WO2012083393A2 - Vetor de dna recombinante, método para produção de plantas tolerantes a estresses ambientais e seus usos - Google Patents

Vetor de dna recombinante, método para produção de plantas tolerantes a estresses ambientais e seus usos Download PDF

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WO2012083393A2
WO2012083393A2 PCT/BR2011/000201 BR2011000201W WO2012083393A2 WO 2012083393 A2 WO2012083393 A2 WO 2012083393A2 BR 2011000201 W BR2011000201 W BR 2011000201W WO 2012083393 A2 WO2012083393 A2 WO 2012083393A2
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Marcelo Menossi Teixeira
Kevin Beggy PADILLA
Eduardo Dal'Ava MARIANO
Carolina Gimiliani LEMBKE
Gláucia Mendes SOUZA
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Universidade Estadual De Campinas- Unicamp
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Definitions

  • Plants are influenced by a large number of environmental, biotic and abiotic factors and recurrently abiotic stresses such as drought, salinity, temperature, pollution, radiation and so on are more severe and affect all plant functions resulting in reduced growth and of productivity. It is estimated that this type of stress generally affects physiological, biochemical and morphological levels, and may reduce productivity by 50% and in some cases up to 70%. This has led to efforts in understanding the response of plants to stress.
  • the present invention describes the production of transgenic plants tolerant to environmental stresses by the introduction of a gene encoding a new sugarcane protein of previously unknown function.
  • Agrobacterium transformation Hooykaas PS, Sch ⁇ lperoort RA (1992) Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Mol Biol 19: 15-38; Barton KA, Chilton MD (1983) Agrobacterium Ti plasmids as vectors Genetic Engineering Methods Enzymol 101: 527-539
  • the direct gene transfer in protoplasts Gharti-Chhetr ⁇ GB, Cherdshewasart, Oewuif J, Paszkowski J, Jacobs M, et al. (1990) Hybrid genes in the analysis of transformation conditions. 3.
  • microarrays or DNA chips have allowed to associate function with these hitherto unknown genes.
  • This low-cost technique allows one to know the DNA sequences of hundreds of thousands of distinct genes using fluorescent molecular tags that light up when a complementary strand is attached.
  • chips have allowed to know and identify genes involved in different plant processes, such as response to abiotic stresses, gene regulation, sucrose accumulation, pest resistance, tolerance to water scarcity, plant-pathogen interaction and so on.
  • cell membranes serve as a permeable barrier to the loss of water and some important molecules.
  • osmotic stress the availability of intercellular water is restricted, which changes extracellular solute concentrations, leading to osmotic imbalance. This causes water to flow out of the cells, causing a decrease in cell turgency and an increase in intracellular solute concentrations.
  • Reactive oxygen species and toxins generated during this process can also cause extensive damage to the cell.
  • Many patents describe different proteins that can tolerate abiotic factors such as drought and salt stress, such as dehydration-activated DNA binding elements (DREB / CBF), which make up an important family with a key role.
  • DREB / CBF dehydration-activated DNA binding elements
  • US7368630 describes a method for using the DREB1A gene to produce a plant, tissue or plant cell line with this transcription factor, as well as dehydration-induced genes from microarray studies.
  • US 7259297 describes transgenic plants created by introducing a gene encoding a DREB transcription factor that binds to the drought response element / crepeat (DRE) and activates the transcription of localized genes. in promoters with said DRE motif.
  • DRE drought response element / crepeat
  • DREB transcription factor overexpression activates the Rd29A, Rd29B, Rd17, Rd22, DREB1A, Cor6, Cor155, Erdl, and Kinl genes, inducing a rapid response in the plant under stress.
  • US7253000 comprises a nucleic acid sequence that utilizes one of the CBF group genes (C-repeat / dehydration-responsive element binding factor, which is another name given to DREB factors).
  • the present invention provides a method of plant production which contains in its cells a sequence of sugarcane nucleotides and the expression of this gene leads to greater tolerance to abiotic stresses to the plant in question.
  • the polynucleotide encoding the sugarcane protein is expressed by a plant-promoting promoter and terminator. More specifically, the present invention provides a recombinant DNA polynucleotide 5 'to 3' direction, comprising a plant-operating promoter operably linked to a second polynucleotide encoding a sugarcane protein operably linked to the terminator that terminates transcription of the DNA polynucleotide providing a polyadenylation site.
  • the invention also discloses a recombinant DNA sequence wherein the promoter is selected from the group consisting of inducible promoters, constitutive promoters, time-regulated promoters, tissue-preferred promoters, stress-specific promoters, drought-inducible promoters, inducible deficit promoters. water, and tissue-specific promoters.
  • the promoter is selected from the group consisting of inducible promoters, constitutive promoters, time-regulated promoters, tissue-preferred promoters, stress-specific promoters, drought-inducible promoters, inducible deficit promoters. water, and tissue-specific promoters.
  • Plants include, but are not limited to, monocotyledonous or dicotyledonous cultivated plants and may include sugar cane, soybean, corn, canola, rice, cotton, barley, oats, grass, wheat, jatropha, mango, guava, lemon, avocado, orange, plum, pitagueira, jabuticabeira, apple, peach, potato, pea, tomato, rose bush, sunflower, bean, eucalyptus, avocado, strawberry, pear, apple, guava, cocoa, lemon, passion fruit, fodder palm, castor, cassava, rubber, mate, rosewood, coffee, pumpkin, watermelon, peach, pitanga and cashew.
  • the invention also provides a method for producing abiotic stress tolerant plants, thanks to genetic transformation with a recombinant DNA molecule expressing a sugarcane protein, as well as plants and their cells and propagules, such as seeds, containing molecules in their genome. of this recombinant DNA.
  • Such plants have one or more of the following properties: a higher growth rate under conditions where drought and / or salt stress would be limiting to the growth of an unprocessed plant of the same species, a higher growth rate under conditions where water would be limiting to the growth of an unprocessed plant of the same species, a higher growth rate under conditions where the increase of salts or ions in the soil and / or water would be limiting to the growth of a plant 1 000201
  • the present invention comprises the propagation of plants of this invention, for example for the purpose of generating seeds, by simply planting such seeds in the soil, or well from sprouting, as is the case with sugar cane tails. , which allows these plants to grow, for example, under stressful conditions. More specifically, this invention provides a method for producing a plant which has as one of the characteristics, such as tolerance to abiotic stresses, increase or increase in root mass yield.
  • the invention comprises the steps of inserting into the genome of a plant cell the construction of a recombinant DNA molecule comprising a sugarcane gene, obtaining a transformed plant cell or transformed cells, regenerating transformed plants of plant cells and the selection of plants with the best agronomic characteristics. It is a feature of the invention that the selected plants have higher abiotic stress tolerance selected from the group consisting of salt stress tolerance, drought tolerance and survival after the combination of abiotic stresses.
  • Figure 1 (A) Polynucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1. (A) DNA sequence and (B) Protein deduced from the DNA fragment obtained from the sugarcane Scdrl gene.
  • Figure 2 Evaluation of real-time PCR expression of the Scdrl gene in plants subjected to water stress for 24, 72 and 120 hours.
  • VI SP83-5073, V2: SP90-1638, V3: SP83-2847 and V4: SP86-155.
  • VI and V3 are tolerant sugarcane varieties, and V2 and V4 are sensitive sugarcane varieties.
  • the asterisk indicates samples with values with statistically significant difference. 201
  • Figure 3 Effect of mannitol and NaCl on germination of plants containing SEQ. ID NO: 1. Germination percentage of transgenic tobacco plants containing SEQ ID NO: 1 (Scdrl-1, Scdrl-2 and Scdrl-3) and wild plants (wt) at different concentrations of mannitol and NaCI, evaluated over of 15 days.
  • A control;
  • B 200 mM mannitol;
  • C 300 mM mannitol;
  • D 100 mM NaCl and E): 175 mM NaCl.
  • Figure 4 Effects of saline and water stress on photosynthesis (A), C0 2 internal concentration (Ci), stomatal conductance (gs) and transpiration rate of wild plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1. 30 days were subjected to 10 days of irrigation with 200 mM mannitol or 175 mM NaCl and thereafter rehydrated for 3 days with water.
  • a- c photosynthesis (A)
  • df Internal CO 2 concentration (Ci)
  • gi stomatal conductance (gs)
  • jl perspiration rate (E); a, d, g and J: control treatment
  • b, e, hek 200 mM mannitol.
  • c, f, ie I 175 mM NaCl.
  • Figure 6 Effects of drought and saline stress on dry mass of wild plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1. 30-day plants were exposed for 10 days to 200 mM mannitol or 175 mM NaCI, and rehydrated for 3 days with Water. ***, ** and * indicate significant differences relative to control P ⁇ 0.0001, P ⁇ 0.001, and P ⁇ 0.01, respectively.
  • Figure 7 Phenotype of wild (wt) tobacco plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 maintained under water and saline stress.
  • Top Line wt and plants of three independent events containing SEQ ID NO: 1 (Scdrl-1, Scdrl-2 and Scdrl-3) grown under normal conditions for 5 weeks.
  • Middle line plants irrigated with 200 mM mannitol for 10 days and irrigated with water again for 3 days.
  • Bottom row plants irrigated for 10 days with 175 mM NaCI and irrigated again for 3 days.
  • the present invention describes the production of transgenic plants tolerant to environmental stresses by the introduction of a gene encoding a new sugarcane protein of previously unknown function.
  • the gene named Scdrl (drought-related sugar), is described in the sequence SEQ ID NO: 1 ( Figure IA), and the protein deduced from this DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 2 ( Figure 1B).
  • the invention described herein relates to recombinant DNA molecules comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 useful for producing transgenic plants and a method for producing genetically modified plants that overexpress a nucleic acid molecule comprising SEQ ID. NO: 1, which is involved in plant response to abiotic stresses.
  • the present invention further comprises a method for producing transgenic plants that overexpress a new sugarcane gene described in sequence SEQ ID NO: 1, which overexpression produces a significant improvement in plant response to abiotic stresses.
  • the gene indicated in SEQ ID NO: 1 directly or indirectly controls the response of plants against these stresses.
  • applications of the invention include, but are not limited to, improving plant yields that are tolerant to such abiotic stresses.
  • the invention encompasses sequences with similarity greater than 60% to SEQ ID NO: 1, but not limited to only them.
  • the DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 comprises the coding region of the Scdrl gene that is used as part of a chimeric DNA capable of enhancing expression in plant cells.
  • the plant transformation vector used to introduce nucleic acid into the plant cell may be a plasmid, wherein the DNA SEQ ID NO: 1 is inserted into restriction endonuclease cleavage sites or by recombination mediated by other protein types.
  • DNA is inserted into the cloning vector using readily known standard procedures. That generally involves the use of restriction enzymes and DNA ligases as described, for example, by Sambrook et al (Wood EJ (1983) Molecular Cloning - A Laboratory Manual - Maniatis, T, Fritsch, Ef, Sambrook. Biochemical Education 11 : 82-82).
  • the resulting plasmid which includes SEQ. ID NO: 1 can then be used to transform a plant cell, plant or plant part by conventional methods of transformation.
  • the preferred plasmid also includes a selection marker gene in plant transformation, although there are methods that preclude the use of such a marker gene.
  • Commonly used vegetable selection markers include the kanamycin resistance gene (neomycin phosphotransferase II or nptll), the hygromycin resistance gene (hygromycin phosphotransferase or HPT), the phosphinothricin acetyl transferase (bar) gene, the 5-enolpyruvylshiquimate gene 3-phosphate synthase (EPSPS), or acetolactate synthase (ALS) gene.
  • the selection marker is the Npt11 gene, which allows the selection of kanamycin transformants.
  • the plasmid may also include a reporter gene that provides a clear indication that the genetic transformation was effected by detecting the activity of the protein encoded by the reporter gene.
  • the most commonly used reporter genes encode beta-glucuronidase (GUS), luciferase and green fluorescent protein (GFP). Reporter genes are often framed in the promoter region and in close proximity to the gene of interest to ensure they are expressed together and not separated by crossover events.
  • the plasmid preferably also includes promoters suitable for expression of the nucleic acid indicated in SEQ ID NO: 1 and also for expression of the selection marker gene as well as the reporter gene.
  • the cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV 35S) is commonly used for plant transformation, as is the rice actin 1 (Actl), ubiquitin 1 (Ubil) gene, the alpha gene promoter -amylase, and stress-induced gene promoters.
  • the promoter used is the CaMV 35S promoter, but other promoters may also be used.
  • the DNA described in SEQ ID NO: 1 may be under the control of a constitutive promoter or may be under the control of the same gene promoter or a different promoter.
  • the plasmid preferably also includes a terminator-encoding nucleic acid molecule, such as the non-coding 3 'region of the genes encoding an actin protease inhibitor, cauliflower mosaic virus, or nopaline (NOS).
  • NOS nopaline synthase terminator
  • the plasmid is preferably a binary plant transformation vector in which the genes of interest are inserted within the edges of the T-DNA.
  • plant transformation vectors that may be used in the present invention are vectors obtained from commercial sources, such as the pCambia, pBH21 or pGreenll series containing a low replication RK2 origin, the neomycin phosphotransferase marker gene ( npt11), and the nopaline synthase terminator (NOS), constitutive promoter and a polyadenylation 3 'NOS signal.
  • any suitable method for the transformation of monocotyledons or dicotyledons can be used, such as Agrobacterium-mediated transformation or particle bombardment (also known as biobalistic transformation).
  • plant cells are contacted with an inoculum of bacteria transformed with the plasmid containing the DNA indicated in SEQ ID NO: 1 of the invention, for example by inoculating plant cells with a bacterial suspension. transformed.
  • Bacteria of the genus Agrobacterium which can be used to transform plant cells include species of Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens, preferably strains of A. tumefaciens LBA4404, EHA105 or GV301.
  • Agrobacterium spp. are transformed with the plasmid by known conventional methods.
  • A. tumefaciens bacteria with the DNA indicated in SEQ ID NO: 1 cloned into the binary vector are grown in a growth medium in the presence of antibiotics, for example, kanamycin for select the bacterial cells that have the binary plasmid. Wild tobacco leaves are then surface sterilized, cut into small disks and incubated in a suspension of A. tumefaciens for a suitable time. Different fabrics can be used for processing, such as leaves, stalk, flower among others. After incubation with A. tumefaciens the infected leaves are transferred to the culture medium in vitro for a certain period of time.
  • transgenic plants Selection of transgenic plants is initiated by placing infected plants in the in vitro selection medium with antibiotic. After the development of rooted seedlings occurs the transfer to soil and growth in growth chamber. Additionally, the present invention relates to the production of plasmid transformed transgenic plants containing the sequence indicated in SEQ ID NO: 1, increasing their tolerance to abiotic stresses such as drought and high salinity.
  • SEQ ID NO: 1 Another approach to increasing expression levels of SEQ ID NO: 1 may be the production of genetically modified plants that overexpress genes that induce endogenous gene promoter activity, such as genes encoding transcription factors.
  • the invention describes the method for producing transgenic plants which contains in their cells a chimeric gene capable of expression in plant cells, as well as subsequent generations comprising a DNA sequence of SEQ ID NO: 1 and DNA sequences that allow the expression of said protein in plant cells.
  • Transgenic plants according to the invention include, without limitation, cereals such as wheat, barley, maize, rice, oats, fodder grasses, peat, other monocotyledons such as sugar cane, miscanthus, or any species of other foods such as beans, soybeans, peas, tomatoes, rapeseed, as well as other species of economic interest, such as tobacco, oranges, etc.
  • cereals such as wheat, barley, maize, rice, oats, fodder grasses, peat, other monocotyledons such as sugar cane, miscanthus, or any species of other foods such as beans, soybeans, peas, tomatoes, rapeseed, as well as other species of economic interest, such as tobacco, oranges, etc.
  • Example 1 EVALUATION OF THE SCDR1 GENE EXPRESSION LEVEL OF SUGAR
  • a quantitative Real-time PCR was performed as described by Rocha et al (Rocha FR, Papini-Terzi FS, Nishiyama MY, Vencio RZN, Vicentini R, et al. (2007) Signal Bmc Genomics 8) using sugarcane leaves with higher drought tolerance (SP83-5073 and SP83-2847) and two with higher drought sensitivity (SP86-155 and SP90- 1638) maintained under irrigation or rainfed (with irrigation suspension, equivalent to drought stress).
  • the sugarcane polyubiquitin gene was used.
  • Dry expression was determined using the 2- ⁇ " method (Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C (T)) Ethods 25: 402-408) using non-stressed (irrigated) samples as a control
  • the statistical significance of relative gene expression differences was determined by assuming a log-normal model that calculates the probability Pr (sample>reference).;-) and Pr (sample ⁇ reference) for induced and repressed genes, respectively.
  • Pr sample>reference
  • Pr sample ⁇ reference
  • Example 2 CLONING OF SEQ ID NO: 1 SUGAR CANE AND PRODUCTION OF A RECOMBINANT CASSETTE.
  • a sugarcane Scdrl gene sequence clone was obtained from the Brazilian Clone Collection Center (BCCCENTER, Jaboticabal, Brazil). From this DNA the complete coding sequence, indicated in SEO ID NO: 1 ( Figure 1), was PCR amplified using specific 5 -GGATCCCTCATCGCCAGCTCCCAT-3- ' and 5-TCTAG ACCTGTGCAGTGTCGG ATTATTC-3 and cloned into pGEMT-Easy vector (Promega, USA). Subsequently, the coding region of the Scdrl gene containing SEQ ID NO: 1 was removed with the enzymes BamHI and Xbal and inserted into the pRT104 vector digested with the same enzymes.
  • the expression cassette was released by HindIII digestion and cloned into the pCAMBIA 2301 (Cambia, Australia) expression vector, also digested with the same enzyme.
  • the resulting final recombinant construct (pCAMBIA2301: Scdrl) was introduced into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (CLONTECH, USA).
  • Wild tobacco seeds (Nicotiana tabacum, var. SRI) were germinated in Petri dishes containing Murashige-Skoog (MS) medium with 0.9% (w / v) agar.
  • the seedlings were transplanted to soil, composed of Baccto (Michigan Peat Co., USA) and sand (4: 1, v / v) in 325 mL pots. When the plants developed between 10 and 12 leaves, they were transplanted to 1 L pots containing the same mixture mentioned above.
  • the plants were grown in a growth chamber with 16 / 8h light / dark (300-400 ⁇ photons m V 1 ) photoperiod at 25 ° C and 75-80% relative humidity.
  • the plants were induced to flowering by length of light exposure.
  • Wild tobacco leaves were sterilized on their surface, cut into small discs and incubated in a suspension of A. tumefaciens for 5 to 20 min. After this, the infected leaves were transferred to MS medium (supplemented with 2 mg L "1 benzyl adenine and 0.1 mg L " 1 naphthylacetic acid) for 3 days.
  • MS medium supplemented with 2 mg L "1 benzyl adenine and 0.1 mg L " 1 naphthylacetic acid
  • Transgenic plant selection was initiated by placing infected plants in the selection medium (MS, 2 mg / L 1 benzyladenine, 0.1 mg / L "1 naphthylacetic acid and 100 mg / L 1 kanamycin, or 30 mg / L " 1 hygromycin and 500 mg / L "1 carbenicillin).
  • the initial characterization of the plants rooted and transferred to soil was first made by the histochemical assay using X-GIuc as substrate for detection of beta-glucuronidase gene, also inserted in the expression cassette.
  • the tube was gently inverted several times to achieve a homogeneous emulsion and the samples were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes. Immediately after the tubes were carefully removed from the microcentrifuge, the upper (aqueous) phase was transferred to a new 1.5 mL tube, avoiding contaminants. 1 000201
  • chlorophyll solution 24 parts chloroform: 1 part isoamyl alcohol
  • the tubes were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes and the upper phase was transferred to a new container.
  • SEQ ID NO: 1 The presence of SEQ ID NO: 1 in genomic DNA extracted from transgenic tobacco plants was confirmed by polymerase chain reaction (PCR). Initially ⁇ DNA, 1.5 ⁇ 4 dNTP (10mM), 1.4 ⁇ MgCI 2 (25mM), sense ⁇ Primer sense (10 ⁇ ), ⁇ Antisense Primer (10 ⁇ ), 2.5 ⁇ _ Taq Buffer 0,3 ⁇ , 0.3 ⁇ were used. Taq Polymerase (Fermentation), 16.3 ⁇ MilliQ water and this reaction was subjected to the following amplification program: 3 minutes at 94 ° C plus 30 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at a temperature of 54 ° C, 2 minutes at 72 ° C and 7 minutes at 72 ° C.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the seeds were superficially sterilized with 70% alcohol for 1 min, incubated in 2% NaCIO for 30 min and washed five to six times in sterile distilled water. Seeds were sown in Petri dishes (30 seeds per plate) containing solid Murashige-Skoog (MS) medium, pH 5.8, in a 23 ° C chamber with 16/8 h light / dark photoperiod (300-400 mmol photons m "2 s " 1 ).
  • MS Murashige-Skoog
  • SEQ ID NO: 1 showed similar germination percentage (Figure 3A). Water stress inhibits or reduces germination in tobacco plants. In the medium containing 200 mM mannitol the seeds of plants containing SEQ ID NO: 1 showed reduced germination percentage compared to wild seeds ( Figure 3B). Under conditions of higher water stress (300 mM), the germination of transgenic and wild plants was strongly reduced ( Figure 3C) and completely inhibited by 400 mM mannitol. Therefore, plants with the Scdrl gene indicated in SEQ ID NO: 1 showed higher tolerance to water stress.
  • germination and initial seedling growth are the most sensitive phases to abiotic stress. For example, some environmental factors such as low temperatures, high salt concentrations or water deficit in the environment significantly retard germination and reduce the rate of germination events. Low seed germination rate can result in uneven soil establishment and reduced yield.
  • a desirable plant characteristic for the production of commercial cultivars. under field conditions is the ability of the seed to germinate rapidly and evenly under stress conditions.
  • Transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 germinated more than 20% at high stress concentrations, while wild seeds were completely inhibited.
  • the performance of transgenic tobacco seeds carrying the gene of interest was better than wild plants under water stress conditions, indicating that the study gene plays a protective role in the early stages of plant development.
  • the seeds were superficially sterilized with 70% alcohol for 1 min, incubated in 2% NaCIO for 30 min and washed five to six times in sterile distilled water. Seeds were sown in Petri dishes (30 seeds per plate) containing solid Murashige-Skoog (MS) medium, pH 5.8, in a 23 ° C chamber with 16/8 h light / dark photoperiod (300-400 mmol photons m "2 s " 1 ) and to test the effect of saline stress NaCl (0, 100, 175 mM) was used in the culture medium. The number of germinated seeds was observed daily for 15 days, and germination was defined as the appearance of the hypocotyl.
  • MS Murashige-Skoog
  • soil salinity is a global problem, which not only precludes the use of large areas for agriculture, but may also reduce productivity in certain agricultural areas as a result of saline increase due to inappropriate water irrigation by have a high salt content.
  • SEQ ID NO: 1 is useful for producing genetically modified plants with greater salinity tolerance.
  • Example 7 EVALUATION OF PHOTOSYTHETIC PARAMETERS OF TRANSGENIC PLANTS CONTAINING SEQ ID NO: 1 SUBMITTED TO WATER STRESS.
  • Example 8 EVALUATION OF PHOTOSYTHETIC PARAMETERS OF TRANSGENIC PLANTS CONTAINING SEQ ID NO: 1 SUBMITTED TO SALINE STRESS
  • wild plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days and then transferred to Plantmax HT pots (Eucatex, Brazil) in a growth chamber. at 22 ° C and 18 hours of light. The plants were irrigated daily with 70 ml of water for 4 weeks before stress began.
  • transgenic and wild plants were regularly irrigated with water for five weeks (control treatment), while a group of plants was irrigated with 150 mM NaCI for 10 days and subsequently rehydrated for three days with water (in the following days). control plants maintained irrigation for the duration of the experiment).
  • SEQ ID NO: 1 SUBMITTED TO WATER STRESS. Wild and transgenic tobacco seeds containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days in Petri dishes containing MS medium and pH 5.8. The seedlings were then transferred to 500 ml pots containing Plantmax HT (Eucatex, Brazil) for 3 weeks in a growth chamber at 23 ° C with 16/8 h light / dark photoperiod and fertilized weekly with nutrient solution (EPPQ, Brazil). ). Each plant was irrigated with 70 ml of a 200 mM mannitol solution for 10 days and then irrigated for three days with pure water for recovery.
  • Plantmax HT Plantmax HT
  • Wild and transgenic tobacco seeds containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days in Petri dishes containing MS medium and pH 5.8. The seedlings were transferred to 500 ml pots containing Plantmax HT (Eucatex, Brazil) for 3 weeks and kept in a growth chamber at 23 ° C with 16/8 h light / dark photoperiod and fertilized weekly with nutrient solution (EPPQ, Brazil). ). Each plant was irrigated with 70 ml of a 175 mM NaCl solution for 10 days and then irrigated for three days with pure water for recovery.
  • Plantmax HT Eucatex, Brazil
  • Leaf water content was calculated as 100x (FW-DW) / (FW), with FW being fresh mass and DW being dry weight.
  • Saline stress decreased water content in wild plants, while transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were able to keep leaf water content almost unchanged ( Figure 5), indicating that plants that overexpress Scdrl are capable of to maintain turgidity under stressful conditions.
  • Example 11 ASSESSMENT OF THE EFFECT OF SEQ ID NO: 1 ON PLANT DRY MASS
  • Wild tobacco plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days and then transferred to containers containing Plantmax HT (Eucatex, Brazil). The plants were deposited in a growth chamber at 22 ° C with 18 hours of light and irrigated daily with 70 ml of water for 4 weeks before stress began. For water stress the seedlings were irrigated with 70 ml of 200 mM mannitol for 10 days and then irrigated again with water for three days as described by Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68: 131-143).
  • Example 12 EVALUATION OF THE EFFECT OF SEQ ID NO: 1 ON DRY PASTA OF SALINE STRESS PLANTS.
  • Wild tobacco plants and transgenic plants containing SEQ ID NO: 1 were germinated for 16 days and then transferred to pots containing Plantmax HT (Eucatex, 201
  • Example 13 VISUAL INSPECTION OF THE EFFECT OF WATER AND SALINE STRESS ON WILD TOBACCO PLANTS AND TRANSGENIC PLANTS CONTAINING SEQ ID NO: 1.

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Abstract

As plantas são influenciadas por um grande número de fatores ambientais bióticos e abióticos e recorrentemente estresses abióticos são mais graves, afetando todas as funções da planta, resultando em redução do crescimento e da produtividade. Nesse sentido, a identificação e a compreensão dos mecanismos de tolerância abióticos são fundamentais no desenvolvimento de novas cultivares tolerantes à seca. Dessa forma, a presente invenção proporciona um método de produção de plantas que contém em suas células uma sequência de nucleotídeos de cana-de-açúcar e a superexpressão desse gene leva a planta em questão à maior tolerância a estresses abióticos. De uma forma mais ampla, descreve-se um polinucleotídeo que codifica a proteína de cana-de-açúcar, o qual é expresso por um promotor e um terminador que funcionam em plantas. Verifica-se que este gene confere tolerância a diferentes estresses abióticos.

Description

"VETOR DE DNA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE PLANTAS TOLERANTES A
ESTRESSES AMBIENTAIS E SEUS USOS"
CAMPO DA INVENÇÃO
As plantas são influenciadas por um grande número de fatores ambientais, bióticos e abióticos e recorrentemente estresses abióticos, como seca, salinidade, temperatura, poluição, radiação e etc, são mais graves e afetam todas as funções da planta, resultando em redução do crescimento e da produtividade. Estima-se que esse tipo de estresse afete geralmente fatores fisiológicos, bioquímicos e os níveis morfológicos, podendo reduzir a produtividade em 50% e em alguns casos até 70%. Isso tem levado a esforços no entendimento da resposta das plantas a estresses.
Nesse sentido, a identificação e a compreensão dos mecanismos de tolerância abióticos são fundamentais no desenvolvimento de novas cultivares tolerantes a diferentes estresses abióticos. Dessa forma, a presente invenção descreve a produção de plantas transgênicas tolerantes a estresses ambientais graças à introdução de um gene que codifica uma nova proteína de cana-de-açúcar, de função até então desconhecida.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Um dos principais problemas na agricultura é a seca, que de longe é o estresse ambiental mais importante. Muitos esforços têm sido feitos para melhorar a produtividade das plantas sob condições limitantes de água. Nas ultimas décadas tem-se investido fortemente na produção de plantas transgênicas tolerantes a estresses, dentre os quais se destacam a seca e o estresse salino. Isso tem permitido compreender melhor as respostas fisiológicas e moleculares das plantas aos estresses, abrindo perspectivas de aumentar o rendimento em condições de estresses.
Dentre as tecnologias para produção de plantas tolerantes, a transformação por Agrobacterium (Hooykaas PS, Schílperoort RA (1992) Agrobacterium and plant genetíc engineering. Plant Mol Biol 19: 15-38; Barton KA, Chilton MD (1983) Agrobacterium Ti plasmids as vectors for plant genetic engineering. Methods Enzymol 101: 527-539), a transferência direta de genes em protoplastos (Gharti-Chhetrí GB, Cherdshewasart , Oewuif J, Paszkowski J, Jacobs M, et al. (1990) Hybrid genes in the analysis of transformation conditions. 3. Temporal/spatial fate of NPTII gene integration, its inheritance and facto rs affecting these processes in Nicotiana plumbaginifolia. Plant Mol Biol 14: 687-696; Lyznik LA, Peng JY, Hodges TK (1991) Simplified procedure for transient transformation of plant protoplasts using polyethylene glycol treatment. Biotechniques 10: 294-300; Rodenburg KW, de Groot MJ, Schilperoort RA, Hooykaas PJ (1989) Single-stranded DNA used as an efficient new vehicle for transformation of plant protoplasts. Plant Mol Biol 13: 711-719 e Bailas N, Zakai N, Loyter A (1987) Transient expression of the plasmid pCaMVCAT in plant protoplasts following transformation with polyethyleneglycol. Exp Celi Res 170: 228-234) e o bombardeamento de partículas (Klein TM, Wolf ED, Sanford JC (1987) High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327: 70-73) são as mais utilizadas.
Nos últimos anos tem-se obtido grande avanço nas tecnologias para a transformação de plantas e as pesquisas têm se voltado para a necessidade de desenvolver eficazes métodos de transformação genética das principais espécies de interesse experimental e económico. A agrotransformação tem ganhado grande aceitação pela facilidade do método de transformação e a alta taxa de plantas transgênicas geradas a partir desse método. Por outro lado, o tabaco tem sido utilizado amplamente como ferramenta de transformação gênica pela facilidade de transformação e rápida obtenção de gerações transformadas. Desta forma, genes de diferentes espécies podem ser avaliados inicialmente em tabaco, pela facilidade e rapidez na produção e análise das plantas transgênicas. Isso tem ocorrido com genes de cereais, produtos hortícolas, plantas ornamentais, medicinais, árvores frutíferas, pastagens, dentre outros. Assim, embora o tabaco seja uma planta dicotiledônea, ele oferece evidência clara que genes de monocotiledôneas, como cana-de-açúcar, milho, trigo e arroz, possam conferir tolerância a estresses abióticos tanto em plantas monocotiledôneas como dicotiledôneas.
Nos últimos anos, com a chegada de novas tecnologias como o sequenciamento genômico, microarrays e outras tecnologias (Mardis ER (2008) Next-generation DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387-402) têm aumentado as informações sobre os genes, até o ponto do patenteamento de genomas completos (Stix G (2006) Owning the stuff of life. Sei Am 294: 76-83 e Stott M, Valentine J (2003) Impact of gene patenting on R&D and commerce. Nat Biotechnol 21: 729-731; author reply 731). A partir dessas novas abordagens, um grande número de genes vem sendo identificado. Dessa forma, tem-se buscado cada vez mais o patententeamento de plantas ricas em alguns nutrientes e vitaminas, que apresentem aumento na produção ou na tolerância a estresses, entre outros.
Dentro dos estresses, os de tipo abiótico têm tido um interesse particular para aplicação na agricultura devido ao efeito negativo sobre o desenvolvimento e a produtividade em geral, bem como pelo temor às mudanças climáticas. Um dos tipos de estresses mais estudados e consequentemente com alto número de patentes é a seca, que é a principal causa de déficit hídrico ou estresse osmótico nas plantas (Cattivelli L, Rizza F, Badeck FW, Mazzucotelli E, Mastrangelo AM, et al. (2008) Drought tolerance improvement in crop plants: An integrated view from breeding to genomics. Field Crops Research 105: 1-14). Apesar do avanço na identificação de genes nos mais diversos genomas, existe um grande grupo de genes em todo genoma que ainda não se conhece sua função. Esses genes podem estar envolvidos em muitas das mais importantes vias de resposta da planta a estresses, crescimento, fotossíntese, etc. Uma das mais recentes técnicas denominada microarrays ou chips de DNA tem permitido associar função a esses genes até então desconhecidos. Essa técnica de baixo custo permite conhecer a sequências de DNA de centenas de milhares de genes distintos usando tags moleculares fluorescentes que se acendem quando se liga uma fita complementar. Desta forma os chips têm permitido conhecer e identificar genes envolvidos em diferentes processos da planta, como resposta a estresses abióticos, regulação gênica, acúmulo de sacarose, além de resistência a pragas, tolerância à escassez de água, interação planta- patógeno e etc.
Os mecanismos de tolerância à seca em plantas têm semelhanças com outros tipos de estresses (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2006) Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses. Annual Review of Plant Biology 57: 781-803), uma vez que as mesmas proteínas e osmoprotetores estão envolvidos em respostas moleculares para diferentes tipos de estresse. Adicionalmente, a maioria dos estresses abióticos começa com um tipo de estresse, por exemplo, osmótico que logo desencadeia os outros. Isto implica que um gene ou via de transdução de sinais identificados como resposta a um estresse especifico pode estar envolvido nas respostas de vários outros tipos de estresses (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2006) e Zhu JK (2002) Salt and drought stress signal transduction in plants. Annu Rev Plant Biol 53: 247-273).
Ao nível celular, as membranas celulares servem como uma barreira permeável para a perda de água e de algumas moléculas importantes. Porém, durante o estresse osmótico, a disponibilidade de água intercelular é restrita, o que altera as concentrações extracelulares de solutos, levando a um desequilíbrio osmótico. Desta forma ocorre um fluxo de água para fora das células, causando uma diminuição na turgência da célula e um aumento nas concentrações intracelulares de solutos. As espécies reativas de oxigénio e toxinas geradas durante esse processo também podem causar um dano extensivo para a célula. Muitas são as patentes que descrevem diferentes proteínas capazes de conferir tolerância a fatores abióticos como seca e estresse salino, tais como os elementos de ligação a DNA ativados em resposta a desidratação (DREB/CBF), os quais compõem uma importante família com um papel chave na regulação de transdução de sinal induzida pelo estresse (Oh S, Song S, Kim Y, Jang H, im S, Kim M, Kim Y, Nahm B, Kim J. (2005). Arabidopsis CBF3/DREB1A and abf3 in transgenic Rrice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth. Plant Physiology. 138:341-351; Stockinger E, Gilmour S, Thomashow M. (1997). Arabidopsis Thaliana CBFl Encodes An AP2 Domain-Containing Transcription Activator That Binds To The C-Repeat/DRE, A Cis-Acting DNA Regulatory Element That Stimulates Transcription In Response To Low Temperature And Water Deficit. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94:1035-1040). Proteínas CBF/DREB possuem diferentes domínios e foram identificadas em diferentes espécies. Os documentos US7368630, US7259297 e US7253000 utilizam estes importantes reguladores da transcrição para a produção de plantas transgênicas tolerantes ao estresse hídrico. 201
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A patente US7368630 descreve um método para usar o gene DREB1A para produzir uma linha de células vegetais, tecidos ou plantas com este fator de transcrição, assim como os genes induzidos por desidratação a partir de estudos de microarrays. Por sua vez, o documento US7259297, descreve plantas transgênicas criadas pela introdução de um gene que codifica um fator de transcrição DREB que se liga ao elemento de resposta a seca DRE/CRT (Drought Response Element/Crepeat) e ativa a transcrição de genes localizados em promotores com o referido motivo DRE. Segundo essa patente, a superexpressão do fator de transcrição DREB ativa os genes Rd29A, Rd29B, Rdl7, Rd22, DREB1A, Cor6, Corl5a, Erdl e Kinl, induzindo uma resposta rápida na planta quando esta submetida ao estresse. Da mesma forma, a patente US7253000 compreende uma sequência de ácido nucléico que utiliza um dos genes pertencentes ao grupo CBF (C-repeat/dehydration-responsive element binding factor, que e um outro nome dado aos fatores DREB).
Outras patentes descrevem o uso de vários fatores de transcrição envolvidos na tolerância ao estresse em plantas como, por exemplo, a WO2005024028 e JP2006158402, que empregam fatores de transcrição tipo dedo de zinco (Zinc finger) para conferir tolerância a estresse hídrico nas plantas. Por sua vez, o documento US2008163397, utilizou o fator de transcrição CAAT-binding, conferindo tolerância a seca e ao estresse por frio, utilizando o dominio B do fator de transcrição. Da mesma forma, na patente US2009265813 utiliza-se o fator de transcrição AP2, para obtenção de plantas transgênicas relacionadas com múltiplas características, incluindo o crescimento reforçado da raiz e obtendo tolerância à seca como resultado final.
As patentes aqui mencionadas são reflexo do potencial biotecnológico dos genes que codificam fatores de transcrição, proteínas quinases e outras proteínas envolvidas nas respostas das plantas à seca. Essas proteínas atuam protegendo diretamente componentes celulares durante a desidratação, bem como amplificando o sinal molecular da percepção do estresse hídrico, permitindo a planta antecipar e acelerar os mecanismos de defesa. Nenhum documento apresenta proteção sobre genes relacionados ao gene Scdrl, cuja sequência encontra-se descrita em SEQ ID: 1 (Figura 1 A). Apesar do crescimento em pesquisas com cana-de-açúcar, são poucos os exemplos de invenções que utilizam genes de cana para produção de plantas com maior tolerância a estresses abióticos (Affenzeller MJ, Darehshouri A, Andosch A, Lutz C, Lutz-Meindl U (2009) Salt stress-induced cell death in the unicellular green alga Micrasterías denticulata. J Exp Bot 60: 939-954 e Molinari HBC, Marur a, Daros E, de Campos MKF, de Carvalho JFRP, et al. (2007) Evaluation of the stress-inducible production of proline in transgenic sugarcane (Saccharum spp.): osmotic adjustment, chlorophyll fluorescence and oxidative stress. Physiologia Plantarum 130: 218-229). E o uso de genes de cana que dão tolerância a estresses abióticos, em contraponto a genes de outras espécies, permite a produção de plantas transgênicas da cana contendo genes da própria cana, os quais têm maior aceitação pelos consumidores. De fato, 70% dos consumidores dão suporte a modificações genéticas envolvendo genes da própria espécie, em contraste com o suporte de 26% quando se tratam de genes de outras espécies (Rommens CM (2010) Barríers and paths to market for genetícally engineered crops. Plant Biotechnology Journal 8: 101-111). Portanto, esta invenção relaciona-se com a direta manipulação de uma seqiiência de
DNA que codifica uma proteína de cana-de-açúcar. O conhecimento prévio no estado da arte não permite associar qualquer função específica ao gene alvo desta invenção. Esta invenção descreve também a construção de vetores que contém a sequência da proteína de cana-de- açúcar, bem como um processo de produção de plantas transgênicas de forma a produzir um fenótipo de tolerância a estresse hídrico, salino, maior biomassa e maior fotossíntese, dentre outros possíveis.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona um método de produção de plantas que contém em suas células uma seqiiência de nucleotídeos de cana-de-açúcar e a expressão desse gene leva à maior tolerância a estresses abióticos à planta em questão.
Em uma forma mais ampla, o polinucleotídeo codificando a proteína de cana-de-açúcar é expresso por um promotor e um terminador que funcionam em plantas. Mais especificamente, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo de DNA recombinante no sentido 5' para 3', que compreende um promotor que funciona em plantas, operacionalmente ligado a um segundo polínucleotídeo que codifica uma proteína de cana, operavelmente ligado ao terminador que finaliza a transcrição do polínucleotídeo de DNA fornecendo um sítio de poliadenilação.
A invenção também descreve uma sequência de DNA recombinante em que o promotor é selecionado do grupo constituído por promotores induzíveis, promotores constitutivos, promotores regulados temporalmente, promotores com preferência por tecidos, promotores de estresses específicos, promotores induzíveis por seca, promotores induzíveis pelo déficit de água, e os promotores tecido-específicos.
Também são descritas células vegetais e plantas que contêm em seu genoma moléculas de DNA recombinante, tal como descrito e os propágulos e descendentes delas produzidas. As plantas incluem, mas não estão limitadas a plantas de cultivo, monocotiledôneas ou dicotiledôneas e dentre elas podem-se incluir cana-de-açúcar, soja, milho, canola, arroz, algodão, cevada, aveia, grama, trigo, pinhão manso, mangueira, goiabeira, limoeiro, abacateiro, laranjeira, ameixeira, pitagueira, jabuticabeira, macieira, pessegueira, batateira, ervilheira, tomateiro, roseira, girassol, feijão, eucalipto, abacate, morango, pêra, maçã, goiaba, cacau, limão, maracujá, palma forrageira, mamona, mandioca, seringueira, mate, jacarandá, café, abóbora, melancia, pêssego, pitanga e caju.
A invenção também proporciona um método para produção de plantas tolerantes aos estresses abióticos, graças à transformação genética com uma molécula de DNA recombinante que expressa uma proteína de cana, bem como as plantas e suas células e propágulos, como sementes, contiverem em seu genoma moléculas desse DNA recombinante.
Tais plantas apresentam uma ou mais das seguintes propriedades: uma maior taxa de crescimento em condições onde a seca e/ou o estresse salino seriam limitantes para o crescimento de uma planta não-transformada da mesma espécie, uma maior taxa de crescimento em condições onde a água seria limitante para o crescimento de uma planta não- transformada da mesma espécie, uma maior taxa de crescimento, sob condições em que o aumento de sais ou íons no solo e / ou água seria limitante para o crescimento de uma planta 1 000201
não-transformada da mesma espécie, maior porcentagem de plantas sobreviventes após um período prolongado de seca ou sob estresse salino do que uma planta não-transformada da mesma espécie, um rendimento maior quando comparado a uma planta não-transformada da mesma espécie, ou maior tolerância à seca em comparação com uma planta não-transformada da mesma espécie.
A presente invenção compreende a propagação de plantas desta invenção, por exemplo, com a finalidade de gerar sementes, por simplesmente plantar tais sementes no solo, ou bem a partir de brotação, como é o caso de uso de toletes em cana-de-açúcar, e que permite a essas plantas crescer, por exemplo, sob condições de estresse. Mais especificamente, esta invenção fornece um método para produzir uma planta que tem como uma das características, tais como tolerância a estresses abióticos, aumento ou incremento no rendimento da massa de raízes. A invenção compreende as etapas de inserir no genoma de uma célula de planta, a construção de uma molécula de DNA recombinante compreendendo um gene cana-de-açúcar, a obtenção de uma célula de planta transformada ou células transformadas, a regeneração de plantas transformadas de células vegetais e a seleção de plantas que apresentam melhores características agronómicas. Uma das características da invenção é o fato das plantas selecionadas apresentarem maior tolerância a estresses abióticos selecionado do grupo consistindo de tolerância ao estresse salino, tolerância à seca e sobrevivência após o a combinação de estresses abióticos. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: (A) Sequência de polinucleotídeo correspondente à SEQ ID NO: 1. (A) Sequência de DNA e (B) Proteína deduzida do fragmento de DNA obtido a partir do gene Scdrl de cana-de- açúcar.
Figura 2: Avaliação da expressão por real-time PCR do gene Scdrl em plantas submetidas a estresse hídrico por 24, 72 and 120 horas. VI: SP83-5073, V2: SP90-1638, V3: SP83-2847 and V4: SP86-155. VI e V3 são variedades de cana-de-açúcar tolerantes, e V2 e V4 são variedades de cana-de-açúcar sensíveis. O asterisco indica amostras com valores com diferença estatisticamente significativa. 201
Figura 3: Efeito de manitol e NaCI sob a germinação de plantas contendo a SEQ. ID NO: 1. Porcentagem de germinação de plantas transgênicas de tabaco contendo a SEQ ID NO: 1 (Scdrl-1, Scdrl-2 e Scdrl-3) e plantas selvagens (wt) em diferentes concentrações de manitol e NaCI, avaliadas ao longo de 15 dias. (A): controle; (B): 200 mM manitol; (C): 300 mM manitol; (D): 100 mM NaCI e E): 175 mM NaCI.
Figura 4: Efeitos dos estresses salino e hídrico sobre a fotossíntese (A), Concentração interna de C02 (Ci), condutância estomática (gs) e taxa de transpiração de plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1. Plantas de 30 dias foram submetidas a 10 dias de irrigação com 200 mM manitol ou 175 mM NaCI e após isso reidratadas por 3 dias com água. a- c: fotossíntese (A), d-f: Concentração interna de C02 (Ci); g-i: condutância estomática (gs); j-l: taxa de transpiração (E); a,d, g e J: tratamento controle, b, e, h e k: 200 mM mannitol. c, f, i e I: 175 mM NaCI.
Figura 5: Conteúdo de água em folhas estressadas de plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1. Plantas de 30 dias foram expostas durante 10 dias a 200 mM mannitol ou 175 mM NaCI, e após o estresse foram irrigadas com água por 3 dias. No tratamento controle as plantas foram irrigadas durante o experimento todo com água (n=5). ***, ** e * indicam diferenças significativas relativas ao controle P < 0.0001, P < 0.001, e P < 0.01, respectivamente.
Figura 6: Efeitos da seca e estresse salino sob massa seca das plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1. Plantas de 30 dias foram expostas durante 10 dias a 200 mM mannitol ou 175 mM NaCI, e reidratadas por 3 dias com água. ***, ** e * indicam diferenças significativas relativas ao controle P < 0.0001, P < 0.001, e P < 0.01, respectivamente.
Figura 7: Fenótipo de plantas de tabaco selvagens (wt) e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 mantidas sob estresse hídrico e salino. Linha Superior: wt e plantas de três eventos independentes contendo a SEQ ID NO: 1 (Scdrl-1, Scdrl-2 e Scdrl-3) crescidas em condições normais por 5 semanas. Linha do meio: plantas irrigadas com 200 mM manitol por 10 dias e irrigadas com água novamente por 3 dias. Linha inferior: plantas irrigadas por 10 dias com 175 mM NaCI e irrigadas novamente por 3 dias. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve a produção de plantas transgênicas tolerantes a estresses ambientais graças à introdução de um gene que codifica uma nova proteína de cana-de-açúcar, de função até então desconhecida. O gene, nomeado Scdrl (sugarçane drought-related), é descrito na sequência SEQ ID NO: 1 (Figura IA), e a proteína deduzida a partir dessa sequência de DNA está indicada na SEQ ID NO:2 (Figura 1B).
O invento descrito neste documento refere-se a moléculas de DNA recombinante compreendendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1, útil para produzir plantas transgênicas e um método para produção de plantas geneticamente modificadas que superexpressam uma molécula de ácido nucléico que compreende a SEQ ID NO: 1, que está envolvido na resposta das plantas a estresses abióticos. Além disso, o presente invento compreende ainda um método para produção de plantas transgênicas que superexpressam um novo gene de cana-de-açúcar descrito na sequência SEQ ID NO:l, cuja superexpressão produz uma melhora significativa na resposta da planta aos estresses abióticos. Assim, determina-se que o gene indicado na SEQ ID NO:l controla direta ou indiretamente a resposta de plantas contra esses estresses.
Como tal, as aplicações da invenção incluem, mas não estão limitadas, à melhoria da produção de plantas que sejam tolerantes a esses estresses abióticos. Da mesma forma, a invenção compreende as sequências com similaridade igual o superior a 60% à SEQ ID NO: 1, mas não limitantes a somente elas.
A sequência de DNA descrita em SEQ ID NO: 1 compreende a região codificante do gene Scdrl que é usada como parte de um DNA quimérico capaz de aumentar a expressão em células vegetais.
O vetor de transformação de plantas usado para introduzir o ácido nucléico na célula vegetal pode ser um plasmídeo, em que o DNA SEQ ID NO:l é inserido em sítios de clivagem de endonucleases de restrição ou por recombinação mediada por outros tipos de proteína. O DNA é inserido no vetor de clonagem utilizando procedimentos padrão facilmente conhecidos. Isso geralmente envolve o uso de enzimas de restrição e ligases do DNA, conforme descrito, por exemplo, por Sambrook et al (Wood EJ (1983) Molecular-Cloning - a Laboratory Manual - Maniatis,T, Fritsch,Ef, Sambrook . Biochemical Education 11: 82-82). O plasmídio resultante, que inclui a SEQ. ID NO:l pode então ser usado para transformar uma célula vegetal, plantas ou partes de plantas por métodos convencionais de transformação.
Para a transformação de plantas, o plasmídeo de preferência também inclui um gene marcador de seleção na transformação de plantas, embora existam métodos que prescindam do uso desse tipo de gene marcador. Marcadores seleção de vegetais comumente usados incluem o gene de resistência a canamicina, (neomicina fosfotransferase II ou nptll), o gene de resistência a higromicina (higromicina fosfotransferase ou HPT), o gene de fosfinotricina acetil transferase (bar), o gene 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou gene da acetolactato sintase (ALS). Na presente invenção, o marcador de seleção é o gene Nptll, que permite a seleção dos transformantes com canamicina.
O plasmídeo também pode incluir um gene repórter que fornece uma indicação clara de que a transformação genética foi efetuada através da detecção da atividade da proteína codificada pelo gene repórter. Os genes repórteres mais comumente utilizados são os que codificam a beta-glucuronidase (GUS), a luciferase e a proteína verde fluorescente (GFP). Genes repórter são muitas vezes colocados em frame da região promotora e nas proximidades do gene de interesse para assegurar que elas são expressas em conjunto e não separadas por eventos do crossover.
O plasmídeo, de preferência também inclui os promotores adequados para a expressão do ácido nucléico indicado na SEQ ID NO: 1 e também para a expressão do gene marcador de seleção, assim como o gene repórter. O promotor do vírus do mosaico couve-flor 35S (CaMV 35S) é comumente utilizado para a transformação de plantas, bem como o do gene da actina 1 de arroz (Actl), da ubiquitina 1 (Ubil), o promotor do gene da alfa-amilase, e promotores de genes induzidos por estresse. Na presente invenção, o promotor utilizado é o promotor CaMV 35S, mas outros promotores também podem ser utilizados. No plasmídeo, o DNA descrito em SEQ ID NO:l pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou pode estar sob o controle do promotor do mesmo gene ou de um promotor diferente. Para a transformação de plantas, o plasmídeo de preferência inclui também uma molécula de ácido nucléico codificando o terminator, como a região 3' não codificante dos genes que codificam um inibidor de protease de actina, do vírus do mosaico da couve-flor, ou da nopalina (NOS). Na presente invenção, o plasmídeo inclui o terminador da nopalina sintase (NOS).
O plasmídeo é de preferência um vetor de transformação de plantas binário em que os genes de interesse são inseridos dentro das bordas do T-DNA. Exemplos de tais vetores de transformação de plantas que podem ser usados na presente invenção são vetores obtidos a partir de fontes comerciais, tais como a serie pCambia, pBH21 ou pGreenll que contém uma origem RK2 de baixa replicação, o gene marcador da neomicina-fosfotransferase (nptll), e o terminador da nopalina sintase (NOS), promotor constitutivo e um sinal de 3' NOS de poliadenilação. Para a transformação das plantas, qualquer método adequado para a transformação de monocotiledôneas ou dicotiledôneas pode ser usado, como por exemplo a transformação mediada por Agrobacterium ou bombardeamento de partículas (também conhecida como transformação de biobalística). Na transformação mediada por Agrobacterium, as células vegetais são colocadas em contato com um inoculo de bactérias transformadas com o plasmídeo contendo o DNA indicado na SEQ ID NO: 1 da invenção, por exemplo, através da inoculação de células de plantas com uma suspensão de bactérias transformadas. Bactérias do género Agrobacterium que podem ser utilizados para transformar células vegetais incluem espécies de Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens de preferência cepas de A. tumefaciens LBA4404, EHA105 ou GV301. Agrobacterium spp. são transformadas com o plasmídeo por métodos convencionais conhecidos.
Por sua vez, utilizando-se um protocolo de transformação de discos foliares, bactérias de A. tumefaciens com o DNA indicado na SEQ ID NO:l clonado no vetor binário são cultivadas em um meio de crescimento na presença de antibióticos, como por exemplo, canamicina, para selecionar as células bacterianas que possuem o plasmídeo binário. Em seguida, folhas de tabaco selvagem são esterilizadas superficialmente, cortadas em pequenos discos e incubadas numa suspensão de A. tumefaciens por um tempo adequado. Diferentes tecidos podem ser utilizados para a transformação, tais como folhas, talo, flor dentre outros. Após a incubação com A. tumefaciens as folhas infetadas são transferidas ao meio de cultura in vitro por determinado período de tempo. A seleção das plantas transgênicas é iniciada colocando-se as plantas infetadas no meio de seleção in vitro com antibiótico. Após o desenvolvimento de plântulas com raízes ocorre a transferência para solo e o crescimento em câmara de crescimento. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a produção de plantas transgênicas transformadas com plasmídeos contendo a seqiiência indicada em SEQ ID NO:l, aumentando sua tolerância a estresses abióticos, como seca e alta salinidade.
Outra abordagem para se aumentar os níveis de expressão de SEQ ID NO: 1 pode ser a produção de plantas geneticamente modificadas que superexpressem genes que induzam a atividade do promotor do gene endógeno, como é o caso de genes que codificam fatores de transcrição.
Assim, a invenção descreve o método para produção de plantas transgênicas que contém em suas células um gene quimérico com capacidade de expressão em células vegetais, assim como as subsequentes gerações compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 1 e sequências de DNA que permitam a expressão da referida proteína em células vegetais.
Plantas transgênicas, de acordo com a invenção, incluem, sem limitação, os cereais, como trigo, cevada, milho, arroz, aveia, gramíneas forrageiras, turfa, outras monocotiledôneas como cana-de-açúcar, miscanthus, ou qualquer espécie de cultura de outros alimentos como o feijão, a soja, ervilha, tomate, colza, bem como outras espécies de interesse económico, como o tabaco, a laranja, etc.
EXEMPLOS
Exemplo 1: AVALIAÇÃO DO NÍVEL DE EXPRESSÃO DO GENE SCDR1 DE CANA-DE-AÇÚCAR Para avaliar o padrão de expressão do gene Scdrl sob seca foi feito um Real time-PCR quantitativo conforme descrito por Rocha et al (Rocha FR, Papini-Terzi FS, Nishiyama MY, Vencio RZN, Vicentini R, et al. (2007) Signal transduction-related responses to phytohormones and environmental challenges in sugarcane. Bmc Genomics 8) utilizando folhas de variedades de cana com maior tolerância à seca (SP83-5073 e SP83-2847) e duas com maior sensibilidade à seca (SP86-155 e SP90-1638) mantidas sob irrigação ou em sequeiro (com suspensão de rega, equivalente à estresse por seca). Como gene de referência foi utilizado o gene da poliubiquitina de cana.
A expressão sob seca (sequeiro) foi determinada a partir do método 2-ΔΔΠ" (Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. ethods 25: 402-408), utilizando amostras não submetidas ao estresse (irrigadas) como controle. A significância estatística das diferenças de expressão gênica relativas foi determinada assumindo-se um modelo log-normal que calcula a probabilidade Pr (amostra > referência;-) e Pr (amostra < referência) para genes induzidos e reprimidos, respectivamente. O Perfil de expressão foi considerado válido quando P>0,95. Para cada tratamento foram usadas folhas de seis plantas.
O resultado da análise mostrou que a expressão do gene Scdrl foi fortemente induzida após 72 horas de estresse nas variedades tolerantes à seca, sendo reprimido em praticamente todas as demais amostras avaliadas (Figura 2). Esses dados sugeriram que o gene Scdrl poderia estar envolvido na tolerância à seca em cana.
Exemplo2: CLONAGEM DA SEQ ID NO: 1 DE CANA-DE-AÇÚCAR E PRODUÇÃO DE UM CASSETE RECOMBINANTE.
Um clone com sequência do gene Scdrl de cana-de-açúcar foi obtido do Brazilian Clone Collection Center (BCCCENTER, Jaboticabal, Brasil). A partir desse DNA a sequência codificante completa, indicada na SEO ID NO: 1 (Figura 1), foi amplificada por PCR utilizando oligonucleotideos específicos 5 -GGATCCCTCATCGCCAGCTCCCAT-3-' e 5 - TCTAG ACCTGTGCAGTGTCGG ATTATTC-3 e clonada no vetor pGEMT-Easy (Promega, EUA). Posteriormente, a região codificante do gene Scdrl contendo a SEQ ID NO: 1 foi retirada com as enzimas BamHI e Xbal e inserida no vetor pRT104 digerido com as mesmas enzimas. O cassete de expressão foi liberado pela digestão com Hindlll e clonado no vetor de expressão pCAMBIA 2301 (Cambia, Austrália), também digerido com a mesma enzima. A construção recombinante final resultante (pCAMBIA2301: Scdrl) foi introduzida em Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 (CLONTECH, EUA).
Exemplo 3: PRODUÇÃO DE PLANTAS GENETICAMENTE MODIFICADAS
Sementes selvagens de tabaco (Nicotiana tabacum, var. SRI) foram germinadas em placas de Petri contendo meio Murashige-Skoog (MS) com 0,9% (w/v) de agar. As plântulas foram transplantadas para solo, composto de Baccto (Michigan Peat Co., EUA) e areia (4:1, v/v) em potes de 325 mL. Quando as plantas desenvolveram entre 10 e 12 folhas, foram transplantadas para potes de 1 L contendo a mesma mistura antes mencionada.
As plantas foram crescidas em câmara de crescimento com fotoperíodo de 16/8h luz/escuro (300-400 μιτιοΙ fótons m V1) a 25°C e umidade relativa de 75-80%. Para a produção de sementes, as plantas foram induzidas à floração por extensão do tempo de exposição à luz.
Folhas de tabaco selvagem foram esterilizadas em sua superfície, cortadas em pequenos discos e incubadas numa suspensão de A. tumefaciens por 5 a 20 min. Após isto, as folhas infetadas foram transferidas ao meio MS (suplementado com 2 mg L"1 benzil-adenina e 0,1 mg L"1 ácido naftilacético) por 3 dias. A seleção das plantas transgênicas foi iniciada colocando as plantas infetadas no meio de seleção (MS, 2 mg/L 1 benziladenina, 0,1 mg/L"1 ácido naftilacético e 100 mg/L 1 canamicina, ou 30 mg/L"1 higromicina e 500 mg/L"1 carbenicilina). Os explantes que então se desenvolveram foram transferidas para o meio MS com 0,1 mg/L"l ácido 3-indol acético, 100 mg/L"1 canamicina, ou 30 mg/L"1 higromicina, e 500 mg/L"1 carbenicillina enquanto as plantas enraizadas foram transferidas para solo e crescidas em câmara de crescimento com fotoperíodo de 16/8h luz/escuro (300-400 μηιοΙ fótons m-2 s"1) à 25°C e umidade relativa de 75-80%. Exemplo 4: ANÁLISES DA PRESENÇA DA SEQ ID NO: 1 EM PLANTAS GENETICAMENTE MODIFICADAS
A caracterização inicial das plantas enraizadas e transferidas para solo foi feita primeiramente por o ensaio histoquímico utilizando-se o X-GIuc como substrato para a detecção do gene beta-glucuronidase, também inserido no cassette de expressão.
Observou-se que um grande número de plantas apresentou forte coloração azul, as quais foram utilizadas para confirmar a integração do transgene contendo o gene Scdrl indicado na SEQ ID NO:l por PCR, utilizando-se DNA genômico como molde.
Em seguida foi extraído DNA total de amostras de folha de plantas selvagens e plantas transgênicas. Para tal, coletaram-se cerca de 50 - 150 mg de folha, que foram transferidos rapidamente para um almofariz contendo nitrogénio líquido. Após evaporação no nitrogénio, o material foi pulverizado até obter um pó bastante fino, ao qual acrescentaram-se 3 mL de tampão de extração. Imediatamente a solução foi transferida para tubos plásticos estéreis de 1,5 mL, os quais foram mantidos em banho-maria a 65°C, por 30 minutos, com agitação suave a cada 10 minutos.
Logo depois, foram adicionados aos tubos 10 microlitros de Proteinase K e os mesmos foram incubados novamente em banho-maria a 65°C por 30 minutos, com agitação suave a cada 10 mim. Em seguida, os tubos foram centrifugados numa microcentrífuga a 10.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi então transferido para um novo tubo plástico de 1,5 mL e, após atingir a temperatura ambiente, foi feita a primeira extração de DNA utilizando-se fenol-clorofórmio (1:1), na proporção de 1:1 (1 parte do sobrenadante: 1 parte de fenol- clorofórmio).
Em sequência, o tubo foi invertido suavemente por várias vezes para conseguir uma emulsão homogêna e as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos. Imediatamente após os tubos serem retirados cuidadosamente da microcentrífuga, a fase superior (aquosa) foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL, evitando-se os contaminantes 1 000201
17/26 da fase inferior. Logo em seguida foi adicionada RNAse 100 mg/mL (1:100) e a mistura foi incubada a 37°C por 30 minutos.
Na última fase da ext ração foi adicionado o mesmo volume da solução de clorofil (24 partes de clorofórmio: 1 parte de álcool isoamílico) e a mistura foi colocada sob agitação suave por 5 minutos. Os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm durante 10 minutos e a fase superior foi transferida para um novo recipiente.
Finalmente, adicionou-se o mesmo volume da solução de clorofil e a mistura foi agitada suavemente. Em seguida, centrifugaram-se os tubos a 10.000 rpm durante 10 minutos e a fase superior foi transferida para um novo tubo. A essa fase aquosa superior, adicionou-se 1 volume de álcool isopropílico e a solução foi, então, homogeneizada até a formação de um precipitado de DNA. O DNA precipitado foi lavado no próprio tubo em álcool 70%, por três vezes e foram adicionados 100 μί de água ultra pura. O DNA genômico foi armazenado a 4°C.
A presença de SEQ ID NO: 1 no DNA genômico extraído de plantas transgênicas de tabaco foi confirmada pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Inicialmente foram utilizados ΙμΙ de DNA, 1,5μί 4 dNTP (lOmM), 1,4μί MgCI2 (25mM), Ιμί de Primer sense (10μΜ), ΙμΙ Primer antisense (10μΜ), 2,5μΙ_ Tampão Taq ΙΟχ, 0,3μί Taq Polimerase (Fermentas), 16,3μί de água MilliQ e essa reação foi submetida ao seguinte programa de amplificação: 3 minutos à 94°C mais 30 ciclos de 30 segundos à 94°C, 30 segundos a uma temperatura de 54°C, 2 minutos a 72°C e 7 minutos a 72°C. O produto dessa reação foi visualizado em gel de agarose 0,8% em TAE contendo brometo de etídeo, sob iluminação de luz ultra-violeta. Dentre 12 amostras de plantas supostamente transgênicas, a presença da SEQ ID NO:l foi confirmada em 8. Essas plantas foram utilizadas nos ensaios posteriores para observar os efeitos do gene Scdrl indicado na SEQ ID NO:l nas características das plantas de tabaco. Exemplo 5: ANÁLISE DA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE PLANTAS GENETICAMENTE
MODIFICADAS CONTENDO A SEQ ID NO: 1 SOB CONDIÇÕES DE ESTRESSE HÍDRICO 0201
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Para determinar os efeitos do estresse hídrico sobre a germinação foram utilizadas sementes de plantas de tabaco do tipo selvagem e de plantas transgênicas identificadas no Exemplo 4.
As sementes foram esterilizadas superficialmente com álcool 70% por 1 min, incubadas em NaCIO 2% por 30 min e lavadas por cinco a seis vezes em água destilada estéril. As sementes foram semeadas em placas de Petri (30 sementes por placa) contendo meio Murashige-Skoog (MS) sólido, pH 5,8, em uma câmara a 23°C com fotoperiodo 16 / 8 h luz/escuro (300-400 mmol fótons m" 2 s"1).
Então, as sementes que foram transformadas em três eventos independentes (Scdrl-1, Scdrl-2 e Scdrl-3), foram utilizadas para avaliar a porcentagem de germinação em meio de cultura contendo manitol verificando-se a resposta ao estresse hídrico. Para testar o efeito da seca foi utilizado manitol no meio de cultura nas concentrações de 0, 200, 300 e 400 mM. O número de sementes germinadas foi observado diariamente durante 15 dias e a germinação foi definida como o surgimento do hipocótilo. Na condição controle sem manitol, sementes de plantas selvagens e plantas contendo a
SEQ ID NO: 1 apresentaram similar porcentagem de germinação (Figura 3A). O estresse hídrico inibe ou reduz a germinação em plantas de tabaco. No meio contendo 200 mM manitol as sementes das plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram porcentagem de germinação reduzida comparada com as sementes selvagens (Figura 3B). Em condições de estresse hídrico mais alto (300 mM), a germinação de plantas transgênicas e selvagens foi fortemente reduzida (Figura 3C) e completamente inibida em 400 mM de manitol. Portanto, as plantas com o gene Scdrl indicado em SEQ ID NO: 1 apresentaram maior nível de tolerância ao estresse hídrico.
Em numerosas plantas cultivadas, a germinação e o crescimento inicial de plântulas são as fases mais sensíveis a estresses abióticos. Por exemplo, alguns fatores ambientais, como baixas temperaturas, altas concentrações de sal ou de déficit hídrico no meio retardam significativamente a germinação e reduzem a taxa de eventos germinativos. A baixa taxa de germinação de sementes pode resultar no estabelecimento irregular no solo, e redução da produtividade. Uma característica da planta desejável para a produção de cultivares comerciais em condições de campo é a habilidade da semente para germinar rapidamente e de forma homogénea sob condições de estresse.
As plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 germinaram mais de 20% em altas concentrações de estresse, enquanto que as sementes selvagens foram completamente inibidas. O desempenho de sementes transgênicas de tabaco carregando o gene de interesse foi melhor do que plantas selvagens em condições de estresse hídrico, indicando que o gene de estudo desempenha um papel protetor nos estágios iniciais de desenvolvimento da planta.
Exemplo 6: ANÁLISE DA GERMINAÇÃO SOB ESTRESSE SALINO
Para determinar os efeitos do estresse hídrico salino sobre a germinação foram utilizados sementes de plantas transgênicas de tabaco do tipo selvagem e transgênicas, identificadas no exemplo 4.
As sementes foram esterilizadas superficialmente com álcool 70% por 1 min, incubadas em NaCIO 2% por 30 min e lavadas cinco a seis vezes em água destilada estéril. As sementes foram semeadas em placas de Petri (30 sementes por placa) contendo meio Murashige-Skoog (MS) sólido, pH 5,8, em uma câmara a 23°C com fotoperíodo 16/8 h luz/escuro (300-400 mmol fótons m"2 s"1) e para testar o efeito do estresse salino foi utilizado NaCI (0, 100, 175 mM) no meio de cultura. O número de sementes germinadas foi observado diariamente durante 15 dias, sendo a germinação foi definida como o surgimento do hipocótilo.
Quando as sementes foram plaqueadas em 100 mM NaCI não se encontraram diferenças entre as plantas transgênicas e não transgênicas (Figura 3D). No entanto, utilizando- se uma concentração de estresse mais severo (175 mM NaCI), a germinação foi totalmente inibida em sementes selvagens, mas só moderadamente nas plantas contendo SEQ ID NO: 1, as quais atingiram 50% de germinação (Figure 3E). Os resultados demonstram que o gene Scdrl, indicado na SEQ ID NO:l em plantas transgênicas, melhora a germinação sob estresse salino. Diferentes respostas a estresses abióticos são o resultado de interações cooperativas entre os vários componentes bioquímicos, fisiológicos e de caracteres morfológicos. Essas interações podem variar entre espécies e mesmo variedades, como observado para o estresse hídrico. Plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram alta nível de tolerância ao estresse salino.
Como mencionado anteriormente, a germinação e o crescimento da plântula são fases muito sensíveis às condições estressantes. Por sua vez, a salinidade dos solos é um problema global, que não só impede o uso de grandes áreas para a agricultura, mas também pode reduzir a produtividade em certas áreas agrícolas, em decorrência do aumento salino ocorrido devido à irrigação com água inapropriada por apresentar elevado conteúdo de sais.
Em condições de alta salinidade, enquanto as plantas selvagens apresentaram total inibição da germinação, as plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram 50% de germinação. Consequentemente, esta invenção mostra que a SEQ ID NO: 1 é útil para a produção de plantas geneticamente modificadas com maior tolerância à salinidade.
Exemplo 7: AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS FOTOSSINTÉTICOS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS CONTENDO A SEQ ID NO: 1 SUBMETIDAS A ESTRESSE HÍDRICO.
Para avaliar a resposta ao estresse hídrico, plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram germinadas durante 16 dias e logo transferidas para potes contendo Plantmax HT (Eucatex, Brasil) em câmara de crescimento, a 22°C e com 18 horas de luz. As plantas foram irrigadas diariamente com 70 ml de água por 4 semanas antes de começar o estresse.
Para o estresse hídrico utilizaram-se cinco plantas por tratamento e por genótipo (selvagem e transgênico), as quais foram irrigadas com 70 ml de manitol 200 mM por 10 dias e depois foram irrigadas novamente com água por três dias, como descrito por Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68: 131-143). Para estimar a condutância estomática de C02 (gs), taxa de transpiração (E), fotossíntese
(A) e concentração interna de C02 (Ci), sob condições controle e sob estresse hídrico, foram utilizadas folhas completamente expandidas na mesma posição das plantas de tabaco. Avaliaram-se três eventos independentes de plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO:_l e plantas selvagens. As medições foram realizadas com equipamento IRGA (LCpro+; ADC bioscientific, Reino Unido), numa concentração de C02 de 360 pL L"1, intensidade de luz de 1000 pmol m 1, fluxo de gás 200 mL min"1 e temperatura dentro da câmara de 25°C (Guo Q, Zhang J, Gao Q, Xing S, Li F, et al. (2008) Drought tolerance through overexpression of monoubiquitin in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology 165: 1745-1755).
Todas as variáveis fisiológicas analisadas foram negativamente afetadas pelo estresse hídrico, tanto nas plantas selvagens como nas plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1. No entanto, as plantas transgênicas apresentaram melhor desempenho nas análises fisiológicas realizadas. A taxa de fotossíntese (A) nas plantas transgênicas contendo SEQ ID NO: 1, submetidas a estresse hídrico, apresentou uma rápida recuperação quando as plantas foram reidratadas durante 3 dias, ao contrario das plantas selvagens que não conseguiram recuperá-la (dia 13 na Figura 4B).
Da mesma forma, tanto gs (Figura 4H) como E (Figura 4K) foram rapidamente recuperadas durante a reidratarão após o estresse hídrico. Ci mostrou valores similares sob condições normais, enquanto que sob condições de estresse as plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram melhor desempenho que as plantas selvagens (Figura 4E). Em resumo, foi observada uma clara diferença entre plantas transgênicas e selvagens em todos os parâmetros fotossintéticos avaliados em condições de seca. As culturas agrícolas usualmente experimentam escassez de água em algum momento ao longo do seu ciclo de vida e, dependendo da duração e intensidade do estresse hídrico, podem ocorrer perdas expressivas na produtividade. Parâmetros importantes da fisiologia das plantas quando submetidas a estresse hídrico foram menos afetados naquelas que continham a SEQ ID NO: 1, comparativamente às plantas selvagens. Isto indica que a presente invenção contribui para a produção de plantas geneticamente modificadas com melhor performance em condições de escassez de água.
Exemplo 8: AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS FOTOSSINTÉTICOS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS CONTENDO A SEQ ID NO: 1 SUBMETIDAS A ESTRESSE SALINO Para avaliar o efeito da SEQ ID NO: 1 em condições de estresse salino, plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram germinadas durante 16 dias e logo transferidas para potes contendo Plantmax HT (Eucatex, Brasil) em câmara de crescimento a 22°C e 18 horas de luz. As plantas foram irrigadas diariamente com 70 ml de água por 4 semanas antes de começar o estresse.
Para avaliar o efeito do estresse salino, plantas transgênicas e selvagens foram regularmente irrigadas com água por cinco semanas (tratamento controle), enquanto um grupo de plantas foi irrigado com 150 mM NaCI por 10 dias e posteriormente foram reidratadas por três dias com água (nas plantas controle foi mantida a irrigação durante o tempo do experimento).
Três eventos independentes de plantas transgênicas contendo a SEQ. ID NO: 1 foram avaliados em termos de condutância estomática (gs), taxa de transpiração (E), fotossíntese (A), e concentração interna de C02 (Ci), sob condições controle e sob estresse salino.
A avaliação da taxa de fotossíntese (A) em plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foi reduzida em resposta ao estresse salino, apresentando uma rápida recuperação quando as plantas foram reidratadas durante três dias, enquanto que as plantas selvagens não apresentaram essa recuperação (Figura 4C). Por sua vez, tanto gs, (Figura 41) como E (Figura 4L) foram rapidamente recuperados durante a reidratação após o estresse salino. Ci mostrou similares valores sob condições normais, embora sob condições de estresse as plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram melhor desempenho que as plantas selvagens (Figura 4F).
Em resumo, foi observada que as plantas contendo a SEQ ID NO: 1 apresentaram melhor performance que as plantas selvagens em todos os parâmetros fotossintéticos avaliados durante o estresse salino. Exemplo 9: AVALIAÇÃO DO TEOR RELATIVO DE ÁGUA DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
CONTENDO A SEQ ID NO: 1 SUBMETIDAS A ESTRESSE HÍDRICO. Sementes de tabaco selvagens e transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram germinadas por 16 dias em placas de Petri contendo meio MS e pH 5,8. As plântulas foram então transferidas para vasos de 500 ml contendo Plantmax HT (Eucatex, Brasil) durante 3 semanas mantidos em uma câmara de crescimento a 23 °C com fotoperíodo 16/8 h luz/escuro e adubadas semanalmente com solução nutritiva (EPPQ, Brasil). Cada planta foi irrigada com 70 ml de uma solução de 200 mM de manitol por 10 dias e, em seguida, irrigada por três dias com água pura para a recuperação.
Para estimar-se o teor de água na folha, amostras de plantas foram incubadas a 80 °C por 24 horas para avaliar o seu peso seco. O teor de água na Folha foi calculado como 100x(FW- DW)/(FW), sendo FW a massa fresca e DW o peso seco. Sob estresse hídrico o conteúdo de água nas folhas foi reduzido drasticamente nas plantas selvagens (Figura 5). Em contraste, plantas transgênicas contendo SEQ ID NO: 1 foram capazes de manter quase inalterado seu conteúdo de água, indicando que a SEQ ID NO: 1 confere uma capacidade maior de manutenção da turgência sob condições de estresse hídrico. Exemplo 10: AVALIAÇÃO DO TEOR RELATIVO DE ÁGUA DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
CONTENDO A SEQ ID NO: 1 SUBMETIDAS A ESTRESSE SALINO.
Sementes de tabaco selvagens e transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram germinadas por 16 dias em placas de Petri contendo meio MS e pH 5,8. As plântulas foram transferidas para vasos de 500 ml contendo Plantmax HT (Eucatex, Brasil) durante 3 semanas e mantidas em câmara de crescimento a 23 °C com fotoperíodo 16/8 h luz/escuro, sendo adubadas semanalmente com solução nutritiva (EPPQ, Brasil). Cada planta foi irrigada com 70 ml de uma solução de 175 mM de NaCI por 10 dias e, em seguida, irrigada por três dias com água pura para a recuperação.
Para estimar o teor de água na folha, amostras de plantas foram incubadas a 80 °C por 24 horas para avaliar o seu peso seco. O teor de água na folha foi calculado como lOOx(FW-DW) /(FW), sendo FW a massa fresca e DW o peso seco. O estresse salino diminuiu o conteúdo de água nas plantas selvagens, enquanto que as plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram capazes de manter quase inalterado o conteúdo de água na folha (Figura 5), indicando que as plantas que superexpressam Scdrl são capazes de manter a turgência sob condições de estresse. Exemplo 11: AVALIAÇÃO DO EFEITO DA SEQ ID NO: 1 NA MASSA SECA DE PLANTAS
SUBMETIDAS A ESTRESSE HÍDRICO.
Plantas de tabaco selvagens e plantas transgênicas contendo SEQ ID NO: 1 foram germinadas durante 16 dias e logo transferidas para recipientes contendo Plantmax HT (Eucatex, Brazil). As plantas foram depositadas numa câmara de crescimento a 22°C com 18 horas de luz e irrigadas diariamente com 70 ml de água por 4 semanas antes de começar o estresse. Para o estresse hídrico as plântulas foram irrigadas com 70 ml de manitol 200 mM, por 10 dias, e depois foram irrigadas novamente com água por três dias, como descrito por Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68: 131-143).
Amostras das plantas foram coletadas e mantidas a 80 °C por 24 horas para avaliação da massa seca nas raízes e na parte aérea, como descrito por Guo et al. (Guo Q, Zhang J, Gao Q, Xing S, Li F, et al. (2008) Orought tolerance through overexpression of monoubíquitin in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology 165: 1745-1755). Observou-se uma redução na massa das plantas selvagens e transgênicas quando submetidas à seca, comparativamente às do tratamento controle. No entanto, ao final do tratamento de estresse hídrico, as plantas transgênicas contento a SEQ ID NO:l apresentaram mais massa seca que as plantas selvagens (Figura 6).
Exemplo 12: AVALIAÇÃO DO EFEITO DA SEQ ID NO: 1 NA MASSA SECA DE PLANTAS SUBMETIDAS A ESTRESSE SALINO.
Plantas de tabaco selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO: 1 foram germinadas durante 16 dias e logo transferidas para potes contendo Plantmax HT (Eucatex, 201
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Brazil), permaneceram localizadas numa câmara de crescimento a 22°C com 18 horas de luz e foram irrigadas diariamente com 70 ml de água por 4 semanas antes de começar o estresse. Para o estresse salino as plantas foram irrigadas com 70 ml de NaCl 175 mM, por 10 dias, e depois foram irrigadas novamente com água por três dias, como descrito por Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasíng the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68: 131-143).
Amostras das plantas transformadas foram coletadas e mantidas a 80 °C por 24 horas para avaliação da massa seca nas raízes e na parte aérea, como descrito por Guo et al. (Guo Q, Zhang J, Gao Q, Xing S, Li F, et al. (2008) Drought tolerance through overexpression of monoubiquitin in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology 165: 1745-1755).
Observou-se que o estresse salino reduz a massa seca de plantas selvagens e transgênicas. No entanto, a presença da SEQ ID NO: 1 nas plantas transgênicas associou-se à uma maior capacidade de acumulação de matéria seca em condições de estresse salino (Figura 6).
Exemplo 13: INSPEÇÃO VISUAL DO EFEITO DOS ESTRESSE HÍDRICO E SALINO EM PLANTAS DE TABACO SELVAGEM E EM PLANTAS TRANSGÊNICAS CONTENDO A SEQ ID NO: 1.
Para avaliar a resposta aos estresses hídrico e salino, plantas selvagens e plantas transgênicas contendo a SEQ ID NO:l foram germinadas durante 16 dias e logo transferidas para potes contendo Plantmax HT (Eucatex, Brasil) em câmara de crescimento a 22°C com 18 horas de luz e irrigadas diariamente com 70 ml de água por 4 semanas antes de começar o estresse. Para avaliar o efeito do estresse hídrico as plântulas foram irrigadas com 70 ml de manitol 200 mM por 10 dias e depois foram irrigadas novamente com água por três dias, como descrito por Zhang et al. (Zhang XX, Liu SK, Takano T (2008) Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasíng the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Molecular Biology 68: 131-143) e para avaliar o efeito do estresse salino as plantas foram irrigadas com 150 mM NaCl por 10 dias e posteriormente foram reidratadas por três dias com água. No tratamento controle as plantas foram irrigadas durante o tempo do experimento.
Em condições controle, todas as plantas tiveram resultados semelhantes (figura 7), enquanto sob estresse hídrico e salino as folhas das plantas selvagens apresentaram murchas. Por sua vez, as plantas transgênicas contendo a SEQ. ID NO: 1 exibiram um fenótipo praticamente similar às plantas mantidas sem estresse (figura 7).
Essas mesmas plantas foram usadas nas análises mostradas nos exemplos 7 e 8 e estão em concordância com a melhor performance das plantas em quanto ao parâmetros fotossintéticos. Da mesma forma, esse fenótipo observado na Figura 7 também é um reflexo dos maiores teores de água mostrados nos exemplos 9 e 10, bem como com a maior massa seca mostrada nos exemplos 11 e 12.

Claims

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REIVINDICAÇÕES
Método para produção de plantas geneticamente modificadas, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) Produção de um vetor que compreenda a seqiiência descrita em SEQ ID NO:l; b) Produção de um vetor em que a sequência descrita em SEQ ID NO:l esteja operacionalmente ligada a um promotor funcional em plantas; c) Produção de um vetor em que a sequência descrita em SEQ ID NO:l esteja operacionalmente ligado a um terminador funcional em plantas; d) Inserção do dito vetor compreendendo a seqiiência descrita em SEQ ID NO:l, o promotor e o terminador no genoma de célula vegetal, planta ou partes de plantas.
Método para produção de plantas geneticamente modificadas, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) Produção de um vetor que compreenda pelo menos 60% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO:l; b) Produção de um vetor em que a sequência com pelo menos 60% de identidade com a seqiiência descrita em SEQ ID NO:l esteja operacionalmente ligada a um promotor funcional em plantas; c) Produção de um vetor em que a seqiiência com pelo menos 60% de identidade com a seqiiência descrita em SEQ ID NO:l esteja operacionalmente ligado a um terminador funcional em plantas; d) Inserção do dito vetor compreendendo a seqiiência com pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID NO:l, o promotor e o terminador no genoma de célula vegetal, planta ou partes de plantas.
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3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas plantas geneticamente modificadas apresentarem no seu genoma a sequência gênica SEQ ID NO:l.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelas plantas geneticamente modificadas apresentarem no seu genoma sequência gênica com pelo menos 60% de identidade com SEQ ID NO:l.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela sequência gênica SEQ ID NO:l ser obtida de cana-de-açúcar.
6. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por poder ser aplicado em monocotiledônias.
7. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por poder ser aplicado em dicotiledônias.
8. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser aplicado em tabaco.
9. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser aplicado em cana-de- açúcar, soja, milho, arroz e trigo.
10. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por permitir a integração do vetor no genoma da célula vegetal.
11. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por modular a tolerância da planta a estresses ambientais.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo estresse ambiental ser preferencialmente seca.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo estresse ambiental ser preferencialmente salinidade.
14. Vetor de DNA recombinante, caracterizado por compreender a sequência gênica descrita em SEQ ID NO.l. 3/5
15. Vetor, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender uma sequência de polinucleotídeos responsável pela produção de um polipeptídeo descrito na SEQ ID NO: 2.
16. Vetor de DNA recombinante, caracterizado por compreender uma seqiiência gênica com pelo menos 60% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO:l.
17. Vetor, de acordo a reivindicação 16, caracterizado por compreender uma sequência de polinucleotídeos responsável pela produção de um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
18. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por ser vetor de expressão ou vetor de clonagem.
19. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por poder ser um plasmídeo.
20. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado pelos genes de interesse serem inseridos entre as bordas do T-DNA de um vetor binário.
21. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por conter um promotor operacionalmente ligado à sequência gênica de interesse.
22. Vetor, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo promotor ser preferencialmente o promotor CaMV 35 S do vírus do mosaico do couve-flor.
23. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por conter um terminador operacionalmente ligado à sequência gênica de interesse.
24. Vetor, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo ácido nucléico que codifica o terminador ser, preferencialmente, o da nopalina sintase (NOS).
25. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por poder conter um gene marcador.
26. Vetor, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo gene marcador ser preferencialmente o gene Nptll.
27. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por poder conter um gene repórter.
28. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por ser capaz de permitir a transferência de DNA para célula vegetal, planta ou partes de plantas.
29. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de célula vegetal, planta ou partes de planta.
30. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de sementes a partir de plantas que contém a sequência descrita em SEQ ID NO:l.
31. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de sementes a partir de plantas que contém sequência gênica com pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID NO:l.
32. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de partes de plantas usadas com a finalidade de reprodução assexuada a partir de plantas que contém a sequência descrita em SEQ ID NO:l.
33. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de partes de plantas usadas com a finalidade de reprodução assexuada a partir de plantas que contém sequência gênica com pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID NO.l.
34. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de progénie de plantas que contém a sequência descrita em SEQ ID NO:l.
35. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de progénie de plantas que contém sequência gênica com pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID NO:l. 5/5
36. Uso do vetor descrito nas reivindicações de 14 a 28 caracterizado por conter a sequencia gênica descrita em SEQ ID NO:l.
37. Uso do vetor descrito nas reivindicações de 14 a 28 caracterizado por conter sequência gênica com pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID NO:l.
38. Uso da sequência gênica descrita em SEQ ID NO: 1 caracterizado por poder ser aplicado em monocotiledônias ou dicotiledônias.
39. Uso das sequências gênicas que apresentam pelo menos 60% de identidade com a sequência gênica descrita em SEQ ID NO: 1, caracterizado por poder ser aplicado em monocotiledônias ou dicotiledônias.
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