ao manipular a expressão de EPF em monocotiledôneas ou em material vegetal, eles são capazes de modificar o número de estômatos por unidade de área

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10/156 (densidade estomática). Apesar do controle finamente equilibrado do desenvolvimento das folhas de monocotiledôneas, os inventores mostraram que a superexpressão ectópica de EPF em linhagens de monocotiledôneas transgênicas resulta em uma densidade estomática reduzida. Vantajosamente, plantas modificadas com níveis aumentados de EPF exibem WUE melhorado. Essa modificação reduz a perda de água por transpiração das plantas modificadas em relação ao ganho de carbono, o que aumenta a eficiência do crescimento das plantas e resulta adicionalmente em uma melhoria significativa na conservação do nível da água no solo.

[0012] Plantas modificadas com níveis aumentados de EPF também exibem melhor tolerância à seca. Além disso, os inventores descobriram surpreendentemente que a superexpressão ectópica de EPF em uma planta monocotiledôneas resulta em melhor WUE e tolerância à seca sem efeitos deletérios no rendimento.

[0013] Em um desenvolvimento ainda mais surpreendente, os inventores descobriram que a superexpressão de EPF em um antecedente de monocotiledôneas ou dicotiledôneas resulta em plantas (monocotiledôneas e dicotiledôneas) com uma resistência melhorada à infecção por patógenos microbianos.

[0014] Ao aproveitar o controle que o EPF exerce sobre o desenvolvimento estomático, a presente invenção torna

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11/156 possível pela primeira vez modificar prontamente a densidade estomática de uma planta monocotiledônea, a fim de melhorar a sobrevivência e o crescimento das culturas em ambientes desafiadores. Além disso, o controle sobre o desenvolvimento estomático permite que a arquitetura da planta seja otimizada para crescimento em ambientes específicos, em estágios específicos de desenvolvimento ou em resposta a estresses abióticos e/ou bióticos. Extraordinariamente, os inventores descobriram que a manipulação de EPF permite que a resistência a esses fatores de estresse seja alcançada sem um prejuízo de rendimento associado. Os polipeptídeos, polinucleotídeos, vetores de expressão, métodos, kits e composições aqui descritos encontram aplicação como ferramentas para modificar a densidade estomática em um antecedente de monocotiledôneas e útil em um antecedente de culturas de cereais, para alcançar as vantagens técnicas acima mencionadas.

[0015] Por conseguinte, em um aspecto, a invenção fornece um método para modificar a densidade estomática em uma planta monocotiledôneas, compreendendo modificar a presença, expressão ou atividade em uma planta monocotiledôneas do polipeptídeo do fator de padronização epidérmico (EPF).

[0016] O termo modificar a presença, expressão ou atividade do polipeptídeo EPF pode se referir à superexpressão, supressão ou má expressão temporal ou

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12/156 espacial dos níveis de polipeptídeo EPF em uma planta ou material vegetal e/ou elevação ou redução no nível biológico da atividade da proteína. Isto pode ser conseguido por várias técnicas padrão bem conhecidas na técnica.

[0017] A modificação dos níveis de EPF, de acordo com a presente invenção, pode geralmente significar um aumento ou diminuição dos níveis na planta; preferencialmente os níveis localizados nas células do tecido foliar, mais preferencialmente nas células do tecido epidérmico foliar de uma planta, em comparação com os níveis no mesmo tecido em uma planta nativa da mesma espécie no mesmo estágio, se cultivados sob condições idênticas condições e nas quais nenhuma alteração deliberada dos níveis de expressão foi feita (isto é, uma planta de controle não modificada) . De preferência, os níveis de EPF são aumentados. Consequentemente, os níveis de EPF podem aumentar na faixa de 5% a 500% em relação às plantas de controle geneticamente equivalentes, mas não modificadas; opcionalmente na faixa de 10% a 250%, de 20% a 200%, ou de 25% a 100%.

[0018] Em todas as modalidades da invenção em que a expressão, nível ou atividade de EPF é aumentada (isto é, elevada ou regulada) em relação aos controles, o nível ou atividade de EPF em plantas ou material vegetal modificado pode opcionalmente ser 101%, 102%, 103% , 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%,

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117%, 118%, 119%, 120 %, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, opcionalmente na faixa de 150% a 199%, 200 % a 249%, 250% a 299%, 300% a 349%, 350% a 399%, 400% a 449%, 450% a 499%, 500% a 599%, 600% a 699%, 700% para 799%, 800% a 899% ou 900% a 1000% em relação ao valor de um ou mais valores de controle. Pode-se dizer que um tal polipeptídeo ou polinucleotídeo está superexpresso, que se refere ao nível de expressão em um organismo modificado, transgênico ou transformado que excede os níveis de expressão em organismos normais ou não transformados. Normalmente, um valor de controle será um valor equivalente a uma planta de controle geneticamente equivalente, mas não modificada, ou material equivalente. Esse valor de controle pode ser adequadamente calculado como um valor médio de várias plantas de controle.

[0019] Alternativamente, os níveis de EPF são reduzidos.

Os níveis de redução do EPF podem cair na faixa de 5% a 500% em relação às plantas de controle geneticamente equivalentes, mas não modificadas; opcionalmente, na faixa de 10% a 250%, 20% a 200% ou 25% a 100%.

[0020] Em todas as modalidades da invenção em que a expressão, nível ou atividade de EPF é reduzida (ou seja, diminuída ou regulada para baixo) em relação aos controles,

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14/156 a expressão, nível ou atividade de EPF em plantas ou material vegetal modificado pode opcionalmente ser de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 68%, 67%, 66%, 65% , 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15% , 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% em relação ao de um ou mais controles valores. Normalmente, um valor de controle será um valor equivalente a uma planta de controle geneticamente equivalente, mas não modificada, ou material equivalente. Esse valor de controle pode ser adequadamente calculado como um valor médio de várias plantas de controle.

[0021] Além disso, a expressão, nível ou atividade do EPF pode ser avaliada em relação a um ou mais valores de referência. Um valor de referência pode ser um padrão 'interno' ou uma gama de padrões internos, por exemplo, uma concentração conhecida de uma proteína, transcrição, marcador ou composto. Alternativamente, o valor de referência pode ser um controle técnico interno para a calibração dos valores de expressão ou para validar a qualidade da amostra ou das técnicas de medição. Isso pode

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15/156 envolver uma medição de uma ou várias proteínas ou transcritos dentro da amostra que são conhecidos por serem constitutivamente expressos ou expressos em um nível conhecido. Por exemplo, tubulina e GADPH podem ser comumente usados como genes de referência para tarefas domésticas. Por conseguinte, seria rotina para o especialista aplicar essas técnicas conhecidas isoladamente ou em combinação para quantificar o nível de EPF em uma amostra em relação a padrões ou outros transcritos ou proteínas ou para validar a qualidade da amostra biológica, o ensaio ou análise estatística.

[0022] A invenção é baseada no uso de um polipeptídeo de EPF ou fragmento funcional do mesmo, que pode ser definido tanto em termos dos seguintes motivos de aminoácidos, quanto em termos da sequência de referência SEQ ID NO: 6 e qualquer variante percentual do mesmo, ou alternativamente em termos da sequência de referência SEQ ID NO: 8, e qualquer variante percentual da mesma, em combinação com qualquer um dos motivos de aminoácidos.

[0023] Em aspectos preferidos da invenção, o polipeptídeo EPF compreende; o motivo de aminoácido GSX1X2PDC [SEQ ID NO: 1], em que Xi é um de S ou R e X2 é um de L ou I.

[0024] Opcionalmente, o polipeptídeo EPF pode compreender; o motivo de aminoácido YRCMC [SEQ ID NO: 2].

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[0025] Opcionalmente, o polipeptídeo EPF pode compreender; o motivo de aminoácido HACGAC [SEQ ID NO: 3].

[0026] Opcionalmente, o polipeptídeo EPF pode compreender; o motivo de aminoácido CPMVYRCMCKGKCYPVPS [SEQ ID NO: 4] .

[0027] Opcionalmente, o polipeptídeo EPF pode compreender; o motivo de aminoácido PCNRVMVSFKC [SEQ ID NO: 5] .

[0028] Opcionalmente, o polipeptídeo EPF pode compreender; o motivo da sequência de aminoácidos TGSSLPDCTHACGACKPCNRVMVSFKCSIAEPCPMVYRCMCKGKCYPVPSS [SEQ ID NO: 6].

[0029] Opcionalmente, o polipeptídeo EPF pode compreender; o motivo da sequência de aminoácidos EKKDGSGFLQEEVYGTGSSLPDCTHACGACKPCNRVMVSFKCSIAEPCPMVYRCMCKGK CYPVPSS [SEQ ID NO: 7].

[0030] Além das sequências de aminoácidos mencionadas acima, a invenção também pode ser definida em termos da sequência de referência SEQ ID NO: 6 e uma variante percentual da mesma em termos de identidade de sequência, em combinação com qualquer um dos motivos de aminoácidos mencionados acima. Alternativamente, a invenção também pode ser definida em termos da sequência de referência SEQ ID NO: 8

MKRHGLAARVHHVRPLLVLLAAVLLLAATVDGIRPDPDDHARPGQAPGAPAVEEKKDGS

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GFLQEEVYGTGSSLPDCTHACGACKPCNRVMVSFKCSIAEPCPMVYRCMCK, e uma variante percentual da mesma em termos de identidade de sequência, em combinação com qualquer um dos motivos de aminoácidos mencionados acima.

[0031] Em aspectos preferidos, o polipeptídeo ou um fragmento do mesmo compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou uma sequência com pelo menos 62%; de preferência pelo menos 90%; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma.

[0032] Opcionalmente, o polipeptídeo EPF pode compreender; uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 38% de identidade com a mesma. Opcionalmente, o polipeptídeo EPF pode compreender; a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 60% de identidade com a mesma. De preferência, o polipeptídeo EPF compreende; uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a mesma; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma.

[0033] Opcionalmente, o polipeptídeo EPF pode compreender; a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 60% de identidade com a mesma, de preferência uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a mesma, e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID

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NO: 6 ou uma sequência com pelo menos 62% de identidade com a mesma, de preferência uma sequência com pelo menos 95% de identidade com a mesma.

[0034] De preferência, o polipeptideo EPF compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6 ou uma sequência com pelo menos 95% de identidade com a mesma, e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a mesma.

[0035] Em um aspecto preferido da invenção, o polipeptideo EPF compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a mesma, e compreende qualquer um dos motivos de aminoácidos;

GSX1X2PDC [SEQ ID NO: 1], em que Xi é um de S ou R e X2 é um de L ou I; ou

YRCMC [SEQ ID NO: 2]; ou

HACGAC [SEQ ID NO: 3]; ou

CPMVYRCMCKGKCYPVPS [SEQ ID NO: 4]; ou

PCNRVMVSFKC [SEQ ID NO: 5]; ou

TGSSLPDCTHACGACKPCNRVMVSFKCSIAEPCPMVYRCMCKGKCYPVPSS

[SEQ ID NO: 6]; ou

EKKDGSGFLQEEVYGTGSSLPDCTHACGACKPCNRVMVSFKCSIAEPCPMVYRC MCKGKCYPVPSS [SEQ ID NO: 7].

[0036] De preferência, o polipeptideo EPF ou seu fragmento compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID

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NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 98% de identidade a ele.

[0037] De preferência, o polipeptídeo EPF pode ser codificado por uma sequência polinucleotídica compreendendo; uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 14 ou uma sequência com pelo menos 58% de identidade com a mesma. De preferência, o polipeptídeo EPF pode ser codificado por uma sequência polinucleotídica compreendendo; uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 14 ou uma sequência com pelo menos 58% de identidade com a mesma; mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade com a mesma; ainda mais preferencialmente 95% de identidade com a mesma; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma.

[0038] Opcionalmente, o polipeptídeo EPF pode ser codificado por uma sequência polinucleotídica compreendendo; SEQ ID NO: 9; ou SEQ ID NO: 10; ou SEQ ID NO: 11; ou SEQ ID NO: 12; ou SEQ ID NO: 13; ou SEQ ID NO: 14; ou SEQ ID NO: 15; ou SEQ ID NO: 16.

[0039] O polipeptídeo EPF pode ser codificado por uma sequência polinucleotídica compreendendo;

SEQ ID NO: 9; ou uma sequência com pelo menos 67%; de preferência pelo menos 90%; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma; ou

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SEQ ID NO: 10; ou uma sequência com pelo menos 67%; de preferência pelo menos 90%; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma; ou

SEQ ID NO: 11; ou uma sequência com pelo menos 59%; de preferência pelo menos 90%; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma; ou

SEQ ID NO: 13; ou uma sequência com pelo menos 66%; de preferência pelo menos 90%; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma; ou

SEQ ID NO: 14; ou uma sequência com pelo menos 58%; de preferência pelo menos 90%; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma.

[0040] Os polinucleotídeos que codificam EPF, podem ser moléculas de ácido nucleico isoladas e podem ser moléculas de RNA ou DNA. Em todo o termo, o termo polinucleotídeo, conforme usados aqui, se refere a um polímero desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo na forma de fita simples ou dupla, ou sentido ou antissentido, e engloba análogos de nucleotídeos que ocorrem naturalmente que hibridizam com ácidos nucleicos de maneira semelhante a nucleotídeos que ocorrem naturalmente. Tais polinucleotídeos

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21/156 podem ser derivados de plantas, bactérias, fungos ou virus e, de preferência, podem ser derivados da mesma espécie de planta que a planta que está sendo modulada para alcançar a função ideal das sequências de interesse no antecedente da planta receptora e reduzir efeitos indesejados. No caso de polinucleotideos que codificam EPF, os polinucleotideos podem preferencialmente ser derivados de plantas, e especialmente de cevada, trigo, milho ou arroz.

[0041] Em todos os aspectos da invenção, onde existe uma sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos de referência e sequências de pelo menos certa identidade percentual são divulgadas, por exemplo 38%, opcionalmente a identidade percentual pode ser diferente. Por exemplo: uma identidade percentual que seja pelo menos uma das seguintes opções:

38%,	39%,	40%,	41%,	42%,	43%,	44%,	45%,	46%,	46%,	47%,	48%,
49%,	50%,	51%,	52%,	53%,	54%,	55%,	56%,	57%,	58%,	59%,	60%,
61%,	62%,	63%,	64%,	65%,	66%,	67%,	68%,	69%,	70%,	71%,	72%,

73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,1%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100%. Tal identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos EPF, sequência polipeptidica, sequência polinucleotidica, gene, mRNA ou cDNA de, por exemplo, Hordeum vulgare, é uma função do número

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22/156 de posições idênticas compartilhadas pelas sequências em uma janela de comparação selecionada, levando em consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que precisam ser introduzidas para o alinhamento ideal das duas sequências.

[0042] O popular programa de alinhamento múltiplo ClustalW (Thompson et ai., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et ai., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882) é uma maneira preferida para gerar múltiplos alinhamentos de proteínas ou DNA de acordo com a invenção. Os parâmetros adequados para o ClustalW podem ser os seguintes: Para alinhamentos de DNA: Penalidade de Abertura de Intervalo = 15,0, Penalidade de Extensão de Intervalo = 6,66 e Matriz = Identidade. Para alinhamentos de proteínas: Penalidade de Abertura de Intervalo = 10,0, Penalidade de Extensão de Intervalo = 0,2 e Matriz = Gonnet.

[0043] Em todos os aspectos da invenção, os resíduos de aminoácidos podem ser substituídos de forma conservadora ou não conservadora. As substituições conservadoras de aminoácidos se referem àquelas em que os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais do polipeptídeo resultante. Do mesmo modo, o especialista na técnica apreciará que as

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23/156 sequências de ácidos nucleicos podem ser substituídas de forma conservadora ou não conservadora sem afetar a função do polipeptídeo. Os ácidos nucleicos modificados conservativamente são aqueles substituídos por ácidos nucleicos que codificam variantes idênticas ou funcionalmente idênticas das sequências de aminoácidos. Cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG e UGG; tipicamente os únicos códons para metionina ou triptofano, respectivamente) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Por conseguinte, cada variação silenciosa (isto é, códon sinônimo) de um polinucleotídeo ou polipeptídeo, que codifica um polipeptídeo da presente invenção, está implícita em cada sequência de polipeptídeo descrita.

[0044] A invenção fornece um método para modificar a densidade estomática em uma planta monocotiledôneas, compreendendo modificar a presença, expressão ou atividade em uma planta monocotiledôneas do polipeptídeo do fator de padronização epidérmico (EPF), em que o método compreende aumentar a expressão e/ou o nível e/ou a atividade do polipeptídeo EPF em células da planta ou material vegetal em comparação com células de uma planta ou material vegetal equivalente. Vantajosamente, a planta ou material vegetal resultante terá uma densidade estomática reduzida em comparação com uma planta ou material vegetal geneticamente

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24/156 equivalente, mas não modificado. De preferência, a planta terá menos estômatos por unidade de área do que uma planta de controle idêntica. Por exemplo, a planta resultante pode ter menos estômatos por unidade de área foliar do que uma planta de controle idêntica.

[0045] Durante todo o processo, uma planta de controle será normalmente uma planta de controle geneticamente equivalente, mas não modificada, ou material equivalente. No caso de plantas de controle para experiências de transformação de polinucleotideos, essa planta de controle pode ser transformada com um vetor 'vazio' ou uma sequência de vetores que não possui o polinucleotídeo de interesse. Os valores de controle podem ser calculados adequadamente como um valor médio de várias plantas de controle.

WUE melhorada e tolerância à seca

[0046] Os inventores descobriram que, além da densidade estomática reduzida, as plantas modificadas da invenção que aumentaram a expressão, os níveis ou a atividade do EPF em comparação com as plantas de controle não modificadas, melhoraram o WUE e a tolerância ao estresse por limitação da água (seca) em relação às plantas de controle. Embora se possa esperar que o aumento do WUE seja acompanhado por uma penalidade de produtividade, devido a uma capacidade reduzida de troca de gases das folhas e, portanto, uma capacidade reduzida de assimilação de carbono, os inventores

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25/156 descobriram que as plantas modificadas da invenção têm rendimentos maiores ou iguais do que as plantas não modificadas quando submetidas a estresse hídrico. Pela primeira vez, isso permite que a densidade estomática reduzida e o aumento do WUE da planta sejam vantajosamente divorciados de uma redução associada no rendimento. Isso supera uma grande limitação de instalações anteriormente disponíveis com melhoria no WUE, onde a capacidade restrita de troca gasosa impunha restrições à produtividade da planta. Vantajosamente, portanto, a planta ou material vegetal resultante pode ter aumentado a eficiência no uso de água (WUE) em comparação com uma planta ou material vegetal equivalente.

[0047] Além disso, os métodos da invenção melhoram a tolerância à seca nas plantas. A planta ou material vegetal resultante aumentou a tolerância à seca em comparação com uma planta ou material de planta equivalente. Tal como acontece com a melhoria do WUE, os inventores descobriram que o aumento da expressão de EPF permite que a densidade estomática reduzida e o aumento do WUE da planta sejam dissociados do rendimento. De preferência, a modificação de qualquer planta monocotiledônea de acordo com os métodos da invenção que resulta em maior expressão, nível e/ou atividade de EPF na planta ou material vegetal resultante resulta em uma planta com rendimento aumentado em comparação com uma

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26/156 planta de controle não modificada, quando submetida às condições de estresse hídrico. Convenientemente, embora se pense que a tolerância à seca em monocotiledôneas seja controlada por vários genes, a presente invenção permite que a tolerância à seca seja alcançada aumentando a expressão de um único gene. Seca ou estresse hídrico se refere a uma situação em que há menos água disponível do que a exigida pelos tecidos vegetais. Nesse caso, o estresse hídrico se refere a condições que provocam uma condição estressada pela água em uma planta de controle geneticamente equivalente, mas não modificada. Uma planta pode ser considerada estressada pela água se o crescimento, desenvolvimento, rendimento ou fertilidade de uma planta de controle não modificada for afetado pela falta de disponibilidade de água em relação à demanda. 0 estresse hídrico pode ser contínuo ou descontínuo. A magnitude ou severidade do estresse em uma planta pode variar ao longo do tempo ou entre diferentes espécies ou indivíduos em um determinado momento, por exemplo, em um campo de plantas cultivadas.

[0048] As espécies vegetais variam substancialmente em suas necessidades de água e, portanto, no status da água no solo em que seriam consideradas sob estresse hídrico. Entender-se-á que a quantidade de água disponível para a planta em condições cavidades umedecidas e restritas à água ou limitadas à água variará de espécie para espécie,

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27/156 e mesmo dentro das espécies, dependendo das demandas de água da planta. Por exemplo, em Cevada, a planta mantida em condições de boa hidratação se refere àquelas mantidas em um nível de pelo menos 60% de teor máximo de água no solo. No entanto, as plantas monocotiledôneas que normalmente ocupam, geralmente são cultivadas e/ou criadas para serem cultivadas sob níveis mais altos de conteúdo de água no solo, podem ser consideradas restritas à água ou limitadas à água nas mesmas condições. Por exemplo, algumas variedades de trigo podem ser consideradas estressadas pela água com um status de água no solo abaixo de 70%. Além disso, o arroz, em particular o arroz cultivado em casca, pode ser criado para ser cultivado sob condições com um valor percentual da água no solo muito mais alto, por exemplo 80% ou 90%. Esse estresse ou a severidade do estresse também podem ser uma função do período de tempo em que as plantas enfrentam situações em que a demanda de água excede a disponibilidade de água, bem como o grau desse déficit. Uma planta pode ser considerada estressada pela água se o crescimento, desenvolvimento, rendimento ou fertilidade de uma planta de controle não modificada for afetado pela falta de disponibilidade de água em relação à demanda. Isso pode ser aparente, por exemplo, como a murcha de plantas de controle não modificadas ou efeitos mais dramáticos, tal como, por exemplo, amarelecimento das folhas, crescimento atrofiado,

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28/156 rendimento reduzido ou produção de sementes em plantas de controle não modificadas etc.

[0049] O rendimento pode ser medido de várias maneiras e pode se referir a partes vegetativas ou reprodutivas da planta, dependendo da colheita e se a biomassa, o número de folhas, o índice de colheita ou o número de sementes ou o tamanho das sementes são desejados. Em modalidades preferidas, o tamanho e/ou número de sementes ou grãos produzidos por uma planta modificada de acordo com um método da invenção é aumentado em relação a plantas de controle não modificadas ou ao material vegetal que sofreu a condição de estresse hídrico. Mais preferencialmente, o tamanho e o número de sementes produzidas por plantas modificadas de acordo com os métodos da invenção são aumentados em relação a plantas equivalentes não modificadas. Preferencialmente, o tamanho e/ou número de sementes ou grãos produzidos por uma planta produzida de acordo com os métodos da invenção é aumentado em relação a plantas de controle não modificadas ou material vegetal que sofreu a condição de estresse hídrico.

[0050] De acordo com todos os aspectos da presente invenção, os métodos aqui divulgados podem ser usados para conferir melhor WUE e/ou tolerância à seca em qualquer espécie de planta monocotiledônea. Os métodos aqui divulgados podem preferencialmente ser usados para modificar

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29/156 as plantas que são tipicamente exploradas para produção de grãos ou biomassa, exibem altas taxas de crescimento e são facilmente cultivadas e colhidas. Em particular, as plantas preferidas incluem aquelas que crescem naturalmente ou são cultivadas em ambientes áridos e/ou com altas temperaturas, baixa umidade, altos déficits de pressão de vapor ou recebem baixas quantidades de água (chuva e/ou irrigação) em relação à demanda de água e eficiência no uso da água (WUE) . Os métodos aqui divulgados podem prevenir ou aliviar de maneira útil o estresse hídrico nas plantas, seja severo, moderado, leve, contínuo ou intermitente. Os métodos divulgados neste documento podem ser usados para produzir plantas monocotiledôneas que são capazes de experimentar e sobreviver a severos estresses hídricos, que de outra forma teriam morrido se não fossem modificadas (isto é, resultariam na morte de uma planta de controle geneticamente equivalente, mas não modificada, sujeita às mesmas condições) .

[0051] Adicionalmente, os métodos da invenção podem ser usados para produzir plantas monocotiledôneas que, em adição a uma redução em SD, apresentam melhor tolerância aos regimes de restrição de água, por exemplo, quando crescem sob condições de 25% de conteúdo de água no solo. As plantas modificadas da invenção preferencialmente não mostram redução no rendimento de grãos quando cultivados em condições de restrição hídrica, comparados com plantas não modificadas

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30/156 cultivadas em condições de boa hidratação. As espécies vegetais variam substancialmente em suas necessidades de água e, portanto, no status da água no solo em que seriam consideradas sob estresse hídrico. Entender-se-á que a quantidade de água disponível para a planta em condições de cavidades umedecidas e restritas à água ou limitadas à água variará de espécie para espécie, e mesmo dentro das espécies, dependendo das demandas de água da planta. Por exemplo, em Cevada, a planta mantida em condições de boa hidratação se refere àquelas mantidas em um nível de pelo menos 60% de teor máximo de água no solo. No entanto, as plantas monocotiledôneas que normalmente ocupam, geralmente são cultivadas e/ou criadas para serem cultivadas sob níveis mais altos de conteúdo de água no solo, podem ser consideradas restritas à água ou limitadas à água nas mesmas condições. Por exemplo, algumas variedades de trigo podem ser consideradas estressadas pela água com um status de água no solo abaixo de 70%. Além disso, o arroz, em particular o arroz cultivado em casca, pode ser criado para ser cultivado sob condições com um valor percentual da água no solo muito mais alto, por exemplo 80% ou 90%. Esse estresse ou a severidade do estresse também podem ser uma função do período de tempo em que as plantas enfrentam situações em que a demanda de água excede a disponibilidade de água, bem como o grau desse déficit. Uma planta pode ser

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31/156 considerada estressada pela água se o crescimento, desenvolvimento, rendimento ou fertilidade de uma planta de controle não modificada for afetado por essas condições. Vantajosamente, as plantas modificadas da invenção, de preferência, não mostram redução no número de sementes, peso de sementes, peso médio de sementes, índice de colheita (a razão entre biomassa acima do solo e peso das sementes), altura da planta ou biomassa acima do solo, sob condições de restrição de água. Em algumas modalidades, sob condições de restrição de água, as plantas modificadas da invenção podem ter um número e rendimento de sementes aumentados em comparação com plantas de controle geneticamente equivalentes, mas não modificadas, cultivadas em condições de água.

[0052] A tolerância melhorada à seca de plantas modificadas da invenção pode se manifestar em uma susceptibilidade reduzida à murcha em comparação com plantas de controle não modificadas. Isso pode ser óbvio a partir da simples observação do fenótipo da planta após um período de limitação da água. Por exemplo, após 6 dias de condições retidas na água, as plantas que superexpressam o EPF podem ser menos suscetíveis ao murchidão e parecer visivelmente mais 'tolerantes à seca'.

[0053] A tolerância à seca de plantas modificadas da invenção pode se manifestar em uma perda reduzida de água no

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32/156 solo em comparação com plantas de controle não modificadas. Um método prático de calcular a perda de água no solo que é comumente usada é medir o peso do solo no qual a planta é cultivada, por exemplo, comparando o peso total do solo em vasos de plantas de controle modificadas e não modificadas em pelo menos dois momentos. As plantas modificadas da invenção podem, por exemplo, perder água mais lentamente do que as plantas de controle não modificadas. Além disso, as plantas modificadas da invenção podem, por exemplo, exibir maior conservação da água do solo em seus vasos durante um determinado período de tempo em condições de retenção de água, por exemplo, do dia 2 até o dia 14 sob condições de retenção de água.

[0054] As medições de fluorescência da clorofila são rotineiramente usadas para medir quaisquer reduções na eficiência do fotossistema II, um indicador do estresse das plantas. Em particular, o rendimento quântico adaptado à luz do fotossistema II (<E>psii) é medido diariamente para plantas de cavidades umedecidas e de retenção de água durante um experimento de seca terminal. As plantas modificadas da invenção podem não mostrar diferença na eficiência do fotossistema II, conforme determinado pelo rendimento quântico adaptado à luz do fotossistema II (<E>psii) , em comparação com as plantas de controle não modificadas em condições de boa hidratação. Notavelmente, no entanto, as

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33/156 plantas modificadas da invenção que tiveram água retida, podem exibir taxas significativamente maiores de <E>psii versus as plantas de controle não modificadas retidas na água. De preferência, as plantas modificadas da invenção que tiveram água retida, podem manter a eficiência do fotossistema II por aproximadamente 4 dias a mais do que os controles não modificados sob condições severas de seca. As plantas modificadas com níveis de expressão ou atividade reguladas para cima de EPF têm uma capacidade aprimorada de reter água nas folhas em condições de seca. Ou seja, níveis mais altos de conteúdo relativo de água nas folhas (RWC) do que controles não modificados sob condições de limitação da água. Mais preferencialmente, no dia 6 da seca terminal, o teor relativo de água em folhas (RWC) das amostras de folhas de plantas com níveis de expressão ou atividade reguladas de EPF, cultivadas em condições de retenção de água, exibirá níveis significativamente mais altos de RWC foliar em comparação com controles não modificados cultivados nas mesmas condições.

Resistência à Infecção por Patógenos

[0055] Vantajosamente, a planta ou material vegetal resultante pode ter maior resistência à infecção por um patógeno microbiano em comparação com uma planta ou material vegetal equivalente. De preferência, o patógeno microbiano é um patógeno bacteriano ou fúngico. Mais preferencialmente,

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34/156 o patógeno microbiano é do gênero Pseudomonas, por exemplo, o patógeno microbiano pode ser Pseudomonas syríngae. Alternativamente, o patógeno microbiano pode ser um patógeno bacteriano do gênero Xanthomonas, por exemplo Xanthomonas oryzae. Alternativamente, o patógeno microbiano pode ser um patógeno fúngico do gênero Septoria ou Puccinia, por exemplo Zymoseptoria trítící ou Puccinia hordei.

[0056] Utilmente, a planta ou material vegetal resultante pode ter rendimento aumentado ou equivalente em comparação com uma planta ou material vegetal equivalente.

Plantas com aumento da densidade estomática

[0057] A presente invenção também fornece um método para modificar a densidade estomática em uma planta monocotiledôneas, compreendendo modificar a presença, expressão ou atividade em uma planta monocotiledôneas do polipeptideo do Fator de Padronização Epidérmico (EPF), em que o método compreende reduzir a expressão e/ou o nivel e/ou atividade do polipeptideo EPF em células da planta ou material vegetal em comparação com células de uma planta ou material de controle equivalente. Beneficamente, a planta ou material vegetal resultante tem um aumento na densidade estomática em comparação com uma planta ou material vegetal geneticamente equivalente, mas não modificado; isto é, um número maior de estômatos por unidade de área do que plantas ou material de controle, por exemplo, mais estômatos por

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35/156 unidade de área foliar em comparação com uma planta ou material de planta equivalente.

[0058] Vantajosamente, esse aumento na densidade estomática em monocotiledôneas, que não foi relatado anteriormente, pode ser alcançado pela redução da expressão, do nível ou da atividade de uma única proteína; EPF.

[0059] As plantas modificadas da invenção preferencialmente não mostram redução no rendimento de grãos em comparação com as plantas não modificadas cultivadas em condições idênticas. Vantajosamente, as plantas modificadas da invenção preferencialmente não mostram redução no número de sementes, peso de sementes, peso médio de sementes, índice de colheita (a razão entre biomassa acima do solo e peso das sementes), altura da planta ou biomassa acima do solo em comparação com plantas não modificadas cultivadas em condições idênticas. Em algumas modalidades, as plantas modificadas da invenção podem ter um número e rendimento de sementes aumentados em comparação com plantas de controle geneticamente equivalentes, mas não modificadas, cultivadas em condições idênticas.

[0060] A invenção também fornece um método para modificar a densidade estomática em uma planta monocotiledônea, compreendendo modificar a expressão, o nível ou a atividade, em uma planta monocotiledônea, do polipeptídeo do Fator de Padronização Epidérmica (EPF), em que o método compreende

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36/156 transformar uma planta ou material vegetal com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência polinucleotídica de ;

SEQ ID NO: 14; ou uma sequência com pelo menos 58%; de preferência pelo menos 90%; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma; ou um fragmento funcional das mesmas; em que a expressão do referido polinucleotídeo nas células da planta ou material vegetal resulta em um aumento na

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37/156 expressão e/ou nível e/ou atividade do polipeptídeo EPF nas referidas células, em comparação com células não transformadas; e uma redução na densidade estomática da planta ou material vegetal em comparação com uma planta ou material vegetal não transformado equivalente.

[0061] De preferência, a expressão ou nível de qualquer um dos polinucleotídeos acima é aumentada em uma ou mais células da planta receptora em relação a uma planta de controle não modificada. Adequadamente, qualquer um dos polinucleotídeos acima pode ser colocado sob o controle de um ou mais elementos reguladores que resultam em um alto nivel de expressão de EPF na planta, material vegetal ou célula vegetal receptora em relação à expressão de EPF em uma planta de controle não modificada, material vegetal ou célula vegetal.

[0062] A utilidade prática da invenção reside na capacidade de usar o EPF como um interruptor principal para o desenvolvimento estomático. Portanto, na maioria das aplicações da invenção, será suficiente variar a expressão, o nivel ou a atividade do EPF sozinho, de acordo com a aplicação desejada, por exemplo, aumentando o nivel de expressão para melhorar a WUE, a tolerância à seca e a resistência à infecção por patógenos microbianos ou reduzir a expressão de EPF para aumentar a densidade estomática. Da mesma forma, muitas vezes será suficiente variar apenas o

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38/156 grau de regulação positiva ou negativa da EPF, a fim de atingir o nível desejado de densidade estomática para atender às condições de crescimento das plantas ou, por exemplo, ajustá-lo às mudanças nas condições ambientais, colocando o EPF sob o controle de promotores, cuja expressão é determinada ambientalmente. Um exemplo disso pode ser colocar a expressão de EPF sob o controle de um promotor sensível à seca ou de um elemento regulador, de modo que a tolerância à seca da planta corresponda à alteração do status da água externa.

[0063] No entanto, enquanto em modalidades preferidas, o EPF pode ser regulado para cima (superexpresso) ou para baixo (suprimido) nas células de uma planta, a fim de operar como um simples interruptor 'desligado'/'ligado' que governa o desenvolvimento estomático e, portanto, a densidade estomática nos tecidos de uma planta receptora, prevê-se que, em certas circunstâncias, seja desejável também regular sub-regulando o EPF em certos tecidos, enquanto regular positivamente o EPF em outros tecidos, a fim de controlar diferencialmente o número ou densidade de estômatos em diferentes locais da planta, ou para regular ou diminuir o EPF em diferentes estágios de desenvolvimento ou em resposta a diferentes condições ambientais. Isso pode ser apropriado, por exemplo, se alterações no WUE, tolerância à seca ou resistência à infecção por patógenos forem necessárias em

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39/156 diferentes estágios de desenvolvimento ou em resposta a diferentes condições ambientais.

Condições Rigorosas

[0064] Nas sequências polinucleotidicas para uso de acordo com a invenção, a sequência nucleotidica pode ser aquela que codifica as respectivas SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 ou na definição do intervalo de sequências variantes, ou na definição de sequências que podem ser usadas para mediar uma alteração na expressão de um dos referidos polinucleotideos, ela pode ser definida como uma sequência hibridizável com a sequência de nucleotideos de referência, preferencialmente sob condições rigorosas, mais preferencialmente condições muito altamente rigorosas. O termo condições rigorosas pode ser entendido para descrever um conjunto de condições para hibridização e lavagem e uma variedade de condições rigorosas de hibridização será familiar para o leitor especialista. A hibridização de uma molécula de ácido nucleico ocorre quando duas moléculas complementares de ácido nucleico sofrem uma quantidade de ligação de hidrogênio entre si, conhecida como emparelhamento de bases Watson-Crick. O rigor da hibridização pode variar de acordo com as condições ambientais (isto é, químicas/ físicas/biológicas) que cercam os ácidos nucleicos, a temperatura, a natureza do método de hibridização e a composição e o comprimento das moléculas de

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40/156 ácido nucleico utilizadas. Os cálculos relativos às condições de hibridização necessários para atingir graus específicos de rigor são discutidos em Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); e Tijssen, Técnicas de Laboratório em Bioquímica e Biologia Molecular

Hibridização com Sondas de Ácidos Nucleicos Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nova York, 1993). A Tm é a temperatura à qual 50% de uma dada cadeia de uma molécula de ácido nucleico é hibridizada com sua cadeia complementar.

[0065] Em qualquer uma das referências aqui apresentadas às condições de hibridização, o seguinte é exemplar e não limitativo:

[0066] Ri gor__mu i to__a 1 to___(permi te__que__sequênci as__que compartilham pelo menos_90% de_identidade hibridizem)

Hibridização: 5x SSC a 65°C por 16 horas

Lave duas vezes: 2x SSC em temperatura ambiente (RT) por 15 minutos cada

Lavar duas vezes: 0,5x SSC a 65°C por 20 minutos cada.

[0067] Alto___rigor____(permite___que___sequências___que compartilham pelo menos 80% de identidade hibridizem)

Hibridização: 5x-6x SSC a 65°C-70°C por 16 a 20 horas

Lavar duas vezes: 2x SSC à temperatura ambiente por 5 a 20 minutos cada

Lave duas vezes: lx SSC a 55 °C-70°C por 30 minutos

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41/156 cada .

[0068] Baixo___rigor___(permite___que___sequências___que compartilham pelo menos 50% de_identidade hibridizem)

Hibridização: 6x SSC a RT a 55°C por 16 a 20 horas

Lave pelo menos duas vezes: 2x-3x SSC à temperatura ambiente a 55°C por 20 a 30 minutos cada.

[0069] Em um aspecto alternativo, a presente invenção também fornece um método para modificar a densidade estomática em uma planta monocotiledônea, compreendendo modificar a presença, expressão ou atividade em uma planta monocotiledônea do polipeptídeo do Fator de Padronização Epidérmica (EPF), em que células da planta ou material vegetal são transformados com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência polinucleotídica capaz de hibridizar com uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14 sob condições rigorosas, de modo gue exista redução ou eliminação da expressão e/ou nível do polipeptídeo nativo de EPF e/ou atividade do mesmo nessas células, em comparação com células não transformadas; e em que a densidade estomática da planta ou material vegetal é aumentada em comparação com uma planta ou material vegetal não modificado ou não transformado.

[0070] De acordo com a presente invenção, esses polinucleotídeos serão complementares, isto é, em uma

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42/156 orientação anti-sentido para uma sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 13 ou SEQ ID NO: 14, e que são capazes de hibridizar especificamente sob condições rigorosas com as sequências polinucleotídicas acima. Tais sequências podem ser úteis na regulação negativa da expressão de EPF, a fim de obter uma densidade estomática aumentada em comparação com uma planta de controle geneticamente equivalente, mas não modificada.

[0071] Uma série de tecnologias pode ser usada para regular, reduzir ou eliminar a expressão e/ou o nível do polipeptídeo nativo de EPF e/ou atividade do mesmo, a fim de obter uma densidade estomática aumentada em comparação com uma planta de controle geneticamente equivalente, mas não modificada. Tais tecnologias podem incluir, mas não estão limitadas a; mutação (inserção, exclusão, substituição) da sequência de DNA genômico, RNAi, microRNA (MiRNA), usando um sistema de fusão de repressores Cas9 (dCas9) cataliticamente inativo e sistemas de edição de genoma, tal como Nucleases de Dedo de Zinco, TALEN, Cas9 ou Cpf1. Por exemplo, o sistema CRISPR-Cas permite a divagem específica do alvo do DNA genômico guiado pela nuclease Cas9 em complexo com um RNA guia (gRNA) que se liga complementarmente a uma sequência direcionada de 20 nt. A alteração da sequência do guia de gRNA, portanto, permite que a endonuclease Cas9 seja

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43/156 programada para cortar o DNA de fita dupla em locais complementares ao RNA guia de 20 pares de bases. O sistema Cas9 tem sido usado para modificar genomas em várias células e organismos.

[0072] Por conseguinte, onde o DNA genômico que codifica EPF (por exemplo, SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14) ou transcrito de mRNA (SEQ ID NO: 9) deve ser editado, por exemplo, usando uma endonuclease, um RNA guia compreendendo uma sequência substancialmente complementar a uma sequência compreendida em uma fita de ácido nucleico alvo pode ser fornecida a uma célula vegetal onde a sequência deve ser editada, de modo que a sequência possa ser editada de uma maneira específica da sequência. Por exemplo, a sequência polinucleotídica capaz de hibridizar com uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14 pode ser um RNA guia.

[0073] A edição das sequências acima pode ser usada para alcançar um aumento na densidade estomática, reduzindo a expressão e/ou o nível e/ou a atividade do EPF em uma ou mais células vegetais receptoras em comparação com células não transformadas ou não transformadas. Adequadamente, a densidade estomática da planta ou material vegetal é aumentada em comparação com uma planta ou material vegetal não transformado.

[0074] Por conseguinte, em qualquer um dos métodos em que

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44/156 plantas ou material vegetal são transformados com um polinucleotídeo aqui divulgado, o material vegetal ou vegetal pode ser transformado de maneira estável com o referido polinucleotídeo.

[0075] Por conseguinte, em qualquer um dos métodos em que plantas ou material vegetal são transformados com um polinucleotídeo divulgado aqui, o material vegetal ou vegetal pode ser transformado com uma multiplicidade dos referidos polinucleotídeos.

[0076] Em um aspecto adicional, a presente invenção também fornece um método para modificar uma planta ou material vegetal para conferir pelo menos resistência parcial a, ou melhorar a resistência à infecção por um patógeno microbiano, em que o método compreende aumentar a expressão e/ou nível e/ou atividade do polipeptídeo EPF em células da planta ou material vegetal comparado às células de uma planta ou material de controle equivalente; em que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 60% de identidade com a mesma. De preferência, o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a mesma.

Plantas com resistência a patógenos melhorada

[0077] Os métodos, polipeptídeos, polinucleotídeos e vetores de expressão da invenção podem ser utilizados para

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45/156 conferir pelo menos resistência microbiana parcial ou melhorada nas plantas. Plantas modificadas, material vegetal ou partes de plantas com resistência melhorada à infecção por um patógeno microbiano ou resistência parcial à infecção por um patógeno microbiano podem ser gerados aumentando a expressão e/ou nivel e/ou atividade do EPF sozinho. Plantas ou material vegetal modificado dessa maneira terão densidade estomática reduzida em comparação com plantas ou material vegetal não modificado ou não transformado de outra forma idênticos.

[0078] Plantas modificadas projetadas para superexpressar EPF ou ter atividade aumentada do EPF, com resistência microbiana aprimorada, podem ser geradas, por exemplo, por modificação genética, transformação genética, edição de genes ou reprodução assistida por marcadores e se referem a plantas que são mais capazes de resistir à infecção por um patógeno microbiano, particularmente um patógeno bacteriano, e mais particularmente um patógeno de Pseudomonas, do que plantas de controle equivalentes idênticas. Em particular, onde a planta hospedeira é o Arroz e o patógeno microbiano é um patógeno bacteriano, a planta de arroz modificada pode ter resistência parcial ou melhorada à infecção por Xanthomonas oryzae em comparação com as plantas de arroz de controle não modificadas. Tais plantas modificadas podem sobreviver ou tolerar a infecção microbiana, caso contrário,

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46/156 plantas de controle equivalentes idênticas não o fariam. Será entendido que essa infecção microbiana pode compreender mais de uma espécie de bactéria, incluindo, por exemplo, Pseudomonas ou Xanthomonas. Da mesma forma, quando o patógeno microbiano é um patógeno fúngico, essa infecção microbiana pode compreender mais de uma espécie ou isolado de fungo, incluindo, por exemplo, Puccinia ou Septoria, por exemplo uma infecção por Zymoseptoría trítící no trigo. Em particular, onde a planta hospedeira é o Trigo e o patógeno microbiano é um patógeno fúngico, a planta do Trigo modificada pode ter resistência parcial ou melhorada à infecção por Zymoseptoría trítící em comparação com as plantas de Trigo de controle não modificadas. Em particular, onde a planta hospedeira é a cevada e o patógeno microbiano é um patógeno fúngico, a planta da cevada modificada pode ter resistência parcial ou melhorada à infecção por Puccinia hordeí em comparação com as plantas da cevada de controle não modificadas.

[0079] A resistência melhorada ao patógeno microbiano pode se referir a uma maior resistência à infecção por uma bactéria ou tolerância a uma infecção bacteriana, em relação a plantas, partes ou material vegetal não modificado ou não transformado. Esta melhoria na resistência pode manifestarse em menos unidades formadoras de colônias (UFC) da bactéria, por exemplo Xanthomonas oryzae ou Pseudomonas

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47/156 syringae presentes na planta, parte da planta ou material vegetal modificado ou transformado (por exemplo, folhas) por unidade de área em comparação com uma planta, parte da planta ou material vegetal não modificado ou não transformado. Isso também pode se manifestar em necrose reduzida de tecidos vegetais (por exemplo, folhas ou órgãos florais), maior tempo de vida ou aumento do rendimento em comparação com plantas, partes ou material vegetal não modificado ou não transformado. As plantas também podem demonstrar aumento do rendimento em comparação com plantas de controle equivalentes em condições de infecção por patógenos ou sob condições que de outra forma causariam infecção por patógenos em plantas de controle equivalentes idênticas, que podem se manifestar, por exemplo, como aumentos na biomassa em relação às plantas de controle equivalentes e/ou aumentos no número, tamanho e/ou qualidade das sementes produzidas pelas plantas em relação a plantas de controle equivalentes ou material vegetal.

[0080] Plantas, material vegetal ou partes de plantas com resistência melhorada à infecção por um patógeno microbiano, seja gerado por exemplo, modificação genética, transformação genética, edição de genes ou melhoramento assistido por marcadores pode se referir a plantas capazes de resistir à infecção ou sobreviver à infecção por isolados de Pseudomonas, onde plantas de controle equivalentes idênticas

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48/156 não o fariam. Plantas, material vegetal ou partes de plantas com resistência melhorada à infecção por um patógeno microbiano podem se referir a plantas capazes de resistir ou sobreviver à infecção por isolados de Pseudomonas, por exemplo, isolados de Pseudomonas syríngae, onde plantas de controle equivalentes idênticas não o fariam. Plantas, material vegetal ou partes de plantas com resistência melhorada à infecção por um patógeno microbiano, seja gerado por exemplo, modificação genética, transformação genética, edição de genes ou melhoramento assistido por marcadores pode se referir a plantas que são capazes de resistir à infecção ou sobreviver à infecção por isolados de Xanthomonas, por exemplo, isolados de Xanthomonas oryzae, onde plantas de controle equivalentes idênticas não o fariam. Plantas, material vegetal ou partes de plantas com resistência melhorada à infecção por um patógeno microbiano, seja gerado por exemplo, modificação genética, transformação genética, edição de genes ou reprodução assistida por marcadores pode se referir a plantas que são capazes de resistir à infecção ou sobreviver à infecção por isolados de Septoria, por exemplo, isolados de Zymoseptoría trítící, onde plantas de controle equivalentes idênticas não o fariam. Plantas, material vegetal ou partes de plantas com resistência melhorada à infecção por um patógeno microbiano, seja gerado por exemplo, por modificação genética,

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49/156 transformação genética, edição de genes ou reprodução assistida por marcadores pode se referir a plantas que são capazes de resistir à infecção ou sobreviver à infecção por isolados de Puccinia, por exemplo, isolados de Puccinia hordeí, onde plantas de controle equivalentes idênticas não o fariam.

[0081] As plantas também podem demonstrar um aumento no rendimento em comparação com as plantas de controle equivalentes sob condições de infecção por patógenos que podem se manifestar, por exemplo, como aumentos na biomassa em relação às plantas de controle equivalentes e/ou aumentos no número, tamanho e/ou qualidade das sementes produzidas por as plantas em relação a plantas de controle equivalentes ou material vegetal.

[0082] Uma planta transformada ou transgênica da invenção inclui plantas, por exemplo, uma planta cujas células expressam um polinucleotídeo da invenção ou têm um cassete de expressão da invenção, isto é, um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo da invenção, cuja planta pode também apresentar rendimentos aumentados e/ou qualidade em comparação com uma planta de tipo selvagem correspondente, por exemplo, sob condições de infecção bacteriana ou condições que normalmente provocariam uma infecção bacteriana, particularmente uma infecção por Pseudomonas ou Xanthomonas em uma planta de controle equivalente não

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50/156 modificada .

[0083] A fim de aumentar ainda mais a resistência das plantas da invenção à infecção microbiana, um especialista na técnica reconhecería que pode ser vantajoso incorporar ou empilhar ou colocar em pirâmide dois ou mais polinucleotídeos diferentes, conforme aqui definido, em uma planta receptora. O número de genes de polinucleotídeos empilhados pode tipicamente ser dois ou mais, até qualquer número aceitável tolerável pela planta receptora. Além disso, deve ser entendido que os polinucleotídeos, conforme aqui definidos, podem ser empilhados com outros polinucleotídeos que são capazes de conferir resistência a patógenos microbianos, sejam de Pseudomonas syríngae ou Puccinia hordei ou qualquer outra espécie.

[0084] Tal método de modificar uma planta ou material vegetal para conferir pelo menos resistência parcial a, ou melhorar a resistência à infecção por um patógeno microbiano, requer um aumento na expressão e/ou nível e/ou atividade do EPF na planta hospedeira.

[0085] Por conseguinte, tal método de modificar uma planta ou material vegetal para conferir pelo menos resistência parcial a, ou melhorar a resistência à infecção por um patógeno microbiano, pode compreender adequadamente transformar a planta, parte da planta ou célula celular com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência

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51/156 polinucleotidica da

SEQ ID NO: 14; ou uma sequência com pelo menos 58%; de preferência pelo menos 90%; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma;

ou um fragmento funcional das mesmas; em que a expressão do referido polinucleotídeo nas células da planta ou material vegetal resulta em um aumento na expressão e/ou no nível e/ou na atividade do polipeptídeo EPF nas referidas células

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52/156 em comparação com células de controle não transformadas; em que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 60% de identidade com a mesma.

[0086] De preferência, a expressão ou o nível de qualquer um dos polinucleotídeos acima é aumentado em uma ou mais células da planta receptora em relação a uma planta de controle não modificada. Adequadamente, qualquer um dos polinucleotídeos acima pode ser colocado sob o controle de um ou mais elementos reguladores que resultam em um alto nível de expressão de EPF na planta, material vegetal ou célula vegetal receptora em relação à expressão de EPF em uma planta de controle não modificada, material vegetal ou célula vegetal.

[0087] Em contraste com outros aspectos da invenção aqui divulgados, que são restritos em sua aplicação a monocotiledôneas, aspectos da invenção que se relacionam com métodos de modificação de uma planta ou material vegetal para conferir pelo menos resistência parcial ou melhorar a resistência à infecção por um patógeno microbiano, em que o método compreende aumentar a expressão e/ou o nível e/ou a atividade do polipeptídeo EPF nas células da planta ou material vegetal em comparação com as células de uma planta ou material de controle equivalente; são aplicáveis a plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Embora em aspectos

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53/156 preferidos, a planta seja monocotiledônea e, de preferência, a planta seja ou o material vegetal seja derivado de uma planta selecionada dos gêneros Hordeum L., Trítícum L., Oryza L. ou Zea L., aumento no nível de expressão e/ou atividade do EPF, melhoram a resistência a patógenos microbianos em fundos de monocotiledôneas e dicotiledôneas em comparação com uma planta de controle ou material vegetal não modificado ou não transformado. Portanto, métodos para melhorar a resistência à infecção por patógenos aqui divulgados são aplicáveis a qualquer espécie de planta, que pode ser usada como um sistema hospedeiro para expressão incorreta ou super expressão do EPF. Por conseguinte, além das espécies hospedeiras monocotiledôneas aqui divulgadas, plantas hospedeiras adequadas podem incluir, mas não estão limitadas a; por exemplo, tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), tomate (Solanum lycopersícum) ou Arabidopsis. Tipicamente, a planta pode ser uma planta Hordeum vulgare L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta Hordeum vulgare L. Da mesma forma, a planta pode ser uma planta de Triticum aestivum L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de Triticum aestivum L. Igualmente, a planta pode ser uma planta de Oryza sativa L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de Oryza sativa L. Alternativamente, a planta pode ser uma planta de Zea mays L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de

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Zea mays L. A planta pode ser uma planta de Arabídopsís thaííana L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de Arabídopsís thaííana L.

[0088] Em um aspecto adicional, a presente invenção também fornece um método para modificar uma planta ou material vegetal para melhorar a tolerância à seca, em que o método compreende aumentar a expressão e/ou o nível e/ou a atividade do polipeptídeo EPF nas células da planta ou material vegetal em comparação com células de uma planta de controle equivalente ou material vegetal; em que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 60% de identidade com a mesma.

[0089] Em um aspecto adicional, a presente invenção também fornece um método para modificar uma planta monocotiledônea ou material vegetal para melhorar a tolerância à seca, compreendendo a transformação da planta, parte da planta ou célula celular com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência polinucleotídica de;

SEQ ID NO: 10; ou uma sequência com pelo menos 67%; de preferência pelo menos 90%; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de

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55/156 identidade com a mesma; ou

ou um fragmento funcional das mesmas; em que a expressão do referido polinucleotideo nas células da planta ou material vegetal resulta em um aumento na expressão e/ou no nivel e/ou na atividade do polipeptideo EPF nas referidas células em comparação com células de controle não transformadas; em que o polipeptideo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 60% de identidade com a mesma.

[0090] Preferencialmente, a presente invenção também fornece um método para modificar uma planta ou material vegetal para melhorar a tolerância à seca, compreendendo a transformação da planta, parte da planta ou célula celular

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56/156 com um polinucleotideo compreendendo uma sequência polinucleotidica de; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 ou, SEQ ID NO: 16 ou uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a mesma; ou um fragmento funcional das mesmas; em que a expressão do referido polinucleotideo nas células da planta ou material vegetal resulta em um aumento na expressão e/ou no nivel e/ou na atividade do polipeptideo EPF nas referidas células em comparação com células de controle não transformadas; em que o polipeptideo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 60% de identidade com a mesma.

[0091] Será entendido que, de acordo com a invenção, é possível obter plantas modificadas com densidade estomática aumentada reduzindo a expressão, o nível e/ou a atividade do EPF nas células da planta em relação às células de uma planta de controle. Embora isso possa ser alcançado de várias maneiras, por exemplo, reduzindo a acumulação de transcritos por RNAi ou miRNA, será apreciado que uma das maneiras pelas quais isso podería ser alcançado seria introduzir mutações, inserções, deleções e/ou substituições de um ou mais nucleotídeos na sequência que codifica para, ou regula a expressão de, EPF, de modo que o produto de expressão do gene nativo não produz transcrito, seja tornado não funcional ou menos ativo na planta modificada em comparação com uma

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57/156 planta não modificada. Por conseguinte, em outro aspecto, a presente invenção fornece uma planta monocotiledônea modificada ou material vegetal de monocotiledônea compreendendo células cujo DNA genômico não forma uma sequência nucleotídica contígua da SEQ ID NO: 13 ou uma sequência com pelo menos 66% de identidade com a mesma, ou SEQ ID NO: 14 ou uma sequência com pelo menos 58% de identidade com a mesma, em que a planta ou material vegetal tem uma densidade estomática aumentada em comparação com planta ou material vegetal geneticamente equivalente, mas não modificada, com as referidas sequências nucleotídicas contíguas.

[0092] Sequências nucleotídicas não contíguas da SEQ ID NO: 13 ou uma sequência com pelo menos 66% de identidade com a mesma, ou SEQ ID NO: 14 ou uma sequência com pelo menos 58% de identidade com a mesma, podem interromper a atividade biológica, a estrutura, as características do produto de expressão, a taxa de expressão ou a maneira de controlar a expressão. Tais modificações podem ser alcançadas por uma variedade de técnicas padrão bem conhecidas na técnica e podem incluir, mas não estão limitadas a introdução de mutações, inserções, deleções e substituições de um ou mais nucleotídeos, por exemplo, por edição de DNA ou mutagênese clássica.

[0093] Um dos métodos pelos quais isso pode ser alcançado

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58/156 na planta modificada é pela aplicação de técnicas de edição de DNA, que são bem entendidas e rotineiras na técnica. Por conseguinte, a presente invenção fornece um método para aumentar a densidade estomática em uma planta monocotiledônea ou material vegetal de monocotiledônea, compreendendo editar um ou mais resíduos nucleotídicos da SEQ ID NO: 13 ou uma sequência com pelo menos 66% de identidade com a mesma, ou SEQ ID NO: 14 ou uma sequência com pelo menos 58% de identidade com a mesma e que está compreendida no genoma da planta, de modo que as células editadas da planta ou do material vegetal resultante tenham uma redução ou eliminação da expressão e/ou do nível de polipeptideo EPF nativo e/ou da atividade do mesmo nas referidas células em comparação com as células geneticamente equivalentes, mas não editadas, de uma planta de controle ou material vegetal; em que o polipeptideo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 60% de identidade com a mesma. De preferência, o referido um ou mais resíduos nucleotídicos é/são editados de modo que o polipeptideo EPF resultante seja não funcional.

[0094] A presente invenção fornece uma planta monocotiledônea ou material vegetal de monocotiledônea transformado com um polinucleotídeo compreendendo qualquer um de ;

SEQ ID NO: 9; ou uma sequência com pelo menos 67%; de

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59/156 preferência pelo menos 90%; mais preferencialmente pelo menos 95%; ainda mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com a mesma; ou

ou um fragmento funcional do mesmo, em que a expressão do referido polinucleotídeo nas células da planta ou do material vegetal resulta em um aumento na expressão e/ou no nível e/ou na atividade do polipeptídeo EPF nas referidas células, em comparação com as células não transformadas; em que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID

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NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 60% de identidade com a mesma. De preferência, a referida planta, ou material vegetal tem densidade estomática reduzida em comparação com uma planta ou material vegetal equivalente não transformado.

[0095] Beneficamente, a referida planta monocotiledônea ou material vegetal melhorou a WUE, melhorou a tolerância à seca e melhorou a resistência à infecção por patógenos em comparação com uma planta de controle não transformada.

[0096] Alternativamente, a presente invenção fornece uma planta monocotiledônea ou material vegetal de monocotiledônea, em que a planta ou o material vegetal é transformado com um polinucleotideo capaz de hibridizar especificamente com um polinucleotideo compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 14, sob condições rigorosas; em que a expressão do referido polinucleotideo em células da planta ou do material vegetal resulta em uma redução ou eliminação da expressão e/ou do nível do polipeptídeo nativo de EPF e/ou da atividade do mesmo nessas células em comparação com as células não transformadas; em que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência com pelo menos 60% de identidade com a mesma. De preferência, a referida planta ou material vegetal aumentou a densidade estomática em comparação com uma planta ou material vegetal equivalente não transformado.

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[0097] Uma planta monocotiledônea modificada ou material vegetal de monocotiledônea, conforme divulgado aqui, pode ter um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 10 ou uma sequência com pelo menos 67% de identidade à mesma, ou um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência com pelo menos 59% identidade ao mesmo, ou um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 14 ou uma sequência com pelo menos 58% de identidade incorporada de maneira estável em seu genoma. Alternativamente, o referido polinucleotídeo pode ser expresso transitoriamente no antecedente da planta. Além disso, a planta monocotiledônea modificada ou o material vegetal de monocotiledônea, conforme divulgado neste documento, pode ser transformado com uma multiplicidade dos referidos polinucleotídeos, de maneira estável, transitória ou uma combinação de ambos.

[0098] A invenção também fornece uma planta monocotiledônea ou material de monocotiledônea, em que a planta ou o material vegetal aumentaram a expressão, o nível ou a atividade do EPF em comparação com uma planta de controle não modificada e em que o referido vegetal ou material da planta melhorou a eficiência do uso da água em comparação com um equivalente não transformado planta ou material vegetal.

[0099] A invenção também fornece uma planta monocotiledônea ou material de monocotiledônea, em que a

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62/156 planta ou o material vegetal aumentaram a expressão, o nível ou a atividade do EPF em comparação com uma planta de controle não modificada, em que o referido vegetal ou material da planta melhorou a tolerância à seca em comparação com uma planta não transformada equivalente ou material vegetal.

[00100] A invenção também fornece uma planta monocotiledônea ou material de monocotiledônea, em que a planta ou o material vegetal aumentam a expressão, o nível ou a atividade do EPF em comparação com uma planta de controle não modificada, em que a referida planta ou material vegetal possui resistência melhorada a um patógeno microbiano em comparação com um eguivalente planta ou material vegetal não transformado. Opcionalmente, o patógeno microbiano pode ser um patógeno fúngico, por exemplo, um patógeno Septoria ou Puccínía. De preferência, o patógeno é um patógeno bacteriano. Mais preferencialmente, o patógeno é do gênero Pseudomonas. Ainda mais preferencialmente, o patógeno é Pseudomonas syríngae.

[00101] Em outras modalidades, preferencialmente o patógeno é um patógeno fúngico. Mais preferencialmente, o patógeno é do gênero Puccínía. Ainda mais preferencialmente, o patógeno é Puccinia hordeí.

Modificando presença, expressão ou atividade de EPF

[00102] A modulação dos níveis ou atividade de um

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63/156 polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucleico pode ser alcançada por vários meios. Por exemplo, elevar ou reduzir os níveis de mRNA que codificam o referido polipeptídeo, colocando o nucleotídeo sob o controle de uma sequência promotora forte ou alterando a dosagem do gene, fornecendo uma célula com várias cópias do referido gene ou seu complemento. Alternativamente, a estabilidade do mRNA que codifica o referido polipeptídeo pode ser modulada para alterar os níveis de estado estacionário de uma molécula de mRNA, isto é, de preferência alcançado através da alteração nas regiões não traduzidas 5' ou 3' do mRNA. Da mesma forma, a produção de um polipeptídeo pode ser modificada alterando a eficiência do processamento da tradução, aumentando ou diminuindo a estabilidade da proteína ou alterando a taxa de modificação pós-tradução (por exemplo, divagem proteolítica) ou secreção.

[00103] Geralmente, quando uma planta expressa naturalmente o referido EPF, a modificação da expressão do EPF pode ser conseguida alterando o padrão de expressão do (s) gene (s) nativo (s) e/ou o processamento e/ou a produção do polipeptídeo. Isto pode ser conseguido por qualquer método adequado, incluindo, entre outros, alteração da transcrição do gene e/ou tradução do mRNA em polipeptídeo e modificação pós-traducional do polipeptídeo. A alteração do padrão de expressão de um gene nativo pode ser alcançada colocando-o

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64/156 sob controle de uma sequência reguladora heteróloga, que é capaz de direcionar o padrão de expressão desejado do gene. Sequências reguladoras adequadas podem ser colocadas 5' e/ou 3' do gene endógeno e podem incluir, entre outras, sequências promotoras, fragmentos terminadores, sequências de poliadenilação ou sequenciadoras intensificadoras (por exemplo, domínio de transativação de VP16) operacionalmente ligadas às sequências de interesse.

[00104] A alteração, se a ativação ou repressão do padrão de expressão do (s) gene (s) do EPF nativo e/ou o processamento e/ou produção do (s) polipeptideo (s) também pode ser alcançada usando a tecnologia CRISPR-Cas, por exemplo, fornecendo um fusão Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) para reprimir ou ativar sinteticamente a expressão de EPF. Em ambas as abordagens, um único RNA guia (sgRNA) pode ser projetado para direcionar o repressor ou ativador dCas9 para um local genômico escolhido, isto é, uma sequência genômica específica para EPF. Os locais-alvo potenciais incluem regiões promotoras, regiões reguladoras e regiões de codificação inicial. Para obter a repressão transcricional, o dCas9 pode ser usado por si só (reprimindo a transcrição por impedimento estérico) ou como parte de uma proteína de fusão do repressor transcricional dCas9-KRAB. Alternativamente, a ativação transcricional do EPF pode ser alcançada por várias abordagens, por exemplo, usando o

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65/156 ativador transcricional VP64. Uma abordagem é uma proteína de fusão dCas9-VP64. Outro, visando a amplificação de sinal, requer a fusão de dCas9 a uma matriz repetida de epítopos peptídicos, que recrutam modularmente várias cópias de anticorpos de fragmento variável de cadeia única (ScFv) fundidos a domínios de ativação transcricional. Uma abordagem adicional é uma proteína de fusão dCas9 - VP64, juntamente com um andaime sgRNA modificado com um loop de motivo de RNA MS2. Esse loop de RNA MS2 recruta a proteína de revestimento MS2 (MCP) fundida com ativadores adicionais, como p65 e fator de choque térmico 1 (HSF1). Deste modo, a expressão de EPF pode ser elevada ou derrubada, conforme desejado. Vários plasmídeos que são projetados para serem manipulados para esse fim estão disponíveis gratuitamente em repositórios de plasmídeos, tal como https://www.addgene.org/crispr/.

Transformação de Plantas

[00105] As plantas transformadas com um polinucleotídeo ou construto de expressão da invenção podem ser produzidas por técnicas padrão para a manipulação genética de plantas que são conhecidas na técnica. O DNA pode ser introduzido nas células vegetais usando qualquer tecnologia adequada, tal como transferência de genes por meio de um vetor de plasmídeo Ti desarmado transportado por Agrobacteríum tumefacíens, usando transformação mediada por Agrobacteríum sp. ,

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Infiltração a vácuo, mergulho floral, pulverização, bombardeio de partículas ou microprojéteis, protoplastos transformação, eletroporação, microinjeção, eletroforese, via do tubo de pólen, transformação mediada por carboneto de silício ou lipossomas, captação pelas raízes, injeção direta no xilema ou floema ou outras formas de captação direta de DNA. 0 bombardeamento de microprojéteis, a eletroporação e a captação direta de DNA são preferidos quando Agrobacteríum é ineficiente ou ineficaz. Alternativamente, uma combinação de diferentes técnicas pode ser empregada para aumentar a eficiência do processo de transformação, por exemplo, bombardeio com micropartículas revestidas com Agrobacteríum ou bombardeio de microprojéteis para induzir ferimentos, seguido de co-cultivo com Agrobacteríum.

[00106] De preferência, os polinucleotídeos que codificam EPF podem ser introduzidos diretamente nas células de plantas de cereais usando bombardeamento de microprojéteis. De preferência, a transformação de cereais usando bombardeamento de microprojéteis incluirá a aceleração de partículas de ouro revestidas com DNA plasmídico (por exemplo, vetor gateway pBRACT214) compreendendo sequências polinucleotídicas genômicas de EPF (SEQ ID NO: 14) ou cDNA (SED ID NO: 11) e uma ou mais sequências reguladoras (por exemplo, o promotor de ubiquitina de milho).

[00107] De acordo com a presente invenção, plantas

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67/156 inteiras, material vegetal ou partes de plantas podem ser transformadas de maneira estável ou transitória, conforme desejado, em que transformação estável se refere a polinucleotideos que são incorporados aos cromossomos hospedeiros da planta, de modo que o material genético do hospedeiro possa ser permanente e hereditariamente alterado e a célula transformada pode continuar a expressar traços causados por esse material genético, mesmo após várias gerações de divisões celulares. Células vegetais transformadas transitoriamente se referem a células que contêm DNA ou RNA heterólogo e são capazes de expressar a característica conferida pelo material genético heterólogo, sem ter incorporado totalmente esse material genético no DNA da célula. 0 material genético heterólogo pode ser incorporado nos genomas nucleares ou plastídios (cloroplásicos ou mitocondriais) , conforme necessário para se adequar à aplicação da invenção. Onde as plantas são transformadas com mais de um polinucleotídeo, está previsto que combinações de transformações estáveis e transitórias sejam possíveis.

Sequências polipeptidicas e polinucleotidicas

[00108] As sequências polipeptidicas e polinucleotidicas utilizadas na presente invenção podem ser isoladas ou purificadas. Por purificadas significa que elas são substancialmente livres de outros componentes ou materiais

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68/156 celulares, ou meio de cultura. Isoladas significa que elas também podem estar livres de sequências que ocorrem naturalmente que flanqueiam a sequência nativa, por exemplo, no caso de uma molécula de ácido nucleico, isolada pode significar que está livre de sequências reguladoras 5' e 3'. De acordo com a presente invenção, para uso na alteração da expressão de EPF em uma célula de uma planta, sequências polinucleotídicas apropriadas podem ser integradas em um cassete de expressão ou construto (por exemplo, um vetor de expressão) compreendendo uma ou mais sequências reguladoras para modular a expressão dos genes EPF nativos em uma planta receptora. Preferencialmente, as uma ou mais sequências reguladoras são projetadas para serem operacionalmente ligadas às sequências polinucleotídicas, a fim de direcionar a expressão de uma maneira de acordo com a presente invenção.

Vetores de Expressão e Elementos Regulatórios

[00109] Os polinucleotídeos, como aqui descritos, e as sequências reguladoras são preferencialmente fornecidas como parte de um cassete de expressão (por exemplo, um vetor de expressão) para expressão do polinucleotídeo em uma célula ou tecido de interesse de uma planta monocotiledôneas. Os vetores de expressão adequados variarão de acordo com a planta receptora escolhida e adequadamente podem incorporar elementos reguladores que permitem a expressão na célula vegetal ou vegetal de interesse. Cassetes de expressão

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69/156 adequados para uso na presente invenção podem ser construídos por técnicas padrão conhecidas na técnica, para compreender sequências regulatórias 5' e 3'. Tais sequências reguladoras podem ser capazes de influenciar a transcrição ou tradução de um gene ou produto gênico, por exemplo, em termos de iniciação, precisão, taxa, estabilidade, processamento a jusante e mobilidade. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores, UTRs 5' e 3', intensificadores (por exemplo, domínio de transativação VP16), fator de transcrição ou sequências de ligação a proteínas, locais de início e sequências de terminação, locais de ligação a ribossomo, locais de recombinação, sequências de poliadenilação, sequências de sentido ou antessentido. Eles podem ser DNA, RNA ou proteína. As sequências reguladoras podem estar operacionalmente ligadas às sequências de interesse. As sequências reguladoras podem ser derivadas de plantas, bactérias, fungos ou vírus e, de preferência, podem ser derivadas da mesma espécie de planta que a planta que está sendo modulada. Tais elementos podem ser incluídos no construto de expressão para obter a expressão e função ideais de EPF na planta ou no material vegetal ou, dependendo da aplicação desejada, para obter redução ideal ou eliminação da expressão de EPF na planta ou no material vegetal. Além disso, polinucleotídeos que codificam, por exemplo, marcadores selecionáveis e genes repórter podem ser

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70/156 incluídos. O cassete de expressão preferencialmente também contém um ou mais locais de restrição, para permitir a inserção da sequência nucleotídica e/ou uma sequência reguladora no genoma da planta, em locais pré-selecionados. Também podem ser fornecidas no cassete de expressão regiões de iniciação de transcrição e tradução, para permitir a expressão dos genes recebidos, regiões de terminação de transcrição e tradução e sequências reguladoras. Essas sequências podem ser nativas da planta que está sendo transformada ou podem ser heterólogas. Os cassetes de expressão podem ser um cassete de expressão bi ou multifuncional que funciona em múltiplos hospedeiros. Além disso, como a aplicação exige, o vetor de expressão pode ainda compreender elementos adicionais que influenciam a expressão da proteína de interesse na planta hospedeira. Tais sequências e elementos reguladores podem permitir que uma pessoa habilitada selecione de maneira predeterminada um padrão de expressão desejado em uma planta hospedeira de interesse, dependendo da aplicação em questão. Os vetores de expressão adequados podem compreender sequências adicionais que codificam marcadores selecionáveis que permitem a seleção do referido vetor em uma célula vegetal e/ou sob condições particulares. Os vetores de expressão adequados também podem compreender sequências adicionais que permitem a visualização ou quantificação da proteína expressa (por

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71/156 exemplo, etiquetas de fusão 3' GFP ou Luciferase) na célula vegetal de interesse. Além disso, o vetor de expressão compreendendo a sequência polinucleotídica heteróloga pode opcionalmente compreender sequências polinucleotídicas que codificam um ou mais peptídeos de trânsito, capazes de localizar a proteína expressa em um compartimento celular específico na célula da planta receptora. Vantajosamente, esses peptídeos de trânsito adequados podem fazer com que a proteína se localize, por exemplo, na parede celular, núcleo ou cloroplastos. De preferência, o vetor de expressão será o vetor de gateway pBRACT214. Mais preferencialmente, o vetor de expressão compreenderá sequência (s) de polinucleotideo genômico de EPF (SEQ ID NO: 14) ou cDNA (SED ID NO: 11) e uma ou mais sequências reguladoras (por exemplo, o promotor de ubiquitina de milho).

[00110] Uma sequência reguladora é uma sequência nucleotídica que é capaz de influenciar a transcrição ou tradução de um gene ou produto gênico, por exemplo em termos de iniciação, precisão, taxa, estabilidade, processamento a jusante e mobilidade. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores, UTRs 5' e 3', intensificadores, fator de transcrição ou sequências de ligação a proteínas, locais de início e sequências de terminação, locais de ligação ao ribossomo, locais de recombinação, sequências de poliadenilação, sequências sensoriais ou antessentido. Eles

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72/156 podem ser DNA, RNA ou proteína. As sequências reguladoras podem ser derivadas de plantas, bactérias, fungos ou vírus, e preferencialmente podem ser derivadas da mesma espécie de planta que a planta que está sendo modulada para alcançar a função ideal das sequências de interesse no antecedente da planta receptora e reduzir efeitos indesejados.

[00111] Tipicamente, o um ou mais promotores que controlam a expressão de polinucleotídeos que codificam EPF ou sequências capazes de hibridizar com eles são opcionalmente específicos de tecidos ou órgãos, de modo que a expressão de EPF ou sequências capazes de hibridizar com eles, pode ser direcionada a um órgão ou tecido específico, como tecido foliar, preferencialmente epiderme. Esses promotores podem ser constitutivos, pelo qual eles direcionam a expressão sob a maioria das condições ambientais ou estágios de desenvolvimento, específicos do estágio de desenvolvimento, específicos de tecido ou induzíveis. De preferência, o promotor é específico do tecido, iniciando a transcrição apenas no tecido da folha. Mais preferencialmente, o promotor é induzível, para direcionar a expressão em resposta a sugestões ambientais, químicas ou de desenvolvimento, como temperatura, luz, produtos químicos, seca, estresse por calor e outros estímulos. Pode ser desejável, por exemplo, controlar diferencialmente o número ou a densidade de estômatos em diferentes locais da planta. Por exemplo, pode

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73/156 ser desejado transformar a planta receptora com várias cópias de EPF, controladas por diferentes elementos reguladores, a fim de controlar diferencialmente a densidade dos estômatos em diferentes tecidos. Também está previsto que o EPF possa ser regulado positivamente em uma parte da planta, por exemplo nas folhas, mas com regulação negativa em outros lugares, por exemplo nas anteras, ou de tal forma que a densidade estomática da planta, ou de um tecido específico, mude em diferentes estágios de crescimento do desenvolvimento. Claramente, uma mistura das abordagens aqui descritas pode ser usada adequadamente para conseguir isso.

[00112] Será entendido que uma série de sequências promotoras podería, em princípio, ser usada para conduzir a expressão das sequências polinucleotídicas aqui divulgadas, dependendo do padrão desejado de acumulação de transcritos. Geralmente, serão utilizados promotores fortes capazes de produzir um alto nível de transcrito de mRNA do gene de interesse na planta hospedeira. Em particular, aqueles capazes de conduzir altos níveis de transcrito de mRNA do gene de interesse no tecido específico de interesse serão selecionados para uso de acordo com a presente invenção. Sequências promotoras adequadas podem incluir, mas não estão limitadas, ao DNA-T de A. tumefacíens, incluindo manopina sintase, nopalina sintase e octopina sintase; promotor de álcool desidrogenase de Zea mays; promotores induzíveis à

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74/156 luz, como o gene da subunidade pequena de ribulose-bifosfatocarboxilase de várias espécies e o principal promotor do gene da proteína de ligação à clorofila a/b; promotores de histonas, promotores de actina; 0 promotor de Zea mays ubiquitina 1; Promotores 35S e 19S do vírus do mosaico da couve-flor; promotores regulados pelo desenvolvimento, como os promotores de cera, zeína ou bronze de Zea mays; bem como promotores sintéticos ou outros promotores naturais, incluindo os promotores que exibem expressão ou expressão específica de órgão em estágios específicos de desenvolvimento da planta, tal como o promotor de alfatubulina. Os promotores preferidos para direcionar a expressão de polinucleotideo em plantas receptoras incluirão aqueles que geram expressão constitutiva, por exemplo, o promotor de ubiquitina de milho. Promotores preferidos alternativos para dirigir a expressão de polinucleotídeos da invenção em plantas receptoras incluem aqueles que geram expressão estável nas células epidérmicas das folhas da planta receptora. Os promotores específicos da epiderme preferidos incluem MERISTEMA LI DE ARABIDOPSIS THALIANA (ATML1) e FATOR PROTODÉRMICO 2 (PDF2), cujas sequências são conhecidas na técnica (San-Bento et al., Plant Journal 2014 77: 46-58). Em uma modalidade preferida, o promotor de ubiquitina pode ser utilizado para conduzir a acumulação de EPF ou sequências hibridáveis com o mesmo. Também será

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75/156 apreciado que a expressão constitutiva nem sempre pode ser desejada. Por exemplo, aplicações especificas podem exigir mudanças sutis na densidade estomática e, portanto, pode ser desejável combinar a força de qualquer promotor e/ou sequências reguladoras usadas para direcionar a expressão de polinucleotideo (por exemplo, polinucleotídeos que codificam EPF) para o nível desejado de expressão ou atividade em a planta hospedeira. Os promotores adequados podem ser derivados de plantas, bactérias, fungos ou vírus ou de qualquer outro organismo adequado, desde que produzam o padrão de expressão desejado na planta receptora. Promotores adequados não precisam ser derivados de monocotiledôneas e, em princípio, podem ser derivados de outras espécies de plantas, tal como Arabídopsis. De preferência, contudo, as sequências promotoras podem ser derivadas da mesma espécie de planta que a planta que está sendo modulada. De preferência, os promotores serão derivados de milho, cevada ou trigo.

[00113] Um cassete de expressão compreendendo o ácido nucleico heterólogo também pode compreender sequências que codificam um peptídeo de trânsito, para direcionar a proteína codificada pelo gene heterólogo para uma parte desejada da célula, por exemplo, a parede celular, núcleo ou cloroplastos. Esses peptídeos de trânsito são bem conhecidos dos versados na técnica e podem incluir peptídeos de trânsito

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76/156 único, bem como vários peptídeos de trânsito obtidos pela combinação de sequências que codificam para pelo menos dois peptídeos de trânsito (por exemplo, peptídeo de trânsito otimizado ou peptídeo de trânsito de cloroplastos), compreendendo na direção da transcrição uma primeira sequência de DNA que codifica um primeiro peptídeo de trânsito de cloroplastos, uma segunda sequência de DNA que codifica um domínio N-terminal de uma proteína madura naturalmente conduzida para os cloroplastos e uma terceira sequência de DNA que codifica um segundo peptídeo de trânsito de cloroplastos .

[00114] A invenção também fornece uma composição compreendendo um vetor de expressão como aqui definido. Por conseguinte, essa composição pode compreender um vetor de expressão compreendendo uma sequência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 10 a 16 ou variantes da mesma, conforme aqui definido.

[00115] De acordo com os métodos da invenção, em uso, os vetores ou composições aqui divulgadas são geralmente aplicados diretamente na superfície da planta ou colheita. Normalmente, isso pode ser alcançado por aplicação direta na planta ou na cultura, por exemplo, por inoculação por esfregaço ou por pulverização do vetor ou composição diretamente no material da planta, por exemplo, nas folhas, caules ou raízes da planta durante a fase vegetativa, embora

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77/156 outros métodos de aplicação igualmente viáveis serão conhecidos na técnica. Está previsto que os compostos aqui divulgados também possam ser aplicados indiretamente ao meio (por exemplo, solo ou água) no qual as plantas ou culturas são cultivadas.

[00116] A transformação de plantas de acordo com os métodos da invenção pode envolver uma única aplicação do vetor ou composição na planta ou no meio de crescimento. No entanto, será entendido que o tratamento pode alternativamente envolver múltiplas aplicações do mesmo vetor ou composição ou mesmo combinações dos vetores ou composições aqui divulgadas. Onde múltiplos (ou seja, dois ou mais) vetores ou composições diferentes são aplicados à mesma planta, eles podem ser aplicados simultaneamente, separadamente (em qualquer ordem) ou sequencialmente.

[00117] Os vetores ou composições aqui divulgadas são tipicamente fornecidos à planta ou cultura na forma de uma solução aquosa. No entanto, os vetores ou composições aqui divulgadas também podem ser fornecidas à planta ou à cultura na forma sólida, como um pó, poeira ou na forma granular e combinações dos mesmos.

[00118] A invenção fornece o uso de uma composição compreendendo qualquer um dos vetores divulgados neste documento (e combinações dos mesmos), seja na expressão de altos níveis de proteína EPF em uma planta monocotiledônea

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78/156 para reduzir a densidade estomática da planta receptora em comparação com os controles ou, alternativamente, na redução da expressão, nível ou atividade de EPF em uma planta monocotiledônea para aumentar a densidade estomática da planta receptora em comparação com os controles. Por conseguinte, os vetores ou composições aqui divulgadas devem ser preferencialmente aplicados à planta ou meio de crescimento como uma solução aquosa.

[00119] Por conveniência, os vetores ou composições aqui divulgadas podem ser combinados com outros ingredientes ativos usados para o tratamento de plantas, por exemplo, podem ser incorporados a outros produtos agroquímicos, como fertilizantes, herbicidas, agentes antibacterianos ou antifúngicos e/ou pesticidas.

Determinando a Expressão de EPF

[00120] Em várias aplicações da invenção, pode ser desejável determinar os níveis de expressão da proteína EPF em plantas receptoras, partes de plantas, tecidos de plantas ou células de plantas. Os níveis de expressão podem ser determinados por várias técnicas que são rotineiramente usadas na técnica. Em modalidades preferidas da presente invenção, os níveis de expressão da proteína em organismos hospedeiros de interesse podem ser determinados. Em alguns casos, pode ser possível determinar diretamente a expressão funcional, por exemplo como com GFP ou por ação enzimática

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79/156 da proteína de interesse (POI) para gerar um sinal ótico detectável. No entanto, em alguns casos, pode ser escolhido para determinar a expressão física, por exemplo por sondagem de anticorpos e confiar em testes separados para verificar se a expressão física é acompanhada pela função requerida.

[00121] Em modalidades preferidas da invenção, a expressão de EPF será detectável por um método de triagem de alto rendimento, por exemplo, baseando-se na detecção de um sinal ótico. Para este fim, pode ser necessário que a proteína de interesse (POI) incorpore uma marcação ou seja rotulada com uma marcação removível, que permita a detecção da expressão. Tal marcação pode ser, por exemplo, uma molécula repórter de fluorescência fundida por translação ao POI, por exemplo Proteína Fluorescente Verde (GFP), Proteína Fluorescente Amarela (YFP), Proteína Fluorescente Vermelha (RFP), Proteína Fluorescente Ciana (CEP) ou mCherry. Tal marcação pode fornecer um marcador adequado para visualização da expressão funcional de EPF, uma vez que sua expressão pode ser simples e diretamente testada por medição de fluorescência em organismos hospedeiros de interesse. Pode ser uma enzima que pode ser usada para gerar um sinal ótico. Os marcadores utilizados para a detecção da expressão também podem ser marcadores peptídicos do antígeno. Qualquer marcação empregada para a detecção de expressão pode ser clivável a partir do POI. Outros tipos de marcadores podem

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80/156 ser utilizados para marcar o ácido nucleico, incluindo moléculas de corante orgânico, rótulos radiomarcados e marcadores de spin que podem ser moléculas pequenas.

Plantas e Material Vegetal

[00122] Em todos os aspectos da invenção, a planta ou o material vegetal pode ser selecionado de qualquer um de plantas inteiras, partes de plantas, tecidos ou células de plantas. De acordo com a presente invenção, plantas, material vegetal ou partes de plantas podem se referir a folhas, caules, bainhas de folhas, raizes, sementes, grãos, embrião, pólen, óvulos, flores, siliques, vagens, espigas, cascas, caules, frutas, pontas das raizes, anteras, pericarpo, colas, pedúnculos, seda, tecidos ou células.

[00123] Plantas modificadas da invenção, métodos para gerá-los e polinucleotideos ou polipeptideos empregados nesses métodos podem geralmente ser direcionados para gerar plantas com reduções ou aumentos na densidade estomática nas folhas em comparação com os controles dependendo da aplicação desejada, variando a expressão de EPF nas folhas ou em todas as células da planta. No entanto, os efeitos a jusante das mudanças na densidade estomática, como WUE melhorado, tolerância à seca e resistência a patógenos, normalmente serão derivados em muitas partes da planta, mesmo se uma mudança na expressão do EPF for alcançada apenas nas folhas. As folhas também não podem fazer parte do material de

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81/156 interesse para fins de colheita.

Plantas Hospedeiras (WUE melhorada e/ou tolerância à seca)

[00124] De acordo com aspectos da presente invenção que se relacionam com WUE melhorada, tolerância à seca; plantas, material vegetal ou partes de plantas podem ser de qualquer espécie monocotiledônea.

[00125] Será apreciado que os métodos, polinucleotídeos, polipeptídeos e vetores de expressão da presente invenção são de grande utilidade e, como tal, encontrarão aplicação em muitas plantas hospedeiras monocotiledôneas (ou receptoras). Em particular, plantas apropriadas para uso de acordo com a presente invenção podem incluir gramíneas monocotiledôneas, culturas, vegetais e plantas ornamentais. De interesse particular, plantas adequadas para modificação com polipeptídeos e/ou polinucleotídeos aqui divulgados de acordo com a presente invenção são aquelas que produzem um alto rendimento de grãos para alimentos, matéria-prima ou biomassa para produção de combustível ou papel. Exemplos de tipos de plantas adequados incluem, mas não estão limitados a, monocotiledôneas de rápido crescimento, por exemplo Trigo, Soja, Arroz, Milho, Sorgo, Milho, Cevada, Centeio, Aveia, Cana de Açúcar e Beterraba. De preferência, a planta é uma colheita de cereais selecionada dos gêneros Trítícum, Aegílops, Panicum, Setaria, Zea, Oryza, Hordeum, Sorghum, Avena, Saccharum ou Secale. Em particular, a planta pode ser

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82/156 uma planta Hordeum sp. ou uma planta Zea sp. Onde a planta é uma planta Hordeum sp., de preferência a planta é uma planta Hordeum vulgare. Onde a planta é uma planta Zea sp., de preferência a planta é uma planta de Zea mays.

[00126] Outras plantas apropriadas podem incluir aquelas que possuem alta demanda de água e/ou são utilizadas para produção de biocombustivel ou celulose, por exemplo, gramineas energéticas. As gramineas perenes preferidas para uso na invenção incluem Switchgrass (Panícum virgatum), Pradaria (Spartina sp.), Capim-cana (Phalaris arundinacea), Brome False roxo (Brachypodium distachyon), Grama do Sudão (Sorghum x drummondii) e Grama de elefante (Miscanthus sp.).

[00127] Geralmente, uma planta apropriada para uso de acordo com a invenção é usada tipicamente como uma colheita, seja para alimentação, energia ou outros fins. Em aspectos preferidos da invenção, a referida planta pode ser selecionada entre: cevada (Hordeum vulgare) , trigo (Trítícum aestivum, Trítícum durum), milho (Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa sp.), Arroz (Oryza sativa), Beterraba sacarina (Beta vulgaris), Aveia (Avena sativa), Centeio (Secale cerale), Sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Soja (Glycine max), Milho (por exemplo, milheto (Pennisetum glaucum), Foxtail Millet (Setaria viridis), painço (Eleusine coracana), painço proso (Panícum miliaceum)), Miscanthus sp. (por exemplo, Miscanthus x

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83/156 giganteus, Miscanthus sinensis e Miscanthus saccharifloras) , capim-de-taus (Aegilops tauschii) , Pennisetum sp., banana (Musa spp.) , gengibre (Zingiber sp.), orquídeas (Orchidaceae) , cebola, alho, tulipas (Tulipa sp.), Lírios, Narcisos (Narcissus) , íris ou Amarílis.

[00128] Utilmente, a planta pode ser uma planta do gênero Hordeum L., Triticum L., Oryza L. ou Zea L. ou o material vegetal é derivado de uma planta do gênero Hordeum L. , Triticum L., Oryza L., ou Zea L. A planta pode ser uma planta Hordeum vulgare L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta Hordeum vulgare L. Do mesmo modo, a planta pode ser uma planta de Triticum aestivum L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de Triticum aestivum L. Igualmente, a planta pode ser uma planta de Oryza sativa L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de Oryza sativa L. Alternativamente, a planta pode ser uma planta de Zea mays L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de Zea mays L.

Plantas hospedeiras (resistência melhorada à infecção por patógenos microbianos)

[00129] De acordo com aspectos da presente invenção que se relacionam com resistência melhorada à infecção por patógenos microbianos; plantas, material vegetal ou partes de plantas podem ser de qualquer espécie vegetal, que pode ser monocotiledônea ou dicotiledônea. Em contraste com

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84/156 outros aspectos da invenção aqui divulgados, que são restritos em sua aplicação a monocotiledôneas, aspectos da invenção que se relacionam com métodos de modificação de uma planta ou material vegetal para conferir pelo menos resistência parcial ou resistência melhorada à infecção por um patógeno microbiano, em que o método compreende aumentar a expressão e/ou o nível e/ou a atividade do polipeptídeo EPF nas células da planta ou material vegetal em comparação com as células de uma planta ou material de controle equivalente; são aplicáveis a plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Embora em aspectos preferidos, a planta ainda seja uma monocotiledônea e, de preferência, a planta seja de, ou o material vegetal seja derivado de uma planta selecionada dos gêneros Hordeum L., Trítícum L., Oryza L. ou Zea L., os aumentos no nível de expressão e/ou da atividade do EPF melhoram a resistência a patógenos microbianos nos antecedentes de hospedeiros monocotiledôneas (por exemplo, Oryza) e dicotiledôneas (por exemplo, Arabídopsís) em comparação com uma planta ou material vegetal controle não modificado ou não transformado. Portanto, métodos para melhorar a resistência à infecção por patógenos aqui divulgados são aplicáveis a qualquer espécie de planta, que pode ser usada como um sistema hospedeiro para expressão incorreta ou super expressão do EPF. Por conseguinte, além das espécies hospedeiras monocotiledôneas aqui divulgadas,

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85/156 plantas hospedeiras adequadas podem incluir, mas não estão limitadas a; por exemplo, tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), tomate (Solanum lycopersícum) ou Arabidopsis. Tipicamente, a planta pode ser uma planta Hordeum vulgare L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta Hordeum vulgare L. Da mesma forma, a planta pode ser uma planta de Triticum aestivum L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de Triticum aestivum L. Igualmente, a planta pode ser uma planta de Oryza sativa L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de Oryza sativa L. Alternativamente, a planta pode ser uma planta de Zea mays L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de Zea mays L. A planta pode ser uma planta de Arabidopsis thaliana L. ou o material vegetal pode ser derivado de uma planta de Arabidopsis thaliana L.

Densidade Estomática

[00130] As densidades estomáticas de plantas modificadas, transgênicas ou transformadas produzidas de acordo com a invenção serão geralmente avaliadas analisando o número de estômatos por unidade de área em tecidos de plantas resultantes, preferencialmente folhas. Em particular, a epiderme das folhas pode ser avaliada. Isto pode ser feito utilizando técnicas que são bem conhecidas na técnica, que incluem, por exemplo, a produção de uma impressão epidérmica revestindo uma superfície da folha, por exemplo a superfície

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86/156 da folha abaxial com, por exemplo, verniz, descascando a camada seca de verniz, montando na água uma lâmina e examinando a impressão sob um microscópio. 0 número estomático por unidade de área foliar pode então ser calculado. Tipicamente, as primeiras folhas das plantas hospedeiras das mudas podem ser comparadas com as plantas controle (transformadas com um vetor vazio). 0 índice estomático (SI) também pode ser calculado, em que o índice estomático é a densidade estomática expressa como uma porcentagem de todas as células da epiderme.

[00131] Tais densidades estomáticas e/ou índices de plantas modificadas ou transformadas podem ser adequadamente comparadas com as de plantas de controle geneticamente equivalentes, mas não modificadas ou não transformadas. Modificações (isto é, aumentos ou reduções) na densidade estomática das folhas ou no índice estomático podem ser adequadamente avaliadas com base em uma única folha ou em várias folhas.

[00132] Plantas, material vegetal ou partes de plantas com densidade estomática alterada ou densidade estomática modificada podem se referir a plantas que apresentam alterações na localização dos estornas, aumento ou redução do número de estômatos por unidade de área (densidade estomática ou DP) e/ou por número de células epidérmicas (índice Estomático ou SI) em relação a plantas, material ou partes

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87/156 de plantas não modificadas ou não transformadas. Em modalidades preferidas, o número de estômatos por unidade de área foliar em uma planta modificada, parte da planta ou material vegetal é aumentado em relação ao de uma planta de controle equivalente. Mais preferencialmente, onde o objetivo é aumentar o número estomático, o índice estomático, que é a densidade de estômatos por número de células epidérmicas em uma planta modificada, parte da planta ou material vegetal é aumentado em relação à de uma planta de controle equivalente. Alternativamente, a densidade de estômatos, que é o número de estômatos por unidade de área foliar em uma planta modificada, parte da planta ou material vegetal, pode ser reduzida em relação à de uma planta de controle equivalente. 0 índice estomático de uma planta modificada ou transformada pode ser reduzido em comparação com o de uma planta de controle equivalente. Além disso, os estômatos também podem estar localizados ectopicamente em relação aos de uma planta de controle equivalente.

[00133] Nas modalidades da invenção em que a densidade estomática é reduzida em relação aos controles, a densidade estomática de plantas modificadas pode ser opcionalmente

99%,	98%,	97%,	96%,	95%,	94%,	93%,	92%,	91%,	90%,	89%,	88%,
87%,	86%,	85%,	84%,	83%,	82%,	81%,	80%,	79%,	78%,	77%,	76%,
75%,	74 %,	73%,	72%,	71%,	70%,	69%,	68%,	67%,	66%,	65%,	64%,
63%,	62%,	61%,	60%,	59%,	58%,	57%,	56%,	55%,	54%,	53%,	52%,

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51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 27%, 26%, 25%, 24 %, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% dos valores de controle.

[00134] Nas modalidades da invenção em que a densidade estomática é aumentada em relação aos controles, a densidade estomática de plantas modificadas pode opcionalmente ser 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 123%, 124%, 125%, 126 %, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, opcionalmente na faixa de 150% a 199%, de 200% a 249%, de 250% a 299%, de 300% a 349%, de 350% a 399%, de 400% a 449%, de 450% a 499%, de 500% a 599%, de 600% a 699%, de 700% a 799%, de 800% a 899% ou de 900% a 1000% dos valores de controle.

[00135] Os métodos, polipeptídeos, polinucleotídeos e vetores de expressão aqui divulgados podem ser úteis para variar os níveis de densidade estomática em uma planta hospedeira receptora, de modo que possa ser sintonizado com as condições ambientais ou bióticas necessárias. O nível de densidade estomática pode ser convenientemente controlado variando a força de expressão do polipeptídeo ou

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89/156 polinucleotídeo. No caso do EPF, esta será uma relação inversa com a densidade estomática. Essa variação nos níveis de EPF pode ser alcançada por técnicas que são bem conhecidas na técnica e podem incluir, entre outras, a seleção de um promotor para direcionar níveis apropriados de acumulação de transcritos, usando sequências ativadoras ou elementos potenciadores operativamente ligados ao polinucleotídeo que codifica EPF ou aumentando a estabilidade da transcrição ou proteína.

[00136] Os métodos, polipeptídeos, polinucleotídeos e vetores de expressão divulgados de acordo com a presente invenção encontram utilidade geral na geração de plantas monocotiledôneas com modificações na densidade estomática. Dependendo da aplicação desejada, a densidade estomática modificada pode significar aumento da densidade estomática em relação às plantas de controle não modificadas ou, alternativamente, pode significar densidade estomática reduzida em relação às plantas de controle não modificadas. Também será apreciado que a descoberta de um interruptor principal que governa o controle do desenvolvimento estomático que é capaz de operar em monocotiledôneas permite a geração de plantas monocotiledôneas nas quais a densidade estomática pode variar temporalmente, em desenvolvimento ou em resposta a sugestões químicas ou ambientais.

Polinucleotídeos isolados

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[00137] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência polinucleotídica de;

Cassetes de expressão/vetores

[00138] Qualquer um dos polinucleotideos aqui divulgados pode ser convenientemente fornecido integrado em um vetor de

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91/156 expressão, a fim de que possam ser rapidamente utilizados na transformação do material vegetal hospedeiro. Por conseguinte, a invenção fornece um vetor de expressão compreendendo uma sequência polinucleotídica de qualquer uma das SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 16 ou uma sequência variante da mesma, conforme aqui definido pela identidade de sequência percentual.

[00139] Esse vetor de expressão pode ser qualquer vetor que seja capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo nele contido em um tecido de interesse em uma planta monocotiledônea, em um estágio de desenvolvimento de interesse ou em resposta a uma sugestão ambiental ou química. Como tais vetores apropriados podem conter qualquer arquitetura genética apropriada para permitir a expressão de alto nível dos polinucleotídeos nela contidos na planta ou material vegetal receptor, em comparação com o nível nativo da expressão de EPF em uma planta não modificada, incluindo, por exemplo, promotores, melhoradores, regiões de controle de 5' e/ou 3'.

[00140] A presente invenção fornece um vetor de expressão, em que o vetor compreende uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 10 a 16, e qualquer variante percentual da mesma, como aqui definido pela identidade da sequência percentual.

[00141] A presente invenção fornece um vetor de expressão

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92/156 compreendendo um polinucleotídeo capaz de hibridizar com um polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 9 sob condições rigorosas.

[00142] Os vetores de expressão aqui divulgados podem ser adequadamente fornecidos como um componente de um kit de partes, juntamente com instruções de uso.

Entrega de vetor

[00143] Os vetores podem ser entregues de várias maneiras diferentes na planta receptora, tal como por exemplo, Trigo, cevada ou Arroz.

[00144] Opcionalmente, os vetores podem ser entregues na planta receptora por agro inoculação direta de culturas de Agrobacteríum transformadas com vetores binários. Alternativamente, os vetores podem ser entregues na planta receptora por inoculação por esfregar as folhas da planta com seiva preparada a partir de outro hospedeiro agro inoculado. Em uma alternativa adicional, os vetores podem ser entregues na planta receptora por inoculação por esfregar as folhas da planta com transcrição in vitro. Em outra alternativa, os vetores podem ser entregues na planta receptora por bombardeamento de folhas de plantas com partículas de ouro revestidas com os plasmídeos.

[00145] A transformação das plantas com vetores de expressão aqui divulgados, de acordo com os métodos da invenção, pode envolver uma única aplicação do vetor à

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93/156 planta. No entanto, será entendido que o tratamento pode, alternativamente, envolver múltiplas aplicações do mesmo vetor ou composição ou mesmo combinações dos vetores de expressão aqui divulgados. Onde múltiplos (ou seja, dois ou mais) vetores diferentes são aplicados à mesma planta, eles podem ser aplicados simultaneamente, separadamente (em qualquer ordem) ou sequencialmente. Os vetores podem ser entregues na planta receptora por qualquer combinação dos métodos acima.

Métodos para identificar plantas com WUE melhorada, resistência à seca e/ou resistência melhorada a patógenos

[00146] Em certas circunstâncias, pode ser desejável testar material vegetal, por exemplo semente, para determinar se possui sequências polinucleotídicas, as quais, por expressão, conferem à planta ou material vegetal uma expressão aumentada ou diminuída de EPF. Por conseguinte, a presente invenção fornece um método para identificar se uma planta tem resistência à infecção por um patógeno microbiano compreendendo detectar em uma amostra da planta o nível de expressão de:

a. um polinucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NO: 10 a 16, e qualquer variante percentual do mesmo, conforme aqui definido pela identidade de sequência percentual; ou

b. um polipeptideo de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 8, e qualquer variante percentual do mesmo, conforme aqui

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94/156 definido pela identidade de sequência percentual;

e comparar o nível de expressão ao de uma planta de controle; em que um aumento na expressão em relação ao da planta de controle é indicativo de resistência à infecção por um patógeno microbiano.

[00147] Diz-se que os polinucleotídeos ou polipeptídeos que codificam EPF nas amostras da planta testada quanto à resistência são expressos diferencialmente e são indicativos de resistência à infecção por um patógeno microbiano e/ou de melhor WUE e/ou de melhor tolerância à seca, quando eles são regulados significativamente em comparação aos de uma planta de controle. Dependendo do marcador individual, a resistência à infecção por um patógeno microbiano pode ser detectada em uma amostra de planta por um aumento no nível de expressão de EPF, escalonado em relação à média e variação da amostra, em relação às plantas de controle ou a um ou mais valores de referência. A variação nas plantas, a arquitetura reguladora usada para direcionar a expressão dos polinucleotídeos que codificam o EPF, o material e as amostras significam que diferentes níveis de confiança estão associados a cada marcador. Diz-se que os níveis de expressão de EPF são altamente regulados significativamente quando, após o escalonamento dos níveis de expressão de biomarcadores em relação à média e variância da amostra, eles exibem uma alteração de 2 vezes em comparação com os controles ou um ou

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95/156 mais valores de referência. De preferência, amostras de plantas com resistência à infecção por um patógeno microbiano exibirão uma alteração de três vezes ou mais em comparação com o valor de referência. Mais preferencialmente, as plantas com resistência à infecção por um patógeno microbiano exibirão uma alteração de 4 vezes ou mais em comparação com o valor de referência. Ou seja, no caso de aumento do nível de expressão (regulação positiva em relação aos valores de referência), o nível de expressão será mais do que o dobro do valor de referência. De preferência, o nível de expressão de uma planta resistente será superior a 3 vezes o nível do valor de referência. Mais preferencialmente, o nível de expressão de uma planta resistente será mais de 4 vezes o nível do valor de referência.

[00148] O nível de expressão de EPF em plantas ou materiais vegetais resistentes pode, opcionalmente, ser 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 126%, 127%, 128%, 129% , 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, opcionalmente na faixa de 150% a 199%, de 200% a 249%, de 250% a 299%, de 300% a 349%, de 350% a 399%, de 400% a 449%, de 450% a 499%, de 500% a 599%, de 600% a 699%, de 700% a 799%, de 800% a 899% ou de 900% a 1000% em relação ao valor

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96/156 de um ou mais valores de controle. Normalmente, um valor de controle será o de uma planta de controle geneticamente equivalente, mas não modificada, ou material equivalente da mesma. Esse valor de controle pode ser adequadamente calculado como um valor médio de várias plantas de controle.

[00149] O patógeno pode ser um patógeno fúngico ou bacteriano. O patógeno pode ser do gênero Puccinia, Pseudomonas, Septoria ou Xanthomonas. O patógeno pode ser Pseudomonas syringae. O patógeno pode ser Puccinia hordei. O patógeno pode ser Zymoseptoria tritici. O patógeno pode ser Xanthomonas oyzae. Neste aspecto da invenção, a planta pode ser uma planta monocotiledônea (por exemplo, Oryza) ou, alternativamente, pode ser uma planta dicotiledônea (por exemplo, Arabídopsís) . De preferência, a planta é uma planta do gênero Hordeum L., Triticum L., Oryza L. ou Zea L, por exemplo, selecionada entre Hordeum vulgare L., Triticum aestivum L., Oryza sativa L. e Zea mays L.

Dispositivos de diagnóstico

[00150] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um dispositivo de diagnóstico para uso na detecção de uma planta com pelo menos resistência microbiana parcial, o dispositivo compreendendo: uma área de carregamento para receber uma amostra biológica; um substrato compreendendo pelo menos um parceiro de ligação específico para uma molécula alvo indicativa da expressão de um polinucleotídeo

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97/156 da SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 14; e qualquer variante percentual da mesma como aqui definida pela identidade de sequência percentual; ou um polipeptideo da SEQ ID NO: 8 e qualquer variante percentual do mesmo, como aqui definido pela identidade da sequência percentual; e meios de detecção para detectar os níveis do referido polinucleotídeo ou polipeptideo presente na amostra. Preferencialmente, o pelo menos um parceiro de ligação compreende iniciadores de ácido nucleico adaptados para hibridizar especificamente com um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 14, ou um fragmento do mesmo em condições rigorosas. De preferência, o pelo menos um parceiro de ligação compreende ainda uma fração fluorescente, por exemplo, um farol molecular.

[00151] Um tal dispositivo pode ser adequadamente um microarranjo ou chip de DNA ou um dispositivo de fluxo e captura. Adequadamente, o dispositivo compreende parceiros de ligação específicos que se ligam seletivamente a uma molécula alvo indicativa da presença ou expressão de um polinucleotídeo, como definido anteriormente. As moléculas alvo podem ser adequadamente moléculas de RNA, moléculas de DNA, moléculas de cDNA ou, alternativamente, proteínas ou polipeptídeos codificados por um polinucleotídeo, como definido anteriormente. Uma variedade de tecnologias apropriadas de captura ou de captura à base de chip ou à base de líquido é bem conhecida na técnica e adequada para

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98/156 a finalidade.

[00152] Adequadamente, pelo menos um parceiro de ligação é selecionado do grupo que consiste em: ácidos nucleicos complementares; aptâmeros; anticorpos ou fragmentos de anticorpos. Classes adequadas de parceiros de ligação para qualquer polinucleotídeo ou proteína serão evidentes para o especialista.

[00153] De preferência, o pelo menos um parceiro de ligação compreende iniciadores de ácido nucleico adaptados para hibridizar especificamente com um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou um fragmento do mesmo sob condições rigorosas.

[00154] Mais preferencialmente, o pelo menos um parceiro de ligação compreende preferencialmente iniciadores de ácido nucleico adaptados para hibridizar especificamente com um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 11 ou um fragmento do mesmo em condições rigorosas.

[00155] O dispositivo é preferencialmente adaptado para detectar e quantificar os níveis dos referidos polinucleotídeos ou proteínas presentes na amostra biológica. Isso pode ser feito com referência a um controle positivo ou, alternativamente, com referência a um padrão interno.

[00156] De preferência, a amostra biológica é um extrato ou lisado de uma planta, célula vegetal, tecido vegetal ou

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99/156 parte da planta, por exemplo tecido foliar homogeneizado. A amostra biológica pode ser adequadamente homogeneizada, processada, tamponada e/ou purificada antes do carregamento no dispositivo.

[00157] Adequadamente, os níveis das moléculas alvo na amostra biológica são detectados por avaliação direta da ligação entre as moléculas alvo e os parceiros de ligação.

[00158] Normalmente, os níveis das moléculas alvo na amostra biológica são detectados usando uma fração repórter ligada a um parceiro de ligação.

[00159] De preferência, a fração repórter é selecionada do grupo que consiste em: fluoróforos; substratos cromogênicos; e enzimas cromogênicas.

[00160] Mais preferencialmente, o pelo menos um parceiro de ligação compreende ainda uma fração fluorescente, por exemplo, um farol molecular.

[00161] Uma aplicação particularmente útil da presente invenção é a capacidade de identificar facilmente plantas resistentes a uma infecção bacteriana, em particular aquelas resistentes à infecção por Pseudomonas, preferencialmente Pseudomonas syríngae.

[00162] Uma aplicação particularmente útil da presente invenção é a capacidade de identificar facilmente plantas resistentes a uma infecção fúngica, em particular aquelas resistentes à infecção por Puccinia, preferencialmente

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Puccinia hordei.

Kits para determinar os níveis de expressão de EPF

[00163] A presente invenção também fornece um kit de peças para determinar seletivamente, em uma amostra, os níveis de expressão de um ou mais dos polinucleotídeos da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 14, e qualquer variante percentual da mesma como aqui definida pela identidade de sequência percentual; ou um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 8; em que o kit compreende: pelo menos um parceiro de ligação que se liga seletivamente a um polinucleotídeo ou polipeptídeo como definido anteriormente, ou um fragmento do mesmo; um controle positivo para a detecção do referido polinucleotídeo ou polipeptídeo; pelo menos um parceiro de ligação que se liga seletivamente a um ácido nucleico ou polipeptídeo que opera como um controle interno; e opcionalmente um padrão interno.

Parceiros de Ligação

[00164] Em certas modalidades da invenção, a existência de pelo menos resistência bacteriana ou fúngica parcial em uma planta pode ser investigada através da determinação da presença ou expressão de um ou mais dos polinucleotídeos da SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 14, e qualquer variante percentual da mesma

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101/156 como aqui definida pela identidade de sequência percentual; ou um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 8; e qualquer variante percentual da mesma, conforme aqui definida pela identidade de sequência percentual. De preferência, a existência de pelo menos resistência bacteriana e/ou fúngica parcial em uma planta pode ser investigada quantificando os níveis de expressão em uma amostra biológica de qualquer uma das moléculas alvo indicativas da expressão de um polinucleotídeo das SEQ ID NOs: 9, 10 , 11, 13 ou 14 ou um polipeptídeo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 8, utilizando parceiros de ligação que se ligam ou hibridizam especificamente às moléculas alvo ou um fragmento das mesmas em condições estritas. Em relação à presente invenção, o termo parceiros de ligação pode incluir quaisquer ligantes, que são capazes de se ligar especificamente à molécula alvo relevante e/ou variantes de nucleotídeo ou peptídeo com alta afinidade. Os referidos ligantes incluem, mas não estão limitados a ácidos nucleicos (DNA ou RNA), proteínas, peptídeos, anticorpos, sondas de afinidade sintética, carboidratos, lipídios, moléculas artificiais ou pequenas moléculas orgânicas, tais como fármacos. Em certas modalidades, pelo menos um parceiro de ligação pode ser selecionado a partir de um ácido nucleico complementar; aptâmero; anticorpo ou fragmento de anticorpo.

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No caso de detecção de mRNAs, os ácidos nucleicos representam parceiros de ligação particularmente adequados.

[00165] No contexto da presente invenção, um parceiro de ligação específico a uma molécula alvo deve ser considerado como exigindo que o parceiro de ligação seja capaz de se ligar ou hibridizar com pelo menos uma dessas moléculas alvo de uma maneira que possa ser distinguida de não ligação específica a moléculas que não são moléculas alvo. Uma distinção adequada pode, por exemplo, basear-se em diferenças distinguíveis na magnitude ou afinidade de tal ligação.

[00166] Em modalidades preferidas dos métodos ou dispositivos da invenção, a molécula alvo é um ácido nucleico, preferencialmente uma molécula de mRNA, e o pelo menos um parceiro de ligação é um ácido nucleico ou aptâmero complementar.

[00167] Adequadamente, o parceiro de ligação é uma molécula de ácido nucleico (tipicamente DNA, mas pode ser RNA) tendo uma sequência que é complementar à sequência do mRNA ou cDNA contra o qual é direcionada. Tal ácido nucleico é frequentemente referido como uma sonda (ou um repórter ou um oligo) e a sequência complementar à qual ele se liga é frequentemente referida como o alvo. A hibridização alvosonda é geralmente detectada e quantificada pela detecção de alvos marcados com fluoróforo, prata ou quimioluminescência

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103/156 para determinar a abundância relativa de sequências de ácidos nucleicos na amostra.

[00168] As sondas podem ter de 25 a 1000 nucleotídeos de comprimento. No entanto, são preferidos comprimentos de 30 a 100 nucleotídeos, e sondas com cerca de 50 nucleotídeos de comprimento são mais comumente usadas com sucesso em análises transcriptômicas e genômicas.

[00169] Embora a determinação de sondas adequadas possa ser difícil, por exemplo em matrizes muito complexas, existem muitas fontes comerciais de matrizes completas de transcriptoma disponíveis, e é rotina desenvolver matrizes sob medida para detectar qualquer conjunto específico de mRNAs ou DNAs usando informações de sequência disponíveis publicamente. Fontes comerciais de microarranjos para análise de transcriptoma incluem Illumina e Affymetrix e para análise de captura de exoma incluem NimbleGen e MYcroarray e para análise de genoma incluem Affymetrix, matrizes de baixa e alta densidade.

[00170] Onde as moléculas alvo a serem detectadas são polinucleotídeos, por exemplo, polinucleotídeos da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14, e qualquer variante percentual dos mesmos aqui definido pela identidade de sequência percentual; as sequências de sonda podem ser projetadas para qualquer região de sequência do transcrito de cDNA ou um

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104/156 fragmento ou variante do mesmo. O especialista na técnica compreenderá que sondas igualmente eficazes podem ser projetadas para várias regiões diferentes da transcrição e que a eficácia das sondas particulares escolhidas variará, entre outras coisas, de acordo com a plataforma usada para medir a abundância da transcrição e as condições de hibridização empregadas. Deverá, portanto, entender-se que sondas direcionadas a diferentes regiões do transcrito também podem ser usadas de acordo com a presente invenção. De preferência, a molécula alvo a ser detectada é um polinucleotídeo das SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 14, ou um fragmento ou variante do mesmo e sondas que são capazes de se ligar especificamente ao polinucleotídeo sob condições rigorosas pode ser projetado de acordo.

[00171] Em outras modalidades adequadas da invenção, a molécula alvo pode ser uma proteína e o pelo menos um parceiro de ligação selecionado a partir de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou um aptâmero.

[00172] Onde a molécula alvo é um polipeptideo, os anticorpos podem ser projetados para qualquer região de sequência da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8 ou um fragmento ou variante da mesma.

[00173] Os polinucleotídeos que codificam qualquer um dos parceiros de ligação específicos das moléculas alvo da

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105/156 invenção citada acima podem ser moléculas de ácido nucleico isoladas e/ou purificadas e podem ser moléculas de RNA ou DNA.

[00174] Geralmente, as sequências polipeptídicas e polinucleotídeos utilizados como parceiros de ligação na presente invenção podem ser isolados ou purificados. Por purificado significa que eles são substancialmente livres de outros componentes ou materiais celulares, ou meio de cultura. Isolado significa que eles também podem estar livres de sequências que ocorrem naturalmente que flanqueiam a sequência nativa, por exemplo, no caso de molécula de ácido nucleico, isolada pode significar que está livre de sequências reguladoras 5' e 3'.

[00175] Geralmente, sequências polipeptídicas e polinucleotídeos podem ser utilizados como parceiros de ligação nos tecidos vivos. Estas sequências polipeptídicas e polinucleotídeos podem ser parceiros expressos que são marcados com diferentes proteínas fluorescentes, por exemplo, proteína Cerulean e proteína Vênus. As proteínas marcadas são frequentemente usadas como um par doadoraceitador por pesquisadores dos estudos de co-localização baseados em Transferência de Energia de Ressonância de Forster (FRET) para monitorar interações proteicas.

[00176] Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico é o mRNA. Existem numerosas técnicas adequadas conhecidas na

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106/156 técnica para a medição quantitativa dos níveis de transcrito de mRNA em uma determinada amostra biológica. Essas técnicas incluem, mas não estão limitadas a; Northern RNA blotting, Reação em cadeia da polimerase em tempo real (RTPCR), Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), PCR digital (dPCR), PCR multiplex, Reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR), amplificação de sinal de DNA ramificado ou por análise de alto rendimento, como microarranjo de hibridização, Next Generation Sequencing (NGS) ou quantificação direta de mRNA, por exemplo, por sequenciamento Nanopore. Em alternativa, podem ser utilizadas tecnologias baseadas em etiquetas, as quais incluem, entre outras, a Análise Serial de Expressão Genética (SAGE). Geralmente, os níveis de transcrito do mRNA da molécula alvo em uma determinada amostra biológica pode ser determinado por hibridização com sondas complementares de nucleotídeos específicas em um microarranjo ou chip de hibridização, pela tecnologia Bead Array Microarray ou pelo RNA-Seq, em que os dados de sequência são comparados a um genoma de referência ou sequências de referência.

[00177] Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece um método para identificar se uma planta tem resistência a uma infecção bacteriana ou fúngica compreendendo detectar em uma amostra da planta a presença ou nível de expressão de um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 9,

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SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO: 11, ou o nível de expressão de urn polinucleotideo codificado pela SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14, e qualquer variante percentual do mesmo, conforme aqui definido pela identidade de sequência percentual; ou um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 8; e qualquer variante percentual da mesma, conforme aqui definida pela identidade de sequência percentual.

[00178] De preferência, o método para identificar se uma planta tem resistência a uma infecção bacteriana compreende detectar em uma amostra da planta o nível de expressão de: um polinucleotideo da SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11. O nível de expressão de um polinucleotideo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 13 ou 14 pode ser determinado rapidamente por PCR, por exemplo, qPCR, dPCR, RTPCR ou PCR multiplex. Preferencialmente, a abundância de transcrito de mRNA gerado pela SEQ ID NO: 14 ou um fragmento ou variante do mesmo será quantificada (por exemplo, SEQ ID NO: 9).

[00179] O especialista na técnica apreciará que os iniciadores de nucleotídeo eficazes podem ser projetados para qualquer região de sequência de um polinucleotideo da SEQ ID NO: 14 ou um fragmento ou variante do mesmo ou uma região do transcrito gerada a partir da expressão da SEQ ID NO: 14, e que a eficácia dos iniciadores específicos

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108/156 escolhidos variará, entre outras coisas, de acordo com a plataforma usada para medir a abundância de transcritos, a amostra biológica e as condições de hibridização empregadas. Embora seja apreciado que, em princípio, os iniciadores direcionados a qualquer região do transcrito possam ser utilizados de acordo com a presente invenção, o especialista na técnica reconhecerá que, ao projetar sequências iniciadoras apropriadas para detectar a expressão de polinucleotídeo, é necessário que as sequências iniciadoras são capazes de se ligar seletiva e especificamente à sequência de cDNA da SEQ ID NO: 11 ou a um fragmento ou variante da mesma (por exemplo, SEQ ID NO: 10) .

[00180] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um kit de peças para determinar seletivamente, em uma amostra, os níveis de expressão de um ou mais dos polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 9 a 16, em que o kit compreende:

a. pelo menos um parceiro de ligação que se liga seletivamente a um polinucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9 a 16, ou um fragmento do mesmo;

b. um controle positivo para a detecção do referido polinucleotídeo;

c. pelo menos um parceiro de ligação que se liga seletivamente a um ácido nucleico que opera como um controle interno; e

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d. opcionalmente um padrão interno.

[00181] Adequadamente, o dispositivo compreende parceiros de ligação específicos aos polinucleotídeos que estão sendo amplificados. Os parceiros de ligação são preferencialmente iniciadores de ácido nucleico adaptados para se ligar ou hibridizar especificamente com o polinucleotídeo das SEQ ID NOs: 9 a 16. Serão fornecidos preferencialmente iniciadores que tenham como alvo específico um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 14 ou um fragmento da mesma.

[00182] Uma variedade de tecnologias baseadas em amplificação por POR adequadas é bem conhecida na técnica. As aplicações de POR são rotineiras na técnica e o especialista poderá selecionar polimerases apropriadas, tampões, controles positivos, padrões internos, porções repórteres e condições de reação, conforme desejado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00183] A invenção será agora descrita em detalhes com referência a exemplos e com referência aos desenhos anexos, nos quais:

[00184] A Figura 1 mostra que a HvEPFl compartilha a similaridade de sequência com Arabidopsis EPF1 e EPF2 e pode restringir o desenvolvimento estomático de Arabidopsis. (a) Alinhamento do peptídeo de sinalização maduro HvEPFl putativo com membros da família de Arabidopsis EPF de

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110/156 peptídeos de sinalização. Os resíduos de cisteína conservados são destacados. As sequências de aminoácidos para a região peptídica madura foram alinhadas usando Multalin e exibidas usando Boxshade, (b) A superexpressão de HvEPFl sob o controle do promotor CaMV35S em Arabídopsís leva a uma diminuição significativa na densidade estomática. (c) Traçados epidérmicos dos cotilédones de Arabídopsís que superexpressam EPF1, EPF2 e HvEPFl ao lado do controle de fundo Col-0. Pontos vermelhos marcam a localização dos estômatos, enquanto pontos verdes marcam a localização dos meristemóides presos. N = 5 plantas, asteriscos indicam P < 0,05 (teste de Dunnett após ANOVA unidirecional). Barras de erro representam SE.

[00185] A Figura 2 mostra a superexpressão de HvEPFl no desenvolvimento estomático de paradas de cevada e reduz a densidade estomática. (a) A densidade estomacal abaxial (SD) de plantas de cevada transformadas em HvEPFl ectopicamente superexpressão (barras cinza) em comparação com linhagens de controle transformadas com o vetor vazio (barras pretas). Todas as linhagens de superexpressão de HvEPFl da geração TI demonstraram uma redução significativa no DP em comparação com as duas linhagens de controle. As linhagens escolhidas para fenotipagem adicional nas gerações T2 são indicadas (asteriscos) (b) Impressões epidérmicas abaxiais traçadas do controle de geração Tl, linhagens HvEPFlOE- (47%) e HvEPFlOE

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111/156 (0,6%) ilustrando a redução no DP. Pontos vermelhos indicam posições de complexos estomáticos. (c) Micrografias epidérmicas abaxiais de plantas de HvEPFlOE. A seta preta indica célula precursora estomática presa. N = 4-8 plantas (teste de comparações múltiplas de Tukey após ANOVA de uma via). Barras de erro representam SE.

[00186] A Figura 3 mostra as características estomáticas das plantas de cevada que superexpressam o HvEPFl. (a) As densidades estomáticas abaxiais de HvEPFl que superexpressam as linhagens de cevada T2 que abrigam uma única cópia do transgene são significativamente diminuídas. HvEPF10E-l (barras brancas) e HvEPF10E-2 (barras cinza) em comparação com as linhagens de controle (barras pretas). (b) O comprimento da célula de guarda diminuiu significativamente em ambas as linhagens de HvEPFlOE. (c) A densidade das células do pavimento é semelhante à do controle em ambas as linhagens de HvEPFlOE. (d) O índice estomático diminuiu significativamente em ambas as linhagens de HvEPFlOE. (e) O índice de linhagem estomática (a proporção de estômatos e células precursoras estomáticas paradas e o número total de células epidérmicas) diminui significativamente em ambas as linhagens de HvEPFlOE. N = 5 plantas, asteriscos indicam P < 0,05 (teste de Dunnett após ANOVA unidirecional) . Barras de erro representam SE.

[00187] A Figura 4 mostra a estrutura celular dos complexos

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112/156 estomáticos de HvEPFlOE. (a) Imagem confocal representada por iodeto de propídio representativa de um plano Z abaixo da superfície epidérmica abaxial de HvEPF10E-l. Asteriscos amarelos marcam a localização da cavidade substomatal sob células protetoras maduras, (b) Imagem superior do plano Z do mesmo campo de visão que (a) para revelar a posição dos estômatos. Asteriscos brancos marcam a localização de precursores estomáticos presos e a falta de cavidades substomatais subjacentes em (a).

[00188] A Figura 5 mostra que a redução da densidade estomática da cevada aumenta a tolerância à seca, preservando o conteúdo de água do solo e da planta, (a) As plantas de cevada HvEPFlOE-Ι e HvEPF10E-2 com 5 semanas de idade mantêm um teor de água no solo significativamente maior em comparação com as plantas de controle guando a água é retida nos dias 2 a 14. (b) As linhagens HvEPFlOE-Ι e HvEPF10E-2 mostram rendimentos quânticos adaptados à luz significativamente mais altos (ΦΡ3ΙΙ) de 10 a 14 dias após a retenção da água (símbolos quadrados; plantas da mesma experiência que (a)). Não houve diferenças significativas entre ΦΡ3ΙΙ de plantas cavidades umedecidas (símbolos circulares) . (c) O conteúdo relativo de água (RWC) das folhas de cevada das linhagens de HvEPFlOE foi significativamente maior do que os controles após 6 dias sem rega. Não houve diferenças na RWC entre plantas cavidades umedecidas. (d)

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Fotografia de plantas representativas para ilustrar a manutenção aprimorada do turgor em HvEPF10E-l e HvEPF10E-2 no dia 6 de condições de retenção de água. N = 5 plantas, o asterisco indica significância para pelo menos P < 0,05 (testes de Dunnett após ANOVA unidirecional para cada grupo de rega). Barras de erro representam SE.

[00189] A Figura 6 mostra que a redução da densidade estomática da cevada diminui a condutância estomática e aumenta a eficiência do uso da água. (a) Sob condições cavidades umedecidas, foi observada uma diminuição significativa na taxa de assimilação de carbono em ambas as linhagens de HvEPFlOE. Sob condições de restrição de água, não houve diferença na assimilação. (b) A condutância estomática (gs) diminuiu significativamente nas linhagens de HvEPFlOE cultivadas em condições de boa hidratação em comparação com os controles. Sob condições de restrição de água, não houve diferença em gs. (c) Sob condições cavidades umedecidas, foi observada uma melhora significativa na eficiência do uso intrínseco da água (iWUE) na linhagem HvEPF10E-2 quando comparada às plantas de controle. Sob condições de restrição de água, não houve diferença no iWUE. (d) A discriminação de isótopos de carbono revelou uma melhoria significativa na eficiência do uso da água da linhagem de cevada HvEPF10E-2 em condições de boa hidratação. Sob condições de restrição de água, ambas as linhagens de

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HvEPFlOE exibiram uma melhora significativa na eficiência do uso de água em comparação aos controles. N = 5 plantas, o asterisco indica significância para pelo menos P < 0,05 (testes de Dunnett após ANOVA unidirecional para cada grupo de rega). Barras de erro representam SE.

[00190] A Figura 7 mostra que a redução da densidade estomática na cevada não tem efeito prejudicial no rendimento. Não foram observadas diferenças significativas em (a) número de sementes, (b) peso total de sementes por planta, (c) peso médio de sementes individuais, (d) índice de colheita (a razão entre o rendimento e a biomassa total da parte aérea) entre HvEPF10E-l , HvEPF10E-2 e plantas de controle sob qualquer condição de rega. N = 5 plantas. Barras de erro representam SE.

[00191] A Figura 8 mostra um alinhamento de cDNAs EPF1/2 previstos de Arabidopsis thaliana (At), Triticum aestivum (Ta), Oryza sativa (Os,), Hordeum vulgarum (Hv) e Zea mays (Zm) (Painel A) . A sequência peptídica ativa é indicada (caixa sombreada).

[00192] O painel B mostra um alinhamento de proteínas deduzidas do tipo EPF1/2 de Arabidopsis thaliana (At), Triticum aestivum (Ta), Oryza sativa (Os), Hordeum vulgarum (Hv) e Zea mays (Zm) . Os resíduos de cisteína exclusivos para EPFs que alteram a densidade estomática são indicados com um asterisco. A região conservada (ativa) é indicada

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115/156 (caixa sombreada).

[00193] A Figura 9-3 mostra a árvore filogenética das sequências peptidicas previstas do fator de padrão epidérmico de Arabidopsis e de cevada construídas usando Multalin. Anotações de cevada tiradas de Ensembl Plants. HvEPFl é destacado em vermelho.

[00194] A Figura 9-5 mostra que o crescimento de plantas de cevada é inibido pelas condições restritas à água utilizadas neste estudo (teor de água do solo de 25%) em comparação com o crescimento em condições de boa hidratação (60% de água do solo). Da esquerda para a direita: planta de controle cavidades umedecida, água com controle restrito, HvEPF10E-l bem com água, HvEPF10E-l com água, HvEPF10E-l com água, HvEPF10E-2 bem com água e HvEPF10E-2 com água.

[00195] A Figura 9-6 mostra as alturas dos controles da planta e HvEPF10E-3 ou HvEPFlOE-4 não foram significativamente diferentes nas condições de boa hidratação ou de restrição de água. Barras de erro representam SE.

[00196] A Figura 9-7 mostra a biomassa acima do solo do controle e as linhagens de plantas HvEPFlOE-3 ou HvEPF10E-4 não foram significativamente diferentes sob condições de boa hidratação ou com restrição de água. N = 5 plantas. Barras de erro representam SE.

[00197] A Figura 9-1 mostra o esquema da construção de

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116/156 expressão gênica inserida no genoma da cevada para superexpressar o gene HvEPFl.

[00198] A Figura 9-2 mostra os resultados de qPCR confirmando a superexpressão significativa de HvEPFl nas linhagens de cevada. N = 5 plantas, o asterisco indica significância para pelo menos P < 0,05 (testes de Dunnett após ANOVA unidirecional). Barras de erro representam SE.

[00199] A Figura 9-4 mostra um alinhamento de proteínas HvEPFl e HvEPF2 com Atlg34245, Atlg71866 e At2g20875.

[00200] A Figura 10 mostra Arabídopsís manipulado para reduzir a densidade estomática e aumentar a resistência ao patógeno. Painel A: Níveis de infecção de plantas de Arabidopsis com densidade estomática reduzida ou aumentada após inoculação por pulverização com Pseudomonas syríngae (PstDC3000); crescimento medido 24 horas após a inoculação; * p < 0,05. Painel B:

[00201] As plantas de Arabídopsís com densidade estomática alterada não apresentam resistência alterada à infecção quando a seringa se infiltrou para superar qualquer limitação estomática.

[00202] A Figura 11 mostra densidade estomática reduzida e superexpressão de EPF em Arroz. O painel A mostra que a densidade estomática é reduzida no arroz transformado com OsEPF2 no vetor pSC310. As letras indicam que as linhagens de superexpressão do EPF2 são estatisticamente

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117/156 significativas do tipo selvagem na primeira folha. 0 painel B mostra a expressão de qPCR mostrando a superexpressão do gene OsEPF2 aos 8 dias de idade em duas linhagens transgênicas.

[00203] A Figura 12 mostra infecção reduzida por ferrugem marrom em linhagens de cevada com densidade estomática reduzida. As linhagens HvEPFlOEl e HvE0PF10E3 foram infectadas com esporos de Puccinia hordei e mostraram uma redução significativa (p < 0,01 pelo teste t: teste) na infecção, medida pelo número de pústulas. Diferenças significativas indicadas por *. n = 6 plantas.

[00204] A Figura 13 mostra que o HvEPFl pode agir para impedir a maturação das células-mãe de guarda e a subsequente cavidade substomatal e a formação de células subsidiárias. Esquema para ilustrar o modo de ação putativo da HvEPFl no desenvolvimento estomático da cevada. Da esquerda para a direita: células epidérmicas indiferenciadas na base das folhas são formadas em arquivos celulares. As células de alguns arquivos ganham a capacidade de se dividir assimetricamente para criar pequenas células precursoras estomáticas mostradas aqui como células-mãe de guarda imaturas (GMC, verde). Uma etapa de desenvolvimento, potencialmente sob o controle do fator de transcrição MUTE, estimula a maturação das células-mãe de guarda (verde escuro) e a divisão das células epidérmicas adjacentes para formar

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118/156 células subsidiárias (SC, laranja). Os GMC maduros dividemse simetricamente para formar pares de células de guarda em forma de haltere (vermelho). Na camada subjacente do mesofilo (M, regiões sombreadas a verde), uma cavidade substomatal se forma durante o GMC maduro ou o estágio da célula de guarda, embora o estágio de desenvolvimento exato desse processo seja desconhecido. Nas plantas com superexpressão de HvEPFl, o HvEPFl impede a maturação do GMC talvez através da supressão da atividade MUTE, resultando em GMCs presos que são incapazes de se diferenciar ainda mais ou formar células subsidiárias, células protetoras ou cavidades substomatais. Desenhado com referência ao desenvolvimento de Brachypodium em Raissig et ai. 2016.

Exemplos

Exemplo 1: Identificação do gene EPF1 em monocoti1edônea s

[00205] Os inventores conseguiram identificar um ortólogo de EPF putativo no genoma da cevada (HvEPFl, MLOC_67484). O HvEPFl é expresso em níveis baixos durante o desenvolvimento de tecidos aéreos (IBSC 2012. International Barley Genome Sequencing Consortium: Nature Publishing Group. 711-716). A função deste ortólogo em gramineas era desconhecida até agora.

Exemplo 2: Construção do Vetor

[00206] O gene genômico do HvEPFl foi amplificado por PCR

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119/156 a partir do cultivar Hordeum vulgare Golden Promise (semente de Robbie Waugh, Instituto James Hutton, Invergowrie, Dundee DD2 5DA, Escócia, Reino Unido, 2013) DNA usando os iniciadores da Tabela 1. 0 gene HVEPF1 é anotado como MLOC67484 no Ensembl Plants (http://plants.ensembl.org/index.html), mas está traduzido incorretamente nesta previsão. Utilizamos o FGENESH (http://www.softberry.com/) para gerar uma tradução alternativa que inclui uma sequência de sinal putativa no terminal N. 0 produto de PCR foi recombinado pENTR/D/TOPO e depois por recombinação de LR no vetor de transformação pCTAPi (Rohila et al., 2004, Plant J 38: 172-181) sob o controle do promotor CaMV35S e introduzido em Arabídopsís thaláana Col-0 antecedente (código de ações NASC N6673, obtido 2001) por mergulho floral (Clough & Bent, 1998, Plant J 16: 7 35-743) . A transformação e a expressão do transgene foram confirmadas por PCR e RT-PCR utilizando os iniciadores (mostrados na Tabela 1) da SEQ ID NO. 17 e SEQ ID NO.18 para confirmação do gene da higromicina, e SEQ ID NO.23 e SEQ ID NO.24 para RT-PCR para medir níveis de cDNA de HVEPF1.

Gene	Para frente	Reverso
Higromicina	ACTCACCGCGACGTCTG (SEQ ID NO.17)	GCGCGTCTGCTGCTCCATA (SEQ ID NO.18)
Hv GAPDH	GT G AGG CT GGT GC T GAT T (SEQ ID NO.19)	CGTGGTGCAGCTAGCATTTGAGAC (SEQ ID NO.20)

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Hv Tubulina	AGTGTCCTGTCCACCCACTC (SEQ ID NO.21)	AGCAT GAAGT G GAT CC T T GG (SEQ ID NO.22)
HvEPFl (qPCR)	GTGGAGGAGAAGAAGGAT GG (SEQ ID NO.23)	ATGGAGCACTTGAAGCTGAC (SEQ ID NO.24)
HvEPFl (construção vetorial)	CACCATGAAGAGGCACGGTCTT (SEQ ID NO.25)	CTAGCTGGAGGGGACGGGGT (SEQ ID NO.26)

[00207] Tabela 1. Sequências de iniciadores usadas para

PCR e RT-qPCR detalhadas na seção de métodos do manuscrito.

Amostra	Cópias_HYg
lllllgggglIiB	\|\|\|\|\|gggggg\|\|gggggggp]§ggggggggggggggggi^
S10	5
Sll	5
S22	2
S25	2
S9	2
S2	2
S12	1
ggggggggie
S4	1
IgggggggglB
gggggggglB

[00208] Tabela 2. Dados do número de cópias genéticas para todas as linhagens geradas. As células sombreadas indicam as linhagens de plantas transformadas usadas neste estudo.

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[00209] Para a transformação da cevada, o gene genômico HvEPFl foi introduzido por recombinação de LR no vetor gateway pBRACT214 sob o controle do promotor de ubiquitina de milho, adjacente a um gene de resistência à higromicina sob o controle de um promotor de CaMV35S (Fig. 9-4) . As transformações de cevada foram realizadas no antecedente Golden Promise (semente de Robbie Waugh, Instituto James Hutton, Invergowrie, Dundee DD2 5DA, Escócia, Reino Unido, 2013) usando o método descrito por Harwood et al. (Harwood et al., 2009, Methods Mol Biol 478: 137-147). As plantas que abrigavam apenas o cassete de resistência à higromicina foram regeneradas ao lado para produzir plantas de 'controle de vetor vazio'. Plantas potencialmente transformadas foram regeneradas em meio seletivo e indivíduos T0 genotipados para confirmar a inserção gênica por PCR. O número de cópias de genes foi estimado pela IDna Genetics Ltd (www.idnagenetics.com) usando um método baseado em PCR. A superexpressão de HvEPFl foi confirmada por RT-qPCR de plantas de geração em T2 (Fig. 9-6). O RNA total foi extraído de mudas de 10 dias de idade usando o kit de RNA total da planta Spectrum (Sigma, UK) e transcrito reversamente usando o kit de síntese de cDNA Maxima H Minus Transcriptase Reversa (Thermo Scientific). O RT-qPCR foi realizado usando um kit Rotor-Gene SYBR® Green PCR (Qiagen) com tubulina e GADPH usado como genes de referência para manutenção, com

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122/156 iniciadores de SEQ. ID NO. 19 a 22 na Tabela 1. Três plantas de cada linhagem transformada foram amplificadas para confirmar a superexpressão do gene HvEPFl. Os valores de indução de dobra da expressão gênica foram normalizados para valores médios de 2acp em relação às amostras de controle do vetor vazio.

Exemplo 3: Condições de Crescimento Vegetal

[00210] Para o crescimento das plantas, as sementes foram esterilizadas em superfície a 50% vol/vol de etanol/alvejante antes de serem colocadas em papel de filtro saturado com água e colocadas em placas de Petri seladas na câmara de crescimento apropriada. As plantas de Arabidopsis foram cultivadas em uma câmara de crescimento controlado (modelo Conviron MTPS120) a 22 °C/16 °C, 9 horas de luz, 150-200 pmol m-2 s-i, 15 horas de escuridão, ambiente [CO2] e 60% de umidade. As plantas de Arabidopsis foram mantidas cavidades umedecidas por toda parte. As plantas de cevada foram cultivadas em uma câmara de crescimento MTPS120 a 21 °C/15 °C, 11 horas de luz a 300 pmol.m-2.si, 13 horas de escuridão, [CO2] ambiente e 60% de umidade. Para plantas cultivadas em casa de vegetação, a temperatura foi definida em 20 °C/16 °C, 12 horas de luz, umidade ambiente e iluminação suplementar garantiram um mínimo de 200 pmol m-2 s-i no nível da bancada.

[00211] Cinco dias após a germinação, mudas individuais de

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123/156 cevada foram colocadas em vasos de 13 cm de diâmetro contendo composto/perlita M3 homogeneizada (4:1) com a adição de Osmocote. Para fenotipagem inicial e medições fisiológicas (Fig. 2), as plantas 'cavidades umedecidas' foram mantidas em 60% da saturação do solo por pesagem diária de vasos. As plantas 'com restrição de água' (relatadas nas Fig.2d, Fig.6 e Fig.7) foram mantidas em 25% da saturação máxima do solo.

Exemplo 4: Microscopia e contagem de células

[00212] Para Arabídopsís e cevada, as contagens de células estomáticas e epidérmicas foram obtidas da superfície abaxial de folhas maduras e totalmente expandidas ou cotilédones. As contagens de células foram obtidas da seção mais larga da primeira folha verdadeira, evitando a veia média. A resina dental (Coltene Whaledent, Suíça) foi aplicada na região de largura máxima da folha e deixada repousar antes de remover a folha e aplicar verniz transparente na resina. As contagens estomáticas foram determinadas a partir de impressões de verniz das unhas por microscopia ótica (Olympus BX51). Foram amostradas 5 áreas por folha de 4 a 8 plantas de cada genótipo e tratamento. Para imagens epidérmicas (Fig. 2b-d), folhas maduras foram excisadas e a veia central da folha cortada. O tecido das folhas foi então desidratado em série em etanol. As amostras foram então colocadas na solução de Clarke modificada (solução 4: 1 de etanol para ácido acético glacial) e depois

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124/156 eliminadas em alvejante a 50% durante a noite.

[00213] Para a fenotipagem epidérmica, a segunda folha madura totalmente expandida foi cortada e uma faixa de 3 a 5 cm a meio caminho ao longo do eixo próximo-distal dessas folhas foi cortada. Essas amostras de folhas foram submersas na solução de Clarke (etanol 3:1 em solução de ácido acético glacial) . Após 1 hora de infiltração a vácuo, as amostras foram deixadas na solução de Clarke por 24 horas para fixação. Uma vez fixadas, as amostras foram transferidas para etanol a 100%. Antes da criação de imagens, as amostras de folhas foram limpas em solução de alvejante a 50% durante a noite. O meio diafragma de cada amostra foi então excisado e as seções restantes das folhas montadas em água deionizada em lâminas de microscópio para geração de imagens. As amostras foram visualizadas por microscopia ótica (Olympus BX51) usando a funcionalidade de contraste de interferência diferencial. Para microscopia confocal (Fig. 4a, Fig. 4b), amostras de cevada foram preparadas conforme descrito (Wuyts et ai., 2010, Plant Methods 6: 1-14) e visualizadas em um Olympus FV1000 usando o objetivo 20X UPlan S-Apo NA 0,75, Laser de 543nm, emissão de 555-655nm e software Fluorview.

Exemplo 5: Medições fisiológicas

[00214] Um sistema portátil de fotossíntese LI-6400 (Licor, Lincoln, NE) foi usado para realizar análise de gás infravermelho (IRGA) em folhas maduras, totalmente

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125/156 expandidas, que ainda estavam ligadas à planta. A umidade relativa do ar dentro da câmara do IRGA foi mantida em 60% -65% usando dessecante auto indicativo, a taxa de fluxo foi ajustada em 300 pmol.s-i e a temperatura da folha a 20 °C. A referência [CO2] foi mantida em 500 ppm e a intensidade da luz em 200 pmol.m-2.si. As plantas foram deixadas equilibrar por 40 a 45 minutos, com a câmara IRGA sendo correspondida pelo menos a cada 15 minutos. Quando as leituras eram estáveis, as medições eram realizadas a cada 20 segundos, por 5 minutos. Para os cálculos do teor de água no solo, determinou-se primeiro o peso de vasos contendo água saturada (100% de teor de água) ou mistura de composto seco no forno (0%). Os vasos foram mantidos com um teor de água no solo de 60% ou 25% por pesagem e adição da quantidade apropriada de água a cada dois dias.

[00215] Depois que as plantas amadureceram e secaram, as plantas foram colhidas, com o número total e o peso de sementes por planta sendo registrados e o peso médio das sementes sendo calculado. Todo o tecido vegetative acima do solo foi seco em estufa a 80°C por dois dias e depois pesado para fornecer o peso seco. O índice de colheita (razão de rendimento em relação à biomassa acima do solo) foi então calculado. Durante todo o experimento de seca terminal, o rendimento quântico adaptado à luz do fotossistema II (ΦΡ3ΙΙ) foi medido diariamente para plantas cavidades umedecidas e

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126/156 retidas em água. A folha totalmente expandida mais recente do perfilho primário foi selecionada para a medição no dia 1 e a mesma folha foi monitorada ao longo do experimento. As leituras foram feitas usando um FluorPen FP100 (Photon Systems Instruments). Após o inicio do tratamento da seca, os vasos foram pesados todos os dias e usados para calcular a porcentagem do conteúdo inicial de água no solo restante. Os controles bem regados foram mantidos com 60% de água no solo.

[00216] O teor de água relativo das folhas foi determinado a partir de folhas excisadas de boa hidratação ou seca e o seu peso fresco medido imediatamente e as folhas flutuaram na água durante a noite e pesadas para registrar o peso hidratado. Eles foram secos no forno durante a noite e pesados para obter seu peso seco; o RWC foi calculado usando a seguinte fórmula RWC (%) = (peso fresco-peso seco) / (peso hidratado-peso seco) * 100.

[00217] Para discriminação de isótopos de carbono (Fig. 6d) , 513C foi avaliado a partir da folha de bandeira de 5 plantas de cada um dos dois regimes de rega (cavidades umedecida e regada), conforme descrito anteriormente (Hepworth et ai., 2015, New Phytologist 208: 336-341).

Exemplo 6: Análise Estatística

[00218] Todas as comparações foram realizadas no software Graph Pad Prism. Os testes post-hoc apropriados foram

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127/156 realizados quando a significância foi confirmada usando um teste ANOVA e um nível alfa de 0,05 ou menos como significativo.

Exemplo 7: Resultados

[00219] 11 genes que codificam peptídeos segregados do tipo EPF putativos foram identificados na sequência do genoma da cevada (IBSC, 2012) (Fig. 9-1) . O MLOC67484 ao qual nos referimos aqui como HvEPFl codifica um peptídeo com extensa semelhança com os fatores de padronização epidérmica de Arabidopsis e contém os 6 resíduos de cisteína conservados (Fig. Ia) que são característicos dos fatores de padronização epidérmica de Arabidopsis (Ohki et al., 2011, Nature Communications 2: 512; Lau & Bergmann, 2012, Development 139: 3683-3692). A análise filogenética da sequência peptídica madura codificada indicou que dentro da família EPF de Arabidopsis, o HvEPFl está mais intimamente relacionado com os inibidores conhecidos do desenvolvimento estomático EPF1 e EPF2, cada um contendo dois resíduos de cisteína adicionais (Fig. 9-1). Para confirmar que esse gene do peptídeo de cevada podería funcionar na regulação estomática, o HvEPFl foi ectopicamente superexpresso em Arabidopsis sob o controle do promotor CaMV35S. A análise do padrão celular na epiderme de plantas de Arabidopsis que superexpressam o HvEPFl confirmou que o desenvolvimento estomático havia sido interrompido; um fenótipo semelhante

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128/156 ao observado na superexpressão de Arabidopsis EPF1, ou seja, uma diminuição significativa na densidade estomática foliar (Fig. 1b) e um número aumentado de meristemóides presos (Fig. 1c) (Hara et al. , 2007, Genes & Development 21: 1720-1725; Hara et al., 2009, Cell Cell Physiol 50: 1019-1031; Hunt & Gray, 2009, Curr Biol 19: 864-869). Em seguida, as plantas de cevada superexpressam ectopicamente o fator de padronização epidérmica HvEPFl sob o controle de um promotor do gene da ubiquitina. A densidade estomática (DP) foi avaliada a partir de 13 linhagens transgênicas de HvEPFlOE na geração TI em condições de sala de crescimento. As primeiras folhas das plantas com mudas apresentaram DP variando de aproximadamente 70% a < 1% do valor das plantas controle (transformadas com o vetor vazio) (Fig. 2a). Duas linhagens foram selecionadas para fenotipagem adicional: HvEPFlOE- (47%) e HvEPFlOE- (0,6%), que exibiram aproximadamente 47% e 0, 6% do DP dos controles, respectivamente. O SD foliar significativamente reduzido foi observado nas impressões epidérmicas abaxiais (Fig. 2b) e manchas incomuns da epiderme com ausência de estornas foram observadas nas folhas de HvEPFlO E (0,6%). Além disso, células precursoras estomáticas paradas foram frequentemente observadas na epiderme madura, totalmente expandida, extremamente rara nos controles (seta preta na Fig. 2c) .

[00220] Para análise fisiológica mais detalhada, foram

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129/156 isoladas linhagens de cevada de homozigotos contendo uma única cópia do transgene (Tabela 1) (referidas como HvEPFlOE1 e HvEPFlOE-2 e indicadas pelos asteriscos pretos esquerdo e direito na Fig. 2a, respectivamente). As plantas de geração T2 foram cultivadas em condições de câmara controlada e o SD abaxial da segunda folha verdadeira foi significativamente reduzido em aproximadamente 52% e 56% dos controles para HvEPFOE-1 e HvEPFOE-2, respectivamente (Fig. 3a). Além disso, os estômatos que se formaram eram menores; o comprimento da célula de guarda foi reduzido significativamente em ambas as linhagens de HvEPFlOE (Fig. 3b). Também observamos um pequeno aumento na densidade das células do pavimento epidérmico, talvez devido aos estômatos menores e menos frequentes, no entanto, isso não foi significativo (Fig. 3c) . Essas diferenças nas densidades celulares combinaram-se para produzir grandes reduções no índice estomático (SI; densidade estomática como uma porcentagem de todas as células na epiderme) . 0 SI das plantas de HvEPFlOE foi reduzido para aproximadamente 50% dos valores de controle (Fig. 3d). Novamente, observamos um aumento significativo no número de células precursoras estomáticas paradas nas folhas de cevada HvEPFlOE (como mostrado na Figura 2). Para calcular se o número de células precursoras estomáticas bloqueadas podería explicar inteiramente as reduções observadas no DP, calculamos o

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130/156 'índice de células da linhagem estomática' (a porcentagem de estornas e células da linhagem estomática interrompida em comparação com todas as células da epiderme). Isso indicou que, se todas as células precursoras estomáticas paradas progredissem normalmente para produzir estômatos, ainda havería uma redução significativa no índice estomático, sugerindo que tanto a iniciação das células para entrar na linhagem estomática quanto a progressão das células através da linhagem estomática a linhagem é comprometida pela superexpressão de HvEPFl (Fig. 3e).

[00221] Tendo demonstrado que a HvEPFl pode efetivamente regular a frequência do desenvolvimento estomático, a seguir exploramos se outros aspectos das folhas da HvEPFlOE foram afetados. Primeiro, investigamos a estrutura interna das folhas. Imagens confocais empilhadas foram produzidas para visualizar as cavidades substomatais de HvEPFlOE. Isso revelou estruturas celulares internas semelhantes e complexos estomáticos de HvEPFlOE tinham células de guarda posicionadas normalmente acima das cavidades subestomáticas como nos controles (asteriscos amarelos, Fig. 4a). No entanto, nas mesmas imagens, foi observada uma falta de formação de cavidade sob as células precursoras estomáticas paradas nas linhagens HvEPFlOE-Ι e HvEPF10E-2 (asteriscos brancos, Fig. 4b).

[00222] Para investigar mais detalhadamente o efeito da

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131/156 redução da DP na tolerância à seca, plantas de geração T2 foram cultivadas em casa de vegetação com iluminação natural e suplementar e controle de temperatura. As plantas de HvEPFlOE-1, HvEPFlOE-2 e 5 semanas de idade foram submetidas a um experimento de seca terminal ao lado de um conjunto paralelo de plantas que foram mantidas cavidades umedecidas (mantidas em 60% do teor máximo de água no solo) . Os vasos foram pesados à mesma hora todos os dias e isso foi usado para calcular a perda de água no solo. Os resultados deste experimento revelaram que ambas as linhagens de cevada transformadas perderam água muito mais lentamente e exibiram uma conservação de água no solo significativamente maior em seus vasos do dia 2 ao dia 14 sob condições de retenção de água (Fig. 5a) . As medidas de fluorescência da clorofila foram usadas para medir quaisquer reduções na eficiência do fotossistema II, um indicador do estresse das plantas. O rendimento quântico adaptado à luz do fotossistema II (<E>psii) foi medido diariamente para plantas cavidades umedecidas e retidas em água durante todo o experimento de seca terminal. Não houve diferenças entre o <E>psii de HvEPFlOE e as plantas de controle no inicio do experimento ou entre os genótipos em condições de muita água, indicando que a densidade estomática reduzida das folhas de HvEPFlOE não estava restringindo a eficiência do fotossistema II. Notavelmente, no entanto, as plantas de HvEPFlOE que mantiveram a água

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132/156 retida apresentaram taxas significativamente maiores de <E>psii versus controles retidos na água do dia 10 ao dia 14; as plantas HvEPFlOE-Ι e HvEPF10E-2 mantiveram sua eficiência do fotossistema II por aproximadamente 4 dias a mais do que os controles sob condições severas de seca. No dia 6 da seca terminal, foram colhidas amostras de folhas para estimativa do teor de água relativo das folhas (RWC) . Este resultado não indicou diferença significativa na RWC foliar entre controles e plantas de HvEPFlOE em condições de água cavidades umedecida. No entanto, sob condições de retenção de água, ambas as linhagens de HvEPFlOE exibiram níveis significativamente mais altos de RWC foliar versus controles (Fig. 5c), indicando uma capacidade aprimorada de reter água em suas folhas em condições de seca. Além disso, as plantas de HvEPFlOE eram menos suscetíveis à murcha e pareciam visivelmente mais 'tolerantes à seca' no dia 6 de condições de retenção de água (Fig. 5d).

[00223] Em um experimento separado em estufa, investigamos se o SD reduzido de plantas de cevada HvEPFlOE podería conferir alguma vantagem ao crescimento sob condições de disponibilidade limitada de água (em vez de reter a água como descrito acima). As plantas HvEPFlOE-Ι, HvEPF10E-2 e controle foram cultivadas sob água cavidades umedecida (60% de água no solo) e com restrição hídrica (25% de água no solo) em paralelo sob condições controladas em casa de

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133/156 vegetação. Esse regime restrito à água foi severo o suficiente para atenuar a taxa de crescimento das plantas de cevada, mas não severo o suficiente para causar sinais visíveis de murcha (Fig. 9-2). As medidas de densidade estomática e de troca de gás em estado estacionário foram realizadas na sexta folha totalmente expandida do perfilho primário de plantas maduras. Isso revelou que o SD e a assimilação fotossintética foram significativamente reduzidos em comparação com os controles em ambas as linhagens de HvEPFlOE em condições de boa hidratação. Nestas folhas, os valores de DP de HvEPFl OE-1/2 foram de 24% e 12% dos valores de controle, respectivamente. Houve uma diminuição significativa de A em ambas as linhagens sob condições de boa hidratação, mas não houve diferenças significativas em A entre HvEPFlOE ou plantas de controle que foram cultivadas sob restrição de água (Fig. 6a). Além disso, houve uma redução significativa na condutância estomática (gs) entre HvEPFlOE e plantas de controle no grupo de tratamento com boa hidratação e uma redução no gs de todas as plantas no tratamento com água (Fig. 6b). Como resultado das grandes reduções em gs e das reduções relativamente pequenas em A, calculou-se que o intrínseco (iWUE) aumentou significativamente na linhagem HvEPF10E-2 em condições de água potável. Não houve aumento no iWUE observado na linhagem HvEPFlOE sob condições de restrição de água (Fig. 6c). Após

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134/156 semanas de seca, o WUE durante toda a vida útil das plantas de cevada foi então avaliado por análise de isótopos de carbono delta. Isso revelou que, sob restrição de água, ambas as linhagens de HvEPFlOE exibiram níveis mais baixos de discriminação de 13C e, portanto, um maior nível de WUE. De acordo com os resultados das trocas gasosas, apenas as plantas de HvEPF10E-2 (que tiveram uma redução mais acentuada de DP) exibiram aumento de WUE sob condições de muita água (Fig. 6d).

[00224] Finalmente, para avaliar o impacto da redução da SD no rendimento e na biomassa da cevada, as plantas cresceram sob os regimes de boa hidratação e de restrição de água descritos acima, até que os pedúnculos das plantas perdessem a cor. Nesse ponto, as plantas foram deixadas secar e foram colhidas. A análise do rendimento de grãos sugeriu que uma redução no SD não teve um efeito deletério no número de sementes, no peso das sementes, no peso médio das sementes, nem no índice de colheita (a razão entre biomassa acima do solo e peso das sementes) sob qualquer condição de rega (Fig. 7 a-d). Curiosamente, sob condições de restrição hídrica, uma tendência para o aumento do número e rendimento de sementes foi evidente em ambas as linhagens de HvEPFlOE. Além disso, não foram encontradas diferenças na altura da planta nem na biomassa acima do solo entre nenhuma linhagem de cevada em regime de rega (Figs. 9-3, 9-4).

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Exemplo 8: Alinhamentos de ortólogos da EPF1

[00225] Os cDNAs previstos de EPF1/2 como Arabídopsís thaliana (At,), Triticum aestivum (Ta), Oryza sativa (Os), Hordeum vulgarum (Hv) e Zea mays (Zm) foram alinhados em silico e são mostrados na Figura 8A. A sequência peptidica ativa conservada é destacada (caixa sombreada).

[00226] As proteínas do tipo EPF1/2 reduzidas de Arabídopsís thaliana (At), Triticum aestivum (Ta), Oryza sativa (Os), Hordeum vulgarum (Hv) e Zea mays (Zm) foram alinhadas e são mostradas na Figura 8B. A região ativa conservada do peptídeo é destacada (caixa sombreada). Os resíduos de cisteína exclusivos para EPFs que alteram a densidade estomática são indicados com um asterisco.

[00227] A identidade de sequência percentual das proteínas EPF2 em relação à HvEPFl (SEQ ID NO: 8) foi calculada e é mostrada na Tabela 3.

[00228] Tabela 3. Identidade percentual de proteínas EPF

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TaEPF12A	OO	59.18	61.22	61.22	61.22	61.22	CXJ	< 1	OO	CO CO	CO	< 1		CO	CO	s
TaEPF12B	O co	61.22	63.27	63.27	63.27	63.27	s	co	co co	o	O	co	100	O O	100	co
TaEPF12D	o co	61.22	63.27	63.27	63.27	63.27	co	co	co co	o	O	co	100	100	o o	co
HvEPFI	o co	61.22	63.27	63.27	63.27	63.27	s	co	co co	o	O	co	100	o o	o o	co
OsEPF2	co	61.22	63.27	63.27	63.27	63.27	co co	co	o			100	co σ>	co	co
ZmOOOOld 026401	61.54	60.78	62.75	62.75	62.75	60.78	65.38	co	C\J	o o	100		<=> σ>	o	o	co co
ZmOOOOld 002144	61.54	60.78	62.75	62.75	62.75	60.78	65.38	co	C\J	100	o o		<=> σ>	o	o	co co
At1g34245	60.78	61.22	63.27	63.27	63.27	61.22	co	60.78	100	CM	CM	o	co co	co co	co co	co co
At1g71866	47.06	48.98	48.98	48.98	48.98	48.98		100	8ΖΌ9	CM	co	co	CM co	co	co	S
At2g20875	61.54	64.71	60.78	60.78	60.78	60.78	100		co	65.38	65.38	co co	co	co	co	co
^LCO 1—	82.35	82.35	96.08	96.08	96.08	100	60.78	48.98	61.22	60.78	60.78	63.27	63.27	63.27	63.27	61.22
^LCO 1—	84.31	86.27	o o	o o	100	96.08	60.78	48.98	63.27	62.75	62.75	63.27	63.27	63.27	63.27	61.22
TaEPF2B	84.31	86.27	o o	100	o o	96.08	60.78	48.98	63.27	62.75	62.75	63.27	63.27	63.27	63.27	61.22
HvEPF2	84.31	86.27	100	o o	o o	96.08	60.78	48.98	63.27	62.75	62.75	63.27	63.27	63.27	63.27	61.22
OsEPF!	86.27	100	86.27	86.27	86.27	82.35	64.71	48.98	61.22	60.78	60.78	61.22	61.22	61.22	61.22	co
ZmOOOOld 025579	100	86.27	84.31	84.31	84.31	82.35	61.54	47.06	8ΖΌ9	61.54	61.54	co	c=> co	o co	o co	oo
	ZmOOOOld 025579	OsEPF!	HvEPF2	TaEPF2B	^LCO 1—	^LCO 1—	At2g20875	At1g71866	At1g34245	ZmOOOOld 002144	ZmOOOOld 026401	OsEPF2	HvEPFI	TaEPF12D	TaEPF12B	TaEPF12A

Exemplo 9: Melhor tolerância à seca e WUE sem redução

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137/156 no rendimento de grãos

[00229] Aqui é relatada a identificação e caracterização de um ortólogo de EPF de cevada funcional, denominado HvEPFl. O HvEPFl atua de maneira semelhante aos peptideos de sinalização Arabidopsis EPF1 e EPF2 para limitar a entrada e a progressão através da linhagem celular estomática. A superexpressão do transcrito de cevada HvEPFl em Arabidopsis levou a uma redução significativa na SD, indicando um nivel de conservação na função peptidica entre monocotiledôneas e dicotiledôneas. A superexpressão de HvEPFl na cevada levou a reduções severas na formação estomática e na entrada de células epidérmicas na linhagem estomátal.

[00230] Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria em particular, a presença frequente de células precursoras estomáticas paradas na epiderme das plantas de Arabidopsis e HvEPFlOE de cevada (Fig. 1c e 2b) sugere que o modo de ação do HvEPFl é mais semelhante ao de Arabidopsis EPF1 , que gera um fenótipo epidérmico semelhante quando superexpresso (Hara et ai., 2007; Hara et ai., 2009) . Ou seja, os precursores estomáticos entram na linhagem do desenvolvimento, mas ficam presos antes da divisão celular simétrica final e da maturação do complexo estomático. Essas células presas em formato ovalado de HvEPFlOE parecem interromper seu desenvolvimento em um estágio de célula mãe de guarda meristemóide ou precoce, antes da transição para

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138/156 células mãe de guarda maduras. Assim, além da entrada na linhagem estomática, a transição para uma célula mãe de guarda madura, competente para dividir e formar um par de células de guarda, parece ser regulada pelo HvEPFl. Em Arabidopsis, esta etapa de transição celular está sob o controle do fator de transcrição MUTE (Fig. 12), cuja atividade promove a ativação de MAP-quinases mediada por EPF1 e a subregulação subsequente da atividade do fator de transcrição SPCH via fosforilação. No entanto, o MUTE da cevada pode ser mais diretamente regulado pelo HvEPFl, pois os genes do MUTE da grama (diferentemente do Arabidopsis MUTE) codificam os potenciais locais de fosforilação da MAPquinase (Liu et al., 2009).

[00231] Apesar de sua importância, sabemos muito pouco sobre a sequência de eventos que levaram à produção dos espaços cheios de ar subjacentes aos estômatos. Em conjunto com os poros estomáticos, essas cavidades substomatais facilitam altos níveis de trocas gasosas nas células fotossintéticas do mesofilo das plantas e mediam a perda de água nas folhas por transpiração. Usando microscopia confocal, não pudemos ver nenhuma evidência para a separação de células mesófilas abaixo das células precursoras estomáticas paradas nas folhas de HvEPFlOE. Nossas observações começam a lançar luz sobre a sequência de desenvolvimento que leva à formação da cavidade. As células

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139/156 precursoras estomáticas paradas em HvEPFlOE não formam cavidades subestimativas, sugerindo que essas cavidades se formam após a maturação do GMC, como as células subsidiárias do complexo estomático, ou após a formação de pares de células de guarda.

[00232] Existem muitas evidências para apoiar uma correlação negativa entre a densidade estomática e o tamanho estomático em uma variedade de espécies e mutantes estomáticos de Arabidopsis, ou seja, aquelas plantas com SD relativamente baixo tendem a produzir estornas maiores (Miskin & Rasmusson, 1970; Franks & Beerling, 2009; Doheny -Adams et ai., 2012) . Curiosamente, a superexpressão de HvEPFl não se conformava a essa tendência e levou a plantas de cevada com células de guarda menores e mais curtas. Assim, se a via de sinalização do EPF regula diretamente o tamanho estomático em espécies de dicotiledôneas (e isso ainda precisa ser demonstrado), parece atuar de maneira oposta na determinação do tamanho estomátal da grama.

[00233] Através da superexpressão ectópica de HvEPFl, criamos transformantes de cevada com uma gama de reduções em SD. Embora as plantas de cevada com número substancialmente reduzido de estômatos tenham mostrado alguma atenuação das taxas fotossintéticas quando cavidades umedecidas, elas exibiram fortes características para evitar a seca e tolerância à seca quando a água era retida. Eles tiveram

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140/156 níveis mais baixos de perda de água por transpiração e conseguiram manter níveis mais altos de conteúdo de água no solo e atrasaram o início das respostas ao estresse f otossintético por vários dias mais do que os controles. Notavelmente, quando cultivadas sob condições de limitação da água (teor de água do pote no solo de 25%), duas linhagens de cevada com reduções no SD demonstraram melhorias significativas no WUE sem efeitos prejudiciais no crescimento das plantas ou no rendimento das sementes (biomassa, peso das sementes ou número de sementes) . Sob condições de limitação da água, as plantas de HvEPFlOE geraram, em média, mais de 50% a mais de rendimento de sementes que, embora não tenham aumentado significativamente em nossos experimentos, merecem uma investigação mais aprofundada. De fato, seria interessante determinar se o WUE e o rendimento podem ser ainda mais otimizados em linhagens de densidade estomática reduzidas sob regimes de rega menos severos ou através de reduções menos drásticas no SD.

[00234] As plantas HvEPFlOE-2 (que apresentaram o menor SD neste experimento) também exibiram níveis significativamente melhorados de tolerância à seca e WUE sob condições de boa hidratação, sem acompanhar as diminuições no rendimento de grãos ou na biomassa da planta. O aumento do iWUE observado nessas experiências foi resultado de uma queda relativamente moderada em A em comparação com uma diminuição maior em gs,

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141/156 sugerindo que A alcançou a saturação nas condições de crescimento de nossa experiência (Yoo et al., 2009) . Sem desejar estar vinculado a nenhuma teoria em particular, a saturação de A em condições de crescimento também pode ser um fator para explicar por que as reduções no SD não afetaram o rendimento das plantas de HvEPFlOE. Explicações adicionais incluem taxas significativamente reduzidas de gs e, portanto, perda de água nas plantas de HvEPFlOE, permitindo que mais recursos sejam alocados para a geração de sementes e biomassa acima do solo, com o custo potencial para o desenvolvimento radicular ou o aumento do teor de água no solo, levando a uma melhor absorção de nutrientes e gs sob limitação da água. Assim, apesar de não ter sido testado neste estudo, a redução da SD também pode melhorar a alocação de recursos ou a capacidade de captação de nutrientes sob restrição hídrica.

[00235] Para concluir, este estudo descreve a função e o efeito fisiológico da superexpressão de um fator de padrão epidérmico nativo em uma espécie de gramínea. A manipulação dos níveis de expressão de HvEPFl melhorou nossa compreensão dos mecanismos de desenvolvimento estomático em gramíneas e gerou uma variedade de plantas de cevada que exibiram SD significativamente reduzido. Estas plantas de cevada exibem tolerância à seca substancialmente melhorada e WUE sem reduções no rendimento de grãos. Esta nova descoberta

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142/156 acrescenta força à proposição de que o desenvolvimento estomático representa um alvo atraente para os criadores ao tentarem culturas à prova de futuro.

Exemplo 10: Resistência Melhorada à Infecção por

Patógenos Microbianos em Arabidopsis

[00236] As plantas foram geradas e cultivadas como anteriormente (ver Exemplos 2 e 3) . As plantas de Arabidopsis que superexpressam o EPF, manipuladas para reduzir a densidade estomática, aumentaram a resistência ao patógeno (Figura 10). Níveis de infecção de plantas de Arabidopsis de densidade estomática reduzida ou aumentada após inoculação por pulverização com Pseudomonas syringae pv tomate DC3000 (PstDC3000), obtido do Prof. Jurriaan Ton, Departamento de

Animais e Plantas, Universidade de Sheffield, Sheffield S10 2TN); crescimento medido 24 horas após a inoculação; * p < 0, 05 são mostrados na Figura 10 (painel esquerdo) . As plantas de Arabidopsis com densidade estomática alterada não apresentam resistência alterada à infecção quando a seringa se infiltrou para superar qualquer limitação estomática (Painel Direito).

Exemplo 11: A superexpressão de um homólogo de um EPF2 reduz a densidade estomática em plantas de arroz

[00237] A variedade de arroz IR64 (Oryza sativa subsp. Indica cv.) Foi obtida do Instituto Internacional de Pesquisa do Arroz, Los Banos, Filipinas, em 2015. Um construto de

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143/156 gene de superexpressão foi feito pela clonagem do homólogo de arroz EPF2 referido aqui como OsEPF2 (LQC_Qs04g54490.1) cDNA gerado por PCR usando

F - CACCATGAGGAGGCACGCTACTC (SEQ ID NO.27)

R - CTAGCTGGAGGGCACAGGGTA (SEQ ID NO.28) iniciadores oligonucleotidicos no vetor pENTR/D-TOPO (Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA) e uma reação de clonase de LR (Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA) realizada para transferir OsEPF2 para o vetor pSC310 usado para transformações de arroz protocolo descrito por Yin et al. Plant Cell Reports 36 (5): 745-757, 2017. As plantas de arroz foram transformadas e cultivadas como descrito em Yin et al. Plant Cell Reports 36 (5): 745-757, 2017. Foram criadas duas linhagens transgênicas de arroz com superexpressão de OsEPF2 e analisados os níveis de densidade estomática e transcrição.

[00238] A densidade estomática das superfícies abaxiais da primeira folha foi medida e é significativamente reduzida no arroz transformado com o construto de superexpressão de OsEPF2 (Figura 11A) . As letras indicam que as linhagens de superexpressão de OsEPF2 são estatisticamente significativas a partir do controle IR64 na primeira folha. A densidade estomática é significativamente reduzida nas linhagens de superexpressão.

[00239] A superexpressão do gene OsEPF2 foi ainda observada aos 8 dias de idade em duas linhagens transgênicas,

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144/156 conforme medido por qPCR (Figura 11B).

Exemplo 12: Resistência Melhorada à Infecção por Patógenos Microbianos em Cevada

[00240] As plantas de cevada HvEPFl foram geradas e cultivadas como anteriormente (ver exemplos 2 e 3) . As plantas modificadas foram pesquisadas quanto à resistência à ferrugem marrom do patógeno fúngico (Puccinia hordei cepa BBR 06/32, virulência de plântulas: BBV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 obtida de Amelia Hubbard, Huntingdon Road, Cambridge, CB3 OLE, 2017). Mudas de 3 semanas de idade foram pintadas com esporos misturados com talco na parte inferior das folhas 2 e 3, colocadas a 100% de umidade por 12 horas a 15 °C e depois retornadas à câmara de crescimento e número de pústulas contadas 7 dias depois. Os números mostrados são o total de pústulas somadas de ambas as folhas (Figura 12), mostrando que as plantas de cevada modificadas com densidade estomática reduzida têm um aumento vantajoso na resistência à infecção por ferrugem por fungos.

[00241] Em toda a descrição e reivindicações desta especificação, as palavras compreendem e contêm e suas variações significam incluindo, mas não se limitando a, e não se destinam a (e não excluem) outras porções, aditivos, componentes, números inteiros ou etapas. Em toda a descrição e reivindicações desta especificação, o singular abrange o plural, a menos que o contexto exija de outra forma. Em

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145/156 particular, quando o artigo indefinido é usado, a especificação deve ser entendida como contemplando a pluralidade e a singularidade, a menos que o contexto exija de outra forma. Aspectos, números inteiros, características, compostos, porções ou grupos químicos descritos em conjunto com um aspecto, modalidade ou exemplo específico da invenção devem ser entendidos como aplicáveis a qualquer outro aspecto, modalidade ou exemplo aqui descrito, a menos que seja incompatível com isso. Todas as características divulgadas nesta especificação (incluindo quaisquer reivindicações, resumo e desenhos), e/ou todas as etapas de qualquer método ou processo divulgado, podem ser combinadas em qualquer combinação, exceto combinações em que pelo menos algumas dessas características e/ou etapas são mutuamente exclusivas. A invenção não está restrita aos detalhes de quaisquer modalidades anteriores. A invenção se estende a qualquer nova, ou qualquer nova combinação, dos recursos divulgados nesta especificação (incluindo quaisquer reivindicações, resumo e desenhos), ou a qualquer nova, ou qualquer nova combinação, das etapas de qualquer método ou processo assim divulgado. A atenção do leitor é direcionada a todos os papéis e documentos arquivados simultaneamente ou anteriores a esta especificação em conexão com este pedido e abertos à inspeção pública com esta especificação, e o conteúdo de todos esses papéis e documentos é incorporado

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146/156 aqui por referência.

SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS

[00242] [SEQ ID NO:1] GSX1X2PDC

[00243] [SEQ ID NO:2] YRCMC

[00244] [SEQ ID NO:3] HACGAC

[00245] [SEQ ID NO:4] CPMVYRCMCKGKCYPVPS

[00246] [SEQ ID NO:5] PCNRVMVSFKC

[00247] [SEQ ID NO:6]

TGSSLPDCTHACGACKPCNRVMVSFKCSIAEPCPMVYRCMCKGKCYPVPSS

[00248] [SEQ ID NO:7]

EKKDGSGFLQEEVYGTGSSLPDCTHACGACKPCNRVMVSFKCSIAEPCPMVYRCMCKGK CYPVPSS

[00249] [SEQ ID NO:8] Aminoácido de comprimento total HvEPfl

MKRHGLAARVHHVRPLLVLLAAVLLLAATVDGIRPDPDDHARPGQAPGAPAVEEKKDGS G

FLQEEVYGTGSSLPDCTHACGACKPCNRVMVSFKCSIAEPCPMVYRCMCKGKCYPVPSS [00250] [SEQ ID NO: 9] Sequência de mRNA de HvEPFl

CCCUCCAAAGCAGGCUGCUCUUGAGUGAGUGUCACCGUGCACUGUCUGUGCACCAGGUC A

AGCUCUUGGAACGCACGCACGCGGGGAUUCUUGGGAUGAUGAUGAAGAGGCACGGUCUU GCCGCCCGAGUUCACCACGUUCGCCCCCUUCUUGUCCUCCUCGCGGCCGUCUUGCUGCU CGCCGCCACGGUCGAUGGCAUCAGACCAGAUCCCGGUAAGUUCAGCCACAUGAAUGAUC UCUAUGUGCAAUGCCAUCUCCUUCGCACGAGAAUCUGACGCUAACUUCCAUCUCCUCCU GGCAGAUGACCAUGCACGCCCGGGGCAGGCGCCAGGUGCACCGGCGGUGGAGGAGAAGA

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147/156

AGGAUGGGUCGGGGUUCCUGCAGGAGGAGGUGUACGGGACGGGGUCGAGCCUGCCGGAC UGCACGCACGCGUGCGGCGCCUGCAAGCCGUGCAACCGCGUGAUGGUCAGCUUCAAGUG CUCCAUCGCCGAGCCCUGCCCCAUGGUCUACCGCUGCAUGUGCAAGGGCAAGUGCUACC CCGUCCCCUCCAGCUAG

CUCAGCUCAGACGAUCUCCCCCGCGCACGUACGCACACGGCGGAUGCAAAU

CGAUGCAGAGGGAGCAGACAGCAGAGUAAUAUAUGUGCCGAUCUAGUUGUAUGUGAUUU

U UUAUGCUGGU

[00251] [SEQ ID NO: 10] Região ativa de cDNA de HvEPFl

GGGTCGAGCCTGCCGGACTGCACGCACGCGTGC

GGCGCCTGCAAGCCGTGCAACCGCGTGATGGTCAGCTTCAAGTGCTCCATCGCCGAGCC C

TGCCCCATGGTCTACCGCTGCATGTGCAAGGGCAAGTGCTACCCCGTCCCCTCCAGCTA

G

[00252] [SEQ ID NO: 11] cDNA de HvEPFl de comprimento total

ATGAAGAGGCACGGTCTTGCCGCCCGAGTTCACCACGTTCGCCCCCTTCTTGTCCTCCT C

GCGGCCGTCTTGCTGCTCGCCGCCACGGTCGATGGCATCAGACCAGATCCCGATGACCA T

GCACGCCCGGGGCAGGCGCCAGGTGCACCGGCGGTGGAGGAGAAGAAGGATGGGTCGGG

G

TTCCTGCAGGAGGAGGTGTACGGGACG

GGGTCGAGCCTGCCGGACTGCACGCACGCGTGC

GGCGCCTGCAAGCCGTGCAACCGCGTGATGGTCAGCTTCAAGTGCTCCATCGCCGAGCC C

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148/156

TGCCCCATGGTCTACCGCTGCATGTGCAAGGGCAAGTGCTACCCCGTCCCCTCCAGCTA

G

[00253] [SEQ ID NO: 12] cDNA de HvEPFl de comprimento total com 5’UTR e 3’UTR

CCCTCCAAAGCAGGCTGCTCTTGAGTGAGTGTCACCGTGCACTGTCTGTGCACCAGGTC

A

AGCTCTTGGAACGCACGCACGCGGGGATTCTTGGGATGATGAAGAGGCACGGTCTTGCC GCCCGAGTTCACCACGTTCGCCCCCTTCTTGTCCTCCTC

GCGGCCGTCTTGCTGCTCGCCGCCACGGTCGATGGCATCAGACCAGATCCCGATGACCA T

GCACGCCCGGGGCAGGCGCCAGGTGCACCGGCGGTGGAGGAGAAGAAGGATGGGTCGGG

G

TTCCTGCAGGAGGAGGTGTACGGGACG

GGGTCGAGCCTGCCGGACTGCACGCACGCGTGC

GGCGCCTGCAAGCCGTGCAACCGCGTGATGGTCAGCTTCAAGTGCTCCATCGCCGAGCC C

TGCCCCATGGTCTACCGCTGCATGTGCAAGGGCAAGTGCTACCCCGTCCCCTCCAGCTA

G

[00254] [SEQ ID NO:13] Região ativa de gDNA de HvEPFl (sem introns)

GGGTCGAGCCTGCCGGACTGCACGCACGCGTGC

GGCGCCTGCAAGCCGTGCAACCGCGTGATGGTCAGCTTCAAGTGCTCCATCGCCGAGCC C

TGCCCCATGGTCTACCGCTGCATGTGCAAGGGCAAGTGCTACCCCGTCCCCTCCAGCTA G

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[00255] [SEQ ID NO: 14] gDNA de HvEPFl de comprimento total ATGATGAAGAGGCACGGTCTTGCCGCCCGAGTTCACCACGTTCGCCCCCTTCTTGTCCT CCTCGCGGCCGTCTTGCTGCTCGCCGCCACGGTCGATGGCATCAGACCAGATCCCGGTA AGTTCAGCCACATGAATGATCTCTATGTGCAATGCCATCTCCTTCGCACGAGAATCTGA CGCTAACTTCCATCTCCTCCTGGCAGATGACCATGCACGCCCGGGGCAGGCGCCAGGTG CACCGGCGGTGGAGGAGAAGAAGGATGGGTCGGGGTTCCTGCAGGAGGAGGTGTACGGG ACGGGGTCGAGCCTGCCGGACTGCACGCACGCGTGCGGCGCCTGCAAGCCGTGCAACCG CGTGATGGTCAGCTTCAAGTGCTCCATCGCCGAGCCCTGCCCCATGGTCTACCGCTGCA TGTGCAAGGGCAAGTGCTACCCCGTCCCCTCCAGCTAG

[00256] [SEQ ID NO: 15] gDNA de HvEPFl de comprimento total com 5’UTR e 3’UTR

CCCTCCAAAGCAGGCTGCTCTTGAGTGAGTGTCACCGTGCACTGTCTGTGCACCAGGTC A

AGCTCTTGGAACGCACGCACGCGGGGATTCTTGGGATGATGATGAAGAGGCACGGTCTT GCCGCCCGAGTTCACCACGTTCGCCCCCTTCTTGTCCTCCTCGCGGCCGTCTTGCTGCT CGCCGCCACGGTCGATGGCATCAGACCAGATCCCGGTAAGTTCAGCCACATGAATGATC TCTATGTGCAATGCCATCTCCTTCGCACGAGAATCTGACGCTAACTTCCATCTCCTCCT GGCAGATGACCATGCACGCCCGGGGCAGGCGCCAGGTGCACCGGCGGTGGAGGAGAAGA AGGATGGGTCGGGGTTCCTGCAGGAGGAGGTGTACGGGACGGGGTCGAGCCTGCCGGAC TGCACGCACGCGTGCGGCGCCTGCAAGCCGTGCAACCGCGTGATGGTCAGCTTCAAGTG CTCCATCGCCGAGCCCTGCCCCATGGTCTACCGCTGCATGTGCAAGGGCAAGTGCTACC CCGTCCCCTCCAGCTAG

CTCAGCTCAGACGATCTCCCCCGCGCACGTACGCACACGGCGGATGCAAAT

CGATGCAGAGGGAGCAGACAGCAGAGTAATATATGTGCCGATCTAGTTGTATGTGATTT T TTATGCTGGT

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150/156

[00257] [SEQ ID NO: 16] gDNA de HvEPFl de comprimento total em vetor

TTTTTATCCCCGGAAGCCTGTGGATAGAGGGTAGTTATCCACGTGAAACCGCTAATGCCC CGCAAAGCCTTGATTCACGGGGCTTTCCGGCCCGCTCCAAAAACTATCCACGTGAAATCG CTAATCAGGGTACGTGAAATCGCTAATCGGAGTACGTGAAATCGCTAATAAGGTCACGTG AAATCGCTAATCAAAAAGGCACGTGAGAACGCTAATAGCCCTTTCAGATCAACAGCTTGC AAACACCCCTCGCTCCGGCAAGTAGTTACAGCAAGTAGTATGTTCAATTAGCTTTTCAAT TATGAATATATATATCAATTATTGGTCGCCCTTGGCTTGTGGACAATGCGCTACGCGCAC CGGCTCCGCCCGTGGACAACCGCAAGCGGTTGCCCACCGTCGAGCGCCAGCGCCTTTGCC CACAACCCGGCGGCCGGCCGCAACAGATCGTTTTATAAATTTTTTTTTTTGAAAAAGAAA LB

AAGCCCGAAAGGCGGCAACCTCTCGGGCTTCTGGATTTCCGATCCCCGGAATTAGATCTT LB

GGCAGGATATATTGTGGTGTAACGTATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGC CGCCCCCTTCACCTAGACTCGACGCGTCCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACA CTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGA CTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTC ACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATA AAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCAC CCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATT GATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACC CTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACGACCCCGATATGAAAAAGCC TGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGA CCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCG TGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTA

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TCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAG CGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCC TGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGGTAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTT GGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTA _{TTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTAC}TTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAACTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATG CGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAA TCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATC ACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGC TGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCT CCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGA TGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTT GTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGC GGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACG GCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAG CCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCT GTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGG Sacl

AATAGAGTAGATGCCGACCGGGATCCGGAGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATT TGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA TTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATG AGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAA ATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGG GAATTCATCGATGATATCAGATCAAGGGTGGGCGCGCCGAACCAGCTTTCTTGTACAAAG XholHindlll

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TGGTGATCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGTGCAGCGT

GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATT

ACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATA

TTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAG

AGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACA

GGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGCT

TCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATG _{GTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAA}

GAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATAGAATAAA

ATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACAT

TTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGAC

ACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTC

Xhol

TGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGT

CGGCATCCAGAAATTGCGTGTCGGACGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCT

CCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCC

CTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTG

TTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCC

GCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCG

Apal

TTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGT

GTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACAC

GTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGT

TCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGC

CCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTT

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153/156 _{TTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGT}p_{GTTCTAGATCGGAGTAGA}ATTAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCC ATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTA TACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTG TGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTT TCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCAT AGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGG GTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTG AGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTT pAHUbi promDprimerforward

GGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTAT TTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCGC CCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAGAAACGTAAAATGATATAAATATCAATA CACCATGAAGAGGCACGGTCTTGCCGCCCGAGTTCACCACGTTCGCCCCCTTCTTGTCCTCCTC GCGGCCGTCTTGCTGCTCGCCGCCACGGTCGATGGCATCAGACCAGATCCCGATGACCAT GCACGCCCGGGGCAGGCGCCAGGTGCACCGGCGGTGGAGGAGAAGAAGGATGGGTCGGGG TTCCTGCAGGAGGAGGTGTACGGGACGGGGTCGAGCCTGCCGGACTGCACGCACGCGTGC GGCGCCTGCAAGCCGTGCAACCGCGTGATGGTCAGCTTCAAGTGCTCCATCGCCGAGCCC TGCCCCATGGTCTACCGCTGCATGTGCAAGGGCAAGTGCTACCCCGTCCCCTCCAGCTAG GCGCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATGGGGGATCCACTAGTTCTAGAATTCGA TTGAGTCAAGCAGGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGT TGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAAT TAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATT ATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCG nosterm 3'Reverseprimer

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154/156

CGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGACCGGCATGCAAGCTGATATCAATCACTAGTGA

Saci

ATTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTA

ATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC

ACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGA

GTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTG

TCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGG

CGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCG

GTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGA

RB

Stul

AAGAACATGAAGGCCTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACTAAGTCGCTGTATGTGTTT

GTTTGAGATCTCATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCG

TTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCA

AGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGC

TCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTC

CCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAG

GTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCC

TTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCA

GCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTG

AAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTG

AAGCCAGTTACCTTCGGAAGAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCT

GGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA

GAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAA

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155/156

GGGATTTTGGT CAT GAGAT TAT CAAAAAGGAT C T T CAC CTAGAT CC T T T TAAAT TAAAAA TGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGTGTAACATTGGTCTAGTGATTAGAAAAAC TCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTT TGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCA AGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTC CCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGT GAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGC TCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCG AGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGG CGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAAT ACCTGGAATGCTGTTTTCCCTGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTA CGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACC ATCTCATCTGTAACAACATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGC GCATCGGGCTTCCCATACAATCGGTAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGA GCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTTGAGCAA GACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGAC AGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGA GAGACAAC GTGGCTTTGTT GAATAAAT C GAACT T T T GC T GAGT T GAAGGAT GAGAT GAG G CATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGG TCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGG GCGATTCAGGCGATCCCCATCCAACAGCCCGCCGTCGAGCGGGCT

[00258] [SEQ ID NO:17] Iniciador Adiante de Higromicina

ACTCACCGCGACGTCTG

[00259] [SEQ ID NO:18] Iniciador Reverso de Higromicina

GCGCGTCTGCTGCTCCATA

[00260] [SEQ ID NO:19] Iniciador Adiante de HvGAPDH

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156/156

GTGAGGCTGGTGCTGATT

[00261] [SEQ ID NO:20] Iniciador Reverso de HvGAPDH

CGTGGTGCAGCTAGCATTTGAGAC

[00262] [SEQ ID NO: 21] Iniciador Adiante de HvTubulina

AGTGTCCTGTCCACCCACTC

[00263] [SEQ ID NO:22] Iniciador Reverso de HvTubulina

AGCATGAAGTGGATCCTTGG

[00264] [SEQ ID NO:23] Iniciador Adiante de HvEPFl (qPCR)

GTGGAGGAGAAGAAGGATGG

[00265] [SEQ ID NO:24] Iniciador Reverso de HvEPFl (qPCR)

ATGGAGCACTTGAAGCTGAC

[00266] [SEQ ID NO:25] Iniciador Adiante de HvEPFl (construção do vetor)

GAG CAT GAAGAGGCAC GG T C T T

[00267] [SEQ ID NO:26] Iniciador Reverso de HvEPFl (construção do vetor)

CTAGCTGGAGGGGACGGGGT

[00268] [SEQ ID NO:27] Iniciador Adiante de OsEPF2

GAG CAT GAG GAGGCAC GC TAG T C

[00269] [SEQ ID NO:28] Iniciador Reverso de OsEPF2

CTAGCTGGAGGGCACAGGGT

Claims

1. Método para modificar a densidade estomática em uma planta monocotiledônea, caracterizado pelo fato de que compreende modificar a presença, expressão ou atividade em uma planta monocotiledônea do polipeptídeo do Fator de Padronização Epidérmica (EPF).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo EPF compreende; o motivo de aminoácido GSX¹X²PDC [SEQ ID NO: 1], em que X¹ é um de S ou R e X² é um de L ou I.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo EPF compreende; o motivo de aminoácido YRCMC [SEQ ID NO: 2].

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo EPF compreende; o motivo de aminoácido HACGAC [SEQ ID NO: 3] .

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo EPF compreende; o motivo de aminoácido CPMVYRCMCKGKCYPVPS [SEQ ID NO: 4].

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o

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2/20 polipeptídeo EPF compreende; o motivo de aminoácido PCNRVMVSFKC [SEQ ID NO: 5]

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo EPF compreende; o motivo da sequência de aminoácidos TGSSLPDCTHACGACKPCNRVMVSFKCSIAEPCPMVYRCMCKGKCYPVPSS [SEQ ID NO: 6] .

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo EPF compreende; o motivo da sequência de aminoácidos EKKDGSGFLQEEVYGTGSSLPDCTHACGACKPCNRVMVSFKCSIAEPCPMVYRCMCKGK CYPVPSS [SEQ ID NO: 7].

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de pelo menos 38% de identidade com a mesma, de preferência pelo menos 60% de identidade com a mesma.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo EPF compreende; a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de pelo menos 90% de identidade com a mesma.

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11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo EPF é codificado por uma sequência polinucleotídica compreendendo;

a. SEQ ID NO: 9; ou uma sequência de pelo menos 67% de identidade com a mesma; ou

b. SEQ ID NO: 10; ou uma sequência de pelo menos 67%; identidade com a mesma; ou

c. SEQ ID NO: 11; ou uma sequência de pelo menos 59%; identidade com a mesma; ou

d. SEQ ID NO: 13; ou uma sequência de pelo menos 66%; identidade com a mesma; ou

e. SEQ ID NO: 14; ou uma sequência de pelo menos 58%; identidade com a mesma.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o método compreende aumentar a expressão e/ou o nível e/ou a atividade do polipeptídeo EPF nas células da planta ou material da planta em comparação com as células de uma planta ou material da planta de controle equivalente.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a planta ou material da planta resultante aumentou a eficiência de uso de água (WUE) em comparação com uma planta ou material da planta de controle equivalente.

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14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a planta ou material da planta resultante aumentou a tolerância à seca em comparação com uma planta ou material da planta de controle equivalente.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a planta ou material da planta resultante tem resistência aumentada à infecção por um patógeno microbiano em comparação com uma planta ou material da planta de controle equivalente.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o patógeno microbiano é um patógeno bacteriano.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o patógeno microbiano é do gênero Pseudomonas ou Xanthomonas ou Puccinia ou Septoria.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o patógeno microbiano é Pseudomonas syringae ou Puccinia hordei.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizado pelo fato de que a planta ou material da planta resultante tem rendimento aumentado ou equivalente em comparação com uma planta ou material da planta de controle equivalente.

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20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o método compreende reduzir a expressão e/ou o nível e/ou a atividade do polipeptideo EPF nas células da planta ou material da planta em comparação com as células de uma planta ou material da planta de controle equivalente em que a planta ou material da planta resultante tem densidade estomática aumentada em comparação com uma planta ou material da planta de controle equivalente.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o método compreende a transformação de uma planta ou material da planta com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência polinucleotídica de;

b. SEQ ID NO: 10; ou uma sequência de pelo menos 67% de identidade com a mesma; ou

c. SEQ ID NO: 11; ou uma sequência de pelo menos 59% de identidade com a mesma; ou

d. SEQ ID NO: 13; ou uma sequência de pelo menos 66% de identidade com a mesma; ou

e. SEQ ID NO: 14; ou uma sequência de pelo menos 58% de identidade com a mesma

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6/20 ou um fragmento funcional das mesmas; em que a expressão do referido polinucleotídeo em células da planta ou do material da planta resulta em um aumento na expressão e/ou nível e/ou atividade do polipeptideo EPF nas referidas células em comparação com células não transformadas; e uma redução na densidade estomática da planta ou material da planta em comparação com uma planta ou material da planta não transformado equivalente.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que células da planta ou do material da planta são transformadas com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência polinucleotídica capaz de hibridizar com uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14 sob condições rigorosas, de modo que haja redução ou eliminação da expressão e/ou nível do polipeptideo de EPF nativo e/ou atividade da mesma em tais células comparadas com células não transformadas; e em que a densidade estomática da planta ou do material da planta é aumentada em comparação com uma planta ou material da planta não transformado.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a sequência polinucleotídica capaz de hibridizar com uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou

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SEQ ID NO: 14 é um RNA guia e em que a sequência polinucleotidica da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14 é editada usando uma endonuclease .

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que a planta ou o material da planta é transformado de maneira estável com o referido polinucleotídeo.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que a planta ou material da planta é transformado com uma multiplicidade dos referidos polinucleotídeos.

26. Método para modificar uma planta ou material da planta para conferir pelo menos resistência parcial a, ou melhorar a resistência à infecção por um patógeno microbiano, caracterizado pelo fato de que o método compreende aumentar a expressão e/ou nível e/ou atividade do polipeptídeo EPF em células da planta ou do material da planta em comparação com as células de uma planta ou material da planta de controle equivalente; em que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de pelo menos 60% de identidade com a mesma.

27. Método para modificar uma planta ou material da planta para conferir pelo menos resistência parcial a, ou melhorar a resistência à infecção por um patógeno microbiano,

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8/20 caracterizado pelo fato de que compreende transformar a planta, parte da planta ou célula da planta com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência polinucleotídica de ;

e. SEQ ID NO: 14; ou uma sequência de pelo menos 58% de identidade com a mesma;

ou um fragmento funcional das mesmas; em que a expressão do referido polinucleotídeo nas células da planta ou do material da planta resulta em um aumento na expressão e/ou nível e/ou atividade do polipeptídeo EPF nas referidas células em comparação com células de controle não transformadas; em que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de pelo menos 60% de identidade com a mesma.

28. Método para modificar uma planta ou material da planta monocotiledônea para melhorar a tolerância à seca, caracterizado pelo fato de que o método compreende aumentar

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9/20 a expressão e/ou nível e/ou atividade do polipeptídeo EPF nas células da planta ou material da planta em comparação com as células de um planta ou material da planta de controle equivalente; em que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de pelo menos 60% de identidade com a mesma.

29. Método para modificar uma planta ou material da planta monocotiledônea para melhorar a tolerância à seca, caracterizado pelo fato de que compreende transformar a planta, parte da planta ou célula da planta com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência polinucleotídica de ;

ou um fragmento funcional das mesmas; em que a expressão do referido polinucleotídeo nas células da planta ou material da planta resulta em um aumento na expressão e/ou nível e/ou

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10/20 atividade do polipeptídeo EPF nas referidas células em comparação com células de controle não transformadas; em que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de pelo menos 60% de identidade com a mesma.

30. Planta monocotiledônea ou material da planta monocotiledônea modificada caracterizada pelo fato de que compreende células cujo DNA genômico não forma uma sequência nucleotídica contígua da sequência SEQ ID NO: 13 de pelo menos 66% de identidade com a mesma, ou SEQ ID NO: 14 ou uma sequência de pelo menos 58% de identidade com a mesma, em que a planta ou material da planta tem uma densidade estomática aumentada em comparação com planta ou material da planta geneticamente equivalente, mas não modificado, com as referidas sequências nucleotídicas contíguas.

31. Método para aumentar a densidade estomática em uma planta monocotiledônea ou material da planta monocotiledônea, caracterizado pelo fato de que compreende editar um ou mais resíduos nucleotídicos da SEQ ID NO: 13 ou uma sequência de pelo menos 66% de identidade com a mesma, ou SEQ ID NO: 14 ou uma sequência de pelo menos 58% de identidade com a mesma e que é compreendida no genoma da planta, de modo que as células editadas da planta ou material da planta resultante tenham uma redução ou eliminação da expressão e/ou nível do polipeptídeo EPF nativo e/ou sua atividade nas referidas células em comparação com células

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11/20 geneticamente equivalentes, mas não editadas, de uma planta ou material da planta de controle; em que o polipeptídeo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de pelo menos 60% de identidade com a mesma.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o referido resíduo de nucleotídeo é editado de modo que o polipeptídeo EPF resultante não seja funcional.

33. Planta monocotiledônea ou material da planta monocotiledônea transformada com um polinucleotídeo caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um de;

ou um fragmento funcional do mesmo, em que a expressão do referido polinucleotídeo nas células da planta ou do material da planta resulta em um aumento na expressão e/ou no nível e/ou na atividade do polipeptídeo EPF nas referidas

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12/20 células em comparação com células não transformadas; em que o polipeptideo EPF compreende uma sequência da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de pelo menos 60% de identidade com a mesma.

34. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a referida planta ou material da planta reduziu a densidade estomática em comparação com uma planta ou material da planta não transformada equivalente.

35. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo está sob o controle do promotor de Ubiquitina Zea mays.

36. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a referida planta ou material da planta tem densidade estomática reduzida em comparação com uma planta ou material da planta não transformada equivalente.

37. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 36, caracterizada pelo fato de que a planta ou material da planta possui o referido polinucleotídeo incorporado de maneira estável em seu genoma.

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38. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37, caracterizada pelo fato de que a planta ou o material da planta é transformado com uma multiplicidade dos referidos polinucleotídeos.

39. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 38, caracterizada pelo fato de que a referida planta ou material da planta tem uma eficiência de uso da água melhorada em comparação com uma planta ou material da planta não transformada eguivalente.

40. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 39, caracterizada pelo fato de que a referida planta ou material de planta tem tolerância à seca melhorada em comparação com uma planta ou material da planta não transformada equivalente.

41. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 40, caracterizada pelo fato de que a referida planta ou material da planta tem resistência melhorada a um patógeno microbiano em comparação com uma planta ou material da planta não transformada equivalente.

42. Planta monocotiledônea ou material da planta monocotiledônea, de acordo com a reivindicação 41,

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14/20 caracterizada pelo fato de que o patógeno é um patógeno fúngico ou bacteriano.

43. Planta monocotiledônea ou material da planta monocotiledônea, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o patógeno é do gênero Pseudomonas ou Xanthomonas, ou Puccinia ou Septoria.

44. Planta monocotiledônea ou material da planta monocotiledônea, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o patógeno é Pseudomonas syringae ou Puccinia hordei.

45. Planta monocotiledônea ou material da planta monocotiledônea, caracterizado pelo fato de que a planta ou material da planta é transformado com um polinucleotídeo capaz de hibridizar especificamente com um polinucleotídeo compreendendo qualquer um de; SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14, sob condições rigorosas; em que a expressão do referido polinucleotídeo em células da planta ou do material da planta resulta em uma redução ou eliminação da expressão e/ou do nível do polipeptideo EPF nativo e/ou da atividade do mesmo nessas células em comparação com células não transformadas; em que o polipeptideo EPF compreende uma sequência de SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de pelo menos 60% de identidade com a mesma.

46. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, de acordo com a reivindicação 39,

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15/20 caracterizado pelo fato de que a referida planta ou material da planta possui densidade estomática aumentada em comparação com uma planta ou material da planta não transformada equivalente.

47. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, como definido em qualquer uma das reivindicações 33 a 46, ou um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a planta ou material da planta é selecionado dentre qualquer uma de plantas inteiras, partes de plantas, tecidos de plantas ou células de plantas.

48. Planta monocotiledônea ou material de planta monocotiledônea, como definido em qualquer uma das reivindicações 32 a 47, ou método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta do gênero Hordeum L., Triticum L., Oryza L., ou Zea L. ou o material da planta é derivado de uma planta dos gêneros Hordeum L., Triticum L., Oryza L. ou Zea L.

49. Planta monocotiledônea, material de planta monocotiledônea ou método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta Hordeum vulgare L. ou o material da planta é derivado de uma planta Hordeum vulgare L.

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50. Planta monocotiledônea, material da planta monocotiledônea ou método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta Triticum aestivum L. ou o material da planta é derivado de uma planta de Triticum aestivum L.

51. Planta monocotiledônea, material de planta monocotiledônea ou método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta de Oryza sativa L. ou o material da planta é derivado de uma planta de Oryza sativa L.

52. Planta monocotiledônea, material da planta monocotiledônea ou método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta de Zea mays L. ou o material da planta é derivado de uma planta de Zea mays L.

53. Vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência polinucleotídica de;

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e. SEQ ID NO: 14; ou uma sequência de pelo menos 58% de identidade com a mesma; ou

f. SEQ ID NO: 15 ou uma sequência de pelo menos 95% de identidade com a mesma; ou

g. SEQ ID NO: 16 ou uma sequência de pelo menos 95% de identidade com a mesma.

54. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 16.

55. Kit de partes caracterizado pelo fato de que compreende ;

a. um vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 53 a 54; e

b. instruções de uso.

56. Método para identificar se uma planta tem resistência à infecção por um patógeno microbiano caracterizado pelo fato de compreender detectar em uma amostra da planta o nível de expressão de:

a. um polinucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 13 ou 14; ou

b. um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10;

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18/20 e comparar o nível de expressão ao de uma planta de controle; em que um aumento na expressão em relação ao da planta de controle é indicativo de resistência à infecção por um patógeno microbiano.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o patógeno é um patógeno bacteriano ou fúngico.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o patógeno é do gênero Pseudomonas ou Xanthomonas ou Puccinia ou Septoria.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o patógeno é Pseudomonas syríngae ou Puccinia hordei.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 59, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta monocotiledônea.

61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta do gênero Hordeum L., Triticum L., Oryza L. ou Zea L.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada dentre Hordeum vulgare L., Triticum aestivum L., Oryza sativa L. e Zea mays L.

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63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 59, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta Arabídopsís.

64. Dispositivo de diagnóstico para uso na detecção de uma planta que possui pelo menos resistência microbiana parcial, o dispositivo caracterizado pelo fato de que compreende:

a. uma área de carregamento para receber uma amostra biológica;

b. um substrato compreendendo pelo menos um parceiro de ligação especifico para uma molécula alvo indicativa da expressão de um polinucleotideo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 13 ou 14; e

c. meios de detecção para detectar os níveis do referido polinucleotideo presente na amostra.

65. Dispositivo de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um parceiro de ligação compreende iniciadores de ácido nucleico adaptados para hibridizar especificamente com um polinucleotideo da SEQ ID NO: 9 ou um fragmento da mesma sob condições rigorosas.

66. Dispositivo de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 64 ou reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um parceiro de ligação compreende

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20/20 ainda uma fração fluorescente, por exemplo, um molecular beacon.

67. Kit de peças para determinar seletivamente, em uma amostra, os níveis de expressão de um dos polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o kit compreende:

a. pelo menos um parceiro de ligação que se liga seletivamente a um polinucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 13 ou 14, ou um fragmento das mesmas;

b. um controle positivo para a detecção do referido polinucleotídeo ;

d. opcionalmente um padrão interno.