BR102013006227A2 - Método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas, construção de expressão, vetor de expressão recombinante, uso, método para aprodução de uma planta transgênica, planta transgénica, parte colhivel, produto e método de fabricação - Google Patents

Abstract

método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas, construção de expressão, vetor de expressão recombinante, uso, método para a produção de uma planta transgênica, planta transgênica, parte colhível, produto e método de fabricação a presente invenção refere-se geralmente do campo de biologia molecular de plantas e se refere a um método para acentuar vários traços relacionados ao rendimento economicamente importantes em plantas. mais 1a especificamente, a presente invenção se refere a um método para acentuar os traços relacionados ao rendimento em plantas ao modular a expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina de maneira específica. a presente invenção também se refere a plantas que possuem expressão modulada de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina modulado por um tipo particular de promotor, essas plantas possuem traços relacionados ao rendimento aumentado comparado com as plantas de controle. a invenção também proporciona construções o conhecidas úteis para realizar os métodos da invenção.

Description

“MÉTODO PARA ACENTUAR UM OU MAIS TRAÇOS RELACIONADOS AO RENDIMENTO EM PLANTAS, CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, USO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTE

COLHÍVEL, PRODUTO E MÉTODO DE FABRICAÇÃO”

O presente pedido reivindica a prioridade dos seguintes pedidos:

EP 12162832.5 depositado em 2 de abril de 2012, e US 61/618861 depositado em 2 de abril de 2012 sendo que todos estão incorporados aqui a título de referência em relação ao conteúdo total da descrição. O pedido de patente 10 internacional PCT/GB02/04612, publicado como W02003/035881, explicitamente as páginas 35 a 45 e particularmente as flavodoxinas e peptídeos de trânsito relacionados aqui; bem como EP1532257, e particularmente as versões modificadas do promotor GOS2 descritas no pedido de patente internacional PCT/IB2011/055412, publicado como WO2012077020, como a SEQ ID NO: 14 e 15 e as sequências relacionadas como descrito na página 6 & 7 do dito pedido, que estão aqui incorporados, e o promotor GOS2 como descrito no pedido internacional publicado como WO 2004/065596 estão

incorporados a título de referência.

Antecedentes da invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se, geralmente, ao campo de biologia molecular e diz respeito a um método para acentuar traços relacionados a rendimento em plantas ao aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo fíavodoxina de maneira particular. A 25 presente invenção também diz respeito a plantas que têm especificamente expressão aumentada de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo fíavodoxina com marcação de plastídeo, cujas plantas têm um ou mais traços relacionados a rendimento aumentado em relação a plantas de controle correspondentes. A invenção também fornece construções úteis nos métodos, usos, plantas, partes colhíveis e produtos da invenção.

Descrição da técnica relacionada

A população mundial em crescimento e o suprimento escasso de terra arável disponível para agricultura estimulam a pesquisa para aumento de eficácia de agricultura. Meios convencionais para aprimoramentos de horticultura e safra utilizam técnicas de reprodução seletiva para identificar plantas que têm características desejáveis. Entretanto, tais técnicas de reprodução seletiva têm diversas desvantagens, a saber, que essas técnicas 10 são, tipicamente, de trabalho intensivo e resulta em plantas que frequentemente contêm componentes genéticos heterogêneos que podem nem sempre resultar no traço desejável que é passado de plantas parentais. Avanços na biologia molecular permitiram a humanidade modificar o germoplasma de animais e plantas. Modificação genética de plantas implica o 15 isolamento e manipulação de material genético (tipicamente na forma de DNA ou RNA) e a introdução subsequente daquele material genético no interior de uma planta. Tal tecnologia tem a capacidade de entregar safras ou plantas que

têm vários traços horticulturais, agronômicos e econômicos aprimorados.

Um traço de interesse econômico é o rendimento aumentado. O rendimento é definido, normalmente, como o produto mensurável de valor econômico de uma safra. O rendimento é dependente, diretamente, de diversos fatores, por exemplo, o número e tamanho dos órgãos, arquitetura de planta (por exemplo, o número de ramos), produção de semente, senescência foliar e mais. O desenvolvimento de raiz, absorção de nutriente, tolerância a 25 estresse e vigor precoce também podem ser fatores importantes na determinação de rendimento. Aperfeiçoar os fatores supracitados pode, portanto, contribuir para o aumento de rendimento de safra.

O rendimento de semente é um traço importante, visto que as sementes de muitas plantas são importantes para nutrição humana e animal. As safras tal como milho, arroz, trigo, canola e feijão soja representam mais da metade da absorção calórica humana total, seja através de consumo direto das próprias sementes ou através do consumo de produtos de carne criados em 5 sementes processadas. Elas também são uma fonte de açúcares, óleos e muitos tipos de metabólitos usados em processos industriais. As sementes contêm um embrião (a fonte de novas mudas e raízes) e um endosperma (a fonte de nutrientes para crescimento de embrião durante germinação e durante crescimento precoce de brotos). O desenvolvimento de uma semente envolve 10 muitos genes, e requer a transferência de metabólitos das raizes, folhas e hastes para o interior da semente em crescimento. O endosperma, em particular, assimila os precursores metabólicos de carboidratos, óleos e proteínas e os sintetiza em macromoléculas de armazenagem para preencher o grão.

Outro traço importante para muitas safras é o vigor precoce.

Aprimorar vigor precoce é um objetivo importante de programas de reprodução de arroz modernos em ambos os cultivos de arroz tropical ou temperado.

Raízes longas são importantes para ancoragem de solo própria em arroz semeado em água. Quando o arroz é plantado diretamente em campos alagados, e quando plantas devem emergir rapidamente pela água, mudas maiores são associadas com vigor. Quando semeadura por semeadora é praticada, mesocótilos e coleóptilos maiores são importantes para surgimento de broto bom. A capacidade para modificar vigor precoce em plantas seria de grande importância em agricultura. Por exemplo, vigor precoce pobre tem sido 25 uma limitação à introdução de híbridos de mais (Zea mays L.) com base em germoplasma de cinturão de milho no Atlântico europeu.

Um traço importante adicional é aquele de tolerância a estresse abiótico aprimorada. Estresse abiótico é uma causa primária de perda de safra mundialmente, sendo que reduz rendimentos médios para maioria de plantas de safra principal por mais que 50% (Wang et al., Plant 218, 1 a 14, 2003). Estresses abióticos podem ser causados por seca, salinidade, deficiência de nutrientes, extremos de temperatura, toxicidade química e estresse oxidativo. A 5 capacidade de aprimorar tolerância de planta a estresse abiótico seria de grande vantagem econômica para fazendeiros mundialmente e permitiría o cultivo de safras durante condições adversas e em territórios em que cultivo de safras pode, de outra forma, não ser possível.

Uma característica importante adicional é a tolerância ao estresse abiótico aumentada. O estresse abiótico é a principal causa de perda de safra mundial, reduzindo os rendimentos médios da maioria das plantas mais produtivas em mais de 50% (Wang et al., Planta 218, 1-14, 2003). Os estresses abióticos podem ser causados por aridez, salinidade, deficiência de nutrientes, extremos de temperatura, toxicidade química e estresse oxidativo. A capacidade de aumentar a tolerância da planta a estresse abiótico podería ser de grande vantagem econômica para cultivadores em todo o mundo e podería permitir o cultivo de safras durante condições adversas e em terrenos onde o

cultivo de safras, de outra forma, não pode ser possível.

O estresse ambiental é um grande fator limitativo da produtividade de planta e rendimento de safra. Muitos dos processos prejudiciais submetidos pelas plantas expostas a condições ambientais adversas são mediados por espécies reativas de oxigênio (ROS) que são geradas em Cloroplastos através do desempenho falho do aparelho fotossintético (Foyer, C. H. et al. (1994) Plant Cell Environ. 17,507- 523, Hammond-Kosack, K. E., and Jones, J. D. G.

(1996) Plant Cell 8, 1773-1791, Allen, R. (1995) Plant Physiol. 107 1 1049-

1054), a auto-oxidação de componentes da cadeia de transporte de elétrons fotossintético resulta na formação de radicais superóxido e seus derivados, radicais peróxido de hidrogênio e hidroxila. Esses compostos reagem com uma grande variedade de biomotéculas (mais conspicuamente, DNA), causando estase e morte celular.

Para lidar com os efeitos prejudiciais de espécies reativas de oxigênio (ROS), os organismos aeróbicos desenvolveram sistemas de defesa 5 antioxidantes altamente eficientes que são compostos de constituintes enzimáticos e não-enzimáticos. Em tecidos e organismos diferentes, os antioxidantes exercem funções diferentes e geralmente protetoras complementares, como captura direta de ROS 1, substituição de biomoléculas sensíveis oxidantes danificadas e atividades de reparo de DNA (Fridovich 1 I.

(1997). J. Biol. Chem. 272,1851-1857). Pelo menos parte da resposta celular contra estresse oxidativo é de natureza adaptável e envolve a síntese de novo de membros comprometidos da barreira antioxidante. Várias respostas multigênicas foram reconhecidas na bactéria aeróbica facultativa Escheríchia coli, inclusive aquelas moduladas pelos regulons soxRS e oxyR (Hidalgo, E., e 15 Demple, B. (1996). In Regulation of Gene Expression in Escheríchia coli,

Molecular Biology Intelligence Unit Series (E. C. C. Lin and A. S. Lynch, eds.), pp. 434-452, Austin, TX: R. G. Landis).

A resposta de soxRS parece ser especificamente adaptada para encarar os desafios impostos pela exposição das células a radicais superóxidos ou a óxido nítrico. Muitos componentes diferentes da resposta foram identificados, inclusive duas flavoproteínas solúveis: ferredoxina-NADP+ reductase contendo FAD (FNR), e sua flavodoxina de substrato de parceiro de elétrons (Liochev et al. (1994) Proc. Natl Acad. Sei, USA 91,1328-1331, Zheng, M. etal (1999) J. Bacteriol. 181,4639-4643).

As flavodoxinas são pequenas proteínas monoméricas (Mw

18,800) que contêm uma molécula de FMN não covalentemente ligada (Razquin, P. et al (1988) J. Bacteriol. 176, 7409- 7411). A FNR é capaz de usar, com eficiências mais ou menos similares, flavodoxina e a proteína ferredoxina contendo ferro-enxofre como substratos para sua atividade de NADP(H) oxidoreductase. Em cianobactérias, a expressão de flavodoxina é induzida sob condições de falta de ferro, quando a ferredoxina não puder ser sintetizada.

Como parte da resposta de soxRS de E. coli, os níveis de FNR e flavodoxina aumentam mais de vinte vezes mediante o tratamento das bactérias com compostos de propagação de superóxido como o herbicida de ciclagem redox metil viologênio (MV) , enquanto as quantidades de ferredoxina não são afetadas (Rodriguez, R. E. et al (1998) Microbiology 144,2375-2376).

Diferente de FNR e ferredoxinas, que são amplamente distribuídas entre plastídeos, mitocôndrias e bactérias, a ocorrência de flavodoxina parece ser bastante limitada a bactérias. As flavodoxinas não foram isoladas de tecidos vegetais, e nenhum homólogo de flavodoxina foi reconhecido no genoma de

Arabidopsis thaliana (The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Nature

408,796- 815). Foi descrito que as linhagens de plantas que foram elaboradas para expressar uma flavoproteína como flavodoxina exibem tolerância aumentada comparado com as plantas de controle, não tratadas, quando expostas a uma condição de estresse ambiental (veja o pedido de patente internacional PCT7GB02/04612, publicado como W02003/035881, depositado 20 em 10.10.2002 pelo requerente PLANT BIOSCIENCE LTD, a seguir referido como WO 03/035881).

O rendimento de safra pode, portanto, ser aumentado ao aperfeiçoar um dos fatores supracitados.

Dependendo do uso final, a modificação de certos traços de rendimento pode ser favorecida sobre outros. Por exemplo, para aplicações tal como forragem ou produção de madeira, ou fonte de biocombustível, um aumento nas partes vegetativas de uma pode ser desejável, e para aplicações tal como produção de farinha, amido ou óleo, um aumento em parâmetros de semente pode ser particularmente desejável. Mesmo entre os parâmetros de semente, alguns podem ser favorecidos sobre outros, dependendo da aplicação. Vários mecanismos podem contribuir para aumentar rendimento de semente, se aquilo está na forma de tamanho de semente aumentado ou 5 número de semente aumentado.

Foi observado, agora, que vários traços relacionados a rendimento pode ser aprimorados em plantas ao modular expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina.

Breve Descrição da invenção

A presente invenção se refere a um método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas ao aumentar especificamente a expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina que é marcado com plastídeos. A presente invenção também se refere a plantas que possuem expressão especificamente aumentada de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina com marcação de plastídeo, essas plantas possuem um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado comparado com as plantas de controle.

A invenção também fornece construções desconhecidas que compreendem ácidos nucleicos codificadores de flavodoxina úteis para realizar os métodos da invenção.

Uma realização preferida é um método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta em relação a plantas de controle, que compreende as etapas de aumentar a expressão, de preferência, por métodos recombinantes em uma planta de um ácido nucleico exógeno que 25 codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina de maneira particular, em que a expressão está sob o controle de uma sequência promotora particular ligada de modo operacional ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina, e desenvolve a(s) planta(s).

Então, um objetivo da invenção é fornecer uma construção de expressão e uma construção de vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina, ligado de modo operacional a uma sequência promotora benéfica. Proporciona-se o uso 5 dessas construções genéticas para produzir uma planta transgênica com um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado, de preferência, rendimento de biomassa e/ou semente aumentado, em relação a plantas de controle.

Também uma realização preferida consiste em plantas 10 transgênicas transformadas com uma ou mais construções de expressão da invenção, e, assim, expressar de maneira particular os ácidos nucleicos que codificam um peptídeo de trânsito e uma proteína flavodoxina, em que as plantas possuem um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado. As partes colhíveis das plantas transgênicas da presente invenção e os 15 produtos derivados das plantas transgênicas e suas partes colhíveis também são parte da presente invenção.

Em particular, descobriu-se surpreendentemente que a expressão

de um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e uma flavodoxina como definido aqui sob o controle de um promotor GOS2 como definido aqui resulta em biomassa aumentada, rendimento de semente aumentado e/ou teor de açúcar aumentado de plantas que compreendem a dita combinação de promotor GOS2 funcionalmente ligado ao dito ácido nucleico exógeno comparado com as plantas de controle sob condições de estresse padrão e/ou abiótico.

Breve descrição das diversas vistas dos desenhos

A presente invenção será descrita agora com referência às seguintes figuras, nas quais:

A Figura 1 representa a estrutura de domínio de SEQ ID NO: 2 com motivos e/ou domínios conservados. Os domínios foram identificados e visualizados utilizando o software InterProScan (veja Zdobnov E.M. e Apweiler R.; InterProScan - an integration platform forthe signature-recognition methods in InterPro.; Bioinformatics, 2001, 17(9): 847-8; banco de dados InterPro, 5 versão 36.0, 23 de fevereiro de 2012) e o software InterproScan versão 4.8, banco de dados InterPro versão 41 de 13 de fevereiro de 2013 (B).

A Figura 2 representa o vetor binário usado para a expressão específica em cana-de-açúcar de um ácido nucleico que codifica flavodoxina (FLD) fundido com um peptídeo de trânsito de plastídeo (TP), representado por 10 TP::FLD, sob o controle de um promotor GOS2 (pGOS2). A flavodoxina, peptídeo de trânsito e o promotor GOS2 são conforme descrito aqui.

Descrição detalhada da invenção

Definições

As seguintes definições serão usadas ao longo do presente 15 pedido. A seção de títulos e cabeçalhos nesse pedido serve apenas para propósitos de conveniência e referência e não devem afetar de forma alguma o significado ou interpretação desse pedido. Os termos técnicos e expressões

usadas dentro do escopo desse pedido servem geralmente para fornecer o significado comumente aplicado a esses na técnica pertinente de biologia vegetal, biologia molecular, bioinformática e reprodução de plantas. Todas as seguintes definições de termos se aplicam ao conteúdo completo desse pedido. Será entendido que como usado no relatório descritivo e nas reivindicações, “um ou “uma” pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual são usados. Assim, por exemplo, uma referência a “uma 25 célula” pode significar que pelo menos uma célula pode ser utilizada.

O termo “essencialmente”, “cerca de”, “aproximadamente” e similares em conjunto com um atributo ou um valor, particularmente também definem exatamente o atributo ou exatamente o valor, respectivamente. O termo “cerca de” no contexto de um determinado valor ou faixa numérica se refere em particular a um valor ou faixa que está dentro de 20%, dentro de 10%, ou dentro de 5% do valor ou faixa fornecida. Como usado aqui, o termo “compreende” também inclui o termo consiste em.

Polipeptídeo(s)/ProteÍna(s)

Os termos “peptídeo”, “oligopeptídeos”, polipeptídeo e proteína são usados de maneira intercambiável aqui e se referem a aminoácidos em uma forma polimérica de qualquer comprimento, ligados por ligações peptídicas, exceto onde mencionado em contrário.

POLINUCLEOTÍDEO(S)/ÁCIDO(S) NUCLEICO(SVSEQUÊNCIA(S) DE ÁCIDO nucleico/Sequénciaís) de nucleotídeos

Os termos polinucleotídeo(s), sequência(s) de ácido nucleicos, “sequência(s) de nucleotídeos, ácido(s) nucleico(s), molécula de ácido nucleico são usados de maneira intercambiável aqui e se referem a 15 nucleotídeos, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma combinação desses, em uma forma polimérica não ramificada de qualquer comprimento.

Homológo(s)

Homólogos de uma proteína incluem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que possuem substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido relativas à proteína não modificada em questão e que possuem substancialmente a mesma atividade biológica e funcional que a proteína não modificada da qual esses são derivados. “Homólogos” de um gene inclui genes que possuem uma sequência de ácido nucleico com substituições, deleções e/ou inserções de nucleotídeo em relação ao gene não modificado em questão e possuem substancialmente a mesma atividade biológica e/ou funcional que o gene não modificado a partir do qual são derivados, ou codificam polipeptídeos que possuem substancialmente a mesma atividade biológica e funcional que o polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucleico não modificada.

O termo “nucleotídeo” se refere a um bloco de construção de ácido nucleico que consiste em uma nucleobase, uma pentose e pelo menos um grupo fosfato. Assim, o termo “nucleotídeo” inclui um nucleosídeo 5 monofosfato, nucleosídeo difosfato, e nucleosídeo trifosfato.

Ortólogos e parálogos são duas formas diferentes de homólogos e incluem conceitos evolutivos usados para descrever as relações ancestrais de genes ou proteínas. Os parálogos são genes ou proteínas dentro da mesma espécie que foram originados através da duplicação de um gene ou proteína 10 ancestral; ortólogos são genes ou proteínas de organismos diferentes que foram originados através de especiação, e também são derivados de um gene ou proteína ancestral comum.

Uma deleção se refere à remoção de um ou mais aminoácidos de uma proteína ou à remoção de um ou mais nucleotídeos de um ácido nucleico.

Uma inserção se refere a um ou mais resíduos de aminoácido sendo introduzidos em um sítio predeterminado em uma proteína ou em um ou mais nucleotídeos introduzidos em um sitio predeterminado em uma sequência

de ácido nucleico. Com referência a uma proteína, as inserções podem compreender fusões N-terminal e/ou C-terminal assim como inserções de intrassequência de um único aminoácido ou múltiplos aminoácidos. Em geral, as inserções na sequência de aminoácido serão menores que as fusões N- ou C-terminal, da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos. Exemplos de proteínas ou peptídeos de fusão N- ou C-terminal incluem o domínio de ligação ou o domínio de ativação de um ativador transcricional conforme usado no sistema de 25 levedura duplamente híbrido, proteínas de revestimento de fago, (histidina)-6tag, glutationa S-transferase-tag, proteína A, proteína de ligação a maltose, diidrofolato redutase, Tag*100 epítopo, c-mic epítopo, FLAG®- epítopo, lacZ, CMP (peptídeo de ligação a calmodulina), HA epítopo, epítopo de proteína C e epítopo VSV.

Uma substituição se refere à substituição de aminoácidos da proteína por outros aminoácidos que possuem propriedades similares (como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão similares para formar 5 ou quebrar estruturas α-helicoidal ou estruturas em folha-β). As substituições de aminoácido são tipicamente de resíduos simples, porém podem ser agrupadas dependendo das restrições funcionais impostas sobre o polipeptídeo. As substituições de aminoácido são, de preferência, substituições conservadoras de aminoácido. As tabelas de substituição conservadora são 10 bem conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H.

Freeman e Company (Eds) e a Tabela 1 abaixo).

Tabela 1: Exemplos de substituições conservadoras de aminoácido

Resíduo	Substituições Conservadoras	Resíduo	Substituições Conservadoras
Ala	Ser	Leu	lie; Vai
Arg	Lys	Lys	Arg; Gin
Asn	Gin; His	Met	Leu; lie
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gin	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Vai
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gin	Vai	lie; Leu
lie	Leu, Vai

As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido podem ser facilmente realizadas utilizando técnicas sintéticas de peptídeo conhecidas, como síntese peptídica em fase sólida e similares, ou por manipulação de DNA recombinante. Os métodos para a manipulação de sequências de DNA para produzir variações de substituição, inserção ou deleção de uma proteína são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as técnicas para produzir mutações por substituição em locais predeterminados em DNA são bem conhecidas pelos elementos versados na técnica e incluem mutagênese M13, mutagênese T7-Gen in vitro (USB, Clevele , OH), mutagênese sítio-dirigida QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagênese sítio-dirigida mediada por PCR outros protocolos de mutagênese sítio-dirigida (veja Current 5 Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 e atualizações anuais)).

Derivados

Derivados de proteínas ou polipeptídeos incluem polipeptídeos que podem, comparados com a sequência de aminoácido da forma de 10 ocorrência natural da proteína ou polipeptídeo, como a proteína de interesse, compreendem substituições de aminoácidos por resíduos de aminoácido de ocorrência não-natural, ou adições de resíduos de aminoácido de ocorrência não-natural. Os derivados de uma proteína ou polipeptídeo também incluem polipeptídeos que compreendem resíduos de aminoácido de ocorrência 15 natural alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados etc.) ou de ocorrência não-natural alterados comparados com a sequência de aminoácido de uma forma de ocorrência não-natural do

polipeptídeo. Um derivado também pode compreender um ou mais substituintes ou adições sem aminoácido comparado com a sequência de aminoácido a partir da qual esse é derivado, por exemplo, uma molécula repórter e outro ligante, covalente ou não-covalentemente ligado à sequência de aminoácido, como uma molécula repórter que é ligada para facilitar sua detecção, e resíduos de aminoácido de ocorrência não-natural relativos à sequência de aminoácido de uma proteína de ocorrência natural. Ademais, os 25 derivados também incluem fusões da forma de ocorrência natural da proteína com peptídeos de marcação como FLAG, HIS6 ou tioredoxina (para uma análise de peptídeos de marcação, veja Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523- 533, 2003). Os “derivados” de ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos que podem, comparados com a sequência de nucleotídeo da forma naturalmente ocorrente do ácido nucleico compreendem deleções, alterações ou adições com nucleotídeos não naturalmente ocorrentes. Os “derivados de um ácido nucleico também incluem ácidos nucleicos que 5 compreendem nucleotídeos alterados naturalmente ocorrentes ou alterados não naturalmente ocorrentes como comparado com a sequência de nucleotídeo de uma forma naturalmente ocorrente do ácido nucleico. Um derivado de uma proteína ou ácido nucleico ainda fornece substancialmente a mesma função, por exemplo, traço relacionado ao rendimento aumentado, 10 quando expresso ou reprimido em uma planta respectivamente.

Fragmentos funcionais

O termo “fragmento funcional” se refere a qualquer ácido nucleico ou proteína que compreende meramente uma parte do ácido nucleico integral ou proteína integral, respectivamente, porém ainda fornece 15 substancialmente a mesma função, por exemplo, traço relacionado ao rendimento aumentado, quando expresso ou reprimido em uma planta respectivamente.

Em casos onde a superexpressão de ácido nucleico é desejada, o termo “substancialmente a mesma atividade funcional” ou “substancialmente a mesma função” significa que qualquer homólogo e/ou fragmento fornece traço(s) relacionado(s) ao rendimento aumentado quando expresso em uma planta. De preferência, substancialmente a mesma atividade funcional ou substancialmente a mesma função significa pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% ou mais traço(s) relacionados ao rendimento aumentado/acentuado comparado com a atividade funcional fornecida pela expressão exógena da sequência de nucleotídeo de flavodoxina integral ou a sequência de aminoácido de flavodoxina.

Domínio, Motivo/Sequênçia consenso/Assinatura

O termo domínio se refere a um conjunto de aminoácidos

conservados	em	posições	específicas ao	longo de um	alinhamento	de
5 sequências	de	proteínas	evolutivamente	relacionadas.	Enquanto	os
aminoácidos	em	outras	posições podem	variar entre	homólogos,	os

aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que são provavelmente essenciais na estrutura, estabilidade ou função de uma proteína. Identificados por seu alto grau de conservação em 10 sequências alinhadas de uma família de homólogos de proteína, esses podem ser usados como identificadores para determinar se qualquer polipeptídeo em questão pertence a uma família de polipeptídeo anteriormente identificada.

O termo motivo” ou sequência consenso ou assinatura se refere a uma região conservada curta na sequência de aminoácidos ou 15 sequências de ácidos nucleicos evolutivamente relacionadas. Para as sequências de aminoácidos, os motivos geralmente são partes altamente conservadas de domínios, porém também podem incluir apenas parte do

domínio, ou podem ser localizadas fora do domínio conservado (se todos os aminoácidos do motivo estiverem fora de um domínio definido).

Há bancos de dados especialistas para a identificação de domínios, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Ácido nucleicos Res 30, 242-244),

InterPro (Mulder et al., (2003) Nuci. Acids. Res. 31 , 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequências motifs e its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd Inter- national Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61 , AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D13416

D137, (2004)), ou Pfam (Bateman et al. , Nucleic Acids Research 30(1): 276280 (2002)) e o banco de dados de famílias de proteína Pfam (R.D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J.E. Pollington, O.L. Gavin, P.

Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A.

Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:211-222). Um conjunto de ferramentas para análise in silico de sequências proteicas está disponível no servidor proteômico ExPASy (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., Ex- PASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge e analysis, Nucleico Acids Res. 31 :3784-3788(2003)). Os domínios ou motivos também podem ser identificados utilizando técnicas rotineiras, como por alinhamento de sequência.

Os métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, esses métodos incluem GAP, BESTFIT,

BLAST, FASTA e TFASTA. GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (ou seja, estendendo as sequências completas) de duas sequências que maximiza o número de pareamentos e minimiza o número de lacunas. O algoritmo BLAST

(Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula a porcentagem de identidade de sequência e realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para realizar a análise BLAST está publicamente disponível através do National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Os homólogos podem ser facilmente identificados utilizando, por exemplo, o algoritmo de sequência múltipla ClustalW (versão 1 .83), com os parâmetros de alinhamento em pares padrão, e um método de pontuação em porcentagem. As porcentagens globais de similaridade e identidade também podem ser determinadas utilizando um dos métodos disponíveis no pacote de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: um aplicativo que gera matrizes de similaridade/identidade utilizando sequências proteicas ou de DNA.). A edição menor de manual pode ser realizada para otimizar o alinhamento entre os motivos conservados, como podería ser óbvio para um elemento versado na técnica. Ademais, em vez de utilizar sequências longas para a identificação de 5 homólogos, domínios específicos também poderíam ser usados. Os valores de identidade de sequência podem ser determinados através de toda a sequência de ácido nucleico ou aminoácido ou através de domínios ou motivo(s) conservado(s) selecionados, utilizando os programas mencionados acima que utilizam os parâmetros padrão. Para alinhamentos locais, o algoritmo de Smith10 Waterman é particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981 ) J. Mol. Biol 147(1 );195-7).

BLAST Recíproco

Tipicamente, isso envolve um primeiro BLAST que envolve aplicar um BLAST (ou seja, executar o software de BLAST com a sequência de 15 interesse como a sequência de busca) a uma sequência de busca (por exemplo, utilizando qualquer uma das sequências mencionadas na Tabela 2 ou

3) a qualquer banco de dados de sequência, como o banco de dados NCBI

publicamente disponível. BLASTN ou TBLASTX (que utiliza valores padrão) é geralmente usado quando parte-se de uma sequência de nucleotídeo, e

BLASTP ou TBLASTN (que utiliza valores padrão) quando parte-se de uma sequência de proteína. Os resultados de BLAST podem ser opcionalmente filtrados. As sequências longas de cada resultado filtrado ou resultado nãofiltrado são então colocadas novamente em BLAST (segundo BLAST) contra as sequências do organismo a partir do qual a sequência de busca é derivada. Os resultados dos primeiro e segundo BLASTs são então comparados. Um parálogo é identificado se um acerto de classificação alta do primeiro blast for da mesma espécie a partir da qual a sequência de busca é derivada, um novo

BLAST então resulta idealmente na sequência de busca entre os maiores acertos; um ortólogo é identificado se um acerto de classificação alta no primeiro BLAST não for da mesma espécie a partir da qual a sequência de busca é derivada, e, de preferência, resulta em novo BLAST na sequência de busca que está entre os maiores acertos.

Os acertos de classificação alta são aqueles que possuem um valor E baixo. Quanto menor for o valor E, mais significativa será a classificação (ou em outras palavras, menor será a chance de o acerto ao acaso). A comparação do valor E é bem conhecido na técnica. Além dos valores E, as comparações também são classificadas por porcentagem de 10 identidade. A porcentagem de identidade se refere ao número de nucleotídeos (ou aminoácidos) idênticos entre as duas sequências de ácido nucleico (ou polipeptídeo) comparadas em um comprimento particular. No caso de famílias grandes, ClustalW pode ser usado, seguido por uma árvore de similaridade, para ajudar a visualizar o agrupamento de genes relacionados e a identificar os 15 ortólogos e paralógos.

Peptídeo de trânsito

Um peptídeo de trânsito” (ou sinal de trânsito, peptídeo de sinal,

sequência de sinal) é uma cadeia de peptídeo curta (3 a 60 aminoácidos de comprimento) que dirige o transporte de uma proteína, de preferência, a organelas dentro da célula ou a determinados locais subcelulares ou para a secreção de uma proteína. Os peptídeos de trânsito também podem ser denominados sinal de trânsito, peptídeo de sinal, sequência de sinal, sinais de marcação ou sinais de localização (subcelulares).

Hibridização

O termo hibridização como definido aqui é um processo em que as sequências de nucleotídeo complementares substancialmente homólogas se anelam. O processo de hibridização pode ocorrer completamente em solução, ou seja, os ácidos nucleicos complementares estão em solução. O processo de hibridização também pode ocorrer com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizados em uma matriz como microesferas magnéticas, microesferas Sepharose ou qualquer outra resina. O processo de hibridização pode ocorrer ainda com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizados 5 em um suporte sólido como uma membrana de nitrocelulose ou náilon ou imobilizados por, por exemplo, foto litografia para, por exemplo, um suporte de vidro silicioso (o último conhecido como arranjos ou microarranjos de ácido nucleico ou como amostras de ácido nucleico). Para permitir que a hibridização ocorra, as moléculas de ácido nucleico são geralmente desnaturadas de forma 10 térmica ou química para fundir uma cadeia dupla em duas cadeias simples e/ou para remover grampos outras estruturas secundárias de ácidos nucleicos de cadeia simples.

O termo severidade se refere às condições sob as quais ocorra a hibridização. A severidade de hibridização é influenciada por condições como temperatura, concentração salina, resistência iônica e composição de tampão de hibridização. Geralmente, as condições de baixa severidade são selecionadas para serem cerca de 30°C menores do que o ponto de fusão

térmica (Tm) para a sequência específica em uma resistência iônica e pH definidos. As condições de severidade média são aquelas em que a temperatura está 20°C abaixo da Tm, e as condições de alta severidade são aquelas em que a temperatura está 10°C abaixo da Tm. As condições de hibridização de alta severidade são tipicamente usadas para isolar as sequências de hibridização que possuem alta similaridade de sequência à sequência de ácido nucleico alvo. Entretanto, os ácidos nucleicos podem se divergir em sequência e ainda codificar um polipeptídeo substancialmente idêntico, devido à degeneração do código genético. Portanto, as condições de hibridização de severidade média podem ser às vezes necessárias para identificar essas moléculas de ácido nucleico. A Tm é a temperatura sob resistência iônica e pH definidos, em que 50% da sequência alvo se hibridizam em uma sonda perfeitamente compatível. A Tm depende das condições de solução e da composição de base e do comprimento da sonda. Por exemplo, sequências maiores se hibridizam especificamente em temperaturas 5 superiores. A taxa máxima de hibridização é obtida de cerca de 16°C a 32°C abaixo da Tm. A presença de cátions monovalentes na solução de hibridização reduz a repulsão eletrostática entre as duas cadeias de ácido nucleico, promovendo assim a formação híbrida; esse efeito é visível para concentrações de sódio de até 0,4M (para concentrações superiores, esse efeito pode ser 10 ignorado). A formamida reduz a temperatura de fusão de DNA-DNA e dúplexes de DNA-RNA com 0,6 a 0,7°C para cada porcentagem de formamida, e a adição de 50% de formamida permite que a hibridização seja realizada a 30 a 45°C, embora a taxa de hibridização seja reduzida. Os pareamentos de pares de base reduzem a taxa de hibridização e a estabilidade térmica dos dúplexes. 15 Em média para sondas grandes, a Tm diminui cerca de 1°C por % de pareamento de base. A Tm pode ser calculada utilizando as seguintes equações, dependendo dos tipos de híbridos:

1) híbridos de DNA-DNA (Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem.,

138: 267 a 284, 1984):

T_m= 81,5°C + 16,6xlogi₀[Na⁺]^a + 0,41x%[G/C^b] - 500x[L^c]’¹ 0.61 x% de formamida

2) híbridos de DNA-RNA ou RNA-RNA:

Tm= 79,8 + 18,5 (log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58 (%G/C^b) + 11,8 (%G/C^b)² 820/L^c

3) híbridos de oligo-DNA ou oligo-RNA^d:

Para <20 nucleotídeos: T_m= 2 (l_n)

Para de 20 a 35 nucleotídeos: T_m= 22 + 1,46 (l_n) ^a ou para outro cátion monovalente, mas apenas preciso na faixa de 0,01-0,4 Μ.

^b apenas preciso para %GC na faixa de 30% a 75%.

^c L = comprimento de duplex em pares de base.

^d oligo, oligonucleotídeo; l_n, = comprimento efetivo de iniciador =

2*(no. de G/C)+(no. de A/T).

A ligação não específica pode ser controlada utilizando-se qualquer uma entre uma série de técnicas conhecidas, como, por exemplo, bloqueio da membrana com soluções que contém proteína, adições de RNA, DNA, e SDS heterólogos ao tampão de hibridização, e tratamento com Rnase.

Para sondas não homólogas, pode-se realizar uma série de hibridizações variando-se um entre (i) reduzir progressivamente a temperatura de têmpera (por exemplo, de 68°C a 42°C) ou (ii) reduzir progressivamente a concentração de formamida (por exemplo, de 50% a 0%). O artesão versado está ciente dos vários parâmetros que podem ser alterados durante a hibridização e quais manterão ou alterarão as condições de severidade.

Além das condições de hibridização, a especificidade de hibridização tipicamente também depende da função de lavagens pós-

hibridização. Com a finalidade de remover o background resultante da hibridização não específica, as amostras foram lavadas com soluções salinas diluídas. Os fatores críticos dessas lavagens incluem a resistência iônica e a temperatura da solução de lavagem final: quanto menor a concentração salina e maior a temperatura de lavagem, maior a severidade da lavagem. As condições de lavagem são tipicamente realizadas em ou abaixo de uma severidade de hibridização. Uma hibridização positiva fornece um sinal que 25 esta é pelo menos o dobro daquela do background. Em geral, as condições severas adequadas para ensaios de hibridização de ácido nucleico ou procedimentos de detecção de amplificação de gene são conforme apresentado anteriormente. Podem-se selecionar mais ou menos condições severas. O artesão versado está ciente dos vários parâmetros que podem ser alterados durante a lavagem e quais manterão ou alterarão as condições de severidade.

Por exemplo, as condições típicas de hibridização de severidade para híbridos de DNA maiores que 50 nucleotídeos abrangem a hibridização a

65°C em 1x SSC ou a 42°C em 1x SSC e 50% de formamida, seguida pela lavagem a 65°C em 0,3x SSC. Exemplos de condições médias de hibridização de severidade para híbridos de DNA maiores que 50 de nucleotídeos abrangem a hibridização a 50°C em 4x SSC ou a 40°C em 6x SSC e 50% de 10 formamida, seguida pela lavagem a 50°C em 2x SSC. O comprimento do híbrido é o comprimento antecipado para hibridização do ácido nucleico.

Quando os ácidos nucleicos de sequência conhecida forem hibridizados, o comprimento híbrido pode ser determinado alinhando-se as sequências e identificando-se as regiões conservadas aqui descritas. 1*SSC é 0,15M a NaCI e citrato de sódio a 15mM; a solução de hibridização e as soluções de lavagem podem incluir, ainda, reagente de Denhardt 5x, 0,5 a 1,0% de SDS, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado e desnaturado, 0,5% de

pirofosfato de sódio.

Variante de junção

O termo variante de junção como usado aqui inclui variantes de uma sequência de ácido nucleico em que os íntrons e/ou éxons selecionados foram excisados, substituídos, deslocados ou adicionados, ou em que os íntrons foram reduzidos ou alongados. Esses variantes serão aqueles em que a atividade biológica da proteína é substancialmente mantida; isso pode ser obtido ao manter seletivamente os segmentos funcionais da proteína. Esses variantes de junção podem ser encontrados na natureza ou podem ser artificiais. Os métodos para prever e isolar esses variantes de junção são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo Foissac e Schiex (2005) BMC

Bioinformatics 6: 25).

Variente alélico

Os alelos ou variantes alélicos são formas alternativas de um determinado gene, localizados substancialmente na mesma posição cromossômica. Os variantes alélicos incluem Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs), bem como Pequenos Polimorfismos de Inserção/Deleção (INDELs). O tamanho de INDELs é geralmente menor do que 100 bp. Os SNPs e INDELs formam o maior conjunto de variantes de sequência em cepas polimórficas de ocorrência natural da maioria dos organismos.

Endógeno

A referência aqui a um ácido nucleico e/ou proteína endógeno se refere ao ácido nucleico e/ou proteína questão encontrado em uma planta em sua forma natural (ou seja, sem que haja qualquer intervenção humana como a tecnologia de engenharia de DNA recombinante), como também se 15 refere àquele mesmo gene (ou um ácido nucleico/gene substancialmente homólogo) em uma forma isolada subsequentemente (re)introduzido em uma planta (um transgene). Por exemplo, uma planta transgênica contendo tal

transgene pode encontrar uma redução substancial da expressão de transgene e/ou redução substancial de expressão do gene endógeno. O gene isolado pode ser isolado de um organismo ou pode ser artificial, por exemplo, por síntese química.

Exógeno

O termo ácido nucleico ou gene “exógeno” (ao contrário de “endógeno”) se refere a um ácido nucleico que foi introduzido em uma planta 25 por meio de tecnologia de DNA recombinante. Um ácido nucleico “exógeno” não pode ocorrer em uma planta em sua forma natural, pode ser diferente do ácido nucleico em questão como encontrado em uma planta em sua forma natural, ou pode ser idêntico a um ácido nucleico encontrado em uma planta em sua forma natural, porém não integrado dentro de seu ambiente genético natural. O significado correspondente de “exógeno” é aplicado no contexto de expressão de proteína. Por exemplo, uma planta transgênica que contém um transgene, ou seja, um ácido nucleico exógeno, pode, quando comparado com 5 a expressão do gene endógeno, encontrar um aumento substancial da expressão do respectivo gene ou proteína no total. Uma planta transgênica de acordo com a presente invenção inclui um ácido nucleico de flavodoxina exógeno integrado em qualquer local genético e opcionalmente a planta também pode incluir o gene endógeno dentro do contexto genético natural.

Rearranjo de gene/Evoluçáo dirigida

Rearranjo de gene ou evolução dirigida consiste em iterações de rearranjo de DNA seguido por varredura e/ou seleção adequada para gerar variantes de ácidos nucleicos ou porções desses que codificam as proteínas que possuem uma atividade biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 15 304(5674): 1151 -4; patentes US 5.811.238 e .6.395.547).

Cassete de expressão “Cassete de expressão” como usado aqui é um DNA capaz de ser

expresso em uma célula hospedeira ou em um sistema de expressão in-vitro. De preferência, o DNA, parte do DNA ou a disposição dos elementos genéticos que formam o cassete de expressão é artificial. Os elementos versados na técnica estão cientes de sequências terminadoras e intensificadoras que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região 5’ não traduzida (UTR) ou à sequência de codificação para aumentar a quantidade da mensagem madura 25 que se acumula no citosol, como descrito na seção de definições para expressão/superexpressão aumentada. Outras sequências de controle (além das sequências promotoras, intensificadoras, silenciadoras, íntron, regiões 3'UTR e/ou 5'UTR) podem ser elementos estabilizadores de proteína e/ou

RNA. Essas sequências poderíam ser conhecidas ou podem ser facilmente obtida por um elemento versado na técnica.

O cassete de expressão pode ser integrado no genoma de uma célula hospedeira e replicado juntamente com o genoma da dita célula 5 hospedeira.

CONSTRUÇÁO/CONSTRUÇÁO GENÉTICA

Esse DNA é Artificial (como, porém sem caráter plasmídeo ou DNA viral) - artificial em parte ou total ou artificial na dos elementos genéticos contidos - capazes de aumentar ou limitativo, disposição reduzir a expressão de DNA e/ou proteína de interesse tipicamente por replicação em uma célula hospedeira e usada para a introdução de uma sequência de DNA de interesse em célula hospedeira ou organismo hospedeiro. A replicação pode ocorrer após a integração no genoma da célula hospedeira ou através da presença da construção como parte de um vetor ou um cromossomo artificial dentro da célula hospedeira.

As células hospedeiras da invenção podem ser qualquer célula selecionada a partir de células bacterianas como células da espécie

Escherichia coli ou Agrobacterium, células de levedura, células de fungos, algas ou cianobactérias ou células vegetais. O elemento versado na técnica está ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes na construção genética para transformar, selecionar e propagar de forma bem sucedida as células hospedeiras que contêm a sequência de interesse.

Tipicamente a construção/ construção genética é uma construção de expressão e compreende um ou mais cassetes de expressão que podem resultar em superexpressão (construção de superexpressão) ou expressão reduzida de um gene de interesse. Uma construção pode consistir em um cassete de expressão. A(s) sequência(s) de interesse é/são ligadas de modo operacional a uma ou mais sequências de controle (pelo menos um promotor) como descrito aqui. Os elementos reguladores adicionais podem incluir intensificadores transcricionais bem como traducionais, um ou mais NEENA como descrito aqui, e/ou um ou mais RENA como descrito aqui. Os elementos versados na técnica estarão cientes de sequências terminadoras e 5 intensificadoras que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não traduzida 5‘ (UTR) ou na sequência de codificação para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol, com descrito na seção de definições para expressão aumentada/superexpressão. Outras sequências de 10 controle (além de sequências promotoras, intensificadoras, silenciadoras, de íntrons, regiões 3'UTR e/ou 5'UTR) podem ser elementos estabilizadores de proteína e/ou RNA. Essas sequências poderíam ser conhecidas ou podem ser facilmente obtidas por um elemento versado na técnica.

As construções genéticas da invenção podem incluir 15 adicionalmente uma origem de sequência de replicação que é exigida para a manutenção e/ou replicação em um tipo de célula específico. Um exemplo é quanto exige-se que uma construção genética seja mantida em uma célula

bacteriana como um elemento genético epissomal (por exemplo, molécula de plasmídeo o cosmídeo). As origens preferidas de replicação incluem, porém sem caráter limitativo, f1-ori e co!E1.

Para a detecção da transferência bem sucedida das sequências de ácido nucleico como usadas nos métodos da invenção e/ou seleção de plantas transgênicas que compreendem esses ácidos nucleicos, é vantajoso utilizar genes marcadores (ou genes-repórter). Portanto, a construção genética 25 pode compreender opcionalmente um gene marcador selecionável. Os marcadores selecionáveis são descritos em mais detalhes na seção definições aqui. Os genes marcadores podem ser removidos ou excisados da célula transgênica uma vez que esses não são mais necessários. As técnicas de remoção de marcador são conhecidas, as técnicas úteis são descritas acima na seção definições.

Construção de vector/vetor

Esse DNA (como, porém sem caráter limitativo, plasmídeo ou

DNA viral) - artificial em parte ou total ou artificial na disposição dos elementos genéticos contidos - capazes de replicação em uma célula hospedeira e usados para a introdução de uma sequência de DNA de interesse em célula hospedeira ou organismo hospedeiro. Um vetor pode ser uma construção ou pode compreender pelo menos uma construção. Um vetor pode se replicar sem 10 se integrar no genoma de uma célula hospedeira, por exemplo, um vetor plasmidial em uma célula hospedeira bacteriana, ou pode integrar parte ou todo seu DNA no genoma da célula hospedeira e, assim, resultar na replicação e expressão de seu DNA. As células hospedeiras da invenção podem ser qualquer célula selecionada a partir de células bacterianas, como células das 15 espécies Escherichia coli ou Agrobacterium, células de levedura, fungos, algas ou cianobactérias ou células vegetais. O elemento versado na técnica está ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes na construção

genética para transformar, selecionar e propagar de forma bem sucedida as células hospedeiras que contêm a sequência de interesse. Tipicamente o vetor compreende pelo menos um cassete de expressão. Uma ou mais sequências de interesse são ligadas de modo operacional a uma ou mais sequências de controle (pelo menos a um promotor) como descrito aqui. Os elementos reguladores adicionais podem incluir intensificadores transcricionais bem como traducionais, um ou mais NEENA como descrito aqui, e/ou um ou mais RENA como descrito aqui. Os elementos versados na técnica estarão cientes de sequências terminadoras e intensificadoras que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não traduzida 5' (UTR) ou na sequência de codificação para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol, com descrito na seção de definições. Outras sequências de controle (além de sequências promotoras, intensificadoras, silenciadoras, de íntrons, regiões 3'UTR e/ou 5'UTR) podem ser elementos estabilizadores de proteína e/ou 5 RNA. Essas sequências poderíam ser conhecidas ou podem ser facilmente obtidas por um elemento versado na técnica.

Elemento regulador/Sequéncia de controle/Promotor/Sequência

PROMOTORA

Os termos elemento regulador, sequência de controle, promotor e “sequência de promotor” se referem a sequências reguladoras de ácido nucleico capazes de realizar a expressão das sequências associadas. Os elementos reguladores podem ser promotor(es). Os termos promotor e “sequência de promotor tipicamente se referem a uma sequência de controle de ácido nucleico localizada a montante do início transcricional de um gene e essa está envolvida no reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas, dirigindo assim a transcrição de um ácido nucleico ligado de maneira funcional. Abrangidos pelos termos anteriormente mencionados estão as

sequências reguladoras transcricionais derivadas de um gene genômico eucariótico clássico (inclusive TATA box que é exigido para a iniciação de transcrição precisa, com ou sem uma sequência CCAAT box) e elementos reguladores adicionais (ou seja, sequências, intensificadores e silenciadores de ativação a montante) que alteram a expressão genética em resposta aos estímulos de desenvolvimento e/ou externos, ou de maneira tecido-específica.

Também incluído dentro do termo está uma sequência reguladora 25 transcricional de um gene procariótico clássico, nesse caso esse pode incluir uma sequência 35 box e/ou sequências reguladoras transcricionais -10 box. O termo elemento regulador também inclui uma molécula de fusão sintética ou derivado que confere, ativa ou aumenta a expressão de uma molécula de ácido nucleico em uma célula, tecido ou órgão.

Um promotor vegetal compreende elementos reguladores, que mediam a expressão de um segmento de sequência de codificação em células vegetais. Consequentemente, um promotor vegetal não precisa ser de origem 5 vegetal, porém pode se originar de vírus ou microrganismos, por exemplo, de vírus que atacam as células vegetais. O promotor vegetal também pode se originar de uma célula vegetal, por exemplo, da planta que é transformada com a sequência de ácido nucleico que será expressa no processo inventivo e descrita aqui. Isso também se aplica a outros sinais reguladores vegetais, 10 como terminadores vegetais. Os promotores a montante das sequências de nucleotídeo úteis nos métodos da presente invenção podem ser modificados por uma ou mais substituição(ões), inserção(ões) e/ou deleção(ões) de nucleotídeo sem interferir na funcionalidade ou atividade dos promotores, do quadro aberto de leitura (ORF) ou da região reguladora 3' como terminadores 15 outras regiões reguladoras 3' que ficam localizadas distante do ORF. Ademais, é possível que a atividade dos promotores seja aumentada pela modificação de sua sequência, ou que esses sejam substituídos por promotores mais ativos,

mesmo promotores de organismos heterólogos. Para expressão em plantas, a molécula de ácido nucleico deve, como descrito aqui, ser ligada de maneira funcional ou compreender um promotor adequado que expressa o gene no momento certo e com o padrão de expressão espacial exigido.

Para a identificação de promotores funcionalmente equivalentes, a resistência de promotor e/ou padrão de expressão de um promotor candidato podem ser analisados, por exemplo, ao ligar de maneira funcional o promotor a 25 um gene repórter e analisar o nível de expressão e padrão do gene repórter em vários tecidos da planta. Os genes repórter bem conhecidos adequados incluem, por exemplo, beta-glucuronidase ou beta-galactosidase. A atividade de promotor é analisada ao medir a atividade enzimática da beta-glucuronidase ou beta-galactosidase. A resistência de promotor e/ou padrão de expressão podem ser então comparados com aqueles de um promotor de referência (como aquele usado nos métodos da presente invenção). Alternativamente, a resistência de promotor pode ser analisada ao quantificar os níveis de mRNA 5 ou ao comparar os níveis de mRNA do ácido nucleico usado nos métodos da presente invenção, com os níveis de mRNA de genes de manutenção como 18S rRNA, utilizando métodos conhecidos na técnica, como Northern blotting com análise densitométrica de autorradiogramas, PCR em tempo real quantitativa ou RT- PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994).

Geralmente, por promotor fraco entende-se um promotor que conduz a expressão de uma sequência codificadora em um baixo nível. Por baixo nível entende-se em níveis de cerca de 1/10.000 transcrições a cerca de 1/100.000 transcrições, a cerca de 1/500.0000 transcrições por célula. Em contrapartida, um promotor forte conduz a expressão de uma sequência codificadora em alto nível, ou em cerca de 1/10 transcrições a cerca de 1/100 transcrições a cerca de 1/1000 transcrições por célula. Geralmente, por promotor de resistência média entende-se um promotor que conduz a

expressão de uma sequência codificadora em um nível menor do que um promotor forte, em particular em um nível que está em todos os casos abaixo daquele obtido quando estiver sob o controle de um promotor 35S CaMV.

Ligado de maneira funcional

O termo ligado de maneira operacional” ou “ligado de maneira funcional é usado aqui de forma intercambiável e, como usado aqui, se refere a uma ligação funcional entre a sequência promotora e o gene de 25 interesse, de modo que a sequência promotora seja capaz de iniciar a transcrição do gene de interesse.

O termo ligação funcional ou funcionalmente ligado em relação a elementos reguladores, será entendido como, por exemplo, a disposição sequencial de um elemento regulador (por exemplo, um promotor) com uma sequência de ácido nucleico que será expressa e, se apropriado, elementos reguladores adicionais (como, por exemplo, um terminador, NEENA como descrito aqui ou um RENA como descrito aqui) de modo que 5 cada elemento regulador possa executar sua função pretendida para permitir, modificar, facilitar ou, de outro modo, influenciar a expressão da dita sequência de ácido nucleico. Como um sinônimo, a palavra “ligação operável” ou “ligado de modo operacional” pode ser usada. A expressão pode resultar, dependendo da disposição das sequências de ácido nucleico, em RNA senso 10 ou anti-senso. Para isso, a ligação direta no sentido químico não é necessariamente exigida. As sequências de controle genéticas como, por exemplo, sequências intensificadoras, também podem exercer sua função sobre a sequência alvo a partir de posições que estão distantes, ou de fato a partir de outras moléculas de DNA. As disposições preferidas são aquelas em 15 que a sequência de ácido nucleico que será expressa é posicionada de forma recombinante atrás da sequência que atua como promotor, de modo que as duas sequências sejam covalentemente ligadas uma à outra. A distância

entre a sequência promotora e a sequência de ácido nucleico recombinante que será expressa é, de preferência, menor que 200 pares de base, especialmente, de preferência, menor que 100 pares de base, muito especialmente, de preferência, menor que 50 pares de base. Em uma realização preferida, a sequência de ácido nucleico que será transcrita fica localizada atrás do promotor de modo que o início da transcrição seja idêntico com o começo desejado do RNA quimérico da invenção. A ligação funcional e uma construção de expressão podem ser geradas por meio de recombinação convencional e técnicas de clonagem como descrito (por exemplo, em

Maniatis T, Fritsch EF e Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY);

Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, and Wiley Interscience;

Gelvin et al. (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic 5 Publisher, Dordrecht, The Netherlands). Entretanto, sequências adicionais, que, por exemplo, atuam como um ligante com sítios de divagem específicos para enzimas de restrição, ou como um peptídeo de sinal, também podem ser posicionados entre as duas sequências. A inserção de sequências também pode resultar na expressão de proteínas de fusão. De 10 preferência, a construção de expressão, que consiste em uma ligação de uma região reguladora, por exemplo, um promotor e sequência de ácido nucleico que será expressa, pode se apresentar em uma forma integrada com vetor e pode ser inserida em um genoma da planta, por exemplo, por transformação.

Promotor constitutivo

Um promotor constitutivo se refere a um promotor que é transcricionalmente ativo durante a maior parte, porém não necessariamente

todas, as fases de crescimento e desenvolvimento e sob a maior parte das condições ambientais, em pelo menos uma célula, tecido ou órgão.

Um promotor ubíquo é ativo em substancialmente todos os tecidos ou células de um organismo.

Um promotor regulado ao longo do desenvolvimento está ativo durante determinados estágios de desenvolvimento ou em partes da planta que sofrem alterações de desenvolvimento.

Um promotor induzível induziu ou aumentou a iniciação de transcrição em resposta a um produto químico (para uma análise, veja Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89- 108), estímulo ambiental ou físico, ou pode ser induzível por estresse, ou seja, ativado quando uma planta for exposta a condições de estresse variadas, ou um induzível por patógeno, ou seja, ativado quando uma planta for exposta a vários patógenos.

Um promotor órgão-específico ou tecido-específico é um que é capaz de iniciar preferencialmente a transcrição em determinados órgãos ou tecidos, como as folhas, raízes, tecido de semente, etc. Por exemplo, um promotor raiz-específico é um promotor que é transcricionalmente ativo predominantemente em raízes das plantas, substancialmente para a exclusão de quaisquer outras partes de uma planta, enquanto ainda permite 10 qualquer expressão basal nessas outras partes da planta. Os promotores capazes de iniciar a transcrição em determinadas células são referidas apenas como célula-específico.

Um promotor semente-específico é transcricionalmente ativo predominantemente em tecido da semente, porém não necessariamente 15 exclusivamente no tecido da semente (em casos de expressão basal). O promotor semente-específico pode ser ativo durante o desenvolvimento e/ou durante a germinação. O promotor semente-específico pode ser

endosperma/aleurona/embrião específico.

Um promotor tecido-específico verde como definido aqui é um promotor que é transcricionalmente ativo predominantemente em tecido verde, substancialmente para a exclusão de quaisquer outras partes de uma planta, enquanto ainda permite qualquer expressão basal nessas outras partes da planta.

Outro exemplo de um promotor tecido-específico é um promotor meristema-específico, que é transcricionalmente ativo predominantemente em tecido meristemático, substancialmente para a exclusão de quaisquer outras partes de uma planta, enquanto ainda permite qualquer expressão basal nessas outras partes da planta.

Terminador

O termo terminador inclui uma sequência de controle que é uma sequência de DNA no final de uma unidade transcricional que sinaliza o processamento 3' e poliadenilação de uma transcrição primária e o término da 5 transcrição. O terminador pode ser derivado do gene natural, de uma variedade de outros genes vegetais, ou de T-DNA. O terminador que será adicionado pode ser derivado, por exemplo, de genes da nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene vegetal, ou com menos preferência de qualquer outro gene eucariótico.

Marcador selecionável (gene)ZGene repórter

Marcador selecionável, gene marcador selecionável ou gene repórter inclui qualquer gene que confere um fenótipo em uma célula em que esse é expresso para facilitar a identificação e/ou seleção de células que são transfectadas ou transformadas com uma construção de ácido nucleico da invenção. Esses 15 genes marcadores permitem a identificação de uma transferência bem sucedida das moléculas de ácido nucleico através de uma série de princípios diferentes. Os marcadores adequados podem ser selecionados a partir de

marcadores que conferem resistência a antibiótico ou herbicida, esses introduzem uma nova característica metabólica ou permitem a seleção visual.

Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem genes que conferem resistência a antibióticos (como nptll que fosforila neomicina e canamicina, ou hpt, que fosforila higromicina, ou genes que conferem resistência, por exemplo, à bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina ou blasticidina), a herbicidas (por exemplo, 25 bar que proporciona resistência a Basta®; aroA ou gox que proporciona resistência contra glifosato, ou os genes que conferem resistência, por exemplo, à imidazolinona, fosfinotricina ou sulfonilureia), ou genes que fornecem uma característica metabólica (como manA que permite que as plantas utilizem manose como única fonte de carbono ou xilose isomerase para a utilização de xilose, ou marcadores antinutritivos como a resistência à 2desoxiglucose). A expressão de genes marcadores visuais resulta na formação de cor (por exemplo, β-glucuronidase, GUS ou β-galactosidase com seus 5 substratos coloridos, por exemplo X-Gal), luminescência (como o sistema luciferina/luceferase) ou fluorescência (Proteína Verde Fluorescente, GFP, e derivados desses). Essa lista representa apenas um pequeno número de possíveis marcadores. O elemento versado conhece esses marcadores. Marcadores diferentes são preferidos, dependendo do organismo e do método 10 de seleção.

É conhecido que mediante a integração estável ou temporária de ácidos nucleicos em células vegetais, apenas uma minoria das células absorve o DNA estranho e, se desejado, se integra em seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada. Para identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (como aqueles descritos acima) é geralmente introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Esses marcadores podem

ser, por exemplo, usados em mutantes em que esses genes não são funcionais, por exemplo, mediante a deleção por métodos convencionais.

Ademais, as moléculas de ácido nucleico que codificam um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor que compreende a sequência que codifica os polipeptídeos da invenção ou usadas nos métodos da invenção, ou ainda em um vetor separado. As células que foram estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas, por exemplo, por seleção (por exemplo, as células que integram o marcador selecionável sobrevivem enquanto as outras células morrem).

Visto que os genes marcadores, particularmente genes para resistência a antibióticos e herbicidas, não são mais exigidos ou são indesejados na célula hospedeira transgênica uma vez que os ácidos nucleicos foram introduzidos com êxito, o processo de acordo com a invenção para introduzir os ácidos nucleicos vantajosamente emprega técnicas que permitem 5 a remoção ou excisão desses genes marcadores. Esse método é o que se chama co-transformação. O método de co-transformação emprega dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor que contém o ácido nucleico de acordo com a invenção e um segundo que contém o(s) gene(s) marcador(es). Uma grande proporção de transformantes recebe ou, no caso de 10 plantas, compreende (até 40% ou mais dos transformantes), ambos os vetores.

No caso de transformação com Agrobacteria, os transformantes geralmente recebem apenas uma parte do vetor, ou seja, a sequência flanqueada pelo TDNA, que geralmente representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem ser subsequentemente removidos da planta transformada 15 ao realizar cruzamentos. Em outro método, os genes marcadores integrados em um transposon são usados para a transformação juntamente com o ácido nucleico desejado (conhecida como a tecnologia Ac/Ds). Os transformantes

podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com uma construção de ácido nucleico que confere a expressão de uma transposase, de forma temporária ou estável. Em alguns casos (aprox.

10%), o transposon salta para fora do genoma da célula hospedeira uma vez que a transformação ocorreu com êxito e foi perdido. Em um número adicional de casos, o transposon salta para um local diferente. Nesses casos, o gene marcador deve ser eliminado ao realizar cruzamentos. Em microbiologia, 25 técnicas foram desenvolvidas para tornar possível, ou facilitar, a detecção desses eventos. Um método vantajoso adicional conta com sistemas de recombinação; cuja vantagem é que a eliminação por cruzamento pode ser abolida. O sistema mais bem conhecido desse tipo é o que se chama de sistema Cre/lox. Cre1 é uma recombinase que remove as sequências localizadas entre as sequências loxP. Se o gene marcador for integrado entre as sequências loxP, esse é removido uma vez que a transformação ocorreu com êxito, por expressão da recombinase. Sistemas de recombinação 5 adicionais são o sistema HIN/HIX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol.

Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Uma integração sitio-específica no genoma da planta das sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção é possível. Naturalmente, esses métodos também podem ser aplicados a microrganismos 10 como levedura, fungos ou bactérias.

T RANSGÊNICO/T RANSGENE/RECOMBINANTE

Para os propósitos da invenção, transgênico, transgene ou recombinante significa em relação a, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico, um cassete de expressão, construção de gene ou um vetor que 15 compreende a sequência de ácido nucleico ou um organismo transformado com as sequências de ácido nucleico, cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, todas essas construções produzidas por métodos

recombinantes em que (a) as sequências dos ácidos nucleicos flavodoxina ou uma parte dessas, ou (b) sequência(s) de controle genética(s) que é/são ligada(s) de maneira operacional á sequência de ácido nucleico flavodoxina de acordo com a invenção, por exemplo um promotor, ou (c) a) e b) não estão localizadas em seu ambiente genético natural ou foram modificadas por métodos recombinantes, por exemplo, modificadas e/ou inseridas pelo homem, por exemplo, por métodos de tecnologia genética. A modificação pode assumir a forma, por exemplo, de uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural é entendido como o lócus genômico natural ou cromossômico na planta original ou a presença em uma biblioteca genômica. Ou combinação com o promotor natural.

Também a ligação de uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito for marcação de plastídeo com um ácido nucleico que codifica flavodoxina como definido aqui que não é naturalmente ligada ao dito peptídeo de trânsito cria uma sequência recombinante.

Um ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, construção genética ou construção de vetor compreende, de preferência, um gene natural e um promotor natural, um gene natural e um promotor nãonatural, um gene não-natural e um promotor natural, ou um gene não-natural e um promotor não-natural.

No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nucléico é, de preferência, retido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico pelo menos em um lado e possui um comprimento de sequência de pelo menos 50 bp, de preferência,

pelo menos 500 bp, especialmente, de preferência, pelo menos 1000 bp, com mais preferência, pelo menos 5000 bp.

Um cassete de expressão de ocorrência natural- por exemplo - a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, como definido acima - se torna um cassete de expressão recombinante quando esse cassete de expressão for modificado pelo homem por métodos não-naturais, sintéticos (artificiais) como, por exemplo, tratamento mutagênico. Os métodos adequados são descritos, por exemplo, em US 5.565.350 ou WO 00/15815 ou US200405323. Ademais, um cassete de expressão naturalmente ocorrente por exemplo, a combinação naturalmente ocorrente do promotor natural das sequências de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, como definido acima- se torna um cassete de expressão 5 recombinante quando esse cassete de expressão não estiver integrado no ambiente genético natural, porém em um ambiente genético diferente.

Deve ser observado ainda que no contexto da presente invenção, o termo “ácido nucleico isolado ou “proteína isolada pode em alguns casos ser considerado como um sinônimo para um “ácido nucleico recombinante” ou 10 uma “proteína recombinante”, respectivamente, e se refere a um ácido nucleico ou proteína que não fica localizado em seu ambiente genético natural e ambiente celular, respectivamente. O gene isolado pode ser isolado de um organismo ou pode ser artificial, por exemplo, por síntese química. Em uma realização, uma sequência de ácido nucleico isolada ou molécula de ácido 15 nucleico isolada é uma que não está em seus arredores nativos ou adjacências de ácido nucleico nativo, ainda é física e funcionalmente conectada a outras sequências de ácido nucleico ou moléculas de ácido nucleico e é encontrada

como parte de uma construção de ácido nucleico, sequência de vetor ou cromossomo.

Como usado aqui, o termo “transgênico referente a um organismo, por exemplo, planta transgênica se refere a um organismo, por exemplo, uma planta, célula vegetal, calo, tecido vegetal, ou parte da planta que contém de forma exógena o ácido nucleico, construção, vetor ou cassete de expressão descrito aqui ou uma parte desse que é, de preferência, introduzida por processos que não são essencialmente biológicos, de preferência, por transformação mediada por Agrobacteria ou bombardeio de partículas. Uma planta transgênica para os propósitos da invenção significa, desse modo, como descrito acima, que os ácidos nucleicos descritos aqui não estão presentes, ou não se originam do genoma da dita planta, ou estão presentes no genoma da dita planta, porém não em seu ambiente genético natural no genoma da dita planta, sendo que é possível que os ácidos nucleicos sejam expressos de maneira homóloga ou heteróloga. Entretanto, 5 como mencionado, transgênico também significa que, embora os ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou usados no método inventivo estejam em sua posição natural no genoma de uma planta, a sequência foi modificada em relação à sequência natural, e/ou que as sequências reguladoras das sequências naturais foram modificadas. Transgênico é, de preferência, 10 entendido para significar a expressão de naturalmente naquela planta que ocorre as sequências de ácido nucleico em um ambiente genético não natural no genoma, ou seja, a expressão homóloga ou, ocorre aquela expressão heteróloga de não naturalmente naquela planta que ocorre as sequências de ácido nucleico. As plantas transgênicas preferidas são mencionadas aqui.

Modulação

O termo modulação significa em relação à expressão ou expressão genética, um processo em que o nível de expressão é alterado pela

dita expressão genética em comparação com a planta de controle, o nível de expressão pode ser aumentado ou reduzido. A expressão original, não modulada pode ser qualquer tipo de expressão de um RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com tradução subsequente. Para os propósitos dessa invenção, a expressão não modulada original também pode ser ausência de qualquer expressão. O termo modular a atividade ou o termo “modular a expressão” deve significar qualquer alteração da expressão das sequências de ácido nucleico inventivas e/ou proteínas codificadas, que resulta em traço(s) relacionado(s) ao rendimento aumentado ou reduzido como, porém sem caráter limitativo, rendimento de semente aumentado ou reduzido e/ou crescimento aumentado ou reduzido das plantas. A expressão pode aumentar de zero (ausência de, ou expressão imensurável) para uma determinada quantidade, ou pode diminuir de uma determinada quantidade para pequenas quantidades imensuráveis ou zero.

Expressão

O termo expressão ou expressão genética significa a transcrição de um gene específico ou genes específicos ou construção genética específica. O termo expressão ou expressão genética em particular significa a transcrição de um gene ou genes ou construção genética em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com ou sem tradução subsequente 10 do último em uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA e o processamento do produto de mRNA resultante. O termo “expressão” ou “expressão genética” também pode incluir a tradução do mRNA e com isso a síntese da proteína codificada, ou seja, expressão proteica.

Expressão aumentada/expressão acentuada/superexpressão

O termo expressão aumentada, “expressão acentuada” ou superexpressão como usado aqui significa qualquer forma de expressão que é adicional ao nível de expressão de ocorrência natural original. Para os propósitos dessa invenção, o nível de expressão de ocorrência natural original também deve ser zero, ou seja, ausência de expressão ou expressão imensurável. Referência aqui à “expressão aumentada”, “expressão acentuada” ou “superexpressão” é considerada para significar um aumento na expressão do gene e/ou, se refere a polipeptideos, níveis de polipeptídeo aumentados e/ou atividade de polipeptídeo aumentada, em relação a plantas de controle. O aumento na expressão, os níveis de polipeptídeo ou atividade de polipeptídeo está na ordem crescente de preferência pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou

50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 100% ou ainda mais comparado com aqueles de plantas de controle. O aumento na expressão pode estar na ordem crescente de preferência pelo menos 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%,

700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000% ou 5000% ou ainda mais comparado com aquele de plantas de controle. Em casos onde as plantas de controle possuem apenas muito pouca expressão, os níveis de polipeptídeo ou atividade de polipeptídeo da sequência em questão e/ou o gene recombinante 5 está sob o controle de elemento(s) regulador(es) forte(s) aumentam em expressão, os níveis de polipeptídeo ou atividade de polipeptídeo podem ser pelo menos 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes, 2000 vezes, 3000 vezes, 5000 vezes, 10 000 vezes, 20 000 vezes, 50 000 vezes, 100 000 vezes ou ainda mais comparado com aqueles de plantas de controle.

Os métodos para aumentar a expressão de genes ou produtos genéticos são bem c documentados na técnica e incluem, por exemplo, a superexpressão conduzida por promotores adequados, o uso de intensificadores de transcrição ou intensificadores de tradução. Os ácidos 15 nucleicos isolados que servem como elementos promotores ou intensificadores de podem ser introduzidos em uma posição adequada (tipicamente a montante) de uma forma não-heteróloga de um polinucleotídeo para super-

regular a expressão de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de interesse. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo por mutação, deleção, e/ou substituição (veja, Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al., WO9322443), ou os promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula vegetal na orientação e distância adequadas de um gene da presente invenção para controlar a expressão do gene.

Se a expressão de polipeptídeo for desejada, geralmente deseja25 se incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3' de uma região de codificação de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes vegetais, ou de T-DNA. A sequência de extremidade 3' que será adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes da nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene vegetal, ou com menos preferência, de outro gene eucariótico.

Uma sequência de íntron também pode ser adicionada à região não traduzida 5' (UTR) ou à sequência codificadora da sequência codificadora parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. A inclusão de um íntron na unidade de transcrição nas construções de expressão vegetais e animais foi mostrada para aumentar a expressão genética nos níveis de mRNA e proteína para até 1000 vezes (Buchman e Berg 10 (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1 1831200). Tal aumento de íntron de expressão genética é tipicamente maior quando colocado próximo à extremidade 5' da unidade de transcrição. O uso dos íntrons de milho Adh1 -S íntron 1 , 2, e 6, o íntron Bronze-1 é conhecido na técnica. Para informações gerais, veja: The Maize Hebook, Chapter 116,

Freeling e Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Para obter a expressão aumentada ou superexpressão de um

polipeptídeo mais comumente o ácido nucleico que codifica esse polipeptídeo é superexpresso na orientação senso com um sinal de poliadenilação. íntrons outros elementos intensificadores podem ser usados além de um promotor adequado para conduzir a expressão com o padrão de expressão pretendido. Em contrapartida, a superexpressão da mesma sequência de ácido nucleico que a construção anti-senso não irá resultar em expressão aumentada da proteína, porém expressão reduzida da proteína.

Expressão reduzida

Aqui, a referência à expressão reduzida ou redução ou eliminação substancial de expressão deve significar uma redução em expressão genética endógena e/ou de níveis de polipeptídeo e/ou atividade de polipeptídeo em relação a plantas de controle. A redução ou eliminação substancial está em ordem crescente de preferência pelo menos 10%, 20%,

30%, 40% ou 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou ainda mais comparada com aquela de plantas de controle.

Transformação

O termo introdução ou transformação como referido aqui inclui a transferência de polinucleotídeo exógeno para uma célula hospedeira, independente do método usado para a transferência. O tecido vegetal capaz de propagação clonal subsequente, seja por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com uma construção genética da presente invenção e 10 uma planta inteira regenerada a partir desse. O tecido particular selecionado irá variar dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis, e mais bem adequados, para a espécie particular que será transformada. Os alvos de tecido exemplificativos incluem discos foliares, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido do calo, tecido meristemático existente 15 (por exemplo, meristema apical, gemas axilares, e meristemas radiculares), e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema do cotilédone e meristema do hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido de maneira

temporária ou estável em uma célula hospedeira e pode ser mantido nãointegrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, esse pode ser integrado no genoma hospedeiro. A célula vegetal transformada resultante pode ser então usada para regenerar uma planta transformada de maneira conhecida pelos elementos versados na técnica. Alternativamente, uma célula vegetal que não pode ser regenerada em uma planta pode ser selecionada como célula hospedeira, ou seja, a célula vegetal transformada resultante não possui a capacidade de se regenerar em uma planta (inteira).

A transferência de genes estranhos para dentro do genoma de uma planta é denominada transformação. A transformação de espécies vegetais é agora uma técnica bastante rotineira. Vantajosamente, qualquer um entre vários métodos de transformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em uma célula ancestral adequada. Os métodos descritos para a transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais podem ser utilizados para a transformação temporária ou estável. Os 5 métodos de transformação incluem o uso de lipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentam a absorção de DNA livre, injeção do DNA diretamente na planta, bombardeio de pistola de partícula, transformação utilizando vírus ou pólen e microprojeção. Os métodos podem ser selecionados a partir do método de cálcio/polietileno glicol para protoplastos (Krens, F.A. et 10 al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373);

eletroporação de protoplastos (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1 102); microinjeção em material vegetal (Crossway A et al. , (1986) Mol. Gen Genet 202: 1 79-185); bombardeio de partículas revestidas por DNA ou RNA (Klein TM et al. , (1987) Nature 327: 70) infecção com vírus (não-integrativos) e similares. As plantas transgênicas, inclusive plantas de safra transgênica, são de preferência produzidas através de transformação mediada por

Agrobacterium. Um método de transformação vantajoso é a transformação na

planta. Com essa finalidade, é possível, por exemplo, permitir que as agrobactérias atuem sobre as sementes da planta ou inoculem o meristema da planta com agrobactérias. Provou-se particularmente vantajoso de acordo com a invenção permitir uma suspensão de agrobactérias transformadas para atuar sobre a planta intacta ou pelo menos sobre os primórdios florais. A planta é subsequentemente desenvolvida até as sementes da planta tratada serem obtidas (Clough e Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Os métodos para a transformação mediada por Agrobacterium de arroz incluem métodos bem conhecidos para a transformação de arroz, como aqueles descritos em qualquer um dos seguintes: Pedido de patente europeu EP 1 198985 A1, Aldemita e Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491 -506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271 -282, 1994), cujas descrições estão aqui incorporadas a título de referência conforme completamente apresentado. No caso de transformação de milho, o método preferido é conforme descrito em Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) ou 5 Frame et al. (Plant Physiol 129(1 ): 13- 22, 2002), cujas descrições estão aqui incorporadas a título de referência conforme completamente apresentado. Os ditos métodos são adicionalmente descritos a título de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering e

Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e in 10 Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucleicos ou a construção que será expressa são, de preferência, clonados em um vetor, que é adequado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por exemplo, pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). As agrobactérias transformadas por esse vetor podem ser então usadas 15 de maneira conhecida para a transformação de plantas, como as plantas usadas como um modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaiiana está dentro do escopo da presente invenção não considerado como uma planta de safra),

ou plantas de safra como, a título de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo, ao imergir folhas machucadas ou folhas cortadas em uma solução agrobacteriana e então ao cultivar as mesmas em meio adequado. A transformação de plantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hofgen e Willmitzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida inter alia a partir de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering e Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Além da transformação de células somáticas, que, então, precisam ser regeneradas em plantas intactas, também é possível transformar as células de meristemas de plantas e, em particular, aquelas células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados seguem o desenvolvimento da planta natural, produzindo vegetais transgênicos. Portanto, por exemplo, as sementes de Arabidopsis são tratadas com agrobactérias e as sementes são obtidas a partir de plantas em desenvolvimento nos quais uma 5 determinada proporção é transformada e, portanto, [Feldman, KA and Marks

MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific,

Cingapura, páginas 274 a 289], Os métodos alternativos se baseiam na remoção repetida de inflorescências e incubação do sítio de excisão no centro 10 da roseta com agrobactérias transformadas, deste modo, as sementes transformadas podem ser obtidas em um ponto de tempo posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551 a 558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363 a 370).

Entretanto, um método especialmente efetivo é o método de infiltração a vácuo com suas modificações, como o método de “mergulho floral”. No caso de 15 infiltração a vácuo de Arabidopsis, as plantas intactas sob pressão reduzida são tratadas com uma suspensão agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sei Paris Life Sei, 316: 1194 a 1199], enquanto no caso do método de

“mergulho floral”, o tecido floral em desenvolvimento é brevemente incubado com uma suspensão agrobacteriana tratada com tensoativos [Clough, SJ and

Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735 a 743], Uma determinada proporção de sementes transgênicas é colhida em ambos os casos, e estas sementes podem ser distinguidas das sementes não transgênicas desenvolvendo-se sob as condições seletivas descritas anteriormente. Além da transformação estável de plastídeos apresentar vantagens pelo fato de os plastídeos serem 25 maternalmente herdados, os mesmo reduzem ou eliminam os riscos em colheitas de fluxo transgenético através de pólen. A transformação do genoma de cloroplasto é geralmente alcançada por um processo que foi esquematicamente exibido em Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2),

225-229], Brevemente, as sequências a serem transformadas são clonadas junto a um gene marcador selecionável entre as sequências de flanqueamento homologas ao genoma de cloroplasto. Estas sequências de flanqueamento homólogas direcionam a integração sítio-específica no plastoma. A 5 transformação plastidal foi descrita em relação a muitas espécies de plantas diferentes e uma visão gerai é dada em Bock (2001) Transgenic plastides in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001, 21 de setembro; 312 (3):425-38 ou Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20 a 28. Um progresso 10 biotecnológico adicional foi recentemente reportado sob a forma de transformantes de plastídeos isentos de marcadores, que podem ser produzidos por um gene marcador cointegrado transiente (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225 a 229).

As células de plantas geneticamente modificadas podem ser 15 regeneradas através de todos os métodos com os quais os indivíduos versados estão familiarizados. Os métodos adequados podem ser encontrados nas publicações supramencionadas por S.D. Kung and R. Wu, Potrykus ou Hõfgen

e Willmitzer. Alternativamente, as células de plantas geneticamente modificadas são não regeneráveis em uma planta inteira.

Geralmente, após a transformação, as células de plantas ou grupamentos celulares são selecionadas pela presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes expressíveis em plantas cotransferidos com o gene de interesse, depois disso o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar as plantas transformadas, o 25 material de planta obtido na transformação é, por via de regra, submetido a condições seletivas de tal modo que as plantas transformadas possam ser distinguidas das plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas da maneira descrita anteriormente podem ser plantadas e, após um período de crescimento inicial, submetidas a uma seleção adequada por aspersão. Uma possibilidade adicional consiste no crescimento das sementes, se apropriado, após a esterilização, em placas de ágar utilizando-se um agente de seleção adequado de tal modo que apenas as sementes transformadas possam se 5 desenvolver nas plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são submetidas à triagem para determinação da presença de um marcador selecionável, tais como aqueles descritos aqui.

Após a transferência e regeneração de DNA, as plantas presumidamente transformadas também podem ser avaliadas, por exemplo, 10 utilizando-se uma análise do tipo Southern, para determinação da presença do gene de interesse, número de cópia e/ou organização genômica. Alternativa ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recentemente introduzido podem ser monitorados utilizando-se análises Northern e/ou Western, sendo que ambas as técnicas são conhecidas pelos indivíduos com 15 habilidade comum na técnica.

As plantas transformadas geradas podem ser propagadas através de uma variedade de meios, tal como propagação clonal ou técnicas

de procriação clássicas. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou T1) pode se auto-reproduzir e os transformantes homozigotos de segunda geração (ou T2) selecionados, e as plantas T2 podem, então, ser propagadas através de técnicas de procriação clássicas. Os organismos transformados gerados podem assumir uma variedade de formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, em plantas, um rizoma transformado enxertado em um descendente não transformado).

Ao longo desse pedido, uma planta, parte da planta, semente ou célula vegetal transformada com - ou transformada de forma intercambiável por - uma construção ou transformada com ou por um ácido nucleico que será entendido como uma planta, parte da planta, semente ou célula vegetal que transporta a dita construção ou dito ácido nucleico como um transgene devido 5 ao resultado de uma introdução da dita construção ou dito ácido nucleico por meios biotecnológicos. A planta, parte da planta, semente ou célula vegetal, portanto, compreende a dita construção recombinante ou dito ácido nucleico recombinante. Qualquer planta, parte da planta, semente ou célula vegetal que não contém mais a dita construção recombinante ou dito ácido nucleico 10 recombinante após a introdução no passado, é denominado segregante nulo, nulizigoto ou controle nulo, porém não é considerada uma planta, parte da planta, semente ou célula vegetal transformada com a dita construção ou com o dito ácido nucleico dentro do significado desse pedido.

Indicação por ativação de T-DNA

A indicação por ativação de T-DNA (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353), envolve a inserção de T-DNA, geralmente contendo um promotor (também pode ser um acentuador de translação ou um intrão), na região genômica do gene de interesse de 10 kb em diante - ou a jusante da região de codificação de um gene em uma configuração de tal modo que o promotor direcione a expressão do gene direcionado. Tipicamente, a regulação da expressão do gene direcionado por seu promotor natural é interrompida e o gene fica sob controle do promotor recentemente introduzido. O promotor é tipicamente embutido em um T-DNA. Este T-DNA é aleatoriamente inserido no genoma da planta, por exemplo, através de 25 infecção de Agrobacterium e leva à expressão modificada de genes próximos ao T-DNA inserido. As plantas transgênicas resultantes mostram fenótipos dominantes devido à expressão modificada de genes próximos ao promotor introduzido.

TILLING

O termo TILLING é uma abreviação de “Segmentação Induzida por Lesões Locais em Genomas e se refere a uma tecnologia de mutagênese útil para gerar e/ou identificar os ácidos nucleicos que codificam proteínas com 5 expressão e/ou atividade modificada. A TILLING também permite a seleção de plantas que realizam tais variantes mutantes. Estas variantes mutantes podem exibir uma expressão modificada, seja em resistência, em local, ou em temporização (se as mutações afetarem o promotor, por exemplo). Essas variantes mutantes podem exibir atividade maior do que aquela exibida pelo 10 gene em sua forma natural. A TILLING combina a mutagênese de alta densidade com métodos de triagem de alto rendimento. As etapas tipicamente seguidas em TILLING são: (a) mutagênese EMS (Redei GP and Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Cingapura, World Scientific Publishing Co, pp. 16 a 82; Feldmann et al., (1994) 15 In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137 a 172; Lightner J and Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular

Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91 a 104); (b) preparação de

DNA e combinação de indivíduos; (c) amplificação de PCR de uma região de interesse, (d) desnaturação e têmpera para permitir a formação de heterodúplexes; (e) DHPLC, onde a presença de um heterodúplex em um conjunto é detectada como um pico extra no cromatograma; (f) identificação do mutante individual; e (g) sequenciamento do produto de PCR mutante. Os métodos para TILLING são bem conhecidos na técnica (McCalIum et al., (2000)

Nat Biotechnol 18: 455 a 457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2):

145 a 50).

Recombinaçâo homóloga

A recombinaçâo homóloga permite a introdução em um genoma de um ácido nucleico selecionado em uma posição selecionada definida. A recombinação homóloga é uma tecnologia padrão usada rotineiramente em ciências biológicas para organismos inferiores, como levedura ou o musgo Physcomitrella. Os métodos para realização de uma recombinação homóloga 5 em plantas foram descritos não apenas para modelos de plantas (Offringa et al.

(1990) EMBO J 9(10): 3077 a 84) mas também para plantas de colheita, por exemplo, arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030 a 4; lida e Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132 a 8), e existem abordagens que são genericamente aplicáveis independentemente do organismo alvo (Miller et 10 al, Nature Biotechnol. 25, 778 a 785, 2007).

Traço(s) relacionado(s) ao Rendimento

Um “traço relacionado ao rendimento'¹ é um traço ou característica que é relacionado ao rendimento da planta. Os traços relacionados ao rendimento podem compreender um ou mais da seguinte lista não limitativa de 15 características: período de florescimento precoce, rendimento, biomassa, rendimento de sementes, vigor inicial, índice de verde, taxa de crescimento aumentada, características agronômicas como tolerância à submersão (que resulta em rendimento aumentado em arroz), Eficiência de Uso da Água (WUE), Eficiência de Uso de Nitrogênio (NUE), etc..

O termo “um ou mais traços relacionados ao rendimento” será entendido para se referir a um traço relacionado ao rendimento, ou dois, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis ou sete ou oito ou nove ou dez, ou mais de dez traços relacionados ao rendimento de uma planta comparado com uma planta de controle.

A referência aqui a “traço relacionado ao rendimento aumentado” pretende significar um aumento em relação a plantas de controle em um traço relacionado ao rendimento, por exemplo, em vigor precoce, rendimento de semente e/ou em biomassa, de uma planta inteira ou de uma ou mais partes de uma planta, que pode incluir (i) partes aéreas, de preferência, partes colhíveis aéreas, e/ou (ii) partes subterrâneas, de preferência, partes colhíveis subterrâneas.

Em particular, essas partes colhíveis são raízes como raízes principais, caules, beterrabas, tubérculos, folhas, flores ou sementes, e o desempenho dos métodos da invenção resulta em plantas com rendimento de semente aumentado em relação ao rendimento de sementes de plantas de controle, e/ou biomassa aérea aumentada, em particular biomassa de caule em relação à biomassa aérea, e em particular biomassa de caule de plantas de 10 controle e/ou biomassa de raiz aumentada em relação à biomassa de raiz de plantas de controle e/ou biomassa de beterraba aumentada em relação à biomassa de beterraba de plantas de controle. Ademais, é particularmente contemplado que o teor de açúcar (em particular o teor de sacarose) nas partes aéreas, particularmente caule (em particular de plantas de cana-de-açúcar) 15 e/ou nas partes subterrâneas, em particular em raízes que incluem raízes principais e tubérculos e/ou em beterrabas (em particular em beterrabas sacarinas) é aumentado em relação ao teor de açúcar (em particular o teor de

sacarose) em parte(s) correspondente(s) da planta de controle.

Ao longo do presente pedido, a tolerância e/ou resistência a um ou mais agroquímicos por uma planta, por exemplo, tolerância a herbicida, não é considerada um traço relacionado ao rendimento dentro do significado desse termo do presente pedido. Uma tolerância e ou resistência alterada a um ou mais agroquímicos por uma planta, por exemplo, tolerância a herbicida aprimorada, não é um “traço relacionado ao rendimento aumentado” como usado ao longo desse pedido.

Em uma realização particular da presente invenção, qualquer referência a um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado se destina a excluir a restauração da expressão e/ou atividade do polipeptídeo

POI em uma planta em que a expressão e/ou a atividade do polipeptídeo POI foi reduzida ou desabilitada quando comparado com a planta de ocorrência natural original ou variedade original. Por exemplo, a superexpressão do polipeptídeo POI em uma variedade mutante inativa de uma planta, em que o 5 dito polipeptídeo POI ou um ortólogo ou parálogo foi inativado não é considerado com acentuando um ou mais traços relacionados ao rendimento dentro do significado da presente invenção.

Rendimento

O termo rendimento significa, em geral, um produto mensurável de valor econômico, tipicamente relacionado a uma colheita especifica, a uma área, e a um período de tempo. As partes de plantas individuais contribuem diretamente para o rendimento com base em seu número, tamanho e/ou peso, ou o rendimento real é o rendimento por metro quadrado para uma colheita ao ano, que é determinada dividindo-se a produção total (incluo tanto a produção 15 colhida como a produção avaliada) por metros quadrados plantados.

Os termos rendimento de uma planta e “rendimento de planta são usados aqui de forma intercambiável e se referem à biomassa vegetativa

como biomassa de raízes e/ou galhos, aos órgãos reprodutores, e/ou a propágulos como sementes de tal planta.

As flores em milho são inflorescências masculinas unissexuais (borlas) se originam do caule apical e as inflorescências femininas (espigas) surgem de pontas de gemas axilares. A inflorescência feminina produz pares de espiguetas sobre a superfície de um eixo central (sabugo). Cada espigueta feminina encerra dois flósculos férteis, um desses geralmente será 25 desenvolvido em um grão de milho uma vez fertilizado. Então um aumento do rendimento pode ser manifestado como um dos seguintes: aumento no número de plantas estabelecidas por metro quadrado, um aumento no número de espigas por planta, um aumento no número de fileiras, número de grãos por fileira, peso dos grãos, peso de mil grãos, comprimento/diâmetro da espiga, aumento na taxa de preenchimento de sementes que é o número de sementes preenchidas pelo número total de sementes e multiplicado por 100, dentre outros.

As inflorescências em plantas de arroz são denominadas panículas. A panícula contém espiguetas, que são as unidades básicas das panículas, e que consistem em um pedicelo e um flósculo. O flósculo é sustentado sobre o pedicelo e inclui uma flor que é coberta por duas glumas protetoras: uma gluma grande (a lema) e uma gluma mais curta (a pálea).

Então, adotando-se o arroz como exemplo, um aumento do rendimento pode se manifestar como um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por metro quadrado, número de panículas por planta, comprimento de panícula, número de espículas por panícula, número de flores (floretes) por panícula, aumento na taxa de preenchimento de sementes que é o número de floretes preenchidos e multiplicados por 100, um aumento em peso de mil grãos, dentre outros.

Tempo de florescimento precoce

As plantas com um “tempo de florescimento precoce como usado aqui são plantas que começam a florescer antes das plantas de controle.

Então, esse termo se refere a plantas que mostram um início precoce de florescimento. O tempo de florescimento de plantas pode ser avaliado ao contar o número de dias (“tempo para florescer) entre a semeação e a emergência de uma primeira inflorescência. O ” tempo de florescimento” de uma planta pode ser determinado, por exemplo, utilizando o método como descrito em WO 2007/093444.

Vigor precoce

O termo “vigor precoce” refere-se ao crescimento bem equilibrado saudável ativo especialmente durante os estágios precoces do crescimento da planta, e pode resultar da adaptação aumentada da planta devido, por exemplo, às plantas estarem mais bem adaptadas a seu ambiente (isto é, otimizar o uso de recursos de energia e o particionamento entre os galhos e as raízes). As plantas que têm um vigor precoce também mostram uma 5 sobrevivência aumentada de mudas e um melhor estabelecimento da colheita, que geralmente resulta em campos altamente uniformes (com o crescimento da colheita de maneira uniforme, isto é, com a maioria das plantas alcançando os vários estágios de desenvolvimento substancialmente ao mesmo tempo), e um rendimento ainda melhor e maior. Portanto, um 10 vigor aumentado pode ser determinado medindo-se vários fatores, tal como peso em mil grãos, germinação percentual, emergência percentual, crescimento das mudas, altura das mudas, comprimento das raízes, biomassa das raízes e galhos e muitos outros.

TAXA DE CRESCIMENTO AUMENTADA

A taxa de crescimento aumentada pode ser específica a uma ou mais partes de uma planta (incluindo sementes) ou pode ser por substancialmente toda a planta. As plantas que têm uma taxa de crescimento aumentada podem ter um ciclo de vida mais curto. O ciclo de vida de uma planta pode ser tomado para significar o tempo necessário para crescer de uma semente madura até o estágio em que a planta tenha produzido mature sementes maduras similares ao material inicial. Esse ciclo de vida pode ser influenciado por fatores tais como a velocidade de germinação, vigor precoce, taxa de crescimento, índice de verdor, tempo de floração e velocidade de maturação de semente. O aumento na taxa de 25 crescimento pode ocorrer em um ou mais estágios no ciclo de vida de uma planta ou durante substancialmente o ciclo de vida de planta inteiro. A taxa de crescimento aumentada durante os estágios iniciais no ciclo de vida de uma planta pode refletir o vigor elevado. O aumento na taxa de crescimento pode alterar o ciclo de colheita de uma planta permitindo que as plantas sejam semeadas mais tarde e/ou colhidas mais cedo do que seria possível de outra forma (um efeito similar pode ser obtido com o tempo de floração mais cedo). Se a taxa de crescimento for suficientemente aumentada, a 5 mesma pode permitir a semeadura adicional de sementes da mesma espécie de planta (por exemplo, semeadura e colheita de plantas de arroz seguidas pela semeadura e colheita de plantas de arroz adicionais tudo dentro de um período de crescimento convencional). Similarmente, se a taxa de crescimento for suficientemente aumentada, a mesma pode permitir a 10 semeadura adicional de sementes de diferentes espécies de plantas (por exemplo, semeadura e colheita de plantas de milho seguidas, por exemplo, pela semeadura e colheita opcional de soja, batata ou qualquer outra planta adequada). Os tempos adicionais de colheita do mesmo talo de raiz no caso das mesmas plantas de cultura podem também ser possíveis. Alterar o ciclo de colheita de uma planta pode levar a um aumento na produção de biomassa por metro quadrado (devido a um aumento no número de vezes (diga-se em um ano) que qualquer planta em particular pode ser crescida e

colhida). Um aumento da taxa de crescimento pode também permitir a cultivação de plantas transgênicas em uma área geográfica maior que suas contrapartes do tipo selvagem, como as limitações territoriais para crescer uma colheita são determinadas por condições ambientais contrarias ou no momento da plantação (início de temporada) ou no momento da colheita (final de temporada). Tais condições adversas podem ser evitadas se o ciclo de colheita for encurtado. A taxa de crescimento pode ser determinada derivando-se vários parâmetros das curvas de crescimento, tais parâmetros podem ser: T-Mid (o tempo tomado para que as plantas alcancem 50% de seu tamanho máximo) e T-90 (tempo tomado para que as plantas alcancem

90% de seu tamanho máximo), dentre outros.

Rendimento de semente

O rendimento de semente aumentado pode se manifestar como um ou mais dos seguintes:

a) um aumento na biomassa de sementes (peso total de semente) que pode estar em uma base de semente individual e/ou por planta e/ou por metro quadrado;

b) número de flores aumentado por planta;

c) número de sementes aumentado;

d) taxa de preenchimento de semente aumentada (que é expressa como a razão entre o número de flósculos preenchidos dividido pelo número total de flósculos);

e) índice de colheita aumentado, que é expresso como a razão do rendimento de partes colhíveis, como sementes, dividida pela biomassa de partes áreas de plantas; e

f) peso de mil grãos aumentado (TKW), que é extrapolado do número de sementes contado e seu peso total. Um TKW aumentado pode resultar de um tamanho também pode resultar endosperma.

Os termos de semente e/ou peso de semente aumentado, e de um aumento no tamanho de embrião e/ou “flósculos preenchidos” e “sementes preenchidas” podem ser considerados sinônimos.

Um aumento no rendimento de semente também pode ser manifestado como um aumento no tamanho de semente e/ou volume de semente. Ademais, um aumento no rendimento de semente também pode se 25 manifestar como um aumento na área de semente e/ou comprimento de semente e/ou largura de semente e/ou perímetro de semente.

ÍNDICE DE VERDOR

O índice de verdor como usado aqui é calculado a partir de imagens digitais de plantas. Para cada pixel pertencente ao objeto vegetal sobre a imagem, a razão do valor de verde versus o valor de vermelho (no modelo RGB para codificação de cor) é calculada. O índice de verdor é expresso como a porcentagem de pixels para a qual a razão de verde-para5 vermelho excede um determinado limite. Sob condições de crescimento normais, sob condições de crescimento de estresse salino, e sob condições de crescimento de disponibilidade de nutrientes reduzida, o índice de verdor de plantas é medido na última imagem antes do florescimento. Em contrapartida, sob condições de crescimento de estresse devido á seca, o índice de verdor de 10 plantas é medido na primeira imagem após a seca.

Biomassa

O termo “biomassa como usado aqui pretende se referir ao peso total de uma planta ou parte da planta. O peso total pode ser medido como peso seco, peso fresco ou peso úmido. Dentro da definição de biomassa, uma 15 distinção pode ser feita entre a biomassa de uma ou mais partes de uma planta, que podem incluir qualquer um ou mais dos seguintes;

- partes aéreas como, porém sem caráter limitativo, biomassa de

brotos, biomassa de sementes, biomassa de folhas, etc.;

- partes aéreas colhíveis como, porém sem caráter limitativo, biomassa de brotos, biomassa de sementes, biomassa de folhas, etc.;

- partes subterrâneas como, porém sem caráter limitativo, biomassa de raiz, tubérculos, bulbos, etc.;

- partes subterrâneas colhíveis como, porém sem caráter limitativo, biomassa de raiz, tubérculos, bulbos, etc

- partes colhíveis parcialmente subterrâneas como, porém sem caráter limitativo, beterrabas e outras áreas de hipocótilo, rizomas, estolhos ou rizomas rastejantes;

- biomassa vegetativa como biomassa de raiz, biomassa de broto etc.;

- órgãos reprodutivos; e

- propáguios como semente.

Raiz

Em uma realização preferida ao longo desse pedido, qualquer referência à “raiz“ como biomassa ou partes colhíveis ou como órgão, por exemplo, de teor de açúcar aumentado, será entendida como uma referência a partes colhíveis parcialmente inseridas ou em contato físico com o solo como, porém sem caráter limitativo beterrabas e outras áreas de hipocótilo de uma 10 planta, rizomas, estolhos ou rizomas rastejantes, bem como partes colhíveis subterrâneas como, porém sem caráter limitativo raiz, raiz principal, tubérculos ou bulbos, porém não incluindo folhas.

Resistência ao estresse

Um aumento no rendimento e/ou taxa de crescimento ocorre se a planta estiver sob condições de não estresse ou se a planta estiver exposta a vários estresses em comparação às plantas de controle. As plantas respondem tipicamente à exposição ao estresse crescendo mais lentamente. Em

condições de estresse severo, a planta pode até mesmo parar de crescer por completo. O estresse moderado por outro lado é definido na presente invenção como sendo qualquer estresse ao qual uma planta é exposta que não resulta na planta cessar a crescer por completo sem a capacidade de retomar o crescimento. O estresse moderado no senso da invenção leva a uma redução no crescimento das plantas estressadas de menos que 40%, 35%, 30% ou 25%, mais preferencialmente menos que 20% ou 15% em comparação à planta de controle sob condições de não estresse. Devido a avanços nas praticas agrícolas (irrigação, fertilização, tratamentos de pesticida) estresses severos não são frequentemente encontrados nas plantas de cultura cultivadas. Como uma consequência, o crescimento comprometido induzido pelo estresse moderado é frequentemente um atributo indesejável para a agricultura.

“Estresse biótico” é entendido como o impacto negativo exercido sobre plantas por outros organismos vivos, como bactérias, vírus, fungos, nematódeos, insetos, outros animais outras plantas. Os “estresses bióticos” 5 são tipicamente aqueles estresses causados por patógenos, como bactérias, vírus, fungos, plantas, nematódeos e insetos, outros animais, que podem resultar em efeitos negativos sobre o crescimento e/ou rendimento da planta.

“Estresse abiótico” é entendido como o impacto negativo de fatores não vivos sobre a planta viva em um ambiente específico. Os 10 “estresses abióticos podem ser devido à secura ou água em excesso, estresse anaeróbico, estresse salino, toxicidade química, estresse oxidativo e temperaturas quentes, frias ou de congelamento. O “estresse abiótico pode ser um estresse osmótico causado por um estresse hídrico, por exemplo, devido á seca, estresse salino ou estresse por congelamento. O “estresse abiótico¹' também pode ser um estresse oxidativo ou um estresse devido ao frio. “Estresse por congelamento” pretende se referir ao estresse devido a temperaturas de congelamento, ou seja, temperaturas nas quais as moléculas

de água disponíveis congelam e viram gelo. “Estrese devido ao frio, também denominado “estresse térmico” pretende se referir a temperaturas frias, por exemplo, temperaturas abaixo de 10°, ou, de preferência, abaixo de 5°C, porém na qual as moléculas de água não congelam. Conforme reportado em Wang et al. (Planta (2003) 218: 1 a 14), o estresse abiótico leva a uma série de mudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e moleculares que afetam adversamente a produtividade e crescimento da planta. Secura, salinidade, temperaturas extremas e estresse oxidativo são conhecidos como estando interconectados e podem induzir danos celulares e de crescimento através de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133:

1755 a 1767) descreve um grau particularmente alto de “interferência” entre o estresse de secura e o estresse de alta salinidade. Por exemplo, a secura e/ou salinização são manifestadas primariamente como estresse osmótico, resultando na interrupção da homeostase e distribuição de íon na célula. O estresse oxidativo, que acompanha frequentemente o estresse de secura, 5 salinidade ou temperatura alta ou baixa, pode causar a desnaturação de proteínas estruturais e funcionas. Como uma consequência, esses diversos estresses ambientais frequentemente ativam similar passagens de sinalização de célula e respostas celulares, tais como a produção de proteínas de estresse, regulação de antioxidantes, acúmulo de solutos compatíveis e 10 interrupção do crescimento. O termo condições de “não estresse conforme usado na presente invenção são aquelas condições ambientais que permitem o crescimento ótimo das plantas. Os versados na técnica têm conhecimento sobre as condições de solo e condições climáticas normais para uma dada localização. As plantas com condições de crescimento ótimo, (crescidas sob 15 condições de não estresse) tipicamente rendem, na ordem crescente de preferência, pelo menos 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% ou 75% da produção média de tal planta em um ambiente dado. A produção

média pode ser calculada com base na colheita e/ou temporada. Os versados na técnica têm conhecimento sobre as produções de rendimento médio de uma safra.

Aumentar/Melhorar/Acentuar

Os termos “aumentar, “melhorar” ou “acentuar” no contexto de um traço relacionado ao rendimento são permutáveis e devem significar no sentido da aplicação pelo menos um aumento de 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%,

9% ou 10%, preferencialmente pelo menos 15% ou 20%, mais preferencialmente 25%, 30%, 35% ou 40% no(s) traço(s) relacionado(s) ao rendimento em comparação às plantas de controles conforme definido na presente invenção.

Reprodução assistida por marcador

Tais programas de reprodução exigem às vezes a introdução de variação alélica por tratamento mutagênico das plantas, com o uso de, por exemplo, mutagênese EMS; alternativamente, o programa pode iniciar com 5 uma coleção de variantes alélicos de assim chamada origem “natural” causada não intencionalmente. A identificação de variantes alélicos, então, ocorre, por exemplo, por PCR. Isso é seguido por uma etapa para a seleção de variantes alélicos superiores da sequência em questão e que geram rendimento aumentado. A seleção é tipicamente realizada monitorando-se o 10 desempenho de crescimento de plantas que contêm diferentes variantes alélicos da sequência em questão. O desempenho de crescimento pode ser monitorado em uma estufa ou no campo. As etapas opcionais adicionais incluem cruzamento de plantas em que o variante alélico superior foi identificado com outra planta. Isso pode ser usado, por exemplo, para fazer 15 uma combinação de atributos fenotípicos interessantes.

USO COMO SONDAS NO (MAPEAMENTO GENÉTICO)

O uso de ácidos nucleicos que codificam a proteína de

interesse para mapear genética e fisicamente os genes exige somente uma sequência de ácido nucleico de pelo menos 15 nucleotídeos no comprimento. Esses ácidos nucleicos podem ser usados como marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP). Southern blots (Sambrook J, Fritsch EF e Maniatis T (1989) Molecular

Cloning, A Laboratory Manual) do DNA genômico de planta digerido por restrição podem ser sondados com os ácidos nucleicos que codificam a proteína de interesse. Os padrões de bandeamento resultantes podem, então, ser submetidos a análises genéticas com o uso de programas de computador tais como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174 a 181) a finde construir um mapa genético. Adicionalmente, os ácidos nucleicos podem ser usados para sondar Southern blots que contém DNAs genômicos tratados por endonuclease de restrição de um conjunto de indivíduos que representa progenitor e progênie de um cruzamento genético definido. A segregação dos polimorfismos de DNA é notada e 5 usada para calcular a posição do ácido nucleico que codifica a proteína de interesse no mapa genético obtido anteriormente com o uso de sua população (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314 a 331).

A produção e uso de sondas derivadas de gene de planta para o uso no mapeamento genético são descritos em Bernatzky and Tanksley 10 (1986) Plant Mol. Biol. Repórter 4: 37 a 41. As numerosas aplicações descrevem o mapeamento genético de clones de cDNA específicos com o uso da metodologia descrita acima ou variações na mesma. Por exemplo, populações de cruzamento F2, populações de retrocruzamento, populações combinadas aleatoriamente, linhagens quase isogênicas e 15 outros conjuntos de indivíduos que podem ser usados para o mapeamento.

Tais metodologias são bem conhecidas aos versados na técnica.

As sondas de ácido nucleico podem também ser usadas para

mapeamento físico (isto é, colocação de sequências em mapas físicos; consulte Hoheisel et al. Em: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical

Guide, Academic press 1996, páginas 319 a 346 e as referências citadas no mesmo).

Em outra realização, as sondas de ácido nucleico podem ser usadas na fluorescência direta no mapeamento de hibridização in situ (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149 a 154). Embora os métodos 25 atuais de mapeamento de FISH favoreçam o uso de clones grandes (vários kb a várias centenas de kb; consulte Laan et al. (1995) Genome Res. 5:1320), melhoras na sensibilidade podem permitir o desempenho do mapeamento de FISH com o uso de sondas mais curtas.

Uma variedade de métodos com base na amplificação de ácido nucleico para mapeamento físico e genético pode ser realizada com o uso dos ácidos nucleicos. Os exemplos incluem amplificação alelo específica (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95 a 96), polimorfismo de 5 fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics

16:325 a 332), ligação alelo específica (Landegren et al. (1988) Science 241:1077 a 1080), reações de extensão de nucleotídeo (Sokolov (1990) Ácido nucleico Res. 18:3671), Mapeamento Híbrido de Radiação (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22 a 28) e Mapeamento Happy (Dear e Cook 10 (1989) Ácido nucleico Res. 17:6795 a 6807). Para esses métodos, a sequência de um ácido nucleico é usada para projetar e produzir pares de iniciadores para o uso em uma reação de amplificação ou em reações de extensão de iniciadores. O projeto de tais iniciadores é bem conhecido aos versados na técnica. Nos métodos que empregam o mapeamento genético 15 com base em PCR, pode ser necessário identificar diferenças de sequência de DNA entre progenitores do mapeamento cruzado na região correspondente à sequência de ácido nucleico imediata. Isso, entretanto,

não é geralmente para os métodos de mapeamento.

Planta

O termo “planta” conforme usado na presente invenção abrange plantas inteiras, ancestrais e progênie das plantas e partes de planta, incluindo sementes, brotos, caules, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores e tecidos e órgãos, em que cada um dentre os mencionados acima compreende o gene/ácido nucleico de interesse. O termo “planta” também abrange células de planta, culturas de suspensão, tecidos de calos, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos, novamente em que cada um dentre os mencionados acima compreende o gene/ácido nucleico de interesse.

Planta(s) de controle

A escolha de plantas de controle adequadas é uma parte de rotina de uma configuração experimental e pode incluir plantas de tipo selvagem correspondentes ou plantas correspondentes sem o gene de 5 interesse. A planta de controle é tipicamente da mesma espécie de planta ou até mesmo da mesma variedade que a planta a ser avaliada. A planta de controle pode também se um nulizigoto da planta a ser avaliada. Os nulizigotos (ou plantas de controle nulo) são indivíduos que não têm o transgene por segregação. Ademais, as plantas de controle se desenvolvem 10 sob condições de crescimento iguais às condições de crescimento das plantas da invenção, ou seja, nos arredores de, e simultaneamente com, as plantas da invenção. Uma “planta de controle conforme usado na presente invenção refere-se não só a plantas inteiras, como também a partes de plantas, incluindo sementes e partes de sementes.

Material de propagação “Material de propagação” é qualquer tipo de órgão, tecido, ou célula de uma planta capaz de se desenvolver em uma planta completa. O

“material de propagação” pode estar baseado na reprodução vegetativa (também conhecida como propagação vegetativa, multiplicação vegetativa, ou clonagem vegetativa) ou reprodução sexual. O material de propagação pode ser, portanto, sementes ou partes dos órgãos não-reprodutores, como caule ou folha. Em particular, em relação a Poaceae, o material de propagação adequado também pode ser seções do caule, ou seja, incisões de caule (como mudas).

Talo

Um “talo” é o caule de uma Poaceae e também é conhecido como “colmos industrializáveis” em particular para a espécie Saccharum como cana-de-açúcar. No contexto de Poaceae “talo”, “caule, “broto, ou “rebento” são usados de forma intercambiável.

Muda

Uma “muda é uma seção do caule de uma Poaceae, em particular para a espécie Saccharum como cana-de-açúcar, que é adequada 5 para ser usada como material de propagação. Expressões sinônimas para “muda” são “semente de cana”, “incisão de caule, “seção do talo”, e “pedaço de semente.

A seguir, a expressão “como definido na reivindicação/item X“ significa induzir o elemento versado na técnica a aplicar a definição como 10 descrito no item/reivindicação X. Por exemplo, “um ácido nucleico como definido no item 1” deve ser entendido de modo que a definição do ácido nucleico como no item 1 seja aplicada ao ácido nucleico. Em consequência, o termo “como definido no item” ou “como definido na reivindicação” pode ser substituído pela definição correspondente daquele item ou reivindicação, 15 respectivamente.

Descrição detalhada

A presente invenção mostra que o aumento da expressão em

uma planta de um ácido nucleico flavodoxina que codifica um polipeptídeo flavodoxina utilizando um tipo particular de promotor e marcação de plastideo resulta em plantas com um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle.

Qualquer referência aqui a uma proteína útil nos métodos da invenção é adotada para indicar um polipeptídeo flavodoxina como definido aqui. Qualquer referência aqui a um ácido nucleico útil nos métodos da 25 invenção é adotada para indicar um ácido nucleico capaz de codificar esse polipeptídeo flavodoxina com marcação de plastideo. Em uma realização, qualquer referência a uma proteína ou ácido nucleico ou construção de expressão “útil nos métodos da invenção” é adotada para indicar proteínas ou ácidos nucleicos ou construção de expressão “úteis nos métodos, construções de vetor, plantas, partes colhíveis e produtos da invenção”. O ácido nucleico a ser introduzido em uma planta (e, portanto, útil em realizar os métodos da invenção) é qualquer ácido nucleico que codifica o tipo de proteína que será 5 agora descrito, doravante também chamado de um ácido nucleico ΡΟΓ ou “gene POI” ou “ácido nucleico flavodoxina ou ácido nucleico flavodoxina ou “gene flavodoxina, de preferência, que codifica a dita proteína com um sinal de marcação no plastídeo de uma planta.

Qualquer referência aqui a “um promotor particular” é adotada 10 para indicar um promotor GOS2 como definido aqui.

Assim, um ácido nucleico flavodoxina que codifica um polipeptídeo flavodoxina é útil nas construções genéticas, métodos, plantas, partes colhíveis e produtos da presente invenção. De preferência, o ácido nucleico flavodoxina é uma molécula de ácido nucleico isolada que 15 compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em:

(i) um ácido nucleico que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%,

59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%,

72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,

85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo desse;

(ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i);

(iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%,

66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo desse; de preferência, o polipeptídeo fíavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle; e (iv) uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização severas.

Com mais preferência, o ácido nucleico fíavodoxina isolado compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em:

(i) um ácido nucleico que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, 15 pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15;

(ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i);

(iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo fíavodoxina que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2 ou 16, de preferência, o polipeptídeo fíavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle; e (iv) uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização de alta severidade.

As porcentagens de identidade de um ácido nucleico são indicadas com referência à região de nucleotídeo total fornecida em uma 5 sequência especificamente descrita aqui.

Em uma realização preferida, o ácido nucleico flavodoxina útil nos métodos, construções de vetor, plantas, partes colhíveis e produtos da invenção codifica um polipeptídeo que compreende um ou mais domínios e motivos relacionados na tabela B, com mais preferência, o domínio PFAM 10 PF00258, de preferência, quando analisados com o software InterproScan como descrito no exemplo 2. Prefere-se ainda que uma localização e/ou ordem de um ou mais domínios e/ou motivos relacionados na tabela B dentro da sequência de polipeptídeo do polipeptídeo flavodoxina seja substancialmente a mesma que aquela mostrada para SEQ ID NO: 2 na figura 1Com mais 15 preferência, o ácido nucleico flavodoxina isolado compreende ou consiste em uma sequência como representado em SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, um complemento dessa, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo

flavodoxina com SEQ ID NO: 2 ou 16, ou uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza com qualquer uma dessas moléculas de ácido nucleico ou uma sequência complementar dessa sob condições de hibridização severas, e, de preferência, que codificam um polipeptídeo que compreende um ou mais domínios e motivos relacionados na tabela B, com mais preferência, o domínio PFAM PF00258, de preferência, quando analisados com o software

InterproScan como descrito no exemplo 2,

Os ácidos nucleicos flavodoxina preferidos são mencionados na

Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Em uma realização, o ácido nucleico flavodoxina compreende uma sequência de ácido nucleico mencionada na

Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Uma sequência de ácido nucleico que compreende o gene flavodoxina de Anabaena sp., de preferência, Anabaena PCC7119 ou Synechocystis sp., de preferência, Synechocystis sp. PCC 6803 é mais preferida como ácido nucleico flavodoxina.

Uma sequência de ácido nucleico que compreende o gene 5 flavodoxina de Anabaena sp., de preferência, Anabaena PCC7119 é mais preferida como ácido nucleico flavodoxina.

Em uma realização, a invenção se refere aos métodos, construções de vetor, plantas, partes colhíveis e produtos como descrito aqui, que compreendem o gene de flavodoxina otimizado com códon de Anabaena w como descrito em SEQ ID NO: 13 que codifica a proteína flavodoxina de SEQ ID NO: 2 ou fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo desse como descrito aqui, em que o dito polipeptídeo flavodoxina, fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo é ligado a um peptídeo de trânsito como descrito aqui e funcionalmente ligado a um promotor adequado para expressão 15 em plantas. Os promotores adequados exceto o promotor descrito em SEQ ID NO: 7 são conhecidos na técnica.

Em uma realização, a invenção se refere aos métodos,

construções de vetor, plantas, partes colhíveis e produtos como descrito aqui, que compreendem o gene flavodoxina de Synechocystis sp. PCC 6803 como descrito em SEQ ID NO: 15 ou que codificam a proteína flavodoxina de SEQ ID

NO: 16, ou fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo desse como descrito aqui, em que o dito polipeptídeo flavodoxina, fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo desse é ligado a um peptídeo de trânsito como descrito aqui e funcionalmente ligado a um promotor adequado para expressão em plantas. Os promotores adequados exceto o promotor descrito em SEQ ID

NO: 7 são conhecidos na técnica. As sequências dos polipeptídeos codificados são mostradas em SEQ ID NO: 16 & 18, com ou sem um peptídeo de trânsito de FNR de ervilha, respectivamente.

Variantes de ácido nucleico adicionais úteis na prática dos métodos da invenção incluem porções de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos flavodoxina, fragmentos funcionais de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos flavodoxina, ácidos nucleicos que hibridizam ácidos 5 nucleicos que codificam polipeptídeos flavodoxina, variantes de junção de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos flavodoxina e variantes de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos flavodoxina obtidos por embaralhamento de gene. Os termos sequência hibridizante, variante de junção, variante alélica e embaralhamento de gene são conforme descrito no presente documento.

Ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de flavodoxina não precisam ser ácidos nucleicos de comprimento total, pois o desempenho dos métodos da invenção nem sempre depende do uso de sequências de ácido nucleico de comprimento total. De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para acentuar traços relacionados ao rendimento em plantas, que compreende introduzir e expressar em uma planta um fragmento funcional de qualquer uma das sequências de ácido nucleico fornecidas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, ou uma porção de um ácido nucleico que codifica um

ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das sequências de aminoácido fornecidas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência.

Um fragmento de um ácido nucleico pode ser preparado, por exemplo, ao realizar uma ou mais deleções ao ácido nucleico. As porções podem ser usadas em forma isolada ou as mesmas podem ser fundidas a outras sequências de codificação (ou não codificação) a fim de, por exemplo, produzir uma proteína que combina diversas atividades. Quando fundidas com outras sequências de codificação, o polipeptídeo resultante produzido mediante a translação pode ser maior do que o previsto para a porção de proteína.

Os fragmentos de um ácido nucleico flavodoxina descritos aqui codificam um polipeptídeo flavodoxina como definido aqui ou pelo menos uma parte desse, que possui substancialmente a mesma atividade biológica que as sequências de aminoácido fornecidas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. De preferência, a porção é uma porção de qualquer um dos ácidos nucleicos fornecidos na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, ou é uma porção de um ácido nucleico que codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das sequências de aminoácido fornecidas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. De preferência, a porção é pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos

cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, pelo menos cerca de 1000 ou mais nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3' do ácido nucleico, de comprimento de qualquer sequência de ácido nucleico fornecida na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. De preferência, o ácido nucleico flavodoxina compreende pelo 15 menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’

ou 3’ do ácido nucleico, ou até o comprimento total da sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 1, 13 ou 15.

De preferência, a porção do ácido nucleico flavodoxina é cerca de

400-425, cerca de 425-450, cerca de 450-475, cerca de 475-500, cerca de 500525, cerca de 525-550, cerca de 550-575, cerca de 575-600, cerca de 625-650,

cerca	de	650-675,	cerca	de	675-700,	cerca	de	700-725,	cerca	de	725-750,
cerca	de	750-775,	cerca	de	775-800,	cerca	de	800-825,	cerca	de	825-850,
25 cerca	de	850-875,	cerca	de	875-900,	cerca	de	925-950,	cerca	de	950-975,

cerca de 975-1000 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico, de comprimento, das sequências de ácido nucleico fornecidas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. De preferência, a porção de ácido nucleico flavodoxina possui cerca de 400-425, cerca de 425-450, cerca de 450-475, cerca de 475500 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico, ou até o 5 comprimento total da sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:

1, 13 ou 15.

Outra variante de ácido nucleico é um ácido nucleico capaz de

hibridizar, em condições de severidade reduzida, de preferência, em condições de severidade, com um ácido nucleico que codifica um relacionado flavodoxina conforme definido no presente documento, ou com uma porção conforme definido no presente documento ou um complemento de cada.

A sequência hibridizante é capaz de se hibridizar com o complemento de qualquer um dos ácidos nucleicos obtidos na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, ou com uma porção de qualquer uma dessas sequências, sendo uma porção conforme definido acima, ou a sequência hibridizante é capaz de se hibridizar com o complemento de um ácido nucleico que codifica um ortólogo ou parálogo de qualquer uma das sequências de aminoácido obtidas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Com a máxima preferência, a sequência hibridizante é capaz de se hibridizar com o complemento de um ácido nucleico fornecido na SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou com o complemento de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo como representado por SEQ ID NO: 2 ou 16 ou com uma porção do mesmo. Em uma realização, as condições de hibridização são de severidade média, de preferência, de alta severidade, como definido na presente invenção.

De preferência, a sequência hibridizante codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácido que compreende a SEQ ID NO: 2 ou 16.

Variantes de junção preferenciais são variantes de junção de um ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou uma variante de junção de um ácido nucleico que codifica um ortólogo ou parálogo de SEQ ID

NO: 2 ou 16.

Adicionalmente, as variantes de ácido nucleico também podem ser obtidas através de mutagênese sítio-dirigida. Diversos métodos estão disponíveis para realizar a mutagênese sítio-dirigida, sendo os mais comuns métodos com base em PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley

Eds.). Os polipeptídeos flavodoxina que se diferem da sequência de SEQ ID

NO: 2 ou 16 por um ou vários aminoácidos (substituição(ões), inserçao(ões) e/ou deleção(ões) como definido aqui) podem ser igualmente úteis para aumentar o rendimento de plantas nos métodos e construções e plantas da invenção.

Os ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos flavodoxina podem ser derivados a partir de qualquer fonte natural ou artificial. O ácido nucleico pode ser modificado a partir de sua forma nativa em ambiente genômico e/ou composição através de manipulação humana deliberada. De preferência, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo flavodoxina é de uma bactéria, de preferência, de uma cianobactéria, com mais preferência, de

Anabaena.

Em outra realização, a presente invenção se refere ao DNA cromossômico recombinante que compreende uma sequência de ácido nucleico (que inclui um promotor particular empregado) útil nos métodos da invenção, em que o dito ácido nucleico está presente no DNA cromossômico como resultado de métodos recombinantes, porém não em seu arnbiente genético natural. Em uma realização adicional, o DNA cromossômico recombinante da invenção está compreendido em uma célula vegetal. O DNA compreendido dentro de uma célula, particularmente uma célula com paredes celulares como uma célula vegetal, é mais bem protegido contra degradação ou danos do que uma sequência de ácido nucleico exposta. O mesmo se aplica a uma construção de DNA compreendida em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula vegetal.

Em uma realização preferida, a invenção se refere a composições que compreendem o DNA cromossômico recombinante da invenção e/ou a construção da invenção e uma célula hospedeira, de preferência, uma célula vegetal, em que o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção estão compreendidos dentro da célula hospedeira, de preferência, dentro de uma

célula vegetal ou uma célula hospedeira com uma parede celular. Em uma realização adicional, a dita composição compreende células hospedeiras mortas, células hospedeiras vivas ou uma mistura de células hospedeiras mortas e vivas, em que o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção da invenção pode ficar localizado em células hospedeiras mortas e/ou células hospedeiras vivas. Opcionalmente, a composição pode compreender células hospedeiras adicionais que não compreendem o DNA cromossômico recombinante da invenção ou a construção da invenção. As composições da invenção podem ser usadas em processos de multiplicar ou distribuir o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção da invenção, e ou

alternativamente para proteger o DNA cromossômico recombinante e/ou a construção da invenção contra colapso e/ou degradação como explicado aqui acima. O DNA cromossômico recombinante da invenção e/ou a construção da invenção pode ser usada como um marcador de qualidade das composições da invenção, como um indicador de origem e/ou como uma indicação de produtor.

Um polipeptídeo flavodoxina como descrito aqui é útil nas construções genéticas, métodos, plantas, partes colhíveis e produtos da presente invenção. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina é um polipeptídeo flavodoxina bacteriano, por exemplo, um polipeptídeo flavodoxina cianobacteriano como a flavodoxina da cianobactéria Anabaena PCC7119 (Fillat M. et al (1991) Biochem J. 280 187-191) ou SEQ ID NO: 2 ou a flavodoxina de Synechocystis descrita em SEQ ID NO: 16. Outros polipeptídeos flavodoxina adequados incluem flavodoxinas de bactérias anoxigênicas fotossintéticas, enterobactérias, diazotrofos e algas. Exemplos de 5 ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos flavodoxina adequados para uso de acordo com a presente invenção são exemplificados na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Embora um polipeptídeo flavodoxina de ocorrência natural seja preferido, um polipeptídeo flavodoxina também pode ser um fragmento, mutante, derivado, variante ou alelo dessa sequência de ocorrência 10 natural.

Fragmentos, mutantes, derivados, variantes e alelos adequados são aqueies que mantêm as características funcionais do polipeptídeo codificado pelo gene flavoproteína de ocorrência natural, especialmente a capacidade de atuar como um antioxidante. Mudanças em uma sequência, 15 para produzir um mutante, variante ou derivado, podem ser qualquer um ou mais entre adição, inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos no ácido nucleico, que resulta na adiçao, inserção, deleção ou

substituição de um ou mais aminoácidos no polipeptídeo codificado.

Naturalmente, mudanças no ácido nucleico que não fazem diferença para a sequência de aminoácido codificada são incluídas.

Um polipeptídeo que é um membro da família de flavodoxina ou que é uma variante da sequência de aminoácido, alelo, derivado ou mutante desse pode compreender uma sequência de aminoácido que compartilha mais de cerca de 30% de identidade de sequência, mais de cerca de 35%, mais de cerca de 40%, mais de cerca de 45%, mais de cerca de 55%, mais de cerca de

65%, mais de cerca de 70%, mais de cerca de 80%, mais de cerca de 90% ou mais de cerca de 95%, de preferência, mais de cerca de 96%, mais de cerca de 97%, mais de cerca de 98%, ou mais de cerca de 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo flavodoxina codificado por um ácido nucleico flavodoxina como mostrado na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência.

Um polipeptídeo que é um membro da família de flavodoxina ou que é uma variante da sequência de aminoácido, alelo, derivado ou mutante 5 desse pode compreender uma sequência de aminoácido que compartilha mais de cerca de 30% de identidade de sequência, mais de cerca de 35%, mais de cerca de 40%, mais de cerca de 45%, mais de cerca de 55%, mais de cerca de

65%, mais de cerca de 70%, mais de cerca de 80%, mais de cerca de 90% ou mais de cerca de 95%, de preferência, mais de cerca de 96%, mais de cerca de 97%, mais de cerca de 98%, ou mais de cerca de 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de flavodoxina Anabaena

PCC7119.

Em algumas realizações, um polipeptídeo flavodoxina pode mostrar pouca homologia total, cerca de 20%, ou cerca de 25%, ou cerca de

30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40% ou cerca de 45%, com a sequência de flavodoxina Anabaena PCC7119 (SEQ ID NO: 2) ou a flavodoxina

Synechocystis (SEQ ID NO: 16), mesmo que essa possua substancialmente a

mesma atividade de anti-oxidação. Entretanto, em domínios ou regiões funcionalmente significativas, a homologia de aminoácido pode ser muito maior. Por exemplo, um polipeptídeo flavodoxina compreende um domínio de ligação a FMN que possui alta homologia com o domínio de ligação a FMN de flavodoxina (um domínio tipo flavodoxina). Os domínios ou regiões putativas funcionalmente significativas podem ser identificados utilizando processos de bioinformática, inclusive comparação das sequências de homólogos.

Em uma realização preferida, o polipeptídeo flavodoxina útil nos métodos, plantas, partes colhíveis e produtos da invenção é um polipeptídeo que compreende um ou mais dos domínios e motivos relacionados na tabela B, com mais preferência, o domínio PFAM PF00258, de preferência, quando analisados com o software InterproScan como descrito no exemplo 2. Preferese ainda uma localização e/ou ordem de um ou mais domínios e/ou motivos relacionados na tabela B dentro da sequência de polipeptídeo do polipeptídeo fíavodoxina que é substancialmente a mesma que aquela mostrada para SEQ 5 ID NO: 2 na figura 1.

Prefere-se ainda como polipeptídeo fíavodoxina um polipeptídeo que compreende ou consiste na proteína fíavodoxina codificada por qualquer

uma das sequências de ácido nucleico fornecidas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, de preferência, de Anabaena sp., de preferência, Anabaena

PCC7119 ou Synechocystis sp., de preferência, Synechocystis sp. PCC 6803, com mais preferência, o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 ou 16 codificado pelo ácido nucleico como descrito na SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, respectivamente, e com mais preferência, o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2.

De preferência, o polipeptídeo fíavodoxina é um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em:

(i) um polipeptídeo que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%,

54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%,

61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%

70%, 71%, 72%, 73%,

74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%

85%, 86%,

87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo desse; de preferência, o polipeptídeo fíavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a 25 plantas de controle;

(ii) um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%,

68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,

81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,

94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou um 5 fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo desse; de preferência, o polipeptídeo flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle.

Com mais preferência, o polipeptídeo flavodoxina é um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em:

(i) um polipeptídeo que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo desse;

(ii) um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico que possui

em ordem crescente de preferência pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos

96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos

100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou um fragmento, derivado, ortólogo ou parálogo desse. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina confere um ou mais um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, de preferência, plantas de controle que não expressam o polipeptídeo flavodoxina.

As porcentagens de identidade de um polipeptídeo ou proteína são indicadas com referência à sequência de aminoácido total especificamente descrita aqui.

De preferência, o polipeptídeo flavodoxina compreende pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 110, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 130, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 145, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 155, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 165, ou pelo menos cerca de 167 aminoácidos, de preferência, aminoácidos

consecutivos, de preferência, contados a partir da terminação N ou terminação

C da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido set out in SEQ ID NO: 2 ou 16. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina possui substancialmente a mesma atividade biológica que a SEQ

ID NO: 2 ou 16. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, de preferência, plantas de controle que não expressam o polipeptídeo flavodoxina.

De preferência, o polipeptídeo flavodoxina compreende pelo menos menos menos menos cerca cerca cerca cerca de 50, pelo de de de menos cerca de 75, pelo menos cerca de 100, pelo

110, pelo

140, pelo menos menos cerca cerca de 120, pelo menos cerca de 130, pelo de 145, pelo menos cerca de 150, pelo

155, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 165, ou pelo menos consecutivos, cerca de 167 aminoácidos, de preferência, aminoácidos de preferência, contados a partir da terminação N ou terminação

C da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total de qualquer uma das sequências de aminoácido codificadas pela sequência de ácido nucleicos apresentada na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina possui substancialmente a mesma atividade biológica que a respectiva sequência da Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, de preferência, plantas de controle que não expressam o polipeptídeo flavodoxina.

De preferência, o polipeptídeo flavodoxina compreende cerca de 50-75, cerca de 75-100, cerca de 100-110, cerca de 110-120, cerca de 1205 130, cerca de 130-140, cerca de 140-150, cerca de 150-160, cerca de 160-170 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir da terminação N ou terminação C da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total de qualquer uma das sequências de

aminoácido codificadas pela sequência de ácido nucleicos apresentada na

Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina possui substancialmente a mesma atividade biológica que a respectiva sequência da Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, de preferência, 15 plantas de controle que não expressam o polipeptídeo flavodoxina.

De preferência, o polipeptídeo flavodoxina compreende cerca de

50-75, cerca de 75-100, cerca de 100-110, cerca de 110-120, cerca de 120-

130, cerca de 130-140, cerca de 140-150, cerca de 150-160, cerca de 160-170 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir da terminação N ou terminação C da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2 ou 16. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina possui substancialmente a mesma atividade biológica que a SEQ

ID NO: 2. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina confere um ou mais traços 25 relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, de preferência, plantas de controle que não expressam o polipeptídeo flavodoxina.

Com mais preferência, o polipeptídeo flavodoxina isolado compreende ou consiste em SEQ ID NO: 2, ou é codificado por um ácido nucleico com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, de preferência, o polipeptídeo flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle.

Os polipeptídeos codificados por variantes alélicas úteis nos métodos da presente invenção possuem substancialmente a mesma atividade biológica que o polipeptídeo flavodoxina da SEQ ID NO: 2 e qualquer uma das sequências de aminoácido codificadas pelas sequências de ácido nucleico

mostradas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. As variantes alélicas existem na natureza, e o uso desses alelos naturais está incluído dentro dos métodos da presente invenção. De preferência, a variante alélica é uma variante alélica de SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou uma variante alélica de um ácido nucleico que codifica um ortólogo ou parálogo da SEQ ID NO: 2 ou 16.

Em outra realização, a sequência de polipeptídeos útil nos métodos, construções, plantas, partes colhíveis e produtos da invenção 15 possuem substituições, deleções e/ou inserções comparado com a sequência da SEQ ID NO: 2 ou 16, em que as substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido podem variar de 1 a 10 aminoácidos cada.

A invenção também fornece construções genéticas, como construções de expressão ou cassetes de expressão, ou construções de vetor, que compreendem um ácido nucleico flavodoxina. De preferência, essas construções genéticas são adequadas para a introdução e/ou expressão em plantas, partes de planta ou células vegetais de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos flavodoxina. As construções de expressão podem ser inseridas em construções de vetores, que podem estar comerciafmente disponíveis, 25 adequadas para transformação em plantas ou células hospedeiras e adequadas para a expressão do gene de interesse nas células transformadas. A invenção também fornece o uso de uma construção genética como definido aqui nos métodos da invenção. Assim, outra realização da presente invenção é uma construção de expressão ou cassete de expressão que compreende um ácido nucleico flavodoxina.

As construções genéticas da invenção podem estar compreendidas em uma célula hospedeira, célula vegetal, semente, produto agrícola ou planta ou parte da planta. As plantas ou células hospedeiras são transformadas com uma construção genética como uma construção de vetor ou uma construção de expressão que compreende qualquer um dos ácidos nucleicos flavodoxina descritos aqui.

Em uma realização, a construção genética da invenção confere rendimento aumentado ou traço(s) relacionado(s) ao rendimento a uma planta quando a mesma for introduzida na dita planta, essa planta expressa o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo flavodoxina compreendido na construção genética. Em outra realização, a construção genética da invenção confere rendimento aumentado ou traço(s) relacionado(s) ao rendimento a uma planta 15 que compreende células vegetais em que a construção foi introduzida, essas células vegetais expressam o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo flavodoxina compreendido na construção genética.

O elemento versado na técnica está ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes na construção genética para transformar, selecionar e propagar de forma bem sucedida as células hospedeiras que contêm a sequência de interesse.

Mais especificamente, a presente construção de expressão que compreende:

(a) um ácido nucleico flavodoxina que invenção fornece uma codifica um polipeptídeo flavodoxina como definido acima;

(b) uma ou mais sequências de controle capazes de conduzir a expressão da sequência de ácido nucleico de (a), em que a sequência de controle é, de preferência, uma sequência promotora; e opcionalmente (c) uma sequência de terminação de transcrição.

Com mais preferência, a presente invenção fornece uma construção de expressão que compreende:

(a) um ácido nucleico flavodoxina que codifica um polipeptídeo flavodoxina como definido acima;

(b) uma sequência de ácido nucleico de trânsito que codifica um peptídeo de trânsito;

(c) uma sequência promotora, ligada de modo operacional ao ácido nucleico de (a) e (b), em que a sequência promotora compreende o promotor GOS2, de preferência, o promotor GOS2 de arroz, ou um fragmento funcional ou variante ou homólogo, ortólogo ou parálogo desse; e opcionalmente (d) uma sequência de terminação de transcrição.

De preferência, o ácido nucleico flavodoxina da construção de expressão compreende qualquer um dos ácidos nucleicos flavodoxina descritos aqui, de preferência, como apresentado na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, ou um fragmento funcional ou variante ou homólogo, ortólogo ou

parálogo desse. De preferência, o ácido nucleico de trânsito é selecionado a partir das sequências de ácido nucleico que codificam qualquer um dos peptídeos de trânsito descritos aqui, de preferência, como apresentado na

Tabela 3, ou um fragmento funcional ou variante ou homólogo, ortólogo ou parálogo desse.

De preferência, a sequência promotora compreende uma sequência promotora como descrito aqui, de preferência, o promotor GOS2, de 25 preferência, o promotor GOS2 de arroz, ou um fragmento funcional ou variante ou homólogo, ortólogo ou parálogo desse.

Em uma realização preferida, qualquer referência a um promotor GOS2 ao longo desse pedido será entendida para se referir a um promotor que em seu contexto genético natural controla a expressão de um ácido nucleico que codifica um gene GOS2. De preferência, o dito promotor é de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea, com mais preferência, de uma Poaceae, com ainda mais preferência, de arroz e, com máxima preferência, o promotor 5 com uma sequência como descrito na SEQ ID NO: 7, ou o promotor é uma versão sinteticamente modificada desse, de preferência, os promotores mostrados em SEQ ID NO: 22 e 23 ou derivados desses.

De preferência, o ácido nucleico flavodoxina da construção de

expressão compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em:

(i) um ácido nucleico que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de 15 sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1, ou 15, em que o ácido nucleico possui, de preferência, a mesma atividade biológica que a SEQ ID NO: 2 ou 16, de preferência, em que o ácido nucleico

codifica um polipeptídeo flavodoxina que confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle;

(ii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i);

(iii) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, 25 pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2 ou 16, de preferência, o polipeptídeo flavodoxina confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle; e (iv) uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) sob condições de hibridização severas, em que o ácido nucleico possui, de preferência, substancialmente a mesma 5 atividade biológica que a SEQ ID NO: 2 ou 16 ou uma sequência complementar dessa, de preferência, em que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo fíavodoxina que confere um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle.

Com mais preferência, o ácido nucleico fíavodoxina da construção de expressão compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, um complemento dessa, um ácido fíavodoxina com SEQ ID NO: 2 ou se hibridiza com qualquer uma nucleico que codifica um polipeptídeo

16, ou uma molécula de ácido nucleico que dessas moléculas de ácido nucleico sob condições de hibridização severas.

Ainda outra realização se refere a construções genéticas úteis nos métodos, construções de vetor, plantas, partes colhíveis e produtos da invenção em que a construção genética compreende o ácido nucleico fíavodoxina da invenção funcionalmente ligado a um promotor como descrito aqui acima e ainda funcionalmente ligado a um ou mais entre

1) ácidos nucleicos acentuadores de expressão de ácido nucleico (NEENAs):

a) como descrito no pedido de patente internacional publicado como WO2011/023537 na tabela 1 na página 27 à página 28 e/ou SEQ ID NO:

a 19 e/ou como definido nos itens i) a vi) da reivindicação 1 do dito pedido internacional tais NEENAs estão incorporados aqui a título de referência; e/ou

b) como descrito no pedido de patente internacional publicado como WO2011/023539 na tabela 1 na página 27 e/ou SEQ ID NO: 1 a 19 e/ou como definido nos itens i) a vi) da reivindicação 1 do dito pedido internacional tais NEENAs estão incorporados aqui a título de referência; e/ou

c) como contido ou descrito:

i) no pedido de prioridade europeu depositado em 05 de julho de 2011 como EP 11172672.5 na tabela 1 na página 27 e/ou SEQ ID NO: 1 a

14937, de preferência, SEQ ID NO: 1 a 5, 14936 ou 14937, e/ou como definido nos itens i) a v) da reivindicação 1 do dito pedido de prioridade europeu tais NEENAs estão incorporados aqui a título de referência; e/ou

ii) o pedido de prioridade europeu depositado em 06 de julho de

2011 como EP 11172825.9 na tabela 1 na página 27 e/ou SEQ ID NO: 1 a

65560, de preferência, SEQ ID NO: 1 a 3, e/ou como definido nos itens i) a v) da reivindicação 1 do dito pedido de prioridade europeu, esses NEENAs estão incorporados aqui a título de referência; e/ou

d) equivalentes que possuem substancialmente o mesmo efeito acentuador; e/ou

2) funcionalmente ligados a uma ou mais moléculas de Ácido

Nucleico Acentuador de Confiabilidade (RENA)

a) como contido ou descrito no pedido de prioridade europeu depositado em depositado em 15 de setembro de 2011 como EP 11181420.8 na tabela 1 na página 26 e/ou SEQ ID NO: 1 a 16 ou 94 a 116666, de preferência, SEQ ID NO: 1 a 16, e/ou como definido no ponto i) a v) do item a) da reivindicação 1 do dito pedido de prioridade europeu, essa(s) molécula(s) de

RENA estão incorporadas aqui a título de referência; ou

b) equivalentes que possuem substancialmente o mesmo efeito acentuador.

Uma realização preferida da invenção se refere a uma construção genética útil nos métodos, construções de vetor, plantas, partes colhiveis e produtos da invenção e compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina da invenção sob o controle de um promotor como descrito aqui acima, em que NEENA, RENA e/ou o promotor é heterólogo à molécula de ácido nucleico flavodoxina da invenção.

As construções genéticas - como construções de expressão descritas aqui e as construções de vetor descritas aqui são úteis nos métodos, 5 plantas, partes colhíveis e produtos da invenção.

De preferência, essas conferem um aumento de um ou mais traços relacionados ao rendimento quando estavelmente introduzidas em uma planta como descrito aqui. De preferência, as plantas que sustentam a construção da invenção mostram um aumento em um ou mais traços 10 relacionados ao rendimento desenvolvidas sob condições sem estresse, condições de seca ou condições de deficiência de nitrogênio, com mais preferência, sob condições sem estresse.

O promotor em uma construção genética descrito aqui pode ser um promotor nativo ou não nativo para o ácido nucleico descrito aqui, ou seja, 15 um promotor que não regula a expressão do dito ácido nucleico em seu ambiente genético natural.

Vantajosamente, qualquer tipo de promotor, seja natural ou

sintético, pode ser usado para conduzir a expressão da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13, 14, 15 ou 17, porém, de preferência, o promotor é de origem vegetal. De preferência, o promotor é um promotor constitutivo ou ubíquo, promotor regulado de maneira desenvolvida, promotor induzível, promotor órgão-específico ou tecido-específico, de preferência, um promotor raiz-específico, promotor semente específico, promotores endospermaespecíficos, promotor embrião específico, promotores embrião específicos, promotores aleurona-específicos, promotor tecido verde-especifico, promotor caule-específico, folha-específico ou meristema-específico.

Vantajosamente, o promotor GOS2 como definido aqui resulta em um aumento maior de um ou mais traços relacionados ao rendimento desejados como qualquer outro promoter, seja natural ou sintético, como promotor constitutivo ou ubíquo, promotor regulado de maneira desenvolvida, promotor induzível, promotor órgão-específico ou tecido-específico, por exemplo, um promotor raiz-específico, promotor semente específico, promotores endosperma-específicos, promotor embrião específico, promotores embrião específicos, promotores aleurona-específicos, promotor tecido verdeespecífico, promotor caule-específico, folha-específico ou meristemaespecífico.

Em uma realização, o promotor GOS2 em uma construção genética descrita aqui é um promotor constitutivo com substancialmente o mesmo padrão de expressão temporal e/ou espacial e/ou substancialmente a mesma resistência de expressão que o promotor mostrado na SEQ ID NO: 7, e, de preferência, é de origem vegetal ou sintética.

De preferência, um promotor GOS2 é usado, em que um promotor

GOS2 é um promotor constitutivo de resistência de expressão média relacionado ao promotor GOS2 de arroz mostrado na SEQ ID NO: 7. Com mais preferência, a sequência promotora ligada de modo operacional ao ácido

nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e uma flavodoxina como definido aqui compreende o promotor GOS2, de preferência, o promotor GOS2 de arroz ou versões sinteticamente modificadas desse, como aquelas mostradas na

SEQ ID NO: 22 & 23 descrita no pedido de patente internacional

PCT/IB2011/055412, publicado como WQ2012077020, como SEQ ID NO: 14 e e as sequências relacionadas como descrito na página 6 & 7 do dito pedido, esses estão aqui incorporados, ou um fragmento funcional ou variante ou 25 homólogo, ortólogo ou parálogo do promotor GOS2 de arroz. Com mais preferência, a sequência promotora consiste no promotor GOS2, de preferência, no promotor GOS2 de arroz (publicado em de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992 e o pedido internacional WO 2004/065596), ou um fragmento funcional ou variante ou homólogo, ortólogo ou parálogo desse, e com ainda mais preferência, o promotor possui a sequência de SEQ ID NO: 7, 22 ou 23. Em uma realização preferida, os fragmentos funcionais ou variantes de promotor possuem em ordem crescente de preferência, pelo menos 50%, pelo menos 51%, pelo menos 52%, pelo menos 53%, pelo menos 54%, pelo menos 55%, pelo menos 56%, pelo menos 57%, pelo menos 58%, pelo menos 59%, pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%,

pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos

72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos

98%, pelo menos 99% ou ainda 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de

preferência, SEQ ID NO: 7.

De preferência, a porção da sequência promotora é uma porção funcional da SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7. De preferência, a porção possui pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de

500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de

800, pelo menos cerca de 900, pelo menos cerca de 1000, pelo menos cerca de 1100 ou mais nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de 25 preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico, de comprimento, das sequências de ácido nucleico fornecidas em SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência SEQ ID NO: 7.

De preferência, a porção da sequência promotora possui cerca de

400-425, cerca de 425-450, cerca de 450-475, cerca de 475-500, cerca de 500525, cerca de 525-550, cerca de 550-575, cerca de 575-600, cerca de 625-650, cerca de 650-675, cerca de 675-700, cerca de 700-725, cerca de 725-750, cerca de 750-775, cerca de 775-800, cerca de 800-825, cerca de 825-850, cerca de 850-875, cerca de 875-900, cerca de 925-950, cerca de 950-975, cerca de 975-1000, cerca de 1000-1025, cerca de 1025-1100, cerca de 11001125, cerca de 1125-1150, cerca de 1150-1175, cerca de 1170-1179

nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5' ou 3’ do ácido nucleico, de comprimento, das sequências de ácido nucleico fornecidas na SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7.

A sequência promotora preferida compreende ou consiste em

SEQ ID NO: 7.

O peptídeo de trânsito codificado pelo ácido nucleico de trânsito possui, de preferência, cerca de 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,

47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, ou mais aminoácidos de comprimento. De

preferência, o peptídeo de trânsito conduz o transporte de uma proteína para outras organelas dentro da célula. De preferência, o peptídeo de trânsito marca o polipeptídeo flavodoxina no núcleo, mitocôndria, matriz mitocondrial, retículo endoplasmático, cloroplastos, apicoplastos, cromoplasto, cianela, tilacoide, amiloplasto, peroxissoma, glioxissoma, e/ou hidrogenossoma. Com mais preferência, o peptídeo de trânsito marca o polipeptídeo flavodoxina em um plastideo, de preferência, em um cloroplasto. De preferência, o peptídeo de 25 trânsito é clivado a partir do polipeptídeo, de preferência, por uma peptidase de sinal, após o polipeptídeo ser transportado. Em outra realização, o peptídeo de trânsito não é clivado a partir do polipeptídeo após o polipeptídeo ser transportado.

Um peptídeo de trânsito de cloroplasto adequado para uso de acordo com algumas realizações da presente invenção pode ser qualquer sequência de peptídeo que dirige um polipeptídeo até o cloroplasto de uma célula vegetal. Os peptídeos adequados podem ser facilmente identificados por 5 um elemento versado na técnica e alguns exemplos são mostrados na Tabela

3. Outros exemplos são conhecidos na técnica.

Em algumas realizações preferidas, um peptídeo de trânsito pode

compreender ou consistir no peptídeo de trânsito de cloroplasto da ferredoxinaNADP+ reductase contendo FAD (FNR), com mais preferência, de FNR de ervilha ou Cyanophora paradoxa, esse peptídeo de trânsito possui com ainda mais preferência a sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou 10, respectivamente. Essa sequência de codificação é, de preferência, conforme mostrado na SEQ ID NO: 3, ou 8 ou 9, respectivamente.

Um ácido nucleico que codifica qualquer polipeptídeo flavodoxina como definido acima pode ser usado de acordo com a presente invenção com qualquer peptídeo de trânsito de cloroplasto adequado como definido acima. De preferência, o polipeptídeo flavodoxina não é fundido com um peptídeo de

trânsito ao qual esse está naturalmente associado, ou seja, esse é fundido com um peptídeo de trânsito heterogêneo. Os polipeptídeos flavodoxina, que não são encontrados em plantas, não estão naturalmente associados aos peptídeos de trânsito de cloroplasto.

Uma sequência de ácido nucleico de trânsito preferida que codifica um peptídeo de trânsito é fornecida na SEQ ID NO: 3, 8 ou 9. De preferência, a sequência de ácido nucleico de trânsito compreende ou consiste em uma sequência de ácido nucleico de trânsito como fornecido na SEQ ID NO: 3, 8 ou 9, ou fragmentos funcionais ou variantes dessa. Os fragmentos funcionais ou variantes de sequência de ácido nucleico de trânsito preferidos possuem em ordem crescente de preferência, pelo menos 50%, 51%, 52%,

53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%,

66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,

79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,

92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 3, ou 9 ou qualquer sequência de ácido nucleico que codifica os peptídeos de trânsito mostrados na Tabela 3.

Em uma realização, o peptídeo de trânsito se difere de qualquer peptídeo de trânsito naturalmente ligado à(s) proteína(s) flavodoxina da tabela

2 e/ou da listagem de sequência.

De preferência, a porção da sequência de ácido nucleico de trânsito possui pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 45, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 90, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 135, pelo menos 15 cerca de 150 ou mais nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5' do ácido nucleico, de comprimento de qualquer sequência de ácido nucleico fornecida na SEQ ID

De preferência, a porção da sequência de ácido nucleico de trânsito possui 15 a 45, cerca de 24 a 60, cerca de 60-75, cerca de 75-102, cerca de 102-126, cerca de 126-150 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5' do ácido nucleico, de comprimento de qualquer sequência de ácido nucleico fornecida na SEQ ID NO: 3, 8 ou 9.

Um peptídeo de trânsito preferido é fornecido na SEQ ID NO: 4 ou

10. De preferência, o peptídeo de trânsito compreende ou consiste em um peptídeo de trânsito como fornecido na SEQ ID NO: 4 ou 10, ou fragmentos funcionais ou variantes dessa. Os fragmentos funcionais ou variantes de peptídeo de trânsito preferidos possuem em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%,

61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%,

74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,

87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NOs: 4, ou qualquer peptídeo de trânsito mostrado na Tabela 3.

De preferência, o peptídeo de trânsito compreende pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 35, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 45 ou pelo menos cerca de 50 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir da terminação N da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada na SEQ

ID

NO: 4 ou

10.

De preferência, o peptídeo de trânsito compreende pelo menos cerca cerca cerca cerca de de

5, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo

20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo de 35, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 45, ou pelo de 50 aminoácidos, de menos menos menos preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir preferência, da terminação N da terminação N ou terminação C, de da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada na Tabela 3.

De preferência, o peptídeo de trânsito compreende cerca de 5 a

20, cerca de 20-25, cerca de 25-30, cerca de 30-35, cerca de 35-40, cerca de

40-45, cerca de 45-50 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir da terminação N da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 10.

De preferência, o peptídeo de trânsito compreende cerca de 5 a 20, cerca de 20-25, cerca de 25-30, cerca de 30-35, cerca de 35-40, cerca de

40-45, cerca de 45-50 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir da terminação N ou terminação C, de preferência, da terminação N da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada na Tabela 3

Os peptídeos de trânsito de cloroplasto preferidos adicionais são mencionados na Tabela 3.

De preferência, a construção de expressão compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em:

(i) um ácido nucleico que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%,

59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%,

72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,

85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo dessa;

(ii) um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido em ordem crescente de preferência com pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%,

54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%,

67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%,

80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,

93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 6, 11 ou 18, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo dessa; e/ou (iii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) ou (ii); e opcionalmente uma sequência promotora como descrito aqui.

De preferência, a porção funcional do ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina e um peptídeo de trânsito possui pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, ou more

nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5’ ou 3’, de preferência, a partir da extremidade 5' do ácido nucleico, de comprimento de qualquer sequência de ácido nucleico fornecida na SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17.

De preferência, a porção funcional do ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina e um peptídeo de trânsito possui cerca de 400425, cerca de 425-450, cerca de 450-475, cerca de 475-500, cerca de 500-525, cerca de 525-550, cerca de 550-575, cerca de 575-600, cerca de 625-650, cerca de 650-675 nucleotídeos, de preferência, nucleotídeos consecutivos, de preferência, contados a partir da extremidade 5' ou 3’, de preferência, a partir

da extremidade 5’ do ácido nucleico, de comprimento, das sequências de ácido nucleico fornecidas na SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17.

Com mais preferência, a construção de expressão compreende uma sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17.

Prefere-se ainda uma construção de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo flavodoxina e uma sequência de trânsito que compreende uma 25 sequência de aminoácido em ordem crescente de preferência com pelo menos

50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%,

63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,

76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,

89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 6, 11 ou 18, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou parálogo dessa.

De preferência, o polipeptídeo que compreende um polipeptídeo fíavodoxina e uma sequência de trânsito compreende pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de

170, pelo menos cerca de 180, pelo menos cerca de 190, pelo menos cerca de

200, pelo menos cerca de 210, pelo menos cerca de 220 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir da terminação N ou terminação C, de preferência, a partir da terminação N da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 6, 11 ou 18.

De preferência, o polipeptídeo fíavodoxina compreende cerca de

100-110, cerca de 110-120, cerca de 120-130, cerca de 130-140, cerca de 140150, cerca de 150-160, cerca de 160-170, cerca de 170-180, cerca de 180-190, cerca de 190-200, cerca de 200-210, cerca de 210-220 aminoácidos, de preferência, aminoácidos consecutivos, de preferência, contados a partir da terminação N ou terminação C, de preferência, a partir da terminação N da sequência de aminoácido, ou até o comprimento total da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 6, 11 ou 18.

Assim, uma realização adicional é um polipeptídeo fíavodoxina codificado por uma construção de expressão que compreende:

(a) um ácido nucleico fíavodoxina que codifica um polipeptídeo fíavodoxina como descrito aqui; e (b) uma sequência de ácido nucleico de trânsito que codifica um peptídeo de trânsito como descrito aqui; em que a construção de expressão compreende uma sequência promotora em ligação funcional à sequência de ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico flavodoxina e a sequência de ácido nucleico de trânsito e em que a sequência promotora compreende o promotor GOS2, de preferência, o promotor GOS2 de arroz, ou um fragmento funcional ou variante ou homólogo, ortólogo ou parálogo desse.

De preferência, o polipeptídeo compreende um polipeptídeo flavodoxina e uma sequência de trânsito compreende um peptídeo de trânsito de ferredoxina-NADP+ reductase (FNR) contendo FAD de ervilha e uma proteína flavodoxina de Anabaena sp. (PCC7119).

De preferência, o polipeptídeo de fusão compreende um polipeptídeo flavodoxina e uma sequência de trânsito compreende uma sequência de aminoácido em ordem crescente de preferência com pelo menos

50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%,

63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%,

76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%,

89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,

56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%,

69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,

82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,

95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por

SEQ ID NO: 6, 11 ou 18, ou um fragmento funcional, derivado, ortólogo ou

parálogo desse.

Com mais preferência, o polipeptídeo que compreende um polipeptídeo flavodoxina e uma sequência de trânsito compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 6, 11 ou

18.

Em algumas realizações preferidas, um polipeptídeo de fusão compreende um polipeptídeo flavodoxina e um peptídeo de marcação de 25 cloroplasto compreendem ou consistem, de preferência, na sequência mostrada na SEQ ID NO: 6, 11 ou 18. Uma molécula de ácido nucleico adequada que codifica esse polipeptídeo de fusão compreende ou consiste, de preferência, na sequência mostrada na SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17.

100

De preferência, a construção de expressão compreende um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito de ferredoxina-NADP+ reductase (FNR) contendo FAD de ervilha e uma proteína flavodoxina de Anabaena sp. (PCC7119) e um promotor GOS2, de preferência, o promotor GOS2 de arroz, de preferência, a sequência promotora compreende ou consiste nas sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7.

De preferência, a construção de expressão compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em:

(i) um ácido nucleico que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%,

59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%,

72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,

85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17, ou um fragmento, derivado, ortólogo, ou parálogo dessa;

(ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo flavodoxina e uma sequência de trânsito que compreende uma sequência de aminoácido em ordem crescente de preferência com pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,

58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%,

71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%,

84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,

97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 6, 11 ou 18, ou um fragmento, derivado, ortólogo, ou parálogo dessa; e (iii) a sequência complementar de qualquer um dos ácidos

101 nucleicos de (i) ou (ii);

e ligada de modo operacional a essa uma sequência promotora que compreende em ordem crescente de preferência pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 5 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos

93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou ainda 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7.

De preferência, a construção de expressão compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão que compreende um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina como mostrado na SEQ ID NO: 5, 12, 14 15 ou 17 e ligado de modo operacional a esse uma sequência promotora como mostrado na SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7.

Opcionalmente, uma ou mais sequências de terminação de

transcrição podem ser usadas na construção introduzida em uma planta. Os elementos versados na técnica estão cientes de sequências terminadoras que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. De preferência, a construção compreende um cassete de expressão que compreende uma sequência promotora ligada de modo operacional ao ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina e uma sequência de terminação de transcrição. De preferência, a sequência de 25 terminação de transcrição é um terminador zeína (t-zeína) ligado à extremidade

3’ da sequência de codificação de flavodoxina. Com mais preferência, o cassete de expressão compreende uma sequência que possui em ordem crescente de preferência pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%,

102 pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com a sequência do terminador zeína (t-zeína).

A construção genética, construção de vetor, ou construção de expressão descrita aqui pode compreender ainda uma ou mais sequências que 5 codificam um marcador selecionável.

Os marcadores selecionáveis preferidos podem ser selecionados a partir de marcadores que conferem resistência a antibiótico ou herbicida,

esses introduzem um novo traço metabólico ou permitem a seleção visual. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem genes que conferem resistência a antibióticos (como nptll que fosforila neomicina e canamicina, ou hpt, fosforila higromicina, ou genes que conferem resistência à, por exemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina ou blasticidina), a herbicidas (por exemplo, bar que proporciona resistência a Basta®; aroA ou gox que proporciona 15 resistência contra glifosato, ou os genes que conferem resistência, por exemplo, à imidazolinona, fosfinotricina ou sulfonilureia), ou genes que fornecem um traço metabólico (como manA que permite que as plantas usem

manose como a única fonte de carbono ou xilose isomerase para a utilização de xilose, ou marcadores antinutritivos como a resistência a 2-deoxiglicose). A expressão de genes marcadores visuais resulta na formação de cor (por exemplo, β-glucuronidase, GUS ou β-galactosidase com seus substratos coloridos, por exemplo, X-Gal), luminescência (como o sistema luciferina/luceferase) ou fluorescência (Proteína Verde Fluorescente, GFP, e derivados dessa). Essa lista representa apenas um pequeno número de 25 possíveis marcadores. O elemento versado na técnica está acostumado com esses marcadores. Marcadores diferentes são preferidos, dependendo do organismo e do método de seleção.

Sabe-se que em tentativas para integrar de forma estável ou

103 temporária os ácidos nucleicos em células vegetais, apenas uma minoria das células adota o DNA estranho e, se desejado, integra o mesmo em seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada. Para identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifica 5 um marcador selecionável (como aqueles descritos aqui) é geralmente introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Esses marcadores podem ser, por exemplo, usados em mutantes em que esses genes não são funcionais, por exemplo, por deleção por métodos convencionais. Ademais, as moléculas de ácido nucleico que codificam um 10 marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor que compreende a sequência que codifica os polipeptídeos da invenção ou usadas nos métodos da invenção, ou ainda em um vetor separado. As células que foram estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas, por exemplo, por seleção (por 15 exemplo, as células que integraram o marcador selecionável sobreviveram enquanto as outras células morreram).

Uma realização adicional da presente invenção é uma construção

de vetor que compreende um ácido nucleico flavodoxina, uma construção de expressão ou cassete de expressão que contém o ácido nucleico flavodoxina como descrito aqui.

Uma realização preferida é uma construção de vetor recombinante que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de trânsito como descrito aqui (de preferência, selecionada a partir da Tabela 3) e um polipeptídeo flavodoxina como descrito aqui (a 25 sequência de codificação de preferência selecionada a partir da Tabela 2 e/ou da listagem de sequência) e, ligada de modo operacional a essa, uma sequência promotora como descrito aqui (de preferência, como mostrado na SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7), em que a sequência

104 promotora compreende o promotor GOS2, de preferência, o promotor GOS2 de arroz, ou um fragmento funcional ou variante ou homólogo, ortólogo ou parálogo desse.

Uma realização preferida adicional é uma construção de vetor recombinante que compreende:

(a) (i) um ácido nucleico flavodoxina que possui pelo menos 60% de identidade, de preferência, pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95 %, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou ainda 100% de identidade de 10 sequência com a SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa;

(ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína flavodoxina que possui pelo menos 60% de identidade, de preferência, pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80 %, pelo menos 90%, pelo menos 95 15 %, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou ainda

100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou 16, um fragmento funcional dessa, um ortólogo ou um parálogo dessa; e/ou

(iii) um ácido nucleico capaz de se hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar desses;

ligada de modo operacional com (b) uma sequência promotora, em que a sequência promotora compreende, de preferência, o promotor GOS2, de preferência, o promotor GOS2 de arroz, ou um fragmento funcional ou variante ou homólogo, ortólogo ou parálogo desse; e, de preferência, (c) uma sequência de terminação de transcrição.

Ademais, uma construção de vetor recombinante é fornecida compreendendo:

105 (a) (i) um ácido nucleico flavodoxina que possui pelo menos 95 %, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou ainda 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 13 ou 15;

(ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que possui pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou ainda 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou 16; e/ou (iii) um ácido nucleico capaz de se hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar desses;

ligada de modo operacional com (b) uma sequência promotora ligada de modo operacional ao ácido nucleico de (a); de preferência, como mostrado na SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7, ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; e, de preferência (c) uma sequência de terminação de transcrição é uma realização adicional da invenção.

Uma realização preferida adicional é uma construção de vetor

recombinante que compreende:

(a) (i) um ácido nucleico flavodoxina que possui pelo menos 60% de identidade, de preferência, pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou ainda 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa;

(ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína flavodoxina que possui pelo menos 60% de identidade, de preferência, pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95 %, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou ainda 100%

106 de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou 16, um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; e/ou (iii) um ácido nucleico capaz de se hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou 5 uma sequência complementar desses;

ligada de modo operacional com (b) uma sequência de ácido nucleico de trânsito que codifica um peptídeo de trânsito; de preferência, como mostrado na SEQ ID NO: 3, 8 ou 9;

(c) uma sequência promotora ligada de modo operacional aos ácidos nucleicos de (a) e (b); de preferência, como mostrado na SEQ ID NO: 7, ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7, ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; e, de preferência (d) uma sequência de terminação de transcrição.

Ademais, uma construção de vetor recombinante é fornecida compreendendo:

(a) (i) um ácido nucleico flavodoxina que possui pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou ainda 100%

de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 13 ou 15;

(ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que possui pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência, ou ainda 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou 16; e/ou (iii) um ácido nucleico capaz de se hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii);

ligada de modo operacional com (b) uma sequência de ácido nucleico de trânsito que codifica um peptídeo de trânsito; de preferência, como mostrado na SEQ ID NO: 3, 8 ou 9, em que o peptídeo de trânsito e a proteína codificada pelo ácido nucleico flavodoxina estão em ligação funcional;

107 (c) uma sequência promotora ligada de modo operacional aos ácidos nucleicos de (a) e (b); de preferência, como mostrado na SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7;

e, de preferência (d) uma sequência de terminação de transcrição, onde a sequência de terminação de transcrição está em ligação funcional com o ácido nucleico flavodoxina.

Uma realização preferida da presente invenção é uma construção

de vetor que compreende SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17. De preferência, o vetor de expressão compreende SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17 e a sequência promotora como representado por SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência,

SEQ ID NO: 7 ligada de modo operacional à SEQ ID NO: 5, 12, 14 ou 17.

As construções de vetor da invenção podem incluir ainda uma origem de sequência de replicação que é exigida para a manutenção e/ou replicação em um tipo de célula específico. Um exemplo é quando for exigido que uma construção genética seja mantida em uma célula bacteriana como um elemento genético epissômico (por exemplo, molécula de plasmídeo ou

cosmídeo). As origens preferidas de replicação incluem, porém sem caráter limitativo, f1-ori e colE1.

Para a detecção da transferência bem sucedida das sequências de ácido nucleico como usado nos métodos da invenção e/ou seleção de plantas transgênicas que compreendem esses ácidos nucleicos, é vantajoso usar genes marcadores (ou genes repórter). Portanto, a construção de vetor pode compreender opcionalmente um gene marcador selecionável. Exemplos de gene marcador selecionável são descritos aqui. Os genes marcadores podem ser removidos ou excisados da célula transgênica uma vez que não são mais necessários. Técnicas para a remoção de marcador são conhecidas, técnicas úteis são descritas aqui.

108

De acordo com outra realização, a presente invenção fornece um método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um 5 polipeptídeo flavodoxina como definido aqui e selecionar opcionalmente plantas que possuem um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em que o dito ácido nucleico é ligado de modo operacional a um promotor particular como descrito aqui e o polipeptídeo flavodoxina é expresso especificamente pelo uso de um promotor particular.

Uma realização adicional da presente invenção é um método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas em relação a plantas de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo flavodoxina e selecionar opcionalmente plantas que possuem um ou mais traços 15 relacionados ao rendimento aumentado em que o dito ácido nucleico é ligado de modo operacional a um promotor particular como descrito aqui e o polipeptídeo flavodoxina é expresso especificamente pelo uso de um promotor

particular e marcado com o(s) plastideo(s). De preferência, a expressão do ácido nucleico exógeno está sob o controle de uma sequência promotora endógena ou exógena.

De preferência, o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado compreendem rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e compreendem, de preferência, rendimento de biomassa aumentado e/ou de semente aumentado em relação a plantas de controle, e 25 compreendem, de preferência, biomassa aérea aumentada, biomassa subterrânea aumentada, rendimento de semente aumentado e/ou rendimento de açúcar aumentado (como açúcar colhível por planta, por peso fresco, por peso seco ou por área) em relação a plantas de controle.

109

Em uma realização preferida, o rendimento de semente é aumentado.

Em outra realização preferida, a biomassa aérea é aumentada.

O desempenho dos métodos da invenção resulta em plantas com um traço relacionado ao rendimento aumentado em relação ao traço relacionado ao rendimento de plantas de controle.

Os métodos inventivos para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas como descrito aqui compreendem introduzir, de preferência, por métodos recombinantes, e expressar em uma 10 planta o(s) ácido(s) nucleico(s) e/ou construções como definido aqui, e, de preferência, a etapa adicional de desenvolver as plantas e opcionalmente a etapa de colher as plantas ou parte(s) dessas.

Em uma realização, o traço relacionado ao rendimento aumentado é o rendimento de semente aumentado, de preferência, índice de colheita aumentado, preenchimento de semente aumentado, número de semente total aumentado, peso total aumentado da semente e quantidade e qualidade de tempo de florescimento aprimoradas. Com mais preferência, o

traço relacionado ao rendimento aumentado é o índice de colheita aumentado, preenchimento de semente aumentado e/ou peso total aumentado da semente.

Em outra realização, o traço relacionado ao rendimento aumentado é a biomassa aumentada, em particular biomassa aérea, de preferência, biomassa de caule, em relação à biomassa aérea, e em particular biomassa de caule, de plantas de controle e/ou biomassa de raiz aumentada em relação à biomassa de raiz de plantas de controle e/ou biomassa de 25 beterraba aumentada em relação à biomassa de beterraba de plantas de controle. Ademais, é particularmente contemplado que o teor de açúcar (em particular o teor de sacarose) nas partes aéreas, particularmente caule (em particular de plantas de cana-de-açúcar) e/ou nas partes subterrâneas, em

110 particular em raízes inclusive raizes principais e tubérculos e/ou em beterrabas (em particular em beterrabas sacarinas) é aumentado em relação ao teor de açúcar (em particular o teor de sacarose) em parte(s) correspondente(s) da planta de controle.

A biomassa aérea preferida é a biomassa de caule. A biomassa de caule aumentada pode ser exibida em um aumento no comprimento de caule, largura de caule, densidade de caule, peso de caule, diâmetro de caule,

número de nós e/ou internódios, diâmetro ou quantidade ou densidade de vasculatura de caule ou feixes vascular, em particular floema e ou xilema.

Ademais, o teor de seiva do caule é, de preferência, aumentado. Ademais, o teor de sacarose, de preferência, o teor de sacarose do caule é, de preferência, aumentado.

Em particular, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de estresse ou não estresse. As condições de 15 estresse são, de preferência, condições de estresse abiótico, com mais preferência, seca, salinidade e/ou temperaturas frias ou quentes e/ou uso de nutriente devido a um ou mais entre deficiência de nutriente como deficiência

de nitrogênio, com mais preferência, seca e/ou deficiência de nitrogênio.

Em uma realização preferida, os métodos da invenção são realizados utilizando plantas necessitadas de tolerância a estresse abiótico aumentada, por exemplo, tolerância à seca, salinidade e/ou temperaturas quentes ou frias e/ou uso de nutrientes devido a um ou mais entre deficiência de nutriente como deficiência de nitrogênio.

Em um exemplo, os métodos da presente invenção podem ser 25 realizados sob condições de estresse, como seca ou seca moderada, para fornecer plantas com rendimento aumentado em relação a plantas de controle. De preferência, quando submetidas a estresse de seca, as plantas transgênicas possuem biomassa aumentada, de preferência, biomassa aérea,

111 e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle.

Em outro exemplo, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de estresse como deficiência de nutriente para fornecer plantas com rendimento aumentado em relação a plantas de controle.

A deficiência de nutriente pode resultar de uma falta de nutrientes como nitrogênio, fosfatos e outros compostos contendo fósforo, potássio, cálcio, magnésio, manganês, ferro e boro, entre outros. De preferência, quando submetidas à deficiência de nutriente, as plantas transgênicas possuem biomassa aumentada, de preferência, biomassa aérea, e/ou rendimento de 10 semente aumentado em relação a plantas de controle.

Ainda em outro exemplo, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de estresse como estresse salino para fornecer plantas com rendimento aumentado em relação a plantas de controle. O termo estresse salino não se limita ao sal comum (NaCI), porém pode ser 15 qualquer um ou mais entre: NaCI, KCI, LiCI, MgCI₂, CaCI₂, entre outros. De preferência, quando submetidas a estresse salino, as plantas transgênicas que possuem biomassa aumentada, de preferência, biomassa aérea, e/ou

rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle.

Ainda em outro exemplo, os métodos da presente invenção podem ser realizados sob condições de estresse como estresse devido ao frio ou estresse por congelamento para fornecer plantas com rendimento aumentado em relação a plantas de controle. De preferência, quando submetidas a estresse devido ao frio, as plantas transgênicas possuem biomassa aumentada, de preferência, biomassa aérea, e/ou rendimento de semente aumentado em relação a plantas de controle.

Em outra realização preferida, os métodos da presente invenção são realizados sob condições sem estresse.

Ainda em outra realização, proporciona-se um método para

112 acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas, que compreende introduzir e expressar em uma planta um ou mais entre qualquer um dos ácidos nucleicos exógenos fornecidos na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência, ou compreende introduzir e expressar em uma planta um fragmento funcional, um ortólogo, parálogo ou homólogo de qualquer uma das sequências de ácido nucleico fornecidas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência ou (i) um ácido nucleico exógeno que possui pelo menos 60% de

identidade com SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; ou (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui pelo menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; ou (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de se hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar desses; ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo com a atividade biológica de uma flavodoxina ou uma ferredoxina; ou

(v) um ácido nucleico exógeno que codifica o mesmo polipeptídeo que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, porém se difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneraçao do código genético; ou (vi) um ácido nucleico exógeno que combina as características dos ácidos nucleicos de qualquer um dos dois (i) a (iv) acima.

De preferência, o ácido nucleico exógeno também codifica qualquer um dos peptídeos de trânsito fornecidos na Tabela 3.

Um método preferido para aumentar a expressão de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo flavodoxina é introduzir e expressar em uma planta um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina, com ainda mais preferência, em que o dito ácido nucleico é ligado

113 de modo operacional a um promotor particular como descrito aqui e o polipeptídeo flavodoxina é marcado com os plastídeos.

De acordo com uma realização, proporciona-se um método para acentuar os traços relacionados ao rendimento como fornecido aqui em plantas em relação a plantas de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo flavodoxina como definido aqui, em que o dito ácido nucleico é ligado de modo

operacional a um promotor particular como descrito aqui e o polipeptídeo flavodoxina é marcado com os plastídeos.

Em outra realização, proporciona-se um método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas, que compreende introduzir e expressar em uma planta um fragmento funcional, ortólogo, parálogo, ou variante de junção de qualquer um dos ácidos nucleicos fornecidos na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência.

Ainda em outra realização, proporciona-se um método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas, que compreende introduzir e expressar em uma planta uma variante alélica de um ou mais entre qualquer um dos ácidos nucleicos fornecidos na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência.

Então, uma realização preferida é um método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta em relação a plantas de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina, em que a expressão está sob o controle de uma 25 sequência promotora ligada de modo operacional ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina. De preferência, a sequência promotora compreende a sequência de nucleotídeo do promotor GOS2, de preferência, promotor GOS2 de arroz, ou fragmentos funcionais ou

114 derivados desses. O promotor GOS2 compreende, de preferência, a sequência de SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7.

Em uma realização preferida, o peptídeo de trânsito marca o polipeptídeo flavodoxina em um plastídeo, de preferência, em um cloroplasto.

De preferência, o peptídeo de trânsito de cloroplasto é selecionado a partir do peptídeo de trânsitos mencionado na Tabela 3.

De preferência, o polipeptídeo flavodoxina é codificado por uma

sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo de sequências de ácido nucleico mencionadas na Tabela 2 e/ou na listagem de sequência. Com mais preferência, o polipeptídeo flavodoxina pertence à Anabaena sp., de preferência, Anabaena PCC7119, ou Synechocystis sp., de preferência,

Synechocystis sp. PCC 6803. Com mais preferência, o peptídeo de trânsito é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno que possui pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa;

(ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que

possui pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; e/ou por (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de se hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar desses.

Com mais preferência, o polipeptídeo flavodoxina é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno que possui pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa;

(ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um

115 fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; e/ou por (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de se hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar desses.

Um método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta em relação a plantas de controle compreende, de preferência (a) transformar de forma estável uma célula vegetal com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico exógeno que 10 codifica um peptídeo de trânsito e codifica um polipeptídeo flavodoxina, em que o polipeptídeo flavodoxina é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno que possui pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa;

(ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; e/ou (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de se hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar desses;

em ligação funcional com uma sequência promotora;

(b) regenerar a planta a partir da célula vegetal; e (c) expressar o dito ácido nucleico exógeno.

De preferência, o peptídeo de trânsito é selecionado a partir dos peptídeos de trânsito mostrados na Tabela 3, com mais preferência, esse é codificado pelos ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 3, 8 ou 9 ou possui a sequência como descrito na SEQ ID NO: 4 ou 10. De preferência, a sequência promotora compreende uma sequência de ácido nucleico como representado

116 por SEQ ID NO: 7, 22 ou 23, de preferência, SEQ ID NO: 7.

Como uma alternativa para o ácido nucleico da SEQ ID NO: 9, o ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 que codifica o peptídeo de trânsito da variante da SEQ ID NO: 10 pode ser usado.

De preferência, a planta usada no método da presente invenção é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. De preferência, a planta é uma Poaceae. Com mais preferência, a planta monocotiledônea do gênero saccharum, de preferência, selecionada a partir do grupo que consiste em

Saccharum arundinaceum, Saccharum bengalense, Saccharum edule,

Saccharum munja, Saccharum officinarum,

Saccharum procerum, Saccharum ravennae,

Saccharum robustum, Saccharum sinense, e Saccharum spontaneum.

O desempenho dos métodos da invenção fornece plantas que têm um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado. Em particular, o desempenho dos métodos da invenção fornece plantas que têm vigor precoce amentado e/ou rendimento aumentado, especialmente maior rendimento de biomassa e/ou semente relacionado a plantas de controle. Os termos vigor

precoce, rendimento¹¹, “biomassa¹¹ e “rendimento de semente são descritos em maiores detalhes na seção de definições no presente documento.

A presente invenção fornece um método para acentuar os traços relacionados ao rendimento, especialmente o rendimento de biomassa e/ou semente de plantas relacionadas a plantas de controle, cujo método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno como descrito aqui. De preferência, o ácido nucleico exógeno também 25 codifica um peptídeo de trânsito, de preferência, uma sequência de trânsito de cloroplasto. De preferência, o dito traço relacionado ao rendimento compreende um rendimento de biomassa aumentado e/ou de semente aumentado em relação a plantas de controle, e de preferência, compreende um rendimento de

117 biomassa aérea aumentado e/ou de semente aumentado em relação a plantas de controle.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o desempenho dos métodos da invenção fornece plantas que têm uma taxa de 5 crescimento aumentada relacionada a plantas de controle. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para aumentar a taxa de crescimento de plantas, tal método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina conforme definido no presente documento.

O desempenho dos métodos da invenção fornece maior rendimento a plantas cultivadas em condições de não estresse e/ou em condições de estresse relacionadas a plantas de controle cultivadas em condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em plantas cultivadas em condições de não estresse e/ou em condições de estresse, tal método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina. De

preferência, o método compreende a etapa de introduzir um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo flavodoxina, e, de preferência um peptídeo de trânsito, na dita planta, de preferência, sob o controle de uma sequência promotora endógena ou exógena como descrito aqui. De preferência, o dito traço relacionado ao rendimento aumentado é obtido sob condições de estresse devido à seca, estresse salino ou deficiência de nitrogênio.

O desempenho dos métodos da invenção fornece plantas cultivadas em condições de seca, traços relacionados ao rendimento aumentado relacionados a plantas de controle cultivadas em condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um

118 método para acentuar os traços relacionados ao rendimento em plantas cultivadas em condições de seca, tal método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo flavodoxina, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira 5 operacional a um promotor particular como descrito aqui e o polipeptídeo flavodoxina é marcado com os plastídeos.

O desempenho dos métodos da invenção gera plantas cultivadas

sob condições de deficiência de nutriente, particularmente sob condições de deficiência de nitrogênio, traços relacionados ao rendimento aumentado em relação às plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para acentuar os traços relacionados ao rendimento em plantas cultivadas sob condições de deficiência de nutriente, tal método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina, em 15 que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operacional a um promotor particular como descrito aqui e o polipeptídeo flavodoxina é marcado com os plastídeos.

O desempenho dos métodos da invenção gera plantas cultivadas sob condições de estresse salino, traços relacionados ao rendimento aumentado em relação às plantas de controle cultivadas sob condições comparáveis. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para acentuar os traços relacionados ao rendimento em plantas cultivadas sob condições de estresse salino, tal método compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um 25 polipeptídeo. flavodoxina, em que o dito ácido nucleico é ligado de maneira operacional a um promotor particular como descrito aqui e o polipeptídeo flavodoxina é marcado com os plastídeos.

Em uma realização da invenção, o rendimento de semente é

119 aumentado.

Em outra realização da invenção, a biomassa aérea é aumentada, de preferência, biomassa de caule, talo e/ou muda, com mais preferência, em Poaceae, com ainda mais preferência, em uma espécie Saccharum, com 5 máxima preferência, em cana-de-açúcar e opcionalmente biomassa subterrânea e/ou crescimento de raiz não é aumentado comparado com as plantas de controle.

Em uma realização adicional, o teor de açúcar colhível total, de preferência, glicose, frutose e/ou sacarose, é aumentado, de preferência, além 10 de outros traços relacionados ao rendimento aumentado como definido aqui, por exemplo, biomassa, e com mais preferência, também além de um aumento no teor de açúcar, de preferência, teor de glicose, frutose e/ou sacarose.

Os métodos para aumentar a expressão de ácidos nucleicos ou genes, ou produtos de gene, são bem documentados na técnica e os exemplos 15 são fornecidos aqui.

Conforme mencionado acima, um método preferencial para modular a expressão de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo

flavodoxina é por introdução e expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina; no entanto, os efeitos da realização do método, isto é, acentuação dos traços relacionados a rendimento podem ser também obtidos com uso de outras técnicas bem conhecidas, incluindo, mas não limitada a identificação de ativação de T-DNA, TILLING, recombinação homóloga. Uma descrição dessas técnicas é fornecida na seção de definições.

Visto que os genes marcadores, particularmente genes para resistência a antibióticos e herbicidas, não são mais exigidos ou são indesejados na célula hospedeira transgênica uma vez que os ácidos nucleicos foram introduzidos com êxito, o processo de acordo com a invenção para introduzir os ácidos nucleicos vantajosamente emprega técnicas que permitem

120 a remoção ou excisão desses genes marcadores. Esse método é o que se chama co-transformação. O método de co-transformação emprega dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor que contém o ácido nucleico de acordo com a invenção e um segundo que contém o(s) gene(s) 5 marcador(es). Uma grande proporção de transformantes recebe ou, no caso de plantas, compreende (até 40% ou mais dos transformantes), ambos os vetores.

No caso de transformação com Agrobacteria, os transformantes geralmente

recebem apenas uma parte do vetor, ou seja, a sequência flanqueada pelo Τ’DNA, que geralmente representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem ser subsequentemente removidos da planta transformada ao realizar cruzamentos. Em outro método, os genes marcadores integrados em um transposon são usados para a transformação juntamente com o ácido nucleico desejado (conhecida como a tecnologia Ac/Ds). Os transformantes podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com uma construção de ácido nucleico que confere a expressão de uma transposase, de forma temporária ou estável. Em alguns casos (aprox. 10%), o transposon salta para fora do genoma da célula hospedeira uma vez que a transformação ocorreu com êxito e foi perdido. Em um número adicional de casos, o transposon salta para um local diferente. Nesses casos, o gene marcador deve ser eliminado ao realizar cruzamentos. Em microbiologia, técnicas foram desenvolvidas para tornar possível, ou facilitar, a detecção desses eventos. Um método vantajoso adicional conta com sistemas de recombinaçâo; cuja vantagem é que a eliminação por cruzamento pode ser abolida. 0 sistema mais bem conhecido desse tipo é o que se chama de sistema Cre/lox. Cre1 é uma recombinase que remove as sequências localizadas entre as sequências loxP. Se o gene marcador for integrado entre as sequências loxP, esse é removido uma vez que a transformação ocorreu com êxito, por expressão da recombinase. Sistemas de recombinaçâo

121 adicionais são o sistema HIN/HIX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol.

Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Uma integração sítio-específica no genoma da planta das sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção é possível.

Naturalmente, esses métodos também podem ser aplicados a microrganismos como levedura, fungos ou bactérias.

Uma realização preferida da presente invenção é o uso de uma

construção de expressão de acordo com ou um vetor de expressão recombinante descrito aqui em um método para produzir uma planta transgênica com um traço relacionado ao rendimento aumentado, de preferência, rendimento de biomassa aumentado e/ou de semente aumentado, em relação a plantas de controle, e com mais preferência, rendimento de biomassa aérea aumentado e/ou de semente aumentado em relação a plantas de controle.

Assim, uma realização preferida é uma planta transgênica, parte de planta transgênica, ou célula vegetal transgênica obtenível por um método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta

em relação a plantas de controle ou por um método para a produção de plantas transgênicas, como descrito aqui, em que a dita planta transgênica, parte de planta transgênica, ou célula vegetal transgênica expressa um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina sob o controle de uma sequência promotora como descrito aqui.

De preferência, a planta transgênica, parte de planta transgênica, ou célula vegetal transgênica é transformada com uma construção de 25 expressão ou com um vetor de expressão recombinante descrito aqui.

Em uma realização preferida a planta, parte da planta, semente, muda ou propágulo da invenção possui um ou mais traço(s) relacionado(s) ao rendimento aumentado sob condições sem estresse e/ou sob condições de

122 seca e/ou deficiência de nitrogênio, com mais preferência, sob condições sem estresse.

Com mais preferência, a planta transgênica, parte da planta transgênica ou célula vegetal transgênica possui um traço relacionado ao 5 rendimento aumentado, de preferência, um rendimento de biomassa aumentado e/ou de semente aumentado em relação a plantas de controle.

A invenção também inclui células hospedeiras que contêm um

ácido nucleico isolado exógeno que codifica um polipeptídeo flavodoxina como definido acima. Em uma realização, as células hospedeiras de acordo com a invenção são células vegetais, leveduras, bactérias ou fungos. As células hospedeiras bacterianas preferidas são Escherichia coli ou Agrobacterium. As plantas hospedeiras dos ácidos nucleicos, construção, cassete de expressão ou vetor usadas no método de acordo com a invenção são, em principio, vantajosamente todas as plantas que são capazes de sintetizar os polipeptídeos usados no método inventivo. Em uma realização particular, as células vegetais da invenção superexpressam a molécula de ácido nucleico da invenção.

Assim, uma realizaçao da presente invenção é um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina, como descrito aqui, ligado de modo operacional a uma sequência promotora, de preferência, um promotor GOS2, com mais preferência, o promotor GOS2 de arroz, como descrito aqui, compreendido em uma célula hospedeira, em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em célula vegetal, célula bacteriana, célula de levedura, célula fúngica, e célula de mamíferos, de preferência, célula vegetal, com mais preferência, uma célula de

Poaceae, com ainda mais preferência, uma célula do gênero Saccharum, com máxima preferência, uma célula de cana-de-açúcar.

Os métodos da invenção são vantajosamente aplicáveis a

123 qualquer planta, em particular a qualquer planta como definido aqui. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas que incluem legumes de forragem ou relva, 5 plantas ornamentais, culturas alimentares, árvores ou arbustos. De acordo com uma realização da presente invenção, a planta é uma planta de cultivo. Exemplos de plantas de cultivo incluem, porém sem caráter limitativo, chicória,

cenoura, mandioca, trevo, soja, beterraba, beterraba sacarina, girassol, canola, alfafa, semente de colza, semente de linho, algodão, tomate, batata e tabaco.

De acordo com outra realização da presente invenção, a planta é uma planta monocotiledônea. Exemplos de plantas monocotiledôneas incluem cana-deaçúcar. De acordo com outra realização da presente invenção, a planta é um cereal. Exemplos de cereais incluem arroz, milho, trigo, cevada, painço, centeio, triticale, sorgo, emmer, espelta, secale, einkorn, teff, milo e aveias. Em uma realização particular, as plantas da invenção ou usadas nos métodos da invenção são selecionadas a partir do grupo que consiste em milho, trigo, arroz, soja, algodão, colza de semente oleaginosa inclusive canola, cana-de-

açúcar, beterraba sacarina e alfafa.

As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas inclusive legumes de forragem ou relva, plantas ornamentais, cultivos de alimentos, árvores ou arbustos selecionados a partir da lista que compreende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera,

Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis,

Avena spp. (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp.,

124

Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgarís, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza de semente oleagninosa, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa 5 macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrusspp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus 10 longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por exemplo,

Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por exemplo, Glycine max, Soja hispida ou Soja 15 max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por exemplo, Helíanthus annuus),

Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens

culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula,

Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica,

Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp.,

Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp.,

Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroseiinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp.,

Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa

125 spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Rícinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por exemplo, 5 Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum),

Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp,, Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum 10 monococcum ou Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus,

Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre outras.

As plantas preferidas são Poaceae. Com mais preferência, a planta é cana-de-açúcar, de preferência, do gênero saccharum. Com mais preferência, é uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em

Saccharum arundinaceum, Saccharum bengalense, Saccharum edule,

Saccharum munja, Saccharum officinarum, Saccharum procerum, Saccharum

ravennae, Saccharum robustum, Saccharum sinense, e Saccharum spontaneum.

Em relação às sequências da invenção ou úteis nos métodos, construções, plantas, partes colhíveis e produtos da invenção, em uma realização, um ácido nucleico ou uma sequência de polipeptídeo que não se origina de plantas superiores é usado nos métodos da invenção ou na construção de expressão útil nos métodos da invenção. Em outra realização, 25 um ácido nucleico ou uma sequência de polipeptídeo de origem vegetal é usado nos métodos, construções, plantas, partes colhíveis e produtos da invenção ou nas construções de expressão úteis nos métodos da invenção, pois o dito ácido nucleico e polipeptídeos possuem a característica de um uso

126 de códon otimizado para expressão em plantas, e do uso de aminoácidos e sítios reguladores comuns em plantas, respectivamente. A planta de origem pode ser qualquer planta, porém, de preferência, aquelas plantas como descrito aqui. Ainda em outra realização, uma sequência de ácido nucleico que 5 não se origina de plantas superiores, porém artificialmente alteradas para possuir o uso de códon de plantas superiores é usada na construção de expressão útil nos métodos da invenção.

De acordo com outra realização, a presente invenção proporciona um método para produzir plantas que possuem um ou mais traços relacionados 10 ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, em que o dito método compreende as etapas de aumentar a expressão na dita planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina como descrito aqui e selecionar opcionalmente plantas com um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado.

De acordo com outra realização, a presente invenção proporciona um método para produzir plantas com um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, em que o dito método compreende as etapas de aumentar a expressão na dita planta de um ácido nucleico que codifica peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina como descrito aqui, em que o dito ácido nucleico é ligado de modo operacional a um particular promotor como descrito aqui, e selecionar opcionalmente plantas com um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado.

Assim, a invenção proporciona ainda plantas ou células hospedeiras transformadas com uma construção como descrito aqui. Em 25 particular, a invenção proporciona plantas transformadas com uma construção como descrito aqui, essas plantas possuem traços relacionados ao rendimento aumentado como descrito aqui.

Portanto, uma realização preferida é um método para a produção

127 de uma planta transgênica, parte de planta transgênica, ou célula vegetal transgênica com um traço relacionado ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, de preferência rendimento de biomassa e/ou de semente aumentado, que compreende:

(a) introduzir uma construção de vetor recombinante descrita aqui em uma planta, uma parte da planta, ou uma célula vegetal;

(b) gerar uma planta transgênica, parte de planta transgênica, ou

célula vegetal transgênica a partir da planta transformada, parte de planta transformada ou célula vegetal transformada; e (c) expressar o ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina.

Em uma realização, os métodos para a produção de uma planta transgênica, parte de planta transgênica, ou célula vegetal transgênica com um traço relacionado ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, 15 compreendem a etapa de colher as sementes da planta transgênica e plantar as sementes e desenvolver as sementes nas plantas, em que as semente compreendem o ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o

polipeptídeo flavodoxina, e a sequência promotora ligada de modo operacional a esse.

Em outra realização, os métodos da invenção são métodos para a produção de uma planta transgênica Poaceae, de preferência, uma planta da espécie Saccharum, uma parte dessa, ou uma célula vegetal transgênica dessa, com um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, e compreendem a etapa de colher mudas da planta transgênica e plantar as mudas e desenvolver as mudas em plantas, em que as mudas compreendem o ácido nucleico exógeno que codifica o polipeptídeo POI e a sequência promotora ligada de modo operacional a esse.

A invenção também fornece um método para a produção de

128 plantas transgênicas que têm biomassa aumentada, de preferência, biomassa aérea e/ou rendimento de semente aumentado em relação às plantas de controle, que compreende a introdução e expressão em uma planta de qualquer ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina conforme 5 definido aqui em que o dito ácido nucleico é ligado de modo operacional a um promotor particular como descrito aqui e o polipeptídeo flavodoxina é marcado com os plastídeos.

Mais especificamente, a presente invenção fornece um método para a produção de plantas transgênicas que têm um ou mais traços 10 relacionados a rendimento aumentado, particularmente rendimento de biomassa e/ou semente aumentado, tal método compreende:

(i) introduzir e expressar em uma planta ou célula vegetal um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina ou uma construção genética que compreende um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo 15 flavodoxina; e (ii) cultivar a célula vegetal sob condições que promovem o crescimento e desenvolvimento da planta, de preferência, promovem o

crescimento e desenvolvimento de plantas que possuem um ou mais traços relacionados ao rendimentos em relação às plantas de controle.

O ácido nucleico de (i) pode ser qualquer um dos ácidos nucleicos que têm capacidade de codificar um polipeptídeo flavodoxina conforme definido na presente invenção. De preferência, o ácido nucleico também codifica um peptídeo de trânsito que marca a flavodoxina com o plastideo e, de preferência, o ácido nucleico é ligado de modo operacional a uma sequência promotora descrita aqui.

O cultivo da célula vegetal sob condições que promovem o crescimento e desenvolvimento de planta, pode ou não incluir a regeneração e/ou crescimento até a maturidade. Consequentemente, em uma realização

129 particular da invenção, a célula vegetal transformada pelo método de acordo com a invenção é regenerável em uma planta transformada. Em outra realização particular, a célula vegetal transformada pelo método de acordo com a invenção não é regenerável em uma planta transformada, ou seja, células 5 que não são capazes de se regenerar em uma planta utilizando técnicas de cultura celular conhecidas. Embora as células vegetais possuam geralmente a característica de totipotência, algumas células vegetais não podem ser usadas para regenerar ou propagar plantas intactas a partir das ditas células. Em uma realização da invenção, as células vegetais da invenção são essas células. Em 10 outra realização, as células vegetais da invenção são células vegetais que não se sustenta, de maneira autotrófica. Um exemplo consiste em células vegetais que não se sustentam através de fotossíntese ao sintetizar carboidrato e proteína dessas substâncias inorgânicas como água, dióxido de carbono e sal mineral.

O ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula vegetal ou na própria planta (incluindo a introdução em um tecido, órgão ou qualquer outra parte de uma planta). De acordo com um recurso preferencial da presente

invenção, o ácido nucleico é preferencialmente introduzido em uma planta ou célula da planta por transformação. O termo transformação é descrito em mais detalhes na seção de definições na presente invenção.

Em uma realização preferida, os métodos da invenção são realizados utilizando plantas necessitadas de tolerância a estresse abiótico aumentada, por exemplo, tolerância à seca, salinidade e/ou temperaturas quentes ou frias e/ou uso de nutrientes devido a um ou mais entre deficiência de nutriente como deficiência de nitrogênio.

Em uma realização, a presente invenção se refere a qualquer célula vegetal ou planta produzida por qualquer um dos métodos descritos aqui, e a todas as partes da planta e propágulos dessa.

130

A presente invenção engloba plantas ou partes das mesmas (incluindo sementes e/ou mudas) obteníveis pelos métodos de acordo com a presente invenção. As plantas ou partes das mesmas compreendem um transgene de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo flavodoxina conforme 5 definido acima, de preferência, em uma construção genética como um cassete de expressão. A presente invenção se refere ainda à progênie de uma célula transformada ou transfectada primária, tecido, órgão ou planta inteira que foi produzida por qualquer um dos métodos anteriormente mencionados, sendo que a única exigência é que a progênie exiba substancialmente a(s) mesma(s) 10 característica(s) genotípica(s) e/ou fenotípica(s) como aquelas produzidas pelos precursores nos métodos de acordo com a invenção.

Em uma realização adicional, a invenção se refere a sementes e/ou mudas que compreendem de forma exógena os cassetes de expressão da invenção, as construções genéticas da invenção, ou os ácidos nucleicos que 15 codificam

- o polipeptídeo flavodoxina

- e/ou o fragmento funcional de flavodoxina,

- derivado,

- ortólogo, e/ou

- parálogo desses, como descrito aqui e ligado de modo operável a um promotor particular como descrito aqui. Tipicamente, uma planta desenvolvida a partir da semente ou muda da invenção também irá mostrar traços relacionados ao rendimento aumentado.

A invenção também se refere a partes colhíveis de uma planta transgênica da presente invenção, como, porém sem caráter limitativo sementes, folhas, frutos, flores, caules, mudas, raízes, rizomas, tubérculos e bulbos, em que as partes colhíveis compreendem a construção da invenção

131 e/ou um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo flavodoxina ligado de modo operacional a um promotor particular como descrito aqui e/ou o polipeptídeo flavodoxina como definido aqui com marcação no plastídeo e especificamente expresso pelo uso de um promotor particular.

Em particular, essas partes colhíveis são raízes como raízes principais, rizomas, frutos, caules, mudas, beterrabas, tubérculos, bulbos, folhas, flores e/ou sementes.

As partes colhíveis preferidas são excisões de semente e/ou caule (como mudas de cana-de-açúcar, porém não limitado a mudas).

Em outra realização, as partes áreas ou partes colhíveis aéreas ou biomassa área serão entendidas como biomassa vegetativa área não incluindo sementes e/ou frutos.

Em uma realização adicional, a invenção se refere a um grão de pólen transgênico que compreende a construção da invenção e/ou um derivado haploide da célula vegetal da invenção. Embora em uma particular realização o grão de pólen da invenção não possa ser usado para gerar uma planta intacta sem acrescentar esse material genético adicional e/ou não seja capaz de

realizar a fotossíntese, o dito grão de pólen da invenção pode possuir usos na introdução do traço relacionado ao rendimento aumentado em outra planta ao fertilizar um óvulo da outra planta utilizando um grão de pólen vivo da invenção, produção de uma semente do óvulo fertilizado e crescimento de uma planta a partir da semente resultante. Os grãos de pólen adicionais encontram uso como marcadores de origem geográfica e/ou temporal.

Além disso, a invenção se refere a produtos derivados ou produzidos a partir de uma planta transgênica descrita aqui ou um ou mais produtos colhíveis de uma planta transgênica descrita aqui, de preferência, diretamente derivada ou diretamente produzida, a partir de uma ou mais parte(s) colhível(is) dessa planta transgênica. Os produtos preferidos são

132 péletes secos, caules comprimidos, mudas, farinha ou pós, fibras, pano ou papel ou papelão contendo fibras produzidas pelas plantas da invenção, óleo, gordura e ácidos graxos, amido, carboidratos, - inclusive amidos, papel ou papelão contendo carboidratos produzidos pelas plantas da invenção -, seiva, 5 sumo, palha, ou proteínas Os carboidratos preferidos são amidos, celulose e/ ou açúcares, de preferência, sacarose. Também, os produtos preferidos são fibras secas residuais, por exemplo, do caule (como bagaço de cana-de-açúcar

após a remoção do caldo da cana), melaço, ou torta de filtro, de preferência, de cana-de-açúcar. Os ditos produtos podem ser produtos agrícolas.

De preferência, o produto compreende - por exemplo, como um indicador da qualidade particular do produto - a construção da invenção, um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo flavodoxina como descrito aqui e/ou um polipeptídeo flavodoxina exógeno como descrito aqui, em que o dito ácido nucleico é ligado de modo operacional a um promotor particular como descrito aqui e o polipeptídeo flavodoxina é marcado nos plastídeos e especificamente expresso pelo uso de um promotor particular.

Em outra realização, a invenção se refere a uma semente moída

anti-falsificação e/ou caule moídos que possui como uma indicação de origem e/ou como uma indicação de produtor, uma célula vegetal da invenção e/ou a construção da invenção, em que o caule moído é, de preferência, caule de

Poaceae moído, com mais preferência, cana-de-açúcar moída.

A invenção também inclui métodos para fabricar um produto que compreende a) desenvolver as plantas da invenção e b) produzir o dito produto a partir de ou através das plantas da invenção ou partes dessas, inclusive 25 caule e/ou sementes. Em uma realização adicional, os métodos compreendem as etapas de a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes colhiveis como descrito aqui das plantas e c) produzir o dito produto a partir de ou com as partes colhiveis de plantas de acordo com a invenção. De

133 preferência, o produto compreende a construção genética, ácido nucleico e/ ou polipeptídeo da invenção como descrito aqui. Com mais preferência, o produto é produzido a partir de sementes ou do caule da planta transgênica.

Em uma realização, o método para fabricar um produto que compreende a) desenvolver as plantas Poaceae da invenção, de preferência, a planta é cana-de-açúcar, b) obter o caule das plantas da invenção, e c) cortar o caule em pedaços, de preferência, em pedaços adequados como material de

propagação, de preferência, em uma ou mais mudas. De preferência, as mudas compreendem a construção, ácido nucleico e/ou polipeptídeo da invenção como descrito aqui.

Em outra realizaçao, o método para fabricar um produto que compreende a) desenvolver as plantas Poaceae da invenção, de preferência, sendo que a planta é uma espécie Saccharum e, com mais preferência, cana de-açúcar, b) obter o caule das plantas da invenção ou partes desse, e c) extrair o caldo, de preferência, o caldo de cana do caule e/ou extrair as fibras residuais após a extração do caldo, e opcionalmente d) extrair açúcar, de preferência, sacarose, do caldo do caule.

Em uma realização preferida, os métodos da invenção são realizados utilizando plantas necessitadas de tolerância a estresse abiótico aumentada, por exemplo, tolerância à seca, salinidade e/ou temperaturas quentes ou frias e/ou uso de nutrientes devido a um ou mais entre deficiência de nutriente como deficiência de nitrogênio.

Em uma realização, o método da invenção é um método para fabricar tecido ao a) desenvolver as plantas da invenção que são capazes de 25 produzir fibras utilizáveis na fabricação de tecido, por exemplo, algodão, b) remover as partes colhíveis como descrito aqui das plantas, e c) produzir fibras a partir da dita parte colhível e d) produzir tecido a partir das fibras de c).

Outra realização da invenção se refere a um método para produzir

134 ração para biorreatores, processos de fermentação ou plantas de biogás, que compreende a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes colhíveis como descrito aqui das plantas e c) produzir ração para biorreatores, processos de fermentação ou plantas de biogás. Em uma realização preferida, 5 o método da invenção é um método para produzir álcool(is) a partir do material vegetal que compreende a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes colhíveis como descrito aqui das plantas e c) produzir opcionalmente ração para o processo de fermentação, e d) - após a etapa b) ou c) - produzir um ou mais álcool(is) a partir da dita ração ou partes colhíveis, de preferência, 10 utilizando microrganismos como fungos, algas, bactérias ou leveduras, ou culturas celulares. Um exemplo típico podería ser a produção de etanol que utiliza partes colhíveis contendo carboidrato, por exemplo, semente de milho, partes do caule da cana-de-açúcar ou partes de beterraba de beterraba sacarina, ou produtos derivados desses, por exemplo, caldo ou seiva de cana15 de-açúcar ou beterraba sacarina ou amido de milho ou xarope de amido de milho. Em uma realização, o produto é produzido a partir do caule da planta transgênica. Em outra realização, o produto é produzido a partir da semente da

planta.

Em outra realização, o método da invenção é um método para a

produção de um ou mais polímeros que compreende a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes colhíveis como descrito aqui as plantas e c) produzir um ou mais monômeros a partir das partes colhíveis, envolver opcionalmente produtos intermediários, d) produzir um ou mais polímero(s) ao reagir pelo menos um dos ditos monômeros com outros monômeros ou reagir o(s) dito(s) monômero(s). Em outra realização, o método da invenção é um método para a produção de um composto farmacêutico que compreende a) desenvolver as plantas da invenção, b) remover as partes colhíveis como descrito aqui das plantas e c) produzir um ou mais monômeros a partir das

135 partes colhíveis, envolver opcionalmente produtos intermediários, d) produzir um composto farmacêutico a partir das partes colhíveis e/ou produtos intermediários. Em outra realização, o método da invenção é um método para a produção de um ou mais produtos químicos que compreende a) desenvolver as 5 plantas da invenção, b) remover as partes colhíveis como descrito aqui das plantas e c) produzir um ou mais blocos de construção químicos como, porém sem caráter limitativo, acetato, piruvato, lactato, ácidos graxos, açúcares, aminoácidos, nucleotídeos, carotenoides, terpenoides ou esteroides a partir

das partes colhíveis, envolver opcionalmente produtos intermediários, d) produzir um ou mais produtos químicos ao reagir pelo menos um dos ditos blocos de construção com outro bloco de construção ou reagir o(s) dito(s) bloco(s) de construção.

A presente invenção também se refere a um produto obtido por um método de fabricação de um produto, como descrito aqui.

Em uma realização, os produtos produzidos pelos métodos da invenção são produtos vegetais como, porém sem caráter limitativo, um produto alimentício, ração, um suplemento alimentar, suplemento nutricional, fibra, cosmético ou produto farmacêutico. Em outra realização, os métodos de produção são usados para fabricar produtos agrícolas como, porém sem caráter limitativo, fibras, extratos vegetais, farelo ou torta prensada e outro material remanescente após um ou mais processos de extração, farinha, proteínas, aminoácidos, carboidratos, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas, e similares. Os carboidratos preferidos são açúcares, de preferência, sacarose.

Em uma realização, o produto agrícola é selecionado a partir do grupo que consiste em 1) fibras, 2) madeira, 3) extratos vegetais, 4) farelo ou torta prensada ou outro material remanescente após um ou mais processos de extração, 5) farinha, 6) proteínas, 7) carboidratos, 8) gorduras, 9) óleos, 10) polímeros, por exemplo, celulose, amido, lignina, lignocelulose, e 11)

136 combinações e/ou misturas de qualquer um entre 1) a 10). Em uma realização preferida, o produto ou produto agrícola geralmente não compreende células vegetais vivas, compreende o cassete de expressão, construção genética, proteína /ou polinucíeotídeo como descrito aqui. De preferência, o produto 5 compreende a construção genética, ácido nucleico e/ ou polipeptídeo da invenção como descrito aqui.

Ainda em outra realização, os polinucleotídeos e/ou os

polipeptídeos e/ou as construções genéticas da invenção estão compreendidos em um produto agrícola. Em uma realização particular, as sequências de ácido nucleico e/ou sequências de proteína e/ou as construções genéticas da invenção podem ser usadas como marcadores de produto, por exemplo, quando um produto agrícola for produzido pelos métodos da invenção. Esse marcador pode ser usado para identificar um produto que foi produzido por um processo vantajoso que resulta não só em uma eficiência maior do processo como também na qualidade aprimorada do produto devido à qualidade aumentada do material vegetal e partes colhíveis usadas no processo. Esses marcadores podem ser detectados por uma variedade de métodos conhecidos

na técnica, por exemplo, porém sem caráter limitativo métodos baseados em PCR para a detecção de ácido nucleico ou métodos baseados em anticorpos para a detecção de proteínas.

Método de reprodução / Método de melhoria de plantas / Método de PRODUÇÃO DE VARIEDADE VEGETAL

A presente invenção também inclui o uso de construções que compreendem ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos flavodoxina e 25 ligados de modo operacional a um promotor particular como descrito aqui e o uso desses polipeptídeos flavodoxina especificamente expressos pelo uso de um promotor particular para acentuar qualquer um dos traços relacionados ao rendimento em plantas anteriormente mencionados. Por exemplo, as

137 construções que compreendem ácidos nucleicos que codificam polipeptídeo flavodoxina e ligados de modo operacional a um promotor particular como descrito aqui, ou os próprios polipeptídeos flavodoxina especificamente expressos pelo uso de um promotor particular, podem encontrar uso nos programas de reprodução em que um marcador de DNA é identificado para ser geneticamente ligado a uma combinação de gene - promotor de

codificação de polipeptídeo flavodoxina como descrito aqui. A combinação promotor/gene de ácidos nucleicos da invenção, ou os próprios polipeptídeos flavodoxina especificamente expressos pelo uso de um promotor particular podem ser usados para definir um marcador molecular.

Esse marcador de DNA ou proteína pode ser então usado em programas de reprodução para selecionar plantas com um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado como definido aqui nos métodos da invenção.

Ademais, as variantes alélicas de um ácido nucleico/gene de codificação de polipeptídeo flavodoxina ligado de modo operacional a um promotor particular como descrito aqui podem encontrar uso em programas de reprodução assistidos por marcador. As combinações inventivas de um

promotor particular e ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos flavodoxina também podem ser usadas como sondas para mapear genética e fisicamente o local genômico de genes do qual esses fazem parte, e como marcadores para traços ligados àqueles genes e seus sítios de inserção. Essas informações podem ser úteis na reprodução de plantas para desenvolver linhagens com fenótipos desejados.

Uma realização preferida é um método de reprodução de uma planta com um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado que compreende (a) cruzar uma planta transgênica da invenção ou uma planta transgênica obtenível por qualquer um dos métodos descritos aqui com uma

138 segunda planta;

(b) obter a semente do cruzamento da etapa (a);

(c) plantar as ditas sementes e desenvolver as sementes nas plantas; e (d) selecionar a partir das ditas plantas, plantas que expressam de forma exógena o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo flavodoxina descrito aqui, de preferência, que codifica o peptídeo de trânsito e o

polipeptídeo flavodoxina, em que o ácido nucleico é, de preferência, ligado de modo funcional a uma sequência promotora descrita aqui.

Opcionalmente, o método de reprodução compreende ainda a etapa de (e) produzir o material de propagação a partir das plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina, em que o material de propagação compreende a construção genética e/ou construção de vetor da invenção. De preferência, o material de propagação consiste em excisões do caule ou sementes.

Outra realizaçao preferida é um método para a melhoria de planta que compreende

(a) obter uma planta transgênica por meio de qualquer um dos métodos da presente invenção;

(b) combinar dentro de uma célula vegetal o material genético de pelo menos uma célula vegetal da planta de a) com o material genético de pelo menos uma célula que se difere em um ou mais genes das células vegetais das plantas de a) ou cruzar a planta transgênica de a) com uma segunda planta;

(c) obter a semente de pelo menos uma planta gerada a partir de uma célula vegetal de b) ou a planta do cruzamento da etapa (b);

(d) plantar as ditas sementes e desenvolver as sementes nas plantas; e

139 (e) selecionar a partir das ditas plantas, as plantas que expressam sob o controle de um promotor particular como descrito aqui o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina; e opcionalmente (f) produzir o material de propagação a partir das plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina, em que o material de propagação compreende a

construção genética e/ou construção de vetor da invenção.

De preferência, o material de propagação consiste em excisões do caule ou sementes.

Em uma realização preferida, os métodos da invenção são realizados utilizando plantas necessitadas de tolerância a estresse abiótico aumentada, por exemplo, tolerância à seca, salinidade e/ou temperaturas quentes ou frias e/ou uso de nutrientes devido a um ou mais entre 15 deficiência de nutriente como deficiência de nitrogênio.

Em uma realização, o teor de carboidrato de armazenamento total das plantas da invenção, ou partes dessas e em particular das partes

colhíveis da(s) planta(s) é aumentado comprado com a(s) planta(s) de controle e as partes de planta correspondentes das plantas de controle.

Os carboidratos de armazenamento são, de preferência, açúcares como, porém sem caráter limitativo sacarose, frutose e glicose, e polissacarídeos como, porém sem caráter limitativo amidos, glucanos e frutanos.

O teor de carboidrato de armazenamento total e o teor de grupos ou espécies individuais de carboidratos pode ser medido de inúmeras formas conhecidas na técnica. Por exemplo, o pedido internacional publicado como W02006066969 descreve nos parágrafos [79] a [117] um método para determinar o teor de carboidrato de

140 armazenamento total de cana-de-açúcar, inclusive teor de frutano.

Outro método de cana-de-açúcar é o seguinte:

As plantas transgênicas de cana-de-açúcar são desenvolvidas durante 10 a 15 meses, na estufa ou no campo. Condições padrão de 5 crescimento das plantas são usados.

Os talos de plantas de cana-de-açúcar que possuem 10 a 15 meses de idade e possuem mais de 10 internódios são colhidos. Após

todas as folhas serem removidas, os internódios do talo são numerados de cima (= 1) para baixo (por exemplo = 36). Um disco de talo com peso de aproximadamente 1 a 2 g é excisado da parte intermediária de cada internódio. Os discos de talo de 3 internódios são então combinados para fornecer uma amostra e são congelados em nitrogênio líquido.

Para a extração de açúcar, os discos de talo são primeiramente triturados em um misturador Waring (de Waring, New 15 Hartford, Connecticut, USA). Os açúcares são extraídos por agitação durante uma hora a 95°C em 10 mM de tampão fosfato de sódio pH 7,0.

Então, os sólidos são removidos por filtração através de uma peneira de 30

pm. A solução resultante é subsequentemente empregada para a determinação de açúcar (veja abaixo).

As plantas transgênicas de cana-de-açúcar se desenvolvem durante 10 a 15 meses. Em cada caso, um talo de cana-de-açúcar da linhagem transgênica e uma planta de cana-de-açúcar de ocorrência natural é desfolhada, o talo é dividido em segmentos de 3 internódios, e esses segmentos de internódio são congelados em nitrogênio líquido em 25 um recipiente de plástico vedado de 50 ml. O peso fresco das amostras é determinado. A extração para os propósitos da determinação de açúcar é realizada conforme descrito abaixo.

Os teores de glicose, frutose e sacarose no extrato obtido de

141 acordo com o método de extração de açúcar descrito acima são determinados de forma fotométrica em um ensaio enzimático através da conversão de NAD+ (dinucleotídeo de nicotinamida e adenina) em NADH (dinucleotídeo de nicotinamida e adenina reduzido). Durante a redução, o 5 caráter aromático no anel de nicotinamida é perdido, e o espectro de absorção, desse modo, muda. Essa alteração no espectro de absorção pode ser detectado de forma fotométrica. A glicose e frutose presentes no extrato são convertidas em glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato por meio

da enzima hexoquinase e trifosfato de adenosina (ATP). A glicose- διό fosfato é subsequentemente oxidada pela enzima glicose-6-fosfato desidrogenase para obter 6-fosfogluconato. Nessa reação, NAD+ é reduzido para obter NADH, e a quantidade de NADH formada é determinada de forma fotométrica. A razão entre a NADH formada e a glicose presente no extrato é 1:1, de modo que o teor de glicose possa ser calculado a partir do teor de NADH utilizando o coeficiente de absorção molar de NADH (6.3 1 por mmol e por cm lightpath). Após a oxidação completa de glicose-6-fosfato, frutose-6-fosfato, que também foi formada

na solução, é convertida pela enzima fosfoglucoisomerase para obter glicose- 6-fosfato que, por sua vez, é oxidada para obter 6-fosfogluconato.

Novamente, a razão entre frutose e a quantidade de NADH formada é 1 :1.

Então, a sacarose presente no extrato é clivada pela enzima sucrase (Megazyme) para obter glicose e frutose. As moléculas de glicose e frutose liberadas são então convertidas com as enzimas mencionadas acima na reação NAD+-dependente para obter 6-fosfogluconato. A conversão de uma molécula de sacarose em 6-fosfogluconato resulta em duas moléculas de NADH. A quantidade de NADH formada também é determinada de forma fotométrica e usada para calcular o teor de sacarose, utilizando o coeficiente de absorção molar de NADH.

142

Os talos de cana-de-açúcar são divididos em segmentos, em cada caso, de três internódios, como especificado acima. Os internódios são numerados de cima para baixo (parte superior = internódio 1, parte inferior = internódio 21).

Ademais, as plantas transgênicas de cana-de-açúcar podem ser analisadas utilizando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, porém sem caráter limitativo:

- The Sampling of Sugar Cane by the Full Width Hatch Sampler; ICUMSA (International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis, 10 http://www.icumsa.org/index.php?id=4) Method GS 5-5 (1994) disponível junto à Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/)

- The Sampling of Sugar Cane by the Corer Method; ICUMSA Method GS 5-7 (1994) available from Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr.

16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/)

- The Determination of Sacarose by Gas Chromatography in Molasses and Factory Products - Official; and Cane Juice; ICUMSA Method GS 4/7/8/5-2 (2002) disponível junto à Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/)

- The Determination of Sacarose, Glicose and Frutose by HPLC in Cane Molasses-and Sacarose in Beet Molasses; ICUMSA Method GS 7/4/8- (2011) disponível junto à Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/)

- The Determination of Glicose, Frutose and Sacarose in Cane 25 Juices ,Syrups and Molasses, and of Sacarose in Beet Molasses by High Performance lon Chromatography; ICUMSA Method GS 7/8/4-24 (2011) disponível junto à Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlin (http://www.bartens.com/).

143

Para safras exceto a cana-de-açúcar, métodos similares são conhecidos na técnica ou podem ser facilmente adaptados a partir de um método conhecido para outra safra.

Em uma realização, a(s) planta(s) de controle não contém/contêm um cassete de expressão da invenção, e então não compreende(m) uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina como descrito aqui ligado de modo operacional a um

promotor particular como definido aqui.

Em outra realização, a(s) planta(s) de controle contêm uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina, porém essa sequência de ácido nucleico não é funcionalmente ligada ao promotor empregado nas construções, vetores, plantas, usos e métodos da presente invenção, ou seja, a expressão da dita sequência de ácido nucleico não está sob o controle do dito promotor.

Ademais, a presente invenção se refere às seguintes realizações específicas, em que a expressão “como definido na reivindicação /item X“ pretende induzir o elemento versado na técnica a aplicar a definição como

descrito no item/reivindicação X. Por exemplo, “um ácido nucleico como definido no item 1” será entendido de modo que a definição do ácido nucleico conforme no item 1 seja aplicada ao ácido nucleico. Em consequência, o termo “como definido no item” ou “como definido na reivindicação” pode ser substituído pela definição correspondente daquele item ou reivindicação, respectivamente:

Realizações específicas

1. Método para acentuar um ou mais traços relacionados ao rendimento em uma planta em relação a uma planta de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina,

144 em que a expressão está sob o controle de uma sequência promotora ligada de modo operacional ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina e em que a sequência promotora compreende a sequência de nucleotídeo de um promotor G0S2, de preferência, um promotor

GOS2 de arroz;

ou fragmentos funcionais ou derivados dessa.

2. Método, de acordo com a realização 1, em que sequência de nucleotídeo do promotor GOS2 compreende pelo menos 70% da sequência

representada pela SEQ ID NO: 7.

3. Método, de acordo com a realização 1 ou 2, em que o peptídeo de trânsito marca o polipeptídeo flavodoxina em um plastídeo, de preferência, em um cloroplasto.

4. Método, de acordo com a realização 3, em que o peptídeo de trânsito de cloroplasto é selecionado a partir dos peptídeos de trânsito relacionados na Tabela 4 ou homólogos desses.

5. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 4, em que o polipeptídeo flavodoxina é codificado por uma sequência de ácido

nucleico selecionada a partir do grupo de sequências de ácido nucleico relacionado na Tabela 3 ou homólogos dessas.

6. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 5, em que o polipeptídeo flavodoxina pertence á Anabaena sp., de preferência,

Anabaena PCC7119.

7. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 6, em que o polipeptídeo flavodoxina é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno que possui pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 13 ou 15, ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; ou (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que

145 possui pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; ou (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de se hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar desses; ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo com

atividade biológica de uma flavodoxina ou uma ferredoxina; ou (v) um ácido nucleico exógeno que codifica o mesmo polipeptídeo que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, porém se difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido á degeneração do código genético; ou (ví) um ácido nucleico exógeno que combina as características dos ácidos nucleicos de qualquer um dos dois entre (i) a (iv) acima.

8. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 7, que compreende

(a) transformar de forma estável uma célula vegetal com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e codifica um polipeptídeo flavodoxina, em que o polipeptídeo flavodoxina é codificado por (i) um ácido nucleico exógeno que possui pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa;

(ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou 16, ou um fragmento funcional dessa, ou um ortólogo ou um parálogo dessa; e/ou (iii) um ácido nucleico exógeno capaz de se hibridizar sob condições severas com qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii) ou uma sequência complementar desses;

(iv) um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo com

146

a atividade biológica de uma flavodoxina ou uma ferredoxina; ou (v) um ácido nucleico exógeno que codifica o mesmo polipeptídeo que os ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima, porém se difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iv) acima devido à degeneração do código genético; ou (vi) um ácido nucleico exógeno que combina as características dos ácidos nucleicos de qualquer um dos dois (i) a (iv) acima.

em que o ácido nucleico exógeno está em ligação funcional com uma sequência promotora que compreende a sequência de nucleotídeo do promotor GOS2, de preferência, o promotor GOS2 de arroz, ou um fragmento funcional desse, ou um ortólogo ou um parálogo desse;

(b) regenerar a planta a partir da célula vegetal; e (c) expressar o dito ácido nucleico exógeno.

9. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 8, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado compreendem biomassa aumentada em relação a plantas de controle, e compreende, de preferência, biomassa aérea aumentada em relação a plantas de controle.

10. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 9, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado são obtidos sob condições sem estresse ou condições de estresse abiótico.

11. Método, de acordo com a realização 10, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado são obtidos sob condições de estresse devido à seca, estresse salino, ou deficiência de nitrogênio.

12. Construção de expressão que compreende:

(i) um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito como definido em qualquer uma das realizações 3 ou 4 e um polipeptídeo flavodoxina como definido em qualquer uma das realizações 5 a 8;

(ii) uma sequência promotora capaz de conduzir a expressão da

147 sequência de ácido nucleico de (i) como definido na realização 1 ou 2; e opcionalmente (iii) uma sequência de terminação de transcrição.

13. Vetor de expressão recombinante que compreende uma construção de expressão de acordo com a realização 12.

14. Uso de uma construção de expressão, de acordo com a realização 12 ou um vetor de expressão recombinante, de acordo com a

realização 13 em um método de produção de uma planta transgênica com um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado, de preferência, biomassa aumentada, em relação a plantas de controle, e com mais preferência biomassa aérea aumentada em relação a plantas de controle.

15. Método para a produção de uma planta transgênica, parte de planta transgênica, ou célula vegetal transgênica com um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado em relação a plantas de controle, de preferência, biomassa aumentada, que compreende:

(a) introduzir uma construção de vetor recombinante de acordo com a realização 13 em uma planta, uma parte da planta, ou uma célula

vegetal;

(b) gerar uma planta transgênica, parte da planta transgênica, ou célula vegetal transgênica a partir da planta transformada, parte da planta transformada ou célula vegetal transformada; e (c) expressar o ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina.

16. Método da realização 15, que compreende ainda a etapa de colher o material de propagação da planta transgênica e plantar o material de propagação e desenvolver o material de propagação em plantas, em que o material de propagação compreende o ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina e a sequência promotora

148 ligada de modo operacional a esse.

17. Planta transgênica, parte da planta transgênica, ou célula vegetal transgênica obtenível por um método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 11, 15, ou 16, em que a planta transgênica, parte da planta 5 transgênica, ou célula vegetal transgênica expressa um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo flavodoxina sob o controle de uma sequência promotora como definido em qualquer uma das

realizações 1 a 8.

18. Planta transgênica, parte da planta transgênica, ou célula vegetal transgênica transformada com uma construção de expressão de acordo com a realização 12 ou com um vetor de expressão recombinante de acordo com a realização 13, e compreende a sequência promotora ligada de modo operacional ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina como definido em qualquer uma das realizações 1 a 8.

19. Planta transgênica, parte da planta transgênica, ou célula vegetal transgênica de acordo com a realização 17 ou 18, em que a planta transgênica, parte da planta transgênica, ou célula vegetal transgênica possui um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado, de preferência, uma biomassa aumentada em relação a plantas de controle.

20. Parte colhível de uma planta transgênica, de acordo com qualquer uma das realizações 17 a 19, em que a dita parte colhível é um órgão aéreo, de preferência, o caule ou partes desse.

21. Produto produzido a partir de uma planta transgênica, de acordo com qualquer uma das realizações 17 a 19,ou a partir da parte colhível de uma planta transgênica, de acordo com a realização 20.

22. Método de fabricação de um produto que compreende as etapas de desenvolver as plantas transgênicas, de acordo com qualquer uma das realizações 17 a 19 e produzir o dito produto a partir de ou através das

149 ditas plantas ou partes, de preferência, o caule, da planta.

23. Método para melhoria de planta que compreende

a) obter uma planta transgênica através do método de qualquer uma das realizações 1 a 11, 15, ou 16;

b) combinar dentro de uma planta o material genético de pelo menos uma célula vegetal da planta de a) com o material genético de pelo menos uma célula que se difere em um ou mais genes das células vegetais das plantas de a) ou cruzar a planta transgênica de a) com uma segunda

planta;

c) obter a semente de pelo menos uma planta gerada a partir de uma célula vegetal de b) ou a planta do cruzamento da etapa (b);

d) plantar as ditas sementes e desenvolver as sementes em plantas; e

e) selecionar a partir das ditas plantas, as plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina; e opcionalmente

f) produzir material de propagação a partir das plantas que

expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina.

24. Construção de expressão da realização 12 ou um DNA cromossõmico recombinante que compreende um cassete de expressão que compreende um promotor como definido no item (ii) da realização 12, um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito ligado a uma flavodoxina como definido no item (i) da realização 12 e uma sequência de terminação de transcrição em ligação funcional, em que a construção ou o DNA cromossõmico recombinante está compreendido em uma célula vegetal.

25. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 11,

15, 16, 22, ou 23, ou a planta transgênica, parte da planta transgênica, ou

150 célula vegetal transgênica, de acordo com qualquer uma das realizações 17 a

19, ou o uso de acordo com a realização 14, a parte colhível de acordo com a realização 20, ou o produto de acordo com a realização 21, ou a construção ou

DNA cromossômico recombinante da realização 24 em que a célula vegetal pertence a ou a planta é selecionada a partir do grupo que consistem feijões, soja, ervilha, trevo, kudzu, luzerna, lentilhas, tremoços, ervilhacas, amendoim, arroz, trigo, milho, cevada, arabidopsis, banana, colza de semente oleaginosa

inclusive canola, algodão, batata, cana-de-açúcar, alfafa, beterraba sacarina, painço, centeio, triticale, sorgo, emmer, espelta, einkorn, teff, milo e aveias.

26. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 11,

15, 16, 22, ou 23, ou a planta transgênica, parte da planta transgênica, ou célula vegetal transgênica, de acordo com qualquer uma das realizações 17 a

19, ou o uso, de acordo com a realização 14, a parte colhível, de acordo com a realização 20, ou o produto, de acordo com a realização 21, ou a construção ou

DNA cromossômico recombinante da realização 24, em que a célula vegetal pertence a ou a planta é uma poaceae, de preferência, do gênero saccharum, com mais preferência, selecionada a partir do grupo que consiste em

Saccharum arundinaceum, Saccharum bengalense, Saccharum edule,

Saccharum munja, Saccharum officinarum, Saccharum procerum, Saccharum ravennae, Saccharum robustum, Saccharum sinense, e Saccharum spontaneum.

Exemplos

A presente invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos apenas por meio de ilustração. Os 25 seguintes exemplos não pretendem definir completamente o escopo da invenção.

Em particular, as plantas usadas nos experimentos descritos são usadas devido à Arabidopsis, plantas de tabaco, arroz e milho são plantas

151 modelo para o teste de transgenes. Essas são amplamente usadas na técnica devido à facilidade relativa de teste visto que possuem uma capacidade de transferência satisfatória dos resultados para outras plantas usadas na agricultura, como, porém sem caráter limitativo milho, trigo, arroz, soja, 5 algodão, colza de semente oleaginosa inclusive canola, cana-de-açúcar, beterraba sacarina e alfafa, ou outras culturas dicotiledôneas ou monocotiledôneas.

Exceto onde indicado em contrário, a presente invenção emprega técnicas e métodos convencionais de biologia vegetal, biologia molecular, bioinformática e reprodução de plantas.

Manipulação de DNA: a não ser que de outra forma determinado, as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com o descrito em

(Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3^a Edição Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nova Iorque) ou nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Materiais e métodos padrão para trabalho molecular em planta são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).

Exemplo 1: Identificação de sequências relacionadas à SEQ ID NO: 1 e SEQ

ID NO: 2

Sequências (cDNA, ESTs ou genômicas de comprimento completo) relacionadas a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 são identificadas dentre aquelas mantidas no banco de dados Entrez Nucleotides no Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (NCBI) com uso de ferramentas de 25 pesquisa de sequência de banco de dados, tal como a Ferramenta Básica de Alinhamento Local (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410; e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 a 3402). O programa é usado para encontrar regiões de similaridade local entre sequências por comparação

152 de ácido nucleico ou sequências de polipeptídeo com bancos de dados de sequência e por cálculo da significância estatística das correlações. Por exemplo, o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 é usado para o algoritmo TBLASTN, com definições padrão e o filtro para ignorar 5 sequências de baixa complexidade acionado. O resultado da análise é visto por comparação por pares e classificado de acordo com a pontuação de probabilidade (valor E), em que a pontuação reflete a probabilidade de que um

alinhamento particular ocorra por acaso (quanto menor o valor E, mais significante o acerto). Adicionalmente aos valores E, comparações também são pontuadas por porcentagem de identidade. A porcentagem de identidade refere-se ao número de nucleotídeos idênticos (ou aminoácidos) entre duas sequências de ácidos nucleicos comparadas (ou polipeptídeo) por um comprimento particular. Em algumas ocorrências, os parâmetros padrão podem ser ajustados para modificar o rigor da pesquisa. Por exemplo, o valor E pode ser aumentado para mostrar correlações menos rigorosas. Dessa forma, correlações exatas quase curtas podem ser identificadas.

Exemplo 2: Identificação de domínios compreendidos em sequências de

POLIPEPTÍDEO ÚTEIS PARA REALIZAR OS MÉTODOS DA INVENÇÃO

O banco de dados de Recurso Integrado de Famílias de Proteína,

Domínios e Sítios (InterPro) é uma interface integrada para os bancos de dados de assinatura comumente usados para pesquisas a base de texto e de sequência. O banco de dados InterPro combina esses bancos de dados que usam diferentes metodologias e graus variáveis de informações sobre proteínas bem caracterizadas para derivas assinaturas de proteína. Os bancos de dados colaboradores incluem SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS,

ProDom e Pfam, Smart e TIGRFAMs. Pfam é uma coleção grande de múltiplos alinhamentos de sequência e modelos de Markov ocultos que cobrem muitos domínios e famílias de proteínas comuns. Pfam é hospedado no servidor do

153

Instituto Sanger no Reino Unido. Interpro é hospedado no Instituto de Bioinformática Europeu no Reino Unido.

Os resultados do InterPro scan ((veja Zdobnov E.M. and Apweiler

R.; InterProScan - an integration platform forthe signature-recognition methods in InterPro.; Bioinformatics, 2001, 17(9): 847-8; banco de dados InterPro, versão 36.0, 23 de fevereiro de 2012 da sequência de polipeptídeo como representado por SEQ ID NO: 2 são apresentados na Tabela B e na figura 1.

Tabela B: Resultados de InterProScan (números de acesso principais) da

SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO COMO REPRESENTADO POR SEQ ID NO: 2

Banco de dados/método	Número de acesso	Nome de acesso	Posição dentro polipeptídeo (resíduos aminoácido)	do de
PROSITE	PS00201	FLAVODOXINA	7-23
PFAM	PF00258	Flavodoxin 1	7-160
PROFILE	PS50902	FLAVODOXINJJKE	5-165
TIGRFAMs	TIGR01752	flavjonga: flavodoxina	4-168

Uma análise repetida utilizando o software InterproScan versão

4.8, banco de dados InterPro versão 41 de 13 de fevereiro de 2013 forneceu os domínios e motivos como mencionado na tabela B com as coordenadas

fornecidas na última coluna da tabela B, e além disso, os domínios e motivos

PIRSF038996, G3DSA:3.40.50.360, PTHR30112, SSF52218 foram detectados.

Em uma realização, um polipeptídeo flavodoxina compreende um domínio conservado (ou motivo) com pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com um domínio conservado da tabela B.

Exemplo 3: Clonagem da sequência de ácido nucleico de codificação de

FLAVODOXINA

Construção de transformaçao de arroz:

O ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o

154 polipeptídeo flavodoxina (SEQ ID NO: 5 - ou códon otimizado para plantas maiores como mostrado na SEQ ID NO: 14) ou que codifica o peptídeo de trânsito e a flavodoxina Synechocystis (SEQ ID NO: 17) foram sintetizados de modo que incluam os sítios AttB para recombinação Gateway (Life 5 Technologies GmbH, Frankfurter StraBe 129B, 64293 Darmstadt, Germany).

Alternativamente, a sequência de ácido nucleico que codifica a flavodoxina pode ser amplificada por PCR utilizando como modelo a biblioteca

de cDNA no caso de eucariotos ou DNA genômico para procariotos, como Anabaena. A PCR é realizada utilizando uma Taq DNA polimerase de revisão comercialmente disponível em condições padrão, utilizando 200 ng de modelo em uma mistura de PCR de 50 pl. Os iniciadores usados incluem os sítios AttB para uma recombinação Gateway. O fragmento de PCR amplificado também é purificado utilizando métodos padrão. A primeira etapa do procedimento

Gateway, a reação BP, é então realizada, durante a mesma o fragmento de

PCR se recombina in vivo com o plasmídeo pDONR201 para produzir, de acordo com a terminologia Gateway, um “clone de entrada”, pFLD. O

plasmídeo pDONR201 pode ser adquirido junto à Invitrogen, como parte da tecnologia Gateway®.

Um ácido nucleico que se funde com o ácido nucleico (SEQ ID

NO: 3) do peptídeo de trânsito FNR de ervilha na sequência de codificação (SEQ ID NO: 2) da flavodoxina Anabaena pode ser gerado como descrito nos parágrafos [0075] e [0076] na página 8 da patente europeia EP 1 442 127, os ditos parágrafos estão incorporados a título de referência. A sequência de ácido nucleico resultante pode ser ligada aos sítios attB para permitir a 25 recombinação Gateway.

O clone de entrada que compreende ácido nucleico de codificação de flavodoxina sintetizado da SEQ ID NO: 1, 13 ou 15 (ligado ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito como mostrado na SEQ ID

155

NO: 5, 14 e 17, respectivamente foi então usado em uma reação LR com um vetor de destino usado para a transformação de arroz. Esse vetor contém como elementos funcionais dentro das bordas de T-DNA: um marcador selecionável de planta; um cassete de expressão de marcador classificável; e um cassete

Gateway destinado para recombinação LR in vivo como a sequência de ácido nucleico de interesse já clonada no clone de entrada. Um promotor GOS2 (SEQ ID NO: 7) para expressão específica está localizado a montante desse

cassete Gateway. O dito promotor é amplificado por PCR utilizando DNA genômica de Oryza sativ. Alternativamente, esse pode ser sintetizado.

Após a etapa de recombinação LR, o vetor de expressão resultante GOS2::TP::flavodoxina (Figura 2) que compreende a combinação (SEQ ID NO: 19, 20 ou 21) do promotor da SEQ ID NO: 7 com o ácido nucleico de peptídeo de trânsito da SEQ ID NO 3 e o ácido nucleico flavodoxina (SEQ

ID NO: 1, 13 ou 15, respectivamente) foi transformado em uma cepa

Agrobacterium adequada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Como uma alternativa, o promotor GOS2 e o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e a flavodoxina Anabaena (SEQ ID NO: 5 - ou

códon otimizado para plantas maiores como mostrado na SEQ ID NO: 14) ou que codifica o peptídeo de trânsito e a flavodoxina Synechocystis (SEQ ID NO:

17) é sintetizado como uma única peça e inserido em um vetor binário para transformação mediada por Agrobacterium, ou em duas ou mais peças ligadas ou montadas em um cassete de expressão dentro de um vetor, por exemplo, um vetor binário.

Construção de expressão de cana-de-açúcar

Para a expressão do ácido nucleico que codifica a proteína de fusão (de peptídeo de trânsito de Cyanophora paradoxa e flavodoxina de Anabaena) como mostrado na SEQ ID NO: 11 sob controle do promotor GOS2, a sequência de promotor GOS2 (SEQ ID NO: 7) e o ácido nucleico de SEQ ID

156

NO: 9 que codifica o peptídeo de trânsito (SEQ ID NO: 10) e o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 que codifica a flavodoxina de Anabaena de SEQ ID NO: 2 foram sintetizados ligados à sequência terminadora de Zeína de milho. O cassete de expressão resultante é mostrado na SEQ ID NO: 12. Para melhorar 5 a eficácia de seleção das plantas transformadas sobre as plantas não transformadas, um cassete marcador de seleção que compreende um a promotor Ubiquitina de milho que controla a expressão do marcador de seleção

nptll e o terminador NOS, inclui a construção para bombardeio de partículas.

As plantas de cana-de-açúcar foram transformadas com o cassete de expressão como mostrado na SEQ ID NO: 12 por bombardeio de partículas.

O dito cassete de expressão também pode ser usado para transformação mediada por Agrobacterium de cana-de-açúcar ou outras plantas após a inserção em um vetor binário e introdução em Agrobacteria.

A construção que compreende os cassetes de expressão para a expressão de peptídeo de trânsito-flavodoxina e o cassete marcador selecionável pode ser isolada do vetor como necessário e usados para bombardeio de partículas de células de cana-de-açúcar como descrito abaixo.

Exemplo 4: Transformação de planta

Transformação de arroz

A Agrobacterium contendo o vetor de expressão foi usada para transformar vegetais Oryza sativa. As sementes secas maduras do cultivar

Nipponbare de subespécie arroz japônica foram descascadas. A esterilização foi realizada por incubação durante um minuto em etanol 70%, seguida por 30 a 60 minutos, de preferência, 30 minutos em solução de hipoclorito de sódio 25 (dependendo do grau de contaminação), seguida por 3 a 6 lavagens, de preferência, 4 vezes com água destilada estéril. As sementes estéreis foram, então, germinadas em um meio contendo 2,4-D (meio de indução de calo).

Após a incubação sob luz durante 6 dias, os calos embriogênicos derivados de

157 escutelo foram transformados com Agrobacterium como descrito aqui abaixo.

A cepa de Agrobacterium LBA4404 contendo o vetor de expressão foi usada para co-cultivação. A Agrobacterium foi inoculada em um meio AB com os antibióticos apropriados e submetida à cultura durante 3 dias a 5 28°C. As bactérias foram, então, coletadas e suspensas em um meio líquido de co-cultivação em uma densidade (ODeoo) igual a cerca de 1. Os calos foram imersos na suspensão durante 1 a 15 minutos. Os tecidos calosos foram,

então, secos em um filtro de papel e transferidos para um meio solidificado de co-cultivação e incubados durante 3 dias no escuro a 25°C. Após a lavagem de

Agrobacterium, os calos foram desenvolvidos em um meio contendo 2,4-D durante 10 a 14 dias (tempo de crescimento para indica: 3 semanas) sob luz a

28°C na presença de um agente de seleção. Durante este período, o crescimento de calos resistentes foi desenvolvido. Após a transferência deste material para um meio de regeneração, o potencial embriogênico foi liberado e ramos se desenvolveram nas quatro a seis semanas seguintes. Os ramos foram excisados dos calos e incubados durante 2 a 3 semanas em um meio contendo auxina a partir do qual eles foram transferidos para o solo. Os ramos

fortificados foram desenvolvidos sob alta umidade e poucos dias em uma estufa.

A transformação de cultivar indica de arroz também pode ser realizada de maneira similar conforme descrito acima de acordo com técnicas bem conhecidas por um elemento versado na técnica.

a 90 transformantes de arroz TO independentes foram gerados para uma construção. Os transformantes primários foram transferidos a partir 25 de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa. Após uma análise de PCR quantitativa para verificar o número de cópia da inserção de T-DNA, apenas os vegetais transgênicos de cópia única que exibem tolerância ao agente de seleção foram mantidos para colheita de semente T1. As sementes

158 foram, então, colhidas três a cinco meses após o transplante. O método produziu transformantes de local único em uma taxa superior a 50 % (Aldemita and Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Como uma alternativa, as plantas de arroz podem ser geradas de acordo com o seguinte método:

Agrobacterium contendo o vetor de expressão é usada para transformar plantas Oryza sativa. As sementes secas maduras do cultivar

japonica de arroz Nipponbare são descascadas. A esterilização é realizada por incubação durante um minuto em 70% de etanol, seguido por 30 minutos em

0,2% de HgCI₂, seguido por 6 lavagens durante 15 minutos com água destilada estéril. As sementes estéreis são então germinadas em um meio contendo 2,4D (meio de indução de calo). Após a incubação no escuro durante quatro semanas, os calos embriogênicos derivados de escutelo são excisados e propagados no mesmo meio. Após duas semanas, os calos são multiplicados 15 ou propagados por subcultura no mesmo meio por mais 2 semanas. As partes de calo embriogênico são sub-cultivadas em meio fresco 3 dias antes do cocultivo (para estimular a atividade de divisão celular).

A cepa de Agrobacterium LBA4404 contendo o vetor de expressão é usada para o co-cultivo. Agrobacterium é inoculada em meio AB com os antibióticos adequados e cultivada durante 3 dias a 28°C. As bactérias são então coletadas e suspensas em meio de co-cultivo líquido em uma densidade (Οϋεοο) de cerca de 1. A suspensão é então transferida para uma placa de Petri e os calos imersos na suspensão durante 15 minutos. Os tecidos de calo são então secos em um papel filtro e transferidos para o meio de co25 cultivo solidificado e incubados durante 3 dias no escuro a 25°C. Os calos cocultivados se desenvolvem em meio contendo 2,4-D durante 4 semanas no escuro a 28°C na presença de um agente de seleção. Durante esse período, ilhas de calos resistentes de crescimento rápido são desenvolvidas. Após a

159 transferência desse material para um meio de regeneração e incubação sob luz, o potencial embriogênico é liberado e os brotos desenvolvidos nas próximas quatro a cinco semanas. Os brotos são excisados dos calos e incubados durante 2 a 3 semanas em um meio contendo auxina a partir do qual 5 esses são transferidos para o solo. Brotos endurecidos são desenvolvidos sob alta umidade e poucos dias em uma estufa.

Aproximadamente 35 a 90 transformantes de arroz TO

independentes são gerados para uma construção. Os transformantes primários foram transferidos a partir de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa. Após uma análise de PCR quantitativa para verificar o número de cópia da inserção de T-DNA, apenas as plantas transgênicas de cópia única que exibem tolerância ao agente de seleção são mantidas para colheita de semente T1. As sementes são, então, colhidas três a cinco meses após o transplante. O método produziu transformantes de local único em uma taxa superior a 50 % (Aldemita and Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Transformação de milho

A transformação do milho (Zea mays) é realizada com uma

modificação do método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6):

745-50. A transformação é dependente de genótipo em milho e apenas os genótipos específicos são receptivos para transformação e regeneração. A linha natural A188 (Universidade de Minnesota) ou híbridos com A188 como um parente são boas fontes de material doador para transformação, porém, outros genótipos também podem ser usados com sucesso. As espigas são colhidas do milho aproximadamente 11 dias após a polinização (DAP) quando 25 o comprimento do embrião imaturo for cerca de 1 a 1,2 mm. Os embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão, e os vegetais transgênicos são recuperados através de organogênese. Os embriões excisados são desenvolvidos no meio de indução

160 de calo, então, o meio de regeneração de milho, contendo o agente de seleção (por exemplo, imidazolinona, porém, vários marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 25 °C durante 2 a 3 semanas, ou até que ramos se desenvolvam. Os ramos verdes são 5 transferidos a partir de cada embrião para o meio de enraizamento de milho e incubados a 25 °C durante 2 a 3 semanas, até que as raizes se desenvolvam.

Os ramos enraizados são transplantados para o solo na estufa. Produzem-se

sementes T1 a partir dos vegetais que exibam tolerância ao agente de seleção e que contenham uma única cópia da inserção de T-DNA..

Transformação de trigo

A transformação do trigo é realizada com o método descrito por

Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. O cultivar Bobwhite (disponível junto á CIMMYT, México) é comumente usado na transformação.

Os embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacteríum tumefaciens contendo o vetor de expressão, e os vegetais transgênicos são recuperados através de organogênese. Após a incubação com Agrobacteríum, os embriões são desenvolvidos in vitro em meio de indução de calos, então em meio de

regeneração, contendo o agente de seleção (por exemplo, imidazolinona, porém vários marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 25 °C durante 2 a 3 semanas, ou até que ramos se desenvolvam. Os ramos verdes são transferidos a partir de cada embrião para o meio de enraizamento de milho e incubados a 25 °C durante 2 a 3 semanas, até que as raízes se desenvolvam. Os ramos enraizados são transplantados para o solo na estufa. Produzem-se sementes T1 a partir dos vegetais que 25 exibam tolerância ao agente de seleção e que contenham uma única cópia da inserção de T-DNA.

Transformação de soja

A soja é transformada de acordo com uma modificação do método

161 descrito na patente Texas A&M US 5.164.310. Diversas variedades de soja comerciais são receptivas à transformação por esse método. O cultivar Jack (disponível junto à Itlinois Seed foundation) é comumente usado para a transformação. As sementes de soja são esterilizadas para semeação in vitro.

O hipocótilo, a radícula e um cotilédone são cortados de mudas jovens com sete dias. O epicótilo e o cotilédone restantes são adicionalmente cultivados para desenvolver nodos axilares. Esses nodos axilares são cortados e

incubados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão.

Após o tratamento de co-cultivação, os explantes são lavados e transferidos para o meio de seleção. Os ramos regenerados são cortados e colocados em um meio de alongamento de ramos. Ramos não maiores do que 1 cm são colocados no meio de enraizamento até as raizes se desenvolverem. Os ramos enraizados são transplantados para o solo na estufa. As sementes T1 são produzidas a partir de vegetais que exibem tolerância ao agente de seleção e 15 que contêm uma única cópia da inserção de T-DNA.

Transformação de semente de colza/canola

Os pecíolos cotiledonares e hipocótilos de mudas jovens com 5 a

dias são usados como explantes para a cultura de tecido e transformados de acordo com Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). O cultivar comercial Westar (Agriculture Canada) é a variedade padrão usada para a transformação, porém outras variedades também podem ser usadas. As sementes de canola são esterilizadas em superfície para semeadura in vitro. Os explantes de pecíolo cotiledonar com o cotilédone junto são cortados das mudas in vitro, e inoculados com Agrobacterium (contendo o vetor de expressão) ao imergir a extremidade cortada do explante de pecíolo na suspensão bacteriana. Os explantes são então cultivados durante 2 dias em meio MSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP, 3 % de sacarose, 0,7 % de Phytagar a 23 °C, 16 h sob a luz. Após dois dias de co-cultivação com Agrobacterium, os

162 explantes de pecíolo são transferidos para o meio MSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina, ou timentina (300 mg/l) durante 7 dias, e então cultivados em meio MSBAP-3 com cefotaxima, carbenicilina, ou timentina e o agente de seleção até a regeneração do ramo. Quando os ramos possuírem 5 a 10 mm de comprimento, esses são cortados e transferidos para o meio de alongamento de ramo (MSBAP-0,5, contendo 0,5 mg/l de BAP). Os ramos de cerca de 2 cm de comprimento são transferidos para o meio de enraizamento (MSO) para a indução do enraizamento. Os ramos enraizados são transplantados para o solo na estufa. As sementes T1 são produzidas a 10 partir de vegetais que exibem tolerância ao agente de seleção e que contém uma única cópia da inserção de T-DNA.

Transformação de alfafa

Um clone de regeneração de alfafa (Medicago sativa) é transformado com o uso do método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 15 119:839 a 847). A regeneração e a transformação de alfafa é dependente de genótipo e, portanto, uma planta de regeneração é exigida. Métodos para se obter plantas de plantas de regeneração foram descritos. Por exemplo, estes

podem ser selecionados dentre o cultivar Rangelander (Agriculture Canada) ou qualquer outra variedade de alfafa comercial, conforme descrito por Brown

DCW e A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4:111 a 112).

Alternativamente, a variedade de RA3 (Universidade de Wisconsin) foi selecionada para uso na cultura de tecido (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654 a 659). Explantes de Pecíolo são co-cultivados com uma cultura de um dia para outro de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999

Plant Physiol 119: 839 a 847) ou LBA4404 que contém o vetor de expressão.

Os explantes são co-cultivados por 3 dias no escuro em meio de indução SH que contém 288 mg/l de Pro, 53 mg/l de tioprolina, 4,35 g/l de K2S04 e 100 pm de acetosiringinona. Os explantes são lavados em meio de Murashige-Skoog

163 de meia força (Murashige e Skoog, 1962) e plaqueados no mesmo meio de indução SH sem acetosiringinona, mas com um agente de seleção adequada e antibiótico adequado para inibir o crescimento de Agrobacterium. Após diversas semanas, os embriões somáticos são transferidos para o meio de 5 desenvolvimento BOÍ2Y que não contém nenhum regulador de crescimento, nenhum antibiótico e 50 g/l de sacarose. Os embriões somáticos são subsequentemente germinados em meio de Murashige-Skoog demeia força.

Os brotos enraizados foram transplantados para potes e cultivados em uma estufa. As sementes T1 são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma única cópia do inserto de TDNA.

	Transformação de algodão
Algodão	é transformado com o uso de Agrobacterium

tumefaciens, de acordo com o método descrito no documento US 5.159.135.

As sementes de algodão são esterilizadas em superfície em 3% de hipoclorito de sódio durante 20 minutos e lavadas em água destilada com 500 g/ml de cefotaxima. As sementes são, então, transferidas para meio SH com 50 g/ml de

benomila para a germinação. Os hipocótilos de brotos de 4 a 6 dias são removidos, cortados em partes de 0,5 cm e são colocados em 0,8% de ágar.

Uma suspensão de Agrobacterium (aproximadamente 108 células por ml, diluídas a partir de uma cultura de um dia para o outro transformada com o gene de interesse e marcadores de seleção adequados), se usada para inoculação de explantes de hipocótilos. Após 3 dias à temperatura e iluminação ambientes, os tecidos são transferidos para um meio sólido (1,6 g/l de Gelrite) 25 com sais de Murashige e Skoog com vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell

Res. 50: 151 a 158 (1968)), 0,1 mg/l de 2,4-D, 0,1 mg/l de 6-furfurilaminopurina e 750 g/ml de MgCL2, e com 50 a 100 g/ml de cefotaxima e 400 a 500 g/ml de carbenicilina para exterminar bactéria residual. Linhagens celulares individuais

164

são isoladas após dois a três meses (com subculturas a cada quatro a seis semanas) e são adicionalmente cultivadas em meio seletivo para ampliação de tecido (30°C, 16 horas de fotoperíodo). Tecidos transformados são subsequente e adicionalmente cultivados em meio não seletivo durante 2 a 3 meses para permitir o crescimento de embriões somáticos. Embriões de aspecto saudável de pelo menos 4 mm de comprimento são transferidos aos tubos com meio SH em vermiculita fina, suplementado com 0,1 mg/l de ácido acético de índole, 6 furfurilaminopurina e ácido giberélico. Os embriões são cultivados a 30/C com um fotoperíodo de 16 horas, e plântulas no estágio de folha 2 a 3, são transferidos para potes com vermiculita e nutrientes. As plantas são enrijecidas e subsequentemente movidas para a estufa para cultivo posterior.

Transformação de beterraba sacarina

As sementes de beterraba sacarina (Beta vulgaris L.) são esterilizada em 70% de etanol durante um minuto seguido por 20 minutos e agitação em 20% de alvejante de Hipoclorito, por exemplo, alvejante comum Clorox® (comercialmente disponível junto à Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, USA). As sementes são lavadas com água estéril e secas ao ar seguido por semeação em meio de germinação (meio baseado em Murashige e Skoog (MS) (Murashige, T., and Skoog, ., 1962. Physiol. Plant, vol. 15, 473497) inclusive vitaminas B5 (Gamborg et al.; Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8.) suplementado com 10 g/l de sacarose e 0,8% de ágar). O tecido de hipocótilo é usado essencialmente para a iniciação de culturas de broto de acordo com Hussey e Hepher (Hussey, G., and Hepher, A., 1978. Annals of Botany, 42, 477-9) e são mantidas em meio baseado em MS suplementado com 30g/l de sacarose mais 0,25mg/l de benzilaminopurina e 0,75% de ágar, pH 5,8 a 2325°C com um fotoperíodo de 16 horas. A cepa de Agrobacterium tumefaciens que contém um plasmídeo binário dotado de um gene marcador selecionável,

165 por exemplo, nptlI, é usada em experimentos de transformação. Um dia antes da transformação, uma cultura de LB líquido que inclui antibióticos é desenvolvida em um agitador (28°C, 150rpm) até uma densidade óptica (O.D.) em 600 nm de -0,6 ser atingida. As culturas bacterianas desenvolvidas 5 durante a noite são centrifugadas e ressuspensas em meio de inoculação baseado em MS (O.D. -1) inclusive Acetosiringona, pH 5,5. O tecido da base de broto é cortado em pedaços (1,0 cm x 1,0 cm x 2,0 mm aproximadamente).

O tecido é imerso durante 30s em meio de inoculação bacteriano líquido. O excesso de líquido é removido por papel filtro. O co-cultivo ocorreu durante

24-72 horas em meio baseado em MS incl. 30g/l de sacarose seguido por um período não seletivo que inclui meio baseado em MS, 30g/l de sacarose com mg/l de BAP para induzir o desenvolvimento de broto e cefotaxime para eliminar Agrobacterium. Após 3 a 10 dias, os são transferidos para o meio seletivo similar, por exemplo, contendo canamicina ou G418 (50-100 mg/l 15 genótipo dependente). Os tecidos são transferidos para meio fresco a cada 2 a 3 semanas para manter a pressão de seleção. A iniciação muito rápida de brotos (após 3 a 4 dias) indica a regeneração de meristemas existentes em

vez de organogênese de meristemas transgênicos recentemente desenvolvidos. Pequenos brotos são transferidos após várias séries de subcultura para o meio de indução de raiz contendo 5 mg/l de NAA e canamicina ou G418. Etapas adicionais são realizadas para reduzir o potencial de gerar plantas transformas que são quiméricas (parciaimente transgênicas). Amostras de tecido de brotos regenerados são usadas para análise de DNA. Outros métodos de transformação de beterraba sacarina são 25 conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles por Linsey & Gallois (Linsey, K., and Gallois, P., 1990. Journal of Experimental Botany; vol. 41, No. 226; 52936) ou os métodos publicados no pedido internacional publicado como

WO9623891A.

166

Transformação de cana-de-açúcar

As hastes são isoladas de plantas de cana-de-açúcar de 6 meses de idade desenvolvidas em campo (Arencibia et al., 1998. Transgenic Research, vol. 7, 213-22; Enriquez-Obregon et al., 1998. Planta, vol. 206, 205 27). O material é esterilizado por imersão em 20% de alvejante de Hipoclorito, por exemplo, alvejante comum Clorox® (comercialmente disponível junto à Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, USA) durante 20 minutos. Seções

transversais de cerca de 0,5cm são colocadas no meio na direção ascedente.

O material vegetal é cultivado durante 4 semanas em meio baseado em MS (Murashige, T., and Skoog, ., 1962. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497) incl.

vitaminas B5 (Gamborg, O., et al., 1968. Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8) suplementado com 20g/l de sacarose, 500 mg/l de hidrolisado de caseína,

0,8% de ágar e 5mg/l de 2,4-D a 23°C no escuro. As culturas são transferidas após 4 semanas em meio fresco idêntico. A cepa de Agrobacterium tumefaciens que contém um plasmídeo binário dotado de um gene marcador selecionável, por exemplo, hpt, é usada em experimentos de transformação.

Um dia antes da transformação, uma cultura de LB líquido que inclui

antibióticos é desenvolvida em um agitador (28°C, 150rpm) até uma densidade óptica (O.D.) em 600 nm de ~0,6 ser atingida. As culturas bacterianas desenvolvidas durante a noite são centrifugadas e ressuspensas em meio de inoculação baseado em MS (O.D. —0,4) inclusive acetosiringona, pH 5,5. As partes do calo embriogênico de cana-de-açúcar (2-4 mm) são isoladas com base nas características morfológicas como estrutura compacta e cor amarela e secas durante 20 minutos na capela de fluxo seguido por imersão em um meio de inoculação bacteriana líquido durante 10-20 minutos. O excesso de líquido é removido por papel filtro. O co-cultivo ocorreu durante 3 a 5 dias no escuro em papel filtro que é colocado na parte superior do meio baseado em MS incl. vitaminas B5 contendo 1 mg/l de 2,4-D. Após o co-cultivo, os calos são

167 lavados com água estéril seguido por um período de cultivo não seletivo em meio similar contendo 500 mg/l de cefotaxime para eliminar as células de Agrobacteríum restantes. Após 3 a 10 dias, os explantes são transferidos para o meio seletivo baseado em MS incl. vitaminas B5 contendo 1 mg/l 2,4-D 5 durante mais 3 semanas com 25 mg/l de higromicina (genótipo dependente).

Todos os tratamentos são realizados a 23°C no escuro. Os calos resistentes são ainda cultivados em meio desprovido de 2,4-D inclusive 1 mg/l de BA e 25 mg/l de higromicina durante um fotoperíodo de 16 h sob luz resultando no desenvolvimento de estruturas de brotos. Os brotos são isolados e cultivados em meio de enraizamento seletivo (baseado em MS que inclui 20g/l de sacarose, 20 mg/l de higromiciana e 500 mg/l de cefotaxime). As amostras de tecido dos brotos regenerados são usadas para análise de DNA. Outros métodos de transformação de cana-de-açúcar são conhecidos na técnica, por exemplo, do pedido internacional publicado como WO2010/151634A e a 15 patente europeia concedida EP1831378.

Para transformação por bombardeio de partículas, a indução de calo e a transformação de cana-de-açúcar pode ser realizada pelo método de

Snyman et al. (Snyman et al., 1996, S. Afr. J. Bot 62, 151-154). A construção pode ser co-transformada com o vetor pEmuKN, que expressa o gene nptll (Beck et al. Gene 19, 1982, 327-336; Gen-Bank Accession No. V00618) sob o controle do promotor pEmu (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81, 581588). As plantas são regeneradas pelo método de Snyman et al. 2001 (Acta

Horticulturae 560, (2001), 105-108).

Exemplo 5: Procedimento de avaliação fenotípica

Plantas de arroz

5.1 Configuração de avaliação a 90 transformantes de arroz T0 independentes foram gerados.

Os transformantes primários foram transferidos de uma câmara de cultura de

168 tecido para uma estufa para o cultivo e colheita de semente T1. Nove eventos, dos quais a progênie T1 foi segregada 3: 1 para presença/ausência do transgene foram retidos. Para cada um desses eventos, aproximadamente seis mudas T1 contendo o transgene (hetero e homozigotos) e aproximadamente 5 seis mudas T1 que não contêm o transgene (nulizigotos) foram selecionadas através do monitoramento de expressão de marcador visual. As plantas transgênicas e os nulizigotos correspondentes foram cultivados lado a lado em

posições aleatórias. As condições de estufa são de dias curtos (12 horas de luz), 28°C na luz e 22°C no escuro, e uma umidade relativa de 70%. As plantas cultivadas sob condiçoes de não estresse foram regadas em intervalos regulares para garantir que a água e nutrientes não sejam limitadores e para satisfazer as necessidades de planta para completar o crescimento e desenvolvimento, a não ser que essas sejam usadas em uma triagem de estresse.

A partir do estágio de semeação até o estágio de maturidade, as plantas passaram várias vezes por um gabinete de formação de imagens digitais. Em cada ponto de tempo, as imagens digitais (2048x1536 pixels, 16 milhões de cores) foram obtidas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes.

Os eventos T1 podem ser adicionalmente avaliados na geração de T2 após o mesmo procedimento de avaliação que a geração de T1, por exemplo, com menos eventos e/ou com mais indivíduos por evento.

Triagem de seca

Triagem de seca precoce

As plantas T1 ou T2 foram germinadas sob condições normais e transferidas para vasos como normalmente. Após colocar as plantas nos seus vasos essas foram então transferidas para uma seção seca onde a irrigação é impedida. Sondas de umidade de solo foram inseridas em potes escolhidos

169 aleatoriamente para monitorar o teor de água do solo (SWC). Quando o SWC cai abaixo de determinados limites, as plantas são automaticamente re-regadas de modo contínuo até que um nível normal seja novamente atingido. As plantas foram, então, retransferidas novamente para condições normais. O ciclo de 5 seca foi repetido duas vezes durante o estágio vegetativo com o segundo ciclo começando após a re-rega e após o primeiro ciclo de seca terminar. As plantas foram representadas antes e após cada ciclo de seca. O resto do cultivo

(maturação de planta, colheita de semente) é o mesmo que para plantas nao cultivadas sob condições de estresse abiótico. Os parâmetros de crescimento e rendimento são registrados como detalhados para o crescimento sob condições normais.

Triagem de seca reprodutiva

As plantas T1 ou T2 foram desenvolvidas em vasos sob condições normais até essas se aproximarem do espigamento. Essas foram 15 então transferidas para uma seção seca onde a irrigação foi privada. Sondas de umidade de solo foram inseridas em vasos aleatoriamente selecionados para monitorar o teor de água do solo (SWC). Quando o SWC estiver abaixo de

determinados limites, as plantas são automaticamente regadas de novo de forma contínua até um nível normal ser atingido novamente. As plantas foram então transferidas novamente para condições normais. O restante do cultivo (maturação de planta, colheita de semente) é igual para plantas não desenvolvidas sob condições de estresse abiótico. Os parâmetros de crescimento e rendimento foram registrados como detalhado para crescimento sob condições normais,

Triagem de eficiência de uso de nitrogênio

As plantas T1 ou T2 são cultivadas em vasos sob condições normais exceto pela solução de nutriente. Os potes foram regados a partir do transplante até a maturação com uma solução de nutrientes especifica que

170 contém teor de nitrogênio N reduzido (N), normalmente entre 7 a 8 vezes menor. O resto do cultivo (maturação de planta, colheita de semente) é o mesmo que para plantas não cultivadas sob condições de estresse abiótico. Os parâmetros de crescimento e rendimento são registrados como detalhados 5 para o crescimento sob condições normais.

Triagem de estresse salino

As plantas T1 ou T2 são cultivadas em um substrato feito de fibras de coco e partículas argila assada argex (razão 3 para 1). Uma solução de nutriente normal é usada durante as primeiras duas semanas após o transplante das plântulas para a estufa. Após as primeiras duas semanas, 25 mM de sal (NaCI) são acrescentados à solução de nutriente, até que as plantas sejam colhidas. Os parâmetros de crescimento e rendimento são registrados como detalhado para crescimento sob condições normais.

Cana-de-açúcar

5.2.1 As plantas transgênicas de cana-de-açúcar geradas como descrito no Exemplo 4 que expressam o gene de flavodoxina fundido com um peptídeo de trânsito são desenvolvidas durante 10 a 15 meses, na estufa ou no campo. Condições padrão de crescimento das plantas são usadas.

5.2.2 Método de extração de açúcar

A extração de açúcares é realizada utilizando métodos padrão, por exemplo, como descrito aqui acima.

5.2.3 Peso fresco e biomassa

O peso fresco e biomassa de verdor são medidos utilizando um método padrão, por exemplo, como descrito aqui acima.

5.2.4 Determinação de açúcar (glicose, frutose e sacarose)

Os teores de glicose, frutose e sacarose no extrato obtido de acordo com o método de extração de açúcar descrito acima são determinados por um dos métodos padrão, por exemplo, como descrito aqui acima.

171

5.3 Análise estatística de dados experimentais de planta de arroz:

teste F

Um ANOVA de dois fatores (análise de variantes) foi usado como um modelo estatístico para a avaliação geral de características de fenotípicas de planta. Um teste F foi realizado em todos os parâmetros medidos de todas as plantas de todos os eventos transformados com o gene da presente invenção. O teste F foi realizado para verificar um efeito do gene em todos os

eventos de transformação e para verificar um efeito geral do gene, também conhecido como efeito de gene global. O limite para significância para um efeito de global verdadeiro é configurado a um nível de probabilidade de 5% para o teste F. Um valor do teste F significante indica um efeito de gene, o que significa que não é apenas a mera presença ou posição do gene que causa as diferenças no fenótipo.

5.4 Parâmetros medidos em arroz

A partir do estágio de semeadura até o estágio de maturidade, as plantas passaram diversas vezes através de um gabinete de formação de imagem digital. Em cada ponto no tempo, imagens digitais (2048x1536 pixels, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta a partir de pelo menos 6 ângulos diferentes como descrito em WO2010/031780. Essas medidas foram usadas para determinar parâmetros diferentes.

Medida de parâmetro relacionado à biomassa

A área de planta sobre o solo (ou biomassa folhosa) foi determinada pela contagem do número total de pixels nas imagens digitais de partes de plantas acima do solo discriminadas do fundo. Esse valor foi ponderado para as imagens obtidas no mesmo ponto de tempo a partir dos ângulos diferentes e foi convertido em um valor de superfície física expresso em mm quadrado por calibração. Os experimentos mostram que a área de planta acima do solo medida dessa forma correlaciona à biomassa de partes

172 de planta acima do solo. A área acima do solo é a área medida no ponto no tempo no qual a planta alcançou sua biomassa folhosa máxima (AreaMax).

O aumento na biomassa de raiz é expresso como um aumento na biomassa de raiz total (medida como a biomassa máxima de raízes observadas 5 durante a expectativa de vida de uma planta); ou como um aumento no índice de raiz/broto medido como a razão entre massa de raiz e massa de broto no

período de crescimento ativo de raiz e broto no período de crescimento ativo de raiz e broto. Em outras palavras, o índice de raiz/broto é definido como a razão da rapidez de crescimento de raiz para a rapidez de crescimento de broto no período de crescimento ativo de raiz e broto. A biomassa de raiz pode ser determinada utilizando um método como descrito em WO 2006/029987.

A altura da planta foi medida. Uma forte indicação da altura da planta é a medida do local do centro de gravidade, ou seja, determinar a altura (in mm) do centro de gravidade da biomassa folhosa. Isso evita a influência por uma única folha ereta, com base na assíntota de ajuste de curva ou, se o ajuste não for satisfatório, com base na máxima absoluta.

Parâmetros relacionados ao tempo de desenvolvimento

Vigor de emergência (“EmVg”) é uma indicação de crescimento precoce da planta. Esse é a biomassa aérea da planta uma semana após o reenvasamento das mudas estabelecidas de suas bandejas de germinação para seus potes finais. A área dessa (em mm²) coberta por biomassa folhosa na formação de imagens. Essa foi determinada pela contagem do número total de pixels de partes aéreas de planta acima do solo discriminadas do fundo. Esse valor foi ponderado para as imagens obtidas no mesmo ponto de tempo a partir dos ângulos diferentes e é convertido em um valor de superfície física expresso em mm quadrado por calibração.

O “tempo de florescimento” da planta pode ser determinado utilizando o método como descrito em WO 2007/093444.

173

O parâmetro “primeira panícula” fornece o número total de panículas na primeira brotação.

O parâmetro “flores por panícula” é um parâmetro calculado que estima o número médio de flósculos por panícula em uma planta. Esse é calculado pelo número total de sementes dividido pelo primeiro valor de parâmetro de panícula.

O verdor antes do florescimento é uma indicação do verdor de uma planta antes do florescimento. Esse é a proporção (expressa como %) de pixels verdes e verdes-escuros na última imagem antes do florescimento.

Medidas de parâmetro relacionadas à semente

As panículas primárias maduras foram colhidas, contadas, ensacadas, marcadas com código de barras e, então, secas por três dias em um forno a 37°C. As panículas foram, então, debulhadas e todas as sementes foram coletadas e contadas. As sementes são geralmente cobertas por uma cobertura externa seca, a casca. As cascas preenchidas (também denominados aqui como flósculos preenchidos) foram separadas das vazias com o uso de um dispositivo de sopro de ar. As cascas vazias foram

descartadas e a fração remanescente foi novamente contada. As cascas preenchidas foram pesadas em uma balança analítica. O número de sementes preenchidas foi determinado pela contagem do número de cascas preenchidas que permanecem após a etapa de separação.

O peso de semente total foi medido ao pesar todas as cascas preenchidas colhidas de uma planta.

O número total de sementes (ou flósculos) por planta foi determinado ao contar o número de cascas (sejam preenchidas ou não) colhidas de uma planta,

O Peso de Mil Grãos (TKW) extrapolou o número de sementes contadas e seu peso total.

174

O índice de Colheita (Hl) na presente invenção é definido como a razão entre o peso total de semente e a área aérea (mm²), multiplicado por um fator 106.

O número de flores por panícula como definido na presente invenção é a razão entre o número total de sementes sobre o número de panículas primárias maduras.

A “taxa de preenchimento de semente” ou “Taxa de preenchimento” é a proporção (expressa como uma %) do número de sementes preenchidas (ou seja, flósculos contendo sementes) sobre o número 10 total de sementes (ou seja, o número total de flósculos). Em outras palavras, a taxa de preenchimento de semente é a porcentagem de flósculos que estão preenchidos com semente.

Exemplo 6: Resultados da avaliação fenotípica das plantas transgênicas

6.1 Plantas de arroz

Experimento 1: Três genes de flavodoxina testados sob condições padrão E CONDIÇÕES DE SECA REPRODUTIVA

Utilizando-se o promotor GOS2 da SEQ ID NO: 7 e o ácido

nucleico da SEQ ID NO: 3 que codifica o peptídeo de trânsito FNR de ervilha, três sequências de ácido nucleico de flavodoxina (SEQ IDNO: 1, 13 e 15) expressas nas plantas transgênicas de arroz geradas como descrito aqui foram testadas sob condições padrão e de seca (veja o exemplo 5). As três sequências de ácido nucleico são

- Nostoc sp. Sequência de flavodoxina de ocorrência natural de PCC 7119 anabaena sp (SEQ ID NO: 1),

- Synechocystis sp. Flavodoxina de ocorrência natural PCC 6803 (SEQ ID NO: 15), e

- Uma flavodoxina otimizada de Nostoc anabaena para uso de códon de planta (SEQ ID NO: 13).

175

Tabela Ia: Resultados de três flavodoxinas sob condições padrão

Fonte de gene	TWS	Taxa de preenchimento	TTF
Nostoc sp. PCC 7119 anabaena sp	1,6	2,9	2,9
Synechocystis sp. PCC 6803	10,0	4,2	2,9
Nostoc anabaena otimizada por códon	8,1	3,1	1,6
Média	6,5	3,4	2,5

Tabela Bi: Resultados de três flavodoxinas sob condições de seca

REPRODUTIVA

Fonte de gene	TWS	Taxa de preenchimento	TTF
Nostoc sp, PCC 7119 anabaena sp	20,2	20,3	1,9
Synechocystis sp, PCC 6803	37,0	42,2	3,9
Nostoc anabaena otimizada por códon	0,9	9,7	-2,4
Média	19,4	24,1	1,1

TWS Peso total de semente; TTF Tempo de florescimento

Experimento 2: Flavodoxina de Nostoc anabaena sob condições de seca REPRODUTIVA

As plantas de arroz que contêm a construção compreendendo o ácido nucleico da flavodoxina de Nostoc anabaena (SEQ ID NO: 1) ligado ao promotor GOS2 da SEQ ID NO: 7 e o ácido nucleico da SEQ ID NO: 3 que 0 codifica um peptídeo de trânsito foram testadas novamente sob condições de seca reprodutiva e parâmetros adicionais foram medidos.

Tabela II: Resultados de flavodoxina de Nostoc anabaena sob condições

DE SECA REPRODUTIVA

Fonte de gene	TWS	Taxa de preenchimento	TTF	Arm.	Hl	EmVg
N. anabaena	19.47	14.58	-0.18	2.34	20.39	10.05

TWS Peso total de semente; TTF Tempo de florescimento;

Arm. AreaMax; Hl índice de colheita; EmVg Vigor de emergência.

Experimento 3: Flavodoxina de Nostoc anabaena sob condições padrão, de

SECA PRECOCE E BAIXO TEOR DE NITROGÊNIO

As plantas de arroz que contêm a construção compreendendo o

176 ácido nucleico da flavodoxina de Nostoc anabaena (SEQ ID NO: 1) ligado ao promotor GOS2 da SEQ ID NO: 7 e o ácido nucleico da SEQ ID NO: 3 que codifica um peptídeo de trânsito foram testadas novamente sob condições padrão, condições de seca precoce e condições de baixo teor de nitrogênio. Os 5 parâmetros adicionais foram medidos.

Tabela III: Parâmetros de rendimento de semente e rendimento de biomassa

SOB TRÊS CONDIÇÕES

a)condições padrão

Fonte de gene	TWS	Taxa de preenchimento	TTF	Arm.	Hl	EmVg
N,anabaena	18,02	11,66	-0,07	4,05	13,26	3,54

b) seca precoce

Fonte de gene	TWS	Taxa de preenchimento	TTF	Arm.	Hl	EmVg
N,anabaena	16,90	14,58	0,37	-0,46	20,32	-10,04
c) Baixo teor de nitroc	lênio
Fonte de gene	TWS	Taxa de preenchimento	TTF	Arm.	Hl	EmVg
N,anabaena	5,07	2,22	-2,01	8,10	-0,68	10,75

TWS Peso total de semente; TTF Tempo de florescimento;

Arm. AreaMax; Hl índice de colheita; EmVg Vigor de emergência

Em todos os experimentos, plantas de controle que não contêm a construção para superexpressão da flavodoxina foram usadas.

6.1.2 Sumário de resultados de múltiplos experimentos

Peso total da semente:

A Tabela 4 resume o peso de semente de plantas de arroz que expressam a flavodoxina de ocorrência natural de Nostoc anabaena sob o controle do promotor GOS2 nas diferentes condições testadas.

Tabela IV: Sumário de peso de semente de múltiplos experimentos

	Seca reprodutível	Padrão	Seca precoce	Baixo teor de N
Fonte de gene	Ano 1	Ano 2	Ano 1	Ano 3	Ano 3	Ano 3	Média
N, anabaena	20,20	19,50	1,60	18,00	16,90	5,10	13,50

177

O peso total de semente e a taxa de preenchimento das plantas de arroz foram aumentados em todos os experimentos.

Sob condições de estresse ambiental como seca durante o estágio reprodutivo ou limitação de nitrogênio e sob condições sem estresse, 5 a biomassa aérea das plantas foi aumentada como indicado pelo valor

AreaMax das plantas.

Sumário de outros parâmetros medidos, porém não mostrados

nas tabelas acima:

O número total de semente e o primeiro valor de panícula foram aumentados sob condições padrão e a uma extensão menor sob condições de seca. As flores por panícula, razão de raiz para broto, verdor antes do florescimento, biomassa de raiz e peso de mil grãos pareceram amplamente não afetados sob todas as condições.

6.1.3 Sumário

As construções de GOS2-peptídeo de trânsito-flavodoxina expressas nas plantas transgênicas de arroz sob condições diferentes resultaram em parâmetros aumentados de rendimento de semente bem como | de biomassa aérea.

Em todas as condições experimentais, o peso total de semente 20 de plantas de arroz que expressa a fíavodoxina de ocorrência natural de

Nostoc anabaena sob o controle do promotor GOS2 e ligada a um peptídeo de trânsito como descrito aqui foi aumentado em 13,5 % comparado com aquele de plantas de controle que não contêm essa construção. O peso total de semente e a taxa de preenchimento das plantas transgênicas de arroz 25 foram aumentados comparado com as plantas de controle sob todas as condições testadas. A área máxima da biomassa aérea como uma indicação rendimento de biomassa foi aumentada sob a maioria das condições testadas.

178

Tabela 2 Exemplos de ácidos nucleicos de flavodoxina como citado em WO

03/035881 na página 35-38

No. de Acesso			Gene	Espécie
NP 358768	9'	15903218	Flavodoxinaa	Streptococcus pneumoniae R6
NP 345761	9'	15901157	Flavodoxina	Streptococcus pneumoniae TIGR4
NP 311794	9'	15833021	Flavodoxina 2	Escherichia coli Ο157Ή7]
NP 311593	9'	15832820	putative Flavodoxina	Escherichia coli Ο157Ή7
NP 308742	gí	15829969	Flavodoxina 1	Escherichia coli Ο157Ή7
CAC92877	9'	15980620	Flavodoxina 1	Yersinia pestis
CAC89737	gí	15978964	Flavodoxina 2	Yersinia pestis
NP 350007	9'	15896658	Flavodoxina	Clostridium acetobutylicum
NP 349066	gí	15895717	Flavodoxina	Clostridium acetobutylicum
NP 347225	gí	15893876	Flavodoxina	Clostridium acetobutylicum
NP 346845	9'	15893496	Flavodoxina	Clostridium acetobutylicum
NP_348645	gi	15895296	Predicted Flavodoxina	Clostridium acetobutylicum
NP 347225	gí	15893876	Flavodoxina	Clostridium acetobutylicum
NP 346845	gi	15893496	Flavodoxina	Clostridium acetobutylicum
NP 282528	gi	15792705	Flavodoxina	Campylobacter jejuni
AAK28628	gi	13507531	Flavodoxina	Aeromonas hydrophila
NP 268951	gí	15674777	putative Flavodoxina	Streptococcus pyogenes
NP 266764	9'	15672590	Flavodoxina	Lactococcus lactis subsp.lactis
NP 207952	9'	15645775	Flavodoxina (fldA)	Helicobacter pylori
NP 232050	gi	15642417	Flavodoxina 2	Vibrio cholera
NP 231731	gi	15642099	Flavodoxina 1	Vibrio cholera
NP 219360	gí	15639910	Flavodoxina	Treponema pallidum

179

No. de Acesso		Gene	Espécie
NP 24012	gi	15616909	Flavodoxina 1	Buchner sp. APS
NP 214435	gi	15607053	Flavodoxina	Aquifex aerolicus
FXAVEP	9'	625194	Flavodoxina	Azotobacter vinelandii
S38632	gi	481443	Flavodoxina	-Synechocystis sp. (strain PCC 6803)
FXDV	9'	476442	Flavodoxina	Desulfovibrio vulgaris
A34640	9'	97369	Flavodoxina	Desulfovibrio salexigens
S24311	gi	97368	Flavodoxina	Desulfovibrio gigas (ATCC 19364)
A37319	gi	95841	Flavodoxina A	Escherichia coli
S06648	gi	81145	Flavodoxina	red alga (Chondrus crispus)
S04600	gi	79771	Flavodoxina	Anabaena variabilis
A28670	gi	79632	Flavodoxina	Synechococcus sp
S02511	gi	78953	Flavodoxina	Klebsiella pneumonia
FXDVD	gi	65884	Flavodoxina	Desulfovibrio desulfuricans (ATCC
				29577)
FXCLEX	g‘	65882	Flavodoxina	Clostridium sp
FXME	9'	65881	Flavodoxina	Megasphaera elsdenii
NP 071157	g'	11499913	Flavodoxina, putative	Archaeoglobus fulgidus
BAA17947	gi	1653030	Flavodoxina	Sybechocystis sp. PCC 6803
BAB61723	g'	14587807	Flavodoxina 2	Vibrio fischeri
BAB61721	9'	14587804	Flavodoxina 1	Vibrio fischeri
AAK66769	9'	14538018	Flavodoxina	Histophilus ovis
P57385	9'	11132294	FLAVODOXINA
AAC7593	gi	1789262	Flavodoxina 2	Escherichia coli K12
AAC73778	gi	1786900	Flavodoxina 1	Escherichia coli K12
AAC75752	gi	1789064	putative Flavodoxina	Escherichia coli K12

180

No. de Acesso		Gene	Espécie
F69821	gi	7429905	Flavodoxina homolog	Bacillus subtilis
			yhcB
QQKBFP	gi	2144338	Pyruvate (Flavodoxina)	Klebsiella pneomoniae
			dehydrogenase nifJ
S16929	9'	95027	Flavodoxina A	Azotobacter chroococcum
F71263	gi	74309914	probable Flavodoxina	Syphilis spirochete
A64665	gi	7430911	Flavodoxina	Helicobacter pylori (strain 26695
JE0109	gi	7430907	Flavodoxina	Desulfovibrio vulgaris
S42570	gi	628879	Flavodoxina	Desulfovibrio desulfuricans (ATCC
				27774)
BAB13365	9'	10047146	Flavodoxina	Alteromonas sp. 0-7
AAF34250	9'	6978032	Flavodoxina	Desulfovibrio gigas
CAB73809	gi	6968816	Flavodoxina	Campylobacter jejuni
D69541	gí	7483302	Flavodoxina homolog	Archaeoglobus
F70479	gi	7445354	Flavodoxina	Aquifex aeolicus
S55234	gi	1084290	Flavodoxina isoform I	Chlorella fusca
S18374	gi	2117434	Flavodoxina	Anabaena sp. (PCC 7119)
S55235	gi	1084291	Flavodoxina isoform II	Chlorella fusca
C64053	9'	1074088	Flavodoxina A	Haemophilus influenza (strain Rd
				KW20)
A61338	gi	625362	Flavodoxina	Clostridium pasteurianum
A39414	gi	95560	Flavodoxina	Enterobacter agglomerans plasmid
				EÍA3
AAD08207	gi	2314319	Flavodoxina (fldA)	Helicobacter pylori 26695
CAB37851	gi	4467982	Flavodoxina	Rhodobacter capsulatus
AAC65882	9'	3323245	Flavodoxina	Treponema pallidum
AAB8890	gi	2648181	Flavodoxina, putative	Archaeflobus fulgidus
AAB65080	gi	2289914	Flavodoxina	Klebsiella pnemoniae
AABV53659	gi	710356	Flavodoxina	Methanothermobacter

181

No. de Acesso		Gene	Espécie
				thermautotrophicus
AAB51076	9'	1914879	Flavodoxina	Klebsiella pneumoniae
AAB36613	9'	398014	Flavodoxina	Azotobacter chroococcum
AAB20462	gi	239748	Flavodoxina	Anabaena
AAA64735	9'	142370	Flavodoxina (nifF)	Azotobacter vinelandii
BAA35341	9'	1651296	Flavodoxina	Escherichia coli
BAA35333	9'	1651291	Flavodoxina	Escherichia coli
AAA27288	9'	415254	Flavodoxina	Synechocystis sp.
AAA27318	9<	154528	Flavodoxina	Synechococcus sp.
AAC45773	gi	1916334	putative Flavodoxina	Salmonella typhimurium
AAC07825	gi	2984302	Flavodoxina	Aquifex aeolicus
AAC02683	gí	2865512	Flavodoxina	Trichodesmium erythraeum

Tabela 3

Exemplos de peptídeos de trânsito de cloroplasto como citado em

WO 03/035881 na página 39-45

No. de acesso		Gene	Espécie
P32260	gi	12644209	CISTEÍNA SINTASE,	Spinacia oleracea
			PRECURSOR DE CLOROPLASTO
AAG59996	gi	12658639	ferredoxina: precursor sulfito redutase	Glycine max
S10200	gi	100078	Precursor carbonato desidratase	Pisum sativum
CAB89287	gi	7672161	Proteína tipo FtsZ cloroplasto	Nicotiana tabacum
P17067	gi	115471	ANIDRASE CARBÔNICA,	Pisum sativum
			PRECURSOR CLOROPLASTO

182

No. de acesso		Gene	Espécie
			(CARBONATO DESIDRATASE)
AAD22109	gi	4530595	heme oxigenase 2	Arabidopsis thaliana
AAD22108	gi	4530593	heme oxigenase 1	Arabidopsis thaliana
AAC50035	gi	450235	APS quinase	Arabidopsis thaliana
AAC12846	gi	1051180	fitoeno desaturase	Zea mays
AAB87573	gi	2645999	Proteína de ligação de clorofila a/b de precursor	Panax ginseng
			LHCII tipo I
CAA47329	gi	312944	Cisteína sinta se	Spinacia oleracea
CAA31137	gi	41201	O-acetilserina sulfidrilase	Escherichia coli
AAA82068	gi	1079732	cpFtsZ	Arabidopsis thaliana
T06368	gí	7489040	Fotossistema II precursor de proteína 1 de complex que envolve oxigênio	Lycopersicon
				esculentum
S71750	gi	7488813	Precursor de proteína 100K associada ao intermediário de importação	Pisum sativum
S71749	gi	7459239	Precursor de proteína DCL,	Lycopersicon
			cloroplasto	esculentum
15825883	gi	15825883	Cadeia B, Estrutura de Treonina	Arabidopsis thaliana
			Sintase
1585882	gi	15825882	CaidenaA, Estrutura de	Arabidopsis thaliana
			Tereonina Sintase
T09543	gi	7488970	deoxixilulose sintase	Capsicum annuum

183

No. de acesso		Gene	Espécie
			precursor TKT2
JC876	gi	7447856	Precursor de proteína induzível por luz precoce	Glycine max
P24493	gi	1170215	PRECUSOR DE ÁCIDO DELTA- AMINOLEVULÍNICO	Spinacia oleracea
			DESIDRATASE
S47966	gi	1076532	Provável precursor de proteína de transferência de lipídeo	Pisum sativum
			M30
A44121	gi	322404	precursor de proteína S1 ribossômico	Spinacia oleracea
S01056	gi	81896	precursor de proteína induzido por luz precoce	Pisum sativum
022773	gi	7388292	LÚMEN DE TILACOIDE 16.5	Arabidopsis thaliana
			PROTEÍNA KDA,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P80470	g>	6093830	PRECURSOR DE PROTEÍNAS PSBY DE COMPLEXO DE NÚCLEO DE FOTOSSISTEMA II	Spinacia oleracea
P55195	gi	1709930	FOSFORIBOSILAMINOIMIDA	Vigna aconitifolia
			AZOL CARBOXILASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P11970	gi	1709654	PLASTOCIANINA B,	Populus nigra
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P00299	gi	1709651	PLASTOCIANIN A,	Populus nigra
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P80484	gi	1709608	PRECURSOR DE PROTEÍNA 1 PERIDININA-CLOROFILA	Amphidinium carterae

184

No. de acesso		Gene	Espécie
P08823	gi	134102	PRECURSOR DE PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE SUBUNIDADE RUBISCO -	Triticum aestivum
			SUBUNIDADE ALFA
P04045	gí	130173	PRECURSOR ALFA-1,4 GLUCANO	Solanum tuberosum
			FOSFORILASE, L-1
			ISOZIMA, CLOROPLASTO
S30897	gi	7427677	precursor 3-isopropilmalato	Solanum tuberosum
			desidrogenase
TXSPM	gi	7427615	precursor tioredoxina m	Spinacia oleracea
FEKM	gi	7427604	precursor ferredoxina [2Fe-2S]	Chlamydomonas
				reinhardtii
CCKM6R	gi	2144284	precursor citocromo c6	Chlamydomonas
				reinhardtii
S30145	gí	419757	precursor cetol-ácido reductoisomerase	Arabidopsis thaliana
DEMZMC	gi	319840	precursor malato desidrogenase (NADP+)	Zea mays
S20510	gi	81676	precursor 3-isopropilmalato	Brassica napus
			desidrogenase
S17180	gi	81509	Precursor cetol-ácido reductoisomerase	Spinacia oleracea
Q9SEL7	gi	15214049	PROTEASE HHOA,	Arabidopsis thaliana
			PRECURSOR CLOROPLASTO
023403	gi	13959580	LÚMEN DE TILACOIDE 21.5	Arabidopsis thaliana

185

No. de acesso		Gene	Espécie
			PROTEÍNA KDA,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P82281	gi	12644689	L-ASCORBATO	Arabidopsis thaliana
			PEROXIDASE PUTATIVA, PRECURSOR CLOROPLASTO
022609	gi	9910645	PROTEASETIPO DO,	Arabidopsis thaliana
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P48417	gi	1352186	ALENO ÓXIDO SINTASE,	Linum usitatissimum
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P49080	gi	1351905	ASPARTOQUINASE BUFUNCIONAL/	Zea mays
			HOMOSERINA DESIDROGENASE
			2, PRECURSOR CLOROPLASTO
P31853	gi	461595	ATP SINTASE CADEIA B’,	Spinacia oleracea
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P10933	gi	119905	PERREDOXINA - - NADP	Pisum sativum
			REDUCTASE, PRECURSOR DE ISOZIMA FOLIAR
P52422	gi	14917033	FOSFORIBOSILGLICINAMID A	Arabidopsis thaliana
			FORMILTRANSFERASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P49077	gi	14917032	ASPARTATO	Arabidopsis thaliana
			CARBAMOILTRANSFERASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
050039	gi	14917022	ORNITINA	Arabidopsis thaliana
			CARBAMOILTRANSFERASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P55229	gi	14916987	GLICOSE-1-FOSFATO	Arabidopsis thaliana

186

No. de acesso		Gene	Espécie
			ADENILTRANSFERASE
			SUBUNIDADE GRANDE 1,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
Q96291	gi	14916972	2-CYS PEROXIREDOXINA	Arabidopsis thaliana
			BAS1, PRECURSOR CLOROPLASTO
Q9ZT00	gi	14916690	RIBULOSE BISFOSFATO	Zea mays
			CARBOXILASE/OXIGENASE
			ACTIVASE,
			PERCURSOR CLOROPLASTO
Q9LZX6	gi	14547977	DIHIDRODIPICOLINATO	Arabidopsis thaliana
			SINTASE 1,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
064903	gi	12644076	NUCLEOSÍDEO DIFOSFATO	Arabidopsis thaliana
			QUINASE II,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
004130	gi	3122858	PRECUSOR D-3- FOSFOGLICERATO	Arabidopsis thaliana
			DESIDROGENASE
024364	gi	3121825	2-CYS PEROXIREDOXINA	Spinacia olercea
			BAS1, PRECURSOR CLOROPLASTO
P49107	gi	1709825	REAÇÃO DE FOTOSSISTEMA I	Arabidopsis thaliana
			PRECURSOR DE SUBUNIDADE CENTRAL N
P49132	gi	1352199	TRIOSE FOSFATO/ FOSFATO	Flaveria trinervia
			TRANSLOCADOR,
			PERCURSOR CLOROPLASTO
P37107	gi	586038	PROTEÍNA54 KDA DE	Arabidopsis thaliana

187

No. de acesso			Gene	Espécie
			PARTÍCULA DE RECONHECIMENTO DE SINAL
			PERCURSOR CLOROPLASTO
Q04836	gí	464662	31 KDA, RIBONUCLEOPROTEÍNA	Arabidopsis thaliana
			PERCURSOR CLOROPLASTO
Q01909	gi	461551	ATP SINTASE GAMA	Arabidopsis thaliana
			CADEIA 2, PERCURSOR CLOROPLASTO
P14671	gi	136251	PRECURSOR TRIPTOFANO SINTASE	Arabidopsis thaliana
			CADEIA BETA I
P07089	gi	132144	RIBULOSE BISFOSFATO	Flaveria trinervia
			PRECURSOR CARBOXILASE DE CADEIA PEQUENA
P22221	gi	130384	PIRUVATO, PRECURSOR FOSFATO	Flaveria trinervia
			DIQUINASE
P22178	gi	126736	ENZIMA MÁLICA NADP- DEPENDENTE	Flaveria trinervia
			1
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P26259	gi	118241	DIHIDRODIPICOLINATO	Zea mays
			SINTASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P23577	gi	118044	PRECURSOR APOCITOCROMO F	Chlamydomonas
				reinhardtii
Q42522	gi	14195661	PRECURSOR GLUTAMATO-1SEMIALDEÍDO	Arabidopsis thaliana
			2,1-AMlNOMUTASE 2

188

No. de acesso		Gene	Espécie
Q96242	gí	13878924	PRECURSOR ALENO OXIDO SINTASE	Arabidopsis thaliana
P46312	gí	13432148	ÁCIDO GRAXO ÔMEGA-6	Arabidopsis thaliana
			DESATURASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P34802	gi	13432144	GERANILGERANIL	Arabidopsis thaliana
			PIROFOSFATO
			SINTETASE.
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P50318	gi	12644295	FOSFOGLICERATO	Arabidopsis thaliana
			QUINASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P46309	gi	12644273	GLUTAMATO - - CISTEÍNA	Arabidopsis thaliana
			LIGASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P21276	gi	12644157	SUPERÓXIDO DISMUTASE	Arabidopsis thaliana
			[FE],
			PRECURSOR CLOROPLASTO
023787	gi	6094476	ENZIMA TIAZOL BIOSSINTÉTICA	Citrus sinensis
			1
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P93407	gí	3915008	SUPERÓXIDO DISMUTASE	Oryza sativa
			[CU-ZN],
			PRECURSOR CLOROPLASTO
Q96255	gi	3914996	FOSFOSERINA	Arabidopsis thaliana
			AMINOTRANSFERASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
024600	gi	3914826	POLIMERASE DE RNA DNADIRIGIDA	Arabidopsis thaliana
			1

189

No. de acesso		Gene	Espécie
			PRECURSOR CLOROPLASTO
042937	gi	3914665	50S RIBOSOMAL PROTEIN	Spinacia oleracea
			L4,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
42915	gi	3914608	RIBULOSE BISFOSFATO	Manihot esculenta
			PRECURSOR CARBOXILASE DE CADEIA PEQUENA
Q3919	gi	2500098	PROTEÍNA DE REPARO DE DNA	Arabidopsis thaliana
			RECA, PRECURSOR CLOROPLASTO
Q96529	gi	2500026	PRECURSOR ADENILOSUCCINATO	Arabidopsis thaliana
			SINTETASE
P55826	gi	2495184	PROTOPORPHYRINOGEN	Arabidopsis thaliana
			OXIDASE, CLOROPLASTO
			PRECURSOR
Q42496	gi	2493687	SUBUNIDADE DE COMPLEXO CITOCROMO B6-F	Chlamydomonas
			4 KDA.	reinhardtii
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P52424	gi	1709925	FOSFORIBOSILFORMILGLI	Viga unguiculata
			CINAMIDINA CICLO-LIGASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P49572	gi	1351303	INDOL-3-GLICEROL	Arabidopsis thaliana
			FOSFATO SINTASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P48496	gi	1351271	TRIOSEFOSFATO	Spinacia oleracea
			ISOMERASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P25269	gi	1174779	PRECURSOR TRIPTOFANO	Arabidopsis thaliana

190

No. de acesso		Gene	Espécie
			SINTASE
			CADEIA BETA 2
P46225	gi	1174745	TRIOSEFOSFATO	Secale cereale
			ISOMERASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P46283	gi	1173345	SEDOHEPTULOSE-1,7-	Arabidopsis thaliana
			BISFOSFATASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
P32069	gi	418134	PRECURSOR ANTRANILATO SINTASE	Arabidopsis thaliana
			COMPONENTE L2
P29450	gi	267120	TIOREDOXINA TIPO F,	Pisum sativum
			PRECURSOR CLOROPLASTO
Q9ZTN9	gi	13878459	PRECURSOR FITOENO DESIDROGENASE	Oryza sativa
Q9SHI1	gi	13627881	FATOR DE INICIAÇÃO DE TRADUÇÃO	Arabidopsis thaliana
			IF-2L,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
Q9LR75	gi	13431553	COPROPORFIRINOGÊNIO III	Arabidopsis thaliana
			OXIDASE,
			PRECURSOR CLOROPLASTO
Q9ZN7	gi	12643970	GLUTAMATO SINTASE 1 FERREDOXINA-DEPENDENTE	Arabidopsis thaliana
			PRECURSOR CLOROPLASTO
Q9SZ30	gi	12643854	PROTEÍNA DE BIOSSÍNTESE DE HISTIDINA BIFUNCIONAL	Arabidopsis thaliana
			HISHF, PRECURSOR CLOROPLASTO

191

No, de acesso		Gene	Espécie
Q9SJE1	gi	12643848	PRECURSOR CHLD DE SUBUNIDADE DE MAGNÉSIOQUELATASE	Arabidopsis thaliana
Q42624	gi	12643761	GLUTAMINA SINTETASE,	Brassica napus
			PRECURSOR CLOROPLASTO
Q38933	gi	12643749	LICOPENO BETA CICLASE,	Arabidopsis thaliana
			PRECURSOR CLOROPLASTO
Q42435	gi	12643508	CAPSANTINA/CAPSORUBIN	Capsicum annuum
			SINTASE. PRECURSOR CLOROPLASTO

Reivindicações

Claims (15)

Reivindicações

1 a 11, 15, 16, 22, ou 23, ou a planta transgênica, parte da planta transgênica,

1 a 9, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado são obtidos sob condições sem estresse.

1 a 7, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado compreendem biomassa aumentada em relação a plantas de controle, e 15 compreende, de preferência, biomassa aérea e/ou rendimento de semente aumentado relativo a plantas de controle.

1 a 7, que compreende (a) transformar de forma estável uma célula vegetal com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico exógeno que 5 codifica um peptídeo de trânsito e codifica um polipeptídeo flavodoxina, em que o ácido nucleico exógeno está em ligação funcional com uma sequência promotora que compreende a sequência de nucleotídeo do promotor GOS2, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou um fragmento funcional dessa, um ortólogo ou um parólogo dessa;

1 a 5, em que o polipeptídeo fíavodoxina pertence à Anabaena sp., de preferência, Anabaena PCC7119, ou Synechocystis sp., de preferência, Synechocystis sp. PCC 6803.

1 a 4, em que o polipeptídeo fíavodoxina é codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo de sequências de ácido nucleico relacionado na Tabela 2 ou homólogos dessas.

25

1. MÉTODO PARA ACENTUAR UM OU MAIS TRAÇOS

RELACIONADOS AO RENDIMENTO EM PLANTAS, relativo a uma planta de controle, que compreende aumentar a expressão em uma planta de um ácido 5 nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo fíavodoxina, em que a expressão está sob o controle de uma sequência promotora ligada de maneira operável ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo fíavodoxina e em que a sequência promotora compreende a sequência de nucleotídeo de um promotor GOS2, de 10 preferência, um promotor GOS2 de promotor de arroz; ou fragmentos funcionais ou derivados desses.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de nucleotídeo do promotor GOS2 compreende pelo menos 70% da sequência representada por SEQ ID NO: 7.

15

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o peptídeo de trânsito marca o polipeptídeo fíavodoxina em um plastídeo, de preferência, em um cloroplasto.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, em que o peptídeo de trânsito de cloroplasto é selecionado a partir dos peptídeos de

20 trânsito relacionados na Tabela 3 ou homólogos desses.

5 24. CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 12 ou um DNA cromossõmico recombinante que compreende um cassete de expressão que compreende um promotor, de acordo com o item (ii) da reivindicação 12, um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito I ligado a uma flavodoxina, de acordo com o item (i) da reivindicação 12 e uma 10 sequência de terminação de transcrição em ligação funcional, em que a construção do DNA cromossõmico recombinante está compreendida em uma célula vegetal.

25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, ou da parte colhível de uma planta transgênica, de acordo com a reivindicação 20, em que o produto compreende a construção de expressão, de acordo com a reivindicação 12.

22. MÉTODO DE FABRICAÇÃO, de um produto que

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado consiste em um rendimento de semente aumentado da(s) planta(s)

20 comparado com a(s) planta(s) de controle.

10 compreende as etapas de desenvolver as plantas transgênicas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, e produzir o dito produto a partir de ou através das ditas plantas ou partes, de preferência, sementes e/ou o caule, da planta.

23. MÉTODO, para o melhoramento da planta que

15 compreende

a) obter uma planta transgênica através do método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 15, ou 16;

b) combinar dentro de uma célula vegetal o material genético de pelo menos uma célula vegetal da planta de a) com o material genético de pelo

20 menos uma célula que se difere em um ou mais genes das células vegetais das plantas de a) ou cruzar a planta transgênica de a) com uma segunda planta;

c) obter a semente de pelo menos uma planta gerada a partir da célula vegetal de b) ou a planta do cruzamento da etapa (b);

25 d) plantar as ditas sementes e desenvolver as sementes nas plantas; e

e) selecionar a partir das ditas plantas, as plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina; e opcionalmente

f) produzir o material de propagação a partir das plantas que expressam o ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina.

10 parte da planta transgênica, ou célula vegetal transgênica expressa um ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo de trânsito e um polipeptídeo fíavodoxina sob o controle de uma sequência promotora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

18. PLANTA TRANSGÊNICA, parte de planta transgênica, ou

15 célula vegetal transgênica transformada com uma construção de expressão, de acordo com a reivindicação 12 ou com um vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 13, e compreende a sequência promotora ligada maneira operável ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo fíavodoxina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

20 7.

19. PLANTA TRANSGÊNICA, parte de planta transgênica, ou célula vegetal transgênica, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que a planta transgênica, parte da planta transgênica ou célula vegetal transgênica compreende a construção de expressão, de acordo com a reivindicação 12 e

25 possui um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado, de preferência, uma biomassa aumentada em relação a plantas de controle, com mais preferência, rendimento de semente e/ou biomassa aérea aumentada.

20. PARTE COLHÍVEL, de uma planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, em que a dita parte colhível compreende a construção de expressão, de acordo com a reivindicação 12 e é um órgão aéreo, de preferência, sementes e/ou o caule ou partes desse.

21. PRODUTO, produzido a partir de uma planta transgênica,

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

10 (b) regenerar a planta a partir da célula vegetal; e (c) expressar o dito ácido nucleico exógeno.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, em que o dito

25 um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado são obtidos sob condições de estresse abiótico, de preferência, estresse devido à seca, estresse salino e/ou deficiência de nitrogênio.

12. CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO, que compreende:

(i) um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, e um polipeptídeo flavodoxina;

(ii) sequências promotoras capazes de conduzir a expressão da 5 sequência de ácido nucleico de (i), de acordo com a reivindicação 1 ou 2; e opcionalmente (iii) uma sequência de terminação de transcrição.

13. VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, que I compreende uma construção de expressão, de acordo com a reivindicação 12. 10

14. USO, de uma construção de expressão, de acordo com a reivindicação 12 ou um vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 13, em um método para produzir uma planta transgênica que possui um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado relativo a plantas de controle, de preferência, biomassa aumentada, e com mais 15 preferência, biomassa aérea e/ou rendimento de semente aumentado relativo a plantas de controle.

15. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA

TRANSGÊNICA, parte de planta transgênica, ou célula vegetal transgênica que possui um ou mais traços relacionados ao rendimento aumentado relativo a

20 plantas de controle, de preferência, biomassa aumentada, que compreende:

(a) introduzir uma construção de vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 13 ou uma construção de expressão, de acordo com a reivindicação 12 em uma planta, uma parte da planta ou uma célula vegetal;

(b) gerar uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou 25 célula vegetal transgênica da planta transformada, parte da planta transformada ou célula vegetal transformada; e (c) expressar o ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo flavodoxina.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, que compreende adicionalmente a etapa de coletar o material de propagação da planta transgênica e plantar o material de propagação e desenvolver o material de propagação em plantas, em que o material de propagação compreende o 5 ácido nucleico exógeno que codifica o peptídeo de trânsito e o polipeptídeo fíavodoxina e a sequência promotora ligada de maneira operável a esses.

17. PLANTA TRANSGÊNICA, parte de planta transgênica, ou célula vegetal transgênica obtenível por um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 15, ou 16, em que a dita planta transgênica,

15 ou célula vegetal transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, ou o uso, de acordo com a reivindicação 14, a parte colhível, de acordo com a reivindicação 20, ou o produto, de acordo com a reivindicação 21, ou a construção ou DNA cromossõmico recombinante, de acordo com a reivindicação 24, em que a célula vegetal pertence à ou a planta é selecionada 20 a partir do grupo que consiste em feijões, soja, ervilha, trevo, kudzu, luzerna, lentilhas, tremoço, ervilhaca, amendoim, arroz, trigo, milho, cevada, arabidopsis, banana, colza de semente oleaginosa inclusive canola, algodão, batata, cana-de-açúcar, alfafa, beterraba sacarina, painço, centeio, triticale, sorgo, emmer, espelta, einkorn, teff, milo e aveias.