MX2014011933A

MX2014011933A - Plantas que tienen uno o mas rasgos mejorados relacionados con el rendimiento y un metodo para producirlas.

Info

Publication number: MX2014011933A
Application number: MX2014011933A
Authority: MX
Inventors: Christophe Reuzeau
Original assignee: Basf Plant Science Co Gmbh
Priority date: 2012-04-02
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2015-07-06
Also published as: AU2013245337A1; BR102013006227A2; WO2013150400A1; PH12014502227A1; EP2834359A1; CN104334727A; EP2834359A4; AR092811A1; CA2868068A1; US20150075519A1

Abstract

Se proporciona un método para mejorar, en plantas, varios rasgos relacionados con el rendimiento de importancia económica mediante la modulación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina en forma específica. Se proporcionan plantas que tienen la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina modulado por un tipo de promotor particular, en donde las plantas tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, en comparación con plantas de control. También se proporcionan construcciones hasta ahora desconocidas, las cuales son útiles para realizar los métodos de la invención.

Description

PLANTAS QUE TI EN EN UNO O MAS RASGOS MEJORADOS RELACIONADOS CON EL RENDIMI ENTO Y UN METODO PARA PRODUCI RLAS La presente solicitud reclama la prioridad de las siguientes solicitudes: EP 12162832.5 presentada el 2 de abril de 2012 y US 61 /618861 presentada el 2 de abril de 2012; todas ellas se incorporan en la presente por referencia con respecto a todo el contenido de la descripción. También se incorporan por referencia la solicitud de patente internacional PCT/GB02/04612, publicada como W02003/035881 , en especial las páginas 35 a 45 y, en particular, las flavodoxinas y los péptidos de tránsito allí enumerados; así como EP 1532257 y en particular las versiones modificadas del promotor GOS2 descrito en la solicitud de patente internacional PCT/I B201 1 /055412, publicada como WO2012077020, como SEC ID NO: 14 y 15, y las secuencias relacionadas, como se describen en las páginas 6 y 7 de dicha solicitud, que se incorporan en la presente, y el promotor GOS2, como se describe en la solicitud internacional publicada como WO 2004/065596.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION de la Invención La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular vegetal y se relaciona con un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante el aumento de la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina en una forma particular. La presente invención también se refiere a plantas que tienen una expresión específicamente aumentada de un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina con direccionamiento a los plástidos, en donde las plantas tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las correspondientes plantas de control. La invención también provee construcciones útiles en los métodos, los usos, las plantas, las partes cosechables y los productos de la invención.

Descripción de la Téenica Relacionada La población mundial en constante crecimiento y la disminución del suministro de tierras arables disponibles para la agricultura estimulan la investigación tendiente a incrementar la eficacia de la agricultura. Los medios convencionales para mejorar los cultivos y la horticultura utilizan técnicas de reproducción selectivas, a fin de identificar plantas que tengan características deseables. Sin embargo, dichas técnicas de reproducción selectivas tienen varios inconvenientes, a saber, que estas técnicas generalmente son laboriosas y dan como resultado plantas que, a menudo, contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre resultarán en que el rasgo deseable sea heredado de las plantas progenitoras. Los avances en biología molecular han permitido que el hombre modifique el germoplasma de animales y plantas. La manipulación genetica de plantas implica el aislamiento y la manipulación del material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Dicha teenología tiene la capacidad de producir cultivos o plantas que tengan varios rasgos mejorados desde el punto de vista económico, agronómico u hortícola.

Un rasgo de interés económico es el aumento del rendimiento. Normalmente, el rendimiento se define como el producto medible de valor económico de un cultivo. El rendimiento depende directamente de diversos factores, por ejemplo, la cantidad y el tamaño de los órganos, la arquitectura de la planta (por ejemplo, la cantidad de ramas), la producción de semillas, la senectud de las hojas y otros. El desarrollo de la raíz, la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés y el vigor temprano también pueden ser factores importantes para determinar el rendimiento. En consecuencia, la optimización de los factores antes mencionados puede contribuir a aumentar el rendimiento del cultivo.

El rendimiento de semillas es un rasgo importante debido a que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición de seres humanos y animales. Los cultivos tales como maíz, arroz, trigo, cañóla y soja representan más de la mitad de la ingesta calórica total de los seres humanos, ya sea por consumo directo de las semillas mismas o por consumo de productos cárnicos obtenidos de semillas procesadas. También son fuente de azúcares, aceites y muchos tipos de metabolitos que se utilizan en procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos brotes y raíces) y un endosperma (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas). El desarrollo de una semilla incluye muchos genes y requiere de la transferencia de metabolitos desde las raíces, hojas y tallos hasta la semilla en crecimiento. El endosperma, en particular, asimila los precursores metabólicos de hidratos de carbono, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoleculas de almacenamiento para llenar el grano.

Otro rasgo importante para muchos cultivos es el vigor temprano. Mejorar el vigor temprano es un objetivo importante de los programas modernos de reproducción de arroz en cultivares de arroz templados y tropicales. Las raíces largas son importantes para un adecuado anclaje al suelo en el caso del arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos inundados y cuando las plantas deben emerger rápidamente del agua, los brotes más largos se asocian al vigor. Cuando se practica la siembra mecánica, los mesocotilos y coleóptilos más largos son importantes para el buen surgimiento de las plántulas. La capacidad de manipular por ingeniería genética el vigor temprano en las plantas sería de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, el escaso vigor temprano ha sido una limitación a la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) basados en el germoplasma del cinturón maicero en el Atlántico Europeo.

Otro rasgo importante es una mejor tolerancia al estrés abiótico. El estrés abiótico es una causa principal de la pérdida de cultivos a nivel mundial, lo cual reduce en más del 50 % el rendimiento promedio de la mayoría de las plantas de cultivo importantes (Wang et al. , Planta 218, 1 -14, 2003). El estrés abiótico puede ser causado por sequía, salinidad, deficiencia de nutrientes, temperaturas extremas, toxicidad química y estrés oxidativo. La capacidad de mejorar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico sería de gran ventaja económica para los agricultores en todo el mundo y permitiría la plantación de cultivos en condiciones adversas y en territorios en los cuales la plantación de cultivos no puede ser posible de otra manera.

El estrés ambiental es un factor principal limitante para la productividad de la planta y el rendimiento de los cultivos. Varios de los procesos nocivos que experimentan las plantas expuestas a condiciones ambientales adversas son mediados por especies reactivas de oxígeno (ROS) que se generan en los cloroplastos por el rendimiento defectuoso del aparato fotosintético (Foyer, C. H. et al. (1994) Plant Cell Environ. 17, 507- 523, Hammond-Kosack, K. E. , y Jones, J. D. G. (1996) Plant Cell 8, 1773-1791 , Alien, R. (1995) Plant Physiol. 107 1 1049-1054), la auto-oxidación de los componentes de la cadena de transporte fotosintético de electrones provoca la formación de radicales de superóxido y sus derivados, peróxido de hidrógeno y radicales de hidroxilo. Estos compuestos reaccionan con una amplia variedad de biomoléculas (en forma más notable, AON), lo que provoca que la celula quede en fase de equilibrio y conduce a la muerte celular.

Para solucionar los efectos dañinos de las especies reactivas de oxígeno (ROS), los organismos aeróbicos han desarrollado sistemas de defensa antioxidantes altamente eficaces que están compuestos por elementos constitutivos enzimáticos y no enzimáticos. En diferentes tejidos y organismos, los antioxidantes cumplen funciones protectoras diferentes y, a menudo, complementarias, tales como el barrido directo del reemplazo de ROS 1 de biomoléculas sensibles oxidantes dañadas y actividades de reparación del ADN (Fridovich 1 I . (1997). J . Biol. Chem. 272, 1851 -1857). Al menos parte de la respuesta celular contra el estrés oxidativo es de naturaleza adaptativa e implica la síntesis de novo de miembros comprometidos de la barrera de antioxidantes. Se han reconocido varias respuestas multigénicas en la bacteria aeróbica facultativa Escherichia coli, incluidas las moduladas por los regulones soxRS y oxyR (Hidalgo, E. , y Demple, B. (1996). In Regulation of Gene Expression in Escherichia coli, Molecular Biology Intelligence Unit Series (E. C. C. Lin y A. S. Lynch, eds.), pp. 434-452, Austin, TX: R. G. Landis).

La respuesta de soxRS pareciera estar específicamente adaptada para enfrentar los desafíos impuestos por la exposición de las células a los radicales de superóxido o al óxido nítrico. Se han identificado diversos componentes de la respuesta, los que incluyen dos flavoproteínas solubles: ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR) que contiene FAD y su sustrato de flavodoxina electrónicamente asociado (Liochev et al. (1994) Proc. Nati Acad. Sei. EE. UU. 91 , 1328-1331 , Zheng, M. et al (1999) J . Bacteriol. 181 ,4639-4643).

Las flavodoxinas son pequeñas proteínas monoméricas (Mw 18,800) que contienen una molécula de FMN unida en forma no covalente (Razqum, P. et al (1988) J. Bacteriol. 176, 7409- 741 1 ). La FNR puede usar, con una eficiencia prácticamente similar, tanto flavodoxina como la proteína de hierro-azufre ferredoxina como sustratos para su actividad de NADP(H) oxidorreductasa. En las cianobacterias, la expresión de la flavodoxina es inducida en condiciones de deprivación de hierro, cuando la ferredoxina no se puede sintetizar.

Como parte de la respuesta de soxRS de E. coli, los niveles de FNR y de flavodoxina aumentan más de veinte veces por el tratamiento de las bacterias con compuestos de propagación de superóxido, tal como el herbicida cielador redox vialógeno de metilo (MV), mientras que las cantidades de ferredoxina no se ven modificadas (Rodríguez, R. E. et al (1998) Microbiology 144,2375-2376). A diferencia de la FNR y las ferredoxinas, que se encuentran ampliamente distribuidas en los plástidos, las mitocondrias y las bacterias, la presencia de flavodoxina pareciera estar ampliamente restringida a las bacterias. Las flavodoxinas no se han aislado de los tejidos vegetales, y no se ha reconocido ningún homólogo de flavodoxina en el genoma de Arabidopsis thaliana (The Arabidopsis Genome I nitiative (2000) Nature 408,796- 815). Se ha descrito que las líneas vegetales que se han modificado por ingeniería genética para expresar una flavoproteína, tal como la flavodoxina, muestran una mejor tolerancia en comparación con las plantas de control sin tratar, cuando se exponen a condiciones de estrés ambiental (véase la solicitud de patente internacional PCT/GB02/04612, publicada como W02003/035881 , presentada el 10-10-2002 por el solicitante PLANT BIOSCIENCE LTD, en adelante denominada WO 03/035881 ).

En consecuencia, se puede aumentar el rendimiento de los cultivos mediante la optimización de uno de los factores antes mencionados.

Según el uso final, se puede favorecer la modificación de ciertos rasgos del rendimiento con respecto a otros. Por ejemplo, para aplicaciones tales como producción de forraje o madera, o recursos de biocombustibles, puede ser deseable un aumento de las partes vegetativas de una planta y, para aplicaciones tales como producción de harina, almidón o aceite, puede ser particularmente deseable un aumento de los parámetros de la semilla. Aún entre los parámetros de las semillas, se pueden favorecer algunos con respecto a otros, según la aplicación. Diversos mecanismos pueden contribuir a aumentar el rendimiento de semillas, ya sea aumentando el tamaño de las semillas o aumentando la cantidad de semillas.

Ahora se ha descubierto que se pueden mejorar varios rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante el aumento específico de la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina que se dirige a los plástidos. La presente invención también se refiere a plantas que tienen una expresión específicamente aumentada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina con direccionamiento a los plástidos, en donde las plantas tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento en comparación las con plantas de control. La invención también provee construcciones desconocidas hasta el momento que comprenden ácidos nucleicos que codifican flavodoxina, útiles para realizar los métodos de la invención.

Una modalidad preferida es un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en una planta con respecto a plantas de control , que comprende las etapas de aumentar la expresión, preferentemente mediante métodos recombinantes, en una planta, de un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina en una forma particular, en donde la expresión está bajo el control de una secuencia de promotor particular ligada operativamente al ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina, y cultivar las plantas.

Por ello, un objeto de la invención es proveer una construcción de expresión y una construcción de vector que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, ligado operativamente a una secuencia de promotor conveniente. Se provee el uso de tales construcciones genéticas para obtener una planta transgénica que tiene uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, preferentemente mayor biomasa y/o rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control.

Una modalidad preferida también se refiere a plantas transgénicas transformadas con una o más construcciones de expresión de la invención y, por ello, que expresan en una forma particular los ácidos nucleicos que codifican un péptido de tránsito y una proteína de flavodoxina, en donde las plantas tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento. Las partes cosechables de las plantas transgénicas de la presente invención, los productos derivados de las plantas transgénicas y sus partes cosechables también son parte de la presente invención.

En particular, se ha descubierto que sorprendentemente la expresión de un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y una flavodoxina, como se define en la presente, bajo el control de un promotor de GOS2, como se define más adelante, da como resultado un aumento de la biomasa, del rendimiento de las semillas y/o del contenido de azúcar de las plantas que comprenden esta combinación del promotor de GOS2 ligado funcionalmente al ácido nucleico exógeno, en comparación con las plantas de control en condiciones de estres abiótico y/o estándares.

Breve Descripción de las Varias Vistas de los Dibujos La presente invención se describirá a continuación con referencia a las siguientes figuras en las cuales: La Figura 1 representa la estructura de dominio de SEC ID NO: 2 con motivos y/o dominios conservados. Los dominios se identificaron y visualizaron usando el software InterProScan (véase Zdobnov E. M. y Apweiler R. ; "InterProScan - an integration platform for the signature-recognition methods in InterPro."; Biomformatics, 2001 , 17(9): 847-8; base de datos I nterPro, versión 36.0, 23 de febrero de 2012)) y el software InterproScan, versión 4.8, base de datos I nterPro, versión 41 del 13 de febrero de 2013 (B).

La Figura 2 representa el vector binario que se usa para la expresión específica en la caña de azúcar de un ácido nucleico que codifica una flavodoxína (FLD) fusionada a un péptido de tránsito (TP) al plástido, representada por TP: : FLD, bajo el control de un promotor de GOS2 (pGOS2). La flavodoxína, el péptido de tránsito y el promotor de GOS2 son como se describen en la presente.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Las siguientes definiciones se usarán a lo largo de la presente solicitud. Los títulos y encabezados de las secciones de esta solicitud se brindan para fines prácticos y de referencia, y no deben afectar de modo alguno el significado o la interpretación de la presente solicitud. Por lo general, las expresiones y los términos téenicos que se usan dentro del alcance de la presente solicitud deben interpretarse con el significado que se les aplica habitualmente en el estado de la técnica pertinente de la biología de las plantas, biología molecular, biomformátíca y reproducción de plantas. Todas las siguientes definiciones de términos se aplican al contenido completo de esta solicitud. Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, se debe tener en cuenta que “un” o “una” pueden significar uno o más, según el contexto en el que se utilice. En consecuencia, por ejemplo, la referencia a “una célula” puede significar que se usa al menos una célula.

Las expresiones “esencialmente”, “alrededor de”, “aproximadamente” y similares, en relación con un atributo o un valor, también definen, en particular, exactamente el atributo o el valor, respectivamente. El término “alrededor de”, en el contexto de un determinado valor o rango numérico, se refiere, en particular, a un valor o rango que está dentro del 20 %, dentro del 10 % o dentro del 5 % del valor o rango determinado. Como se usa en la presente, el término “comprende” también abarca la expresión “consiste en”.

Los términos "péptidos", oligopéptidos", polipéptido” y “proteína” se usan en forma indistinta en la presente y se refieren a aminoácidos en forma polimérica de cualquier longitud, ligados por enlaces peptídicos, a menos que se indique de otra manera.

Polinucleótidofsl/Ácidofs) Nucleicofsl/Secuenciafs) de ácidos nucleicos/Secuenciafs) de N ucleótidos Las expresiones “polinucleótido(s)”, “secuencia(s) de ácidos nucleicos”, “secuencia(s) de nucleótidos”, “ácido(s) nucleico(s)”, “molécula de ácido nucleico” se usan en forma indistinta en la presente y se refieren a nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica no ramificada de cualquier longitud.

Homólogo(s) Los “homólogos” de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos con respecto a la proteína en cuestión sin modificar y que tienen una actividad biológica y funcional sustancialmente similar a la proteína sin modificar de la que derivan. Los “homólogos” de un gen abarcan genes que tienen una secuencia de ácidos nucleicos con sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de nucleótidos con respecto al gen en cuestión sin modificar y que tienen sustancialmente la misma actividad biológica y/o funcional que el gen sin modificar del que derivan, o que codifican polipéptidos que tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que el polipeptido codificado por la secuencia de ácido nucleico sin modificar.

El término “nucleótido” se refiere a un bloque de construcción de ácido nucleico que consiste en una nucleobase, una pentosa y al menos un grupo fosfato. Por ello, el término “nucleótido” incluye un nucleosidomonofosfato, nucleosidodifosfato y nucleosldotrifosfato.

Los ortólogos y parálogos son dos formas diferentes de homólogos y abarcan conceptos evolutivos que se utilizan para describir las relaciones ancestrales de los genes o las proteínas. Los parálogos son genes o proteínas dentro de la misma especie, que se han originado por duplicación de un gen o proteína ancestrales; los ortólogos son genes o proteínas que provienen de diferentes organismos, que se han originado por especiación y también derivan de un gen o una proteína ancestrales comunes.

Una "eliminación" se refiere a retirar uno o más aminoácidos de una proteína o a retirar uno o más ácidos nucleótidos de un ácido nucleico.

Una “inserción” se refiere a uno o más residuos de aminoácidos que se introducen en un sitio predeterminado en una proteína o a uno o más nucleótidos que se introducen en un sitio predeterminado en una secuencia de ácidos nucleicos. Con respecto a una proteína, las inserciones pueden comprender fusiones del terminal N y/o terminal C y también inserciones intra-secuencia de aminoácidos simples o múltiples. En general, las inserciones en la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones del terminal N o C, en el orden de alrededor de 1 a 10 residuos. Los ejemplos de péptidos o proteínas de fusión del terminal N o C incluyen el dominio de fijación o el dominio de activación de un activador de la transcripción como se usa en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de recubrimiento de fagos, etiqueta de (histidina)-6, etiqueta de glutatión S-transferasa, proteína A, proteína de fijación a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo Tag*100, epítopo c-myc, epítopo FLAG® , lacZ, CMP (péptido de fijación a calmodulina), epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo VSV.

Una "sustitución" se refiere al reemplazo de aminoácidos de la proteína con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión similar a formar o romper estructuras helicoidales a o estructuras de hoja b). En general, las sustituciones de aminoácidos son de residuos simples, pero se pueden agrupar según las restricciones funcionales del polipéptido. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos. Los cuadros de sustituciones conservadoras son conocidos en el estado de la téenica (véase, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds) y el siguiente Cuadro 1 ).

Cuadro 1 : Ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos Las sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos se pueden realizar fácilmente mediante las téenicas de síntesis de péptidos conocidas en el estado de la técnica, tales como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o mediante la manipulación de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variante de sustitución, inserción o eliminación de una proteína son muy conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, las técnicas para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados del ADN son muy conocidas por las personas del oficio de nivel medio e incluyen mutagénesis M 13, mutagénesis de T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio (véase Current Protocols in Molecular Biology, John Wilcy & Sons, N.Y. ( 1989 y las actualizaciones anuales)).

Derivados Los “derivados” de proteínas o polipéptidos incluyen polipéptidos que pueden comprender, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma natural de la proteína o del polipéptido, tal como la proteína de interés, sustituciones de aminoácidos por residuos de aminoácidos no naturales o adiciones de residuos de aminoácidos no naturales. Los “derivados” de proteínas o polipéptidos también abarcan polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos alterados naturales (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, etc.) o alterados no naturales, en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones de no aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cual deriva, por ejemplo una molécula indicadora u otro ligando, unido de forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula indicadora que se liga para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos no naturales, con respecto a la secuencia de aminoácidos de una proteína natural. Además, los “derivados” también incluyen fusiones de la forma natural de la proteína con péptidos rotuladores tales como FLAG, H IS6 o tiorredoxina (para una reseña sobre péptidos rotuladores, véase Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003). Los “derivados” de ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos que, en comparación con la secuencia de nucleótidos de la forma natural de ácidos nucleicos, comprenden eliminaciones, alteraciones o adiciones con nucleótidos no naturales. Los “derivados” de un ácido nucleico también abarcan ácidos nucleicos que comprenden nucleótidos naturales alterados o nucleótidos no naturales alterados, en comparación con la secuencia de nucleótidos de una forma natural del ácido nucleico. Un derivado de una proteína o ácido nucleico aún proporciona sustancialmente la misma función, por ejemplo, mejores rasgos relacionados con el rendimiento, cuando están expresados o reprimidos en una planta, respectivamente.

Fragmentos funcionales La expresión “fragmento funcional” se refiere a cualquier ácido nucleico o proteína que comprende solamente una parte del ácido nucleico de longitud completa o de la proteína de longitud completa, respectivamente, pero aún así proporciona sustancialmente la misma función, por ejemplo, un rasgo mejorado relacionado con el rendimiento, cuando están expresados o reprimidos en una planta, respectivamente.

En los casos en los que se desea la sobreexpresión del ácido nucleico, las expresiones “sustancialmente la misma actividad funcional” o “sustancialmente la misma función” significan que cualquier homólogo y/o fragmento proporcionan rasgos aumentados/mejorados relacionados con el rendimiento cuando se expresan en una planta. Con preferencia, sustancialmente la misma actividad funcional o sustancialmente la misma función significan al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o 100% o más rasgos aumentados/mejorados relacionados con el rendimiento, en comparación con la actividad funcional provista por la expresión exógena de la secuencia de nucleótidos de flavodoxina de longitud total o la secuencia de aminoácidos de flavodoxina.

Dominio / Motivo/ Secuencia de Consenso/ Característica El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de una alineación de secuencias de proteínas relacionadas con la evolución. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que probablemente son esenciales para la estructura, estabilidad o función de una proteína. Si se los identifica por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, se los puede utilizar como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos previamente identificada.

Las expresiones “motivo”, “secuencia de consenso” o “característica” se refieren a una región corta conservada en las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos relacionadas en términos evolutivos. En el caso de secuencias de aminoácidos, en general, los motivos son partes de dominios altamente conservadas, pero también pueden incluir solo una parte del dominio o pueden estar ubicados fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo están fuera de un dominio definido).

Existen bases de datos especializadas para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU . 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al. , (2003) Nucí. Acids. Res. 31 , 315-318), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (En) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R. , Brutlag D. , Karp P. , Lathrop R. , Searls D. , Eds. , pp53-61 , AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al. , Nucí. Acids. Res. 32: D134-D137, (2004)), o Pfam (Bateman et al. , Nucleic Acids Research 30(1 ): 276-280 (2002) ) y la base de datos Pfam protein families database (R. D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J. E. Pollington, O. L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E. L. Sonnhammer, S. R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:21 1 -222). Un conjunto de herramientas para el análisis in silico de secuencias proteicas se encuentra disponible en el servidor proteómico ExPASy (Swiss Institute of Biomformatics (Gasteiger et al. , ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31 :3784-3788(2003)). También se pueden identificar dominios o motivos mediante téenicas de rutina, tales como alineación de secuencias.

Los métodos para la alineación de secuencias para la comparación son conocidos en el estado de la técnica, dichos métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para hallar la alineación global (es decir, que abarca las secuencias completas) de dos secuencias que maximiza la cantidad de comcidencias y minimiza la cantidad de brechas. El algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está disponible al público mediante National Centre for Biotechnology I nformation (NCBI). Se pueden identificar fácilmente homólogos mediante, por ejemplo, el algoritmo ClustalW de alineación de secuencia múltiple (versión 1.83), con los parámetros predeterminados de alineación de pares y un método de calificación en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud e identidad también se pueden determinar mediante uno de los métodos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella et al. , BMC Bioinformatics. 10 de julio de 2003;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Se puede realizar la edición manual menor para optimizar la alineación entre motivos conservados, como sería evidente para un experto en la técnica. Además, en lugar de utilizar secuencias de longitud total para la identificación de homólogos, tambien se pueden utilizar dominios específicos. Los valores de identidad de secuencia se pueden determinar con respecto a la secuencia completa de ácidos nucleicos o aminoácidos, o con respecto a motivos conservados o dominios seleccionados, utilizando los programas antes mencionados con los parámetros predeterminados. Para las alineaciones locales, el algoritmo de Smith-Waterman es particularmente útil (Smith TF, Waterman MS ( 1981 ) J. Mol. Biol 147(1 ); 195-7).

BLAST recíproco En general, esto incluye un primer BLAST que implica someter a BLAST (es decir, operar el software BAST con la secuencia de interés como una secuencia incógnita) una secuencia incógnita (por ejemplo, usando cualquiera de las secuencias enumeradas en los Cuadros 2 o 3) con respecto a cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos disponible al público NCBI . Generalmente, se utilizan BLASTN o TBLASTX (con valores predeterminados estándares) cuando se comienza desde una secuencia de nucleótidos, y BLASTP o TBLASTN (utilizando valores predeterminados estándares) cuando se comienza desde una secuencia de proteínas. Los resultados de BLAST se pueden filtrar opcionalmente. Las secuencias de longitud total de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados luego se someten de nuevo a BLAST (segundo BLAST) con respecto a secuencias provenientes del organismo del cual deriva la secuencia incógnita. Luego se comparan los resultados del primer y segundo BLAST. Se identifica un parálogo si una comcidencia de alto rango del primer blast proviene de la misma especie de la cual deriva la secuencia incógnita, entonces un nuevo BLAST idealmente daría como resultado que la secuencia incógnita se encuentre entre las mayores coincidencias; se identifica un ortólogo si una coincidencia de alto rango en el primer BLAST no proviene de la misma especie de la cual deriva la secuencia incógnita y preferentemente, daría como resultado que el nuevo BLAST en la secuencia incógnita se encuentre entre las mayores coincidencias.

Las coincidencias de alto rango son aquellas que tienen bajo valor E. Cuanto más bajo es el valor E, más importante es la calificación (o, en otras palabras, menor es la probabilidad de hallar la coincidencia por azar). El cálculo del valor E es bien conocido en el estado de la téenica. Además de los valores E, las comparaciones también se califican por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere a la cantidad de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos) comparadas sobre una longitud particular. En el caso de grandes familias, se puede utilizar ClustalW, seguido por un árbol de unión cercana, para contribuir a visualizar la agrupación de genes relacionados e identificar ortólogos y parálogos.

Peptido de Tránsito Un “péptido de tránsito” (o señal de tránsito, péptido de señal, secuencia de señal) es una cadena peptídica corta (3-60 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte de una proteína, preferentemente a las organelas, dentro de la célula o a determinados sitios subcelulares o para la secreción de una proteína. Los péptidos de tránsito también se pueden denominar señal de tránsito, péptido de señal, secuencia de señal , señales de direccionamiento o señales de localización (subcelular).

Hibridación El término “hibridación”, como se define en la presente, es un proceso en el cual las secuencias de nucleótidos complementarias sustancialmente homologas se aparean entre sí. El proceso de hibridación se puede producir por completo en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El proceso de hibridación también se puede producir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como esferas magnéticas, esferas de sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación también se puede producir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o nylon o inmovilizado, por ejemplo, por fotolitografía, por ejemplo, en un soporte de vidrio silíceo (este último se conoce como micromatriz multigénica o como chips de ácido nucleico). Con el fin de permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácido nucleico generalmente se desnaturalizan en forma térmica o química para fundir una doble cadena en dos cadenas simples y/o eliminar las horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios.

El término “rigurosidad” se refiere a las condiciones en las cuales tiene lugar la hibridación. La rigurosidad de hibridación está influenciada por condiciones tales como temperatura, concentración salina, fuerza iónica y composición del regulador de pH de hibridación. Generalmente, las condiciones de baja rigurosidad se seleccionan para que sean de alrededor de 30°C por debajo del punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media son aquellas en que la temperatura es 20°C por debajo de Tm, y las condiciones de rigurosidad alta son aquellas en que la temperatura es 10°C por debajo de Tm. Las condiciones de hibridación de rigurosidad alta se utilizan típicamente para aislar secuencias de hibridación que tienen mucha similitud de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos blanco. Sin embargo, los ácidos nucleicos se pueden desviar en secuencia y aún así codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. En consecuencia, algunas veces las condiciones de hibridación de rigurosidad media pueden ser necesarias para identificar dichas moléculas de ácido nucleico.

La Tm es la temperatura con una fuerza iónica y pH definidos, a la cual el 50% de la secuencia objetivo se híbrida a una sonda perfectamente apareada. La Tm depende de las condiciones de la solución, la composición base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. La tasa máxima de hibridación se obtiene de alrededor de 16°C a 32°C por debajo de Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electroestática entre las dos cadenas de ácido nucleico, promoviendo de este modo la formación de híbridos; este efecto es visible para las concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (para mayores concentraciones, este efecto se puede ignorar). La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 a 0, 7°C para cada porcentaje de formamida, y la adición de 50% de formamida permite que la hibridación se realice de 30 a 45°C, si bien se reducirá la tasa de hibridación. Los errores de apareamiento de los pares de bases reducen la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para sondas grandes, la Tm disminuye alrededor de 1 °C por % de errores de apareamiento de las bases. La Tm se puede calcular con las siguientes ecuaciones, según los tipos de híbridos: 1 ) Híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem. , 138: 267-284, 1984): Tm= 81 , 5’C + 16,6xlogi0[Na+]a + 0,41 x%[G/Cb] - 500x[Lc] 1 - 0,61 x% de formamida 2) Híbridos de ADN-ARN o ARN -ARN: Tm= 79,8°C+ 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 1 1 ,8 (%G/Cb)2 -820/Lc 3) H íbridos de oligo-ADN u oligo-ARNd: Para <20 nucleótidos: Tm= 2 (ln) Para 20-35 nucleótidos: Tm= 22 + 1 ,46 (l„) a o para otro catión monovalente, pero solo exacto en el rango 0,01 -0,4 M. b solo exacto para el % de GC en el rango de 30% a 75%. c L = longitud del dúplex en pares de bases. d oligo, oligonucleótidos; ln, = longitud efectiva del cebador = 2x (N. ° de G/C) + (N .° de A/T).

La unión no específica se puede controlar mediante cualquiera de las numerosas téenicas conocidas, tales como bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteínas, adiciones de ARN, ADN y SDS heterólogos al regulador de pH de hibridación y tratamiento con Rnasa. En las sondas no homologas, se puede realizar una serie de hibridaciones mediante la variación de una de las siguientes (i) reducir progresivamente la temperatura de apareamiento (por ejemplo, de 68°C a 42°C) o (ii) reducir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo, de 50% a 0%). La persona del oficio de nivel medio conoce varios parámetros que se pueden alterar durante la hibridación y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de la hibridación generalmente también depende de la función de los lavados posteriores a la hibridación. Para retirar el fondo que resulta de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de dichos lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: a menor concentración salina y mayor temperatura del lavado, mayor rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente con la rigurosidad de la hibridación o con una rigurosidad inferior a esta. Una hibridación positiva produce una señal que es por lo menos el doble de la del fondo. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o procedimientos de detección de amplificación génica son como se indicaron anteriormente. También se pueden seleccionar condiciones más o menos rigurosas. La persona del oficio de nivel medio conoce varios parámetros que se pueden alterar durante el lavado y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad típicas para los híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos comprenden hibridación a 65°C en 1 x SSC o a 42°C en 1 x SSC y 50% de formamida, seguida de lavados a 65°C en 0,3 x SSC. Los ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos comprenden hibridación a 50°C en 4x SSC o a 40°C en 6x SSC y 50% de formamida, seguida de lavados a 50°C en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud prevista para el ácido nucleico de hibridación. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, se puede determinar !a longitud del híbrido mediante la alineación de las secuencias y la identificación de las regiones conservadas descritas en la presente. 1 xSSC es NaCI 0, 15 M y citrato de sodio 15 mM ; la solución de hibridación y las soluciones de lavado tambien pueden incluir reactivo de Denhardt 5x, 0,5-1 , 0 % de SDS, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, 0,5% de pirofosfato de sodio. En una modalidad preferida, las condiciones de alta rigurosidad significan una hibridación a 65°C en 0, 1 x SSC que comprende 0, 1 SDS y, opcionalmente, reactivo de Denhardt 5x, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, 0,5% de pirofosfato de sodio, seguido del lavado a 65°C en 0,3 x SSC. A fin de definir el nivel de rigurosidad, se puede hacer referencia a Sambrook et al. (2001 ) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3.a edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press, CSH , Nueva York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wilcy & Sons, N .Y. (1989 y las actualizaciones anuales).

Variante de empalme Como se usa en la presente, la expresión “variante de empalme” abarca variantes de una secuencia de ácidos nucleicos en la cual se escindieron, reemplazaron, desplazaron o agregaron intrones y/o exones seleccionados, o en la cual se acortaron o alargaron intrones. Estas variantes serán aquellas en las que la actividad biológica de la proteína está sustancialmente retenida; esto se puede obtener mediante la retención selectiva de segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de empalme se pueden hallar en la naturaleza o pueden ser fabricadas por el hombre. Los metodos para predecir y aislar dichas variantes de empalme son conocidos en el estado de la téenica (véase, por ejemplo, Foissac y Schiex (2005) BMC Biomformatics 6: 25).

Variante alélica Los “alelos” o las “variantes alélicas” son formas alternativas de un gen determinado, que se ubican sustancialmente en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas abarcan polimorfismos de nucleótido único (SNP) y también polimorfismos de inserción/eliminación pequeña (I NDEL). Usualmente, el tamaño de los I NDEL es menor que 100 pb. Los SNP e I NDEL forman el mayor conjunto de variantes de secuencia en las cepas polimórficas naturales de la mayoría de los organismos.

Endógeno La referencia en la presente a una proteína y/o un ácido nucleico “endógeno” se refiere a la proteína y/o al ácido nucleico en cuestión que se encuentran en una planta en su forma natural (es decir, sin que medie intervención humana, como tecnología de ingeniería genética de ADN recombinante), pero también se refiere a ese mismo gen (o a un gen/ácido nucleico sustancialmente homólogo) en forma aislada que es (re)introducido posteriormente en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene este transgén puede presentar una reducción sustancial de la expresión del transgén y/o una reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado se puede aislar de un organismo o puede ser preparado por el hombre, por ejemplo, mediante síntesis química.

La expresión gen o ácido nucleico “exógeno” (en contraposición con "endógeno”) se refiere a un ácido nucleico que se introdujo en una planta mediante teenología de ADN recombinante. Un ácido nucleico “exógeno” puede no ocurrir en una planta en su forma natural, ser diferente del ácido nucleico en cuestión como se encuentra en una planta en su forma natural, o puede ser idéntico a un ácido nucleico que se encuentra en una planta en su forma natural, pero no se integra en su entorno genético natural. El significado correspondiente de “exógeno” se aplica en el contexto de expresión proteica. Por ejemplo, una planta transgénica que contiene un transgén, es decir, un ácido nucleico exógeno, puede, cuando se compara con la expresión del gen endógeno, presentar un aumento considerable de la expresión de la proteína o gen respectivo en total. Una planta transgénica de acuerdo con la presente invención incluye un ácido nucleico de flavodoxina exógeno integrado en cualquier sitio genético y, opcionalmente, también puede incluir el gen endógeno en el entorno genético natural.

Transposición qenica/Evol ución diriqida La "transposición génica" o "evolución dirigida" consiste en iteraciones de transposición de ADN seguido del barrido y/o selección adecuada para generar variantes de ácidos nucleicos o porciones de estos que codifican proteínas que tienen actividad biológica modificada (Castle et al. , (2004) Science 304(5674): 1 151 -4; patentes de E. Ü.A. 5, 81 1 ,238 y 6,395,547).

Casete de expresión Como se usa en la presente, “casete de expresión” es ADN capaz de ser expresarse en una célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Preferentemente, el ADN, parte del ADN o la disposición de los elementos genéticos que forman el casete de expresión son artificiales. El experto en la téenica conoce los elementos genéticos que deben estar presentes en el casete de expresión, a fin de poder expresarse con éxito. El casete de expresión comprende una secuencia de interés que se desea expresar que está ligada operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor), como se describe en la presente. Otros elementos reguladores pueden incluir potenciadores de la transcripción y de la traducción, uno o más N EENA, como se describe en la presente, y/o uno o más RENA, como se describe en la presente. Aquellos expertos en la técnica conocen las secuencias terminadoras y potenciadoras que pueden ser adecuadas para utilizar en la realización de la invención. También se puede agregar una secuencia intrónica a la región 5' no traducida (UTR) o en la secuencia codificante para aumentar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección Definiciones, para una mayor expresión/sobreexpresión. Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, potenciadoras, silenciadores, intrónicas, regiones 3’UTR y/o 5'UTR) pueden ser elementos estabilizantes de ARN y/o proteína. El experto en la téenica conoce estas secuencias o las puede obtener fácilmente.

El casete de expresión puede integrarse en el genoma de una célula huésped y replicarse junto con el genoma de la célula huésped.

Construcción/construcción genética El ADN (por ejemplo, plásmidos o ADN viral) — parcial o totalmente artificial o artificial en cuanto a la disposición de los elementos genéticos contenidos— puede aumentar o disminuir la expresión de ADN y/o proteína de interés mediante la replicación en una célula huésped y se puede usar para la introducción de una secuencia de ADN de interés en una célula u organismo huésped. La replicación se puede producir después de la integración en el genoma de la célula huésped o mediante la presencia de la construcción como parte de un vector o un cromosoma artificial dentro de la célula huésped.

Las células huésped de la invención pueden ser cualquier célula seleccionada de células bacterianas, tales como células de especies de Escherichia coli o Agrobacterium, células de levadura, células de hongos, algas o cianobacterias o células vegetales. El experto en la téenica conoce los elementos genéticos que deben estar presentes en la construcción genética a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huésped que contienen la secuencia de interés.

En general, la construcción/construcción genética es una construcción de expresión y comprende uno o más casetes de expresión que pueden generar una sobreexpresión (construcción d e sobreexpresión) o una expresión reducida de un gen de interés. Una construcción puede consistir en un casete de expresión. La secuencia de interés está ligada operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor), como se describe en la presente. Otros elementos reguladores pueden incluir potenciadores de la transcripción y de la traducción, uno o más NEENA, como se describe en la presente, y/o uno o más RENA, como se describe en la presente. Los expertos en la técnica c onocen las secuencias terminadoras y potenciadoras que pueden ser adecuadas para utilizar en la realización de la invención. También se puede agregar una secuencia intrónica a la región 5' no traducida (UTR) o en la secuencia codificante para aumentar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de Definiciones, para una mayor expresión/sobreexpresión. Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, potenciadoras, silenciadoras, intrónicas, regiones 3'UTR y/o 5'UTR) pueden ser elementos estabilizantes de ARN y/o proteína. El experto en la téenica conoce estas secuencias o las puede obtener fácilmente.

Las construcciones genéticas de la invención también pueden incluir una secuencia de origen de replicación que es necesaria para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo de célula específica. Un ejemplo es cuando es necesario mantener una construcción genética en una célula bacteriana, como elemento genético episomal (por ejemplo, una molécula de cósmido o plásmido) Los orígenes de replicación preferidos incluyen, entre otros, f 1 -o ri y colE 1.

Para detectar la transferencia exitosa de las secuencias de ácidos nucleicos como se usan en los métodos de la invención y/o la selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucleicos, es conveniente usar genes marcadores (o genes indicadores). Por lo tanto, la construcción genética puede comprender, opcionalmente, un gen marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables se describen en mayor detalle en la sección de "definiciones" de la presente. Los genes marcadores se pueden retirar o eliminar de la célula transgénica cuando dejan de ser necesarios. Las técnicas para retirar marcadores son conocidas en el estado de la técnica; las técnicas útiles se describieron anteriormente en la sección de Definiciones.

Construcción de vector/ vector El ADN (por ejemplo, plásmidos o ADN viral) — parcial o totalmente artificial o artificial en cuanto a la disposición de los elementos geneticos contenidos— puede replicarse en una célula huésped y usarse para la introducción de una secuencia de ADN de interés en una célula u organismo huésped. Un vector puede ser una construcción o puede comprender al menos una construcción. Un vector puede replicarse sin integrarse en el genoma de una célula huésped, por ejemplo, un plásmido vector en una célula huésped bacteriana, o puede integrar parcial o totalmente su ADN en el genoma de la célula huésped y, por ello, generar la replicación y expresión de su ADN. Las células huésped de la invención pueden ser cualquier célula seleccionada de células bacterianas, tales como células de especies de Escherichia cotí o Agrobacterium, células de levadura, células de hongos, algas o cianobacterias o células vegetales. El experto en la téenica conoce los elementos genéticos que deben estar presentes en la construcción genética a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huésped que contienen la secuencia de interés. En general, el vector comprende al menos un casete de expresión. Una o más secuencias de interés están ligadas operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor), como se describe en la presente. Otros elementos reguladores pueden incluir potenciadores de la transcripción y de la traducción, uno o más NEENA, como se describe en la presente, y/o uno o más RENA, como se describe en la presente. Aquellos expertos e n la téenica conocen las secuencias terminadoras y potenciadoras que pueden ser adecuadas para usarse en la realización de la invención. También se puede agregar una secuencia intrónica a la región 5' no traducida (UTR) o en la secuencia codificante para aumentar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de definiciones. Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, potenciadoras, silenciadoras, intrónicas, regiones 3'UTR y/o 5'UTR) pueden ser elementos estabilizantes de ARN y/o proteína. El experto en la técnica conoce estas secuencias o las puede obtener fácilmente.

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor/Secuencia de promotor Los términos “elemento regulador”, “secuencia de control”, “promotor” y “secuencia de promotor” se refieren a secuencias de ácidos nucleicos reguladoras capaces de realizar la expresión de las secuencias asociadas. Los elementos reguladores pueden ser promotores. En general, las expresiones “promotor” y "secuencias de promotor" se refieren a una secuencia de ácidos nucleicos de control ubicada corriente arriba del inicio de la transcripción de un gen y que participa en el reconocimiento y la fijación de ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de este modo la transcripción de un ácido nucleico ligado operativamente. Las expresiones antes mencionadas abarcan las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariótico clásico (incluso la caja TATA que es necesaria para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias de activación corriente arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a los estímulos del desarrollo y/o externos, o de manera específica de tejido. El término también incluye una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariótico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de la caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de la caja -10. El término “elemento regulador” también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o mejora la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, un tejido u un órgano.

Un “promotor de planta” comprende elementos reguladores que median la expresión de un segmento de una secuencia codificante en las células de las plantas. En consecuencia, un promotor de planta no necesariamente es de origen vegetal, pero se puede originar a partir de virus o microorganismos, por ejemplo, de virus que atacan las células de las plantas. El “promotor de planta” también se puede originar de una célula vegetal, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácidos nucleicos expresada en el proceso de la invención y que se describe en la presente. Esto también se aplica a otras señales reguladoras de “planta”, tales como terminadores de “planta”. Los promotores corriente arriba de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de la presente invención se pueden modificar mediante una o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de nucleótidos sin interferir en la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, el marco de lectura abierto (ORF) o la región reguladora 3', tales como terminadores u otras regiones reguladoras 3' que se localizan fuera del ORF. Además, es posible que la actividad de los promotores aumente mediante la modificación de su secuencia o que sean reemplazados por completo por promotores más activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico, como se describe en la presente, debe estar ligada operativamente o comprender un promotor adecuado que exprese el gen en el punto temporal correcto y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, se pueden analizar la potencia del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato, por ejemplo, mediante la unión operativa del promotor a un gen indicador y el análisis del nivel de expresión y patrón del gen indicador en varios tejidos de la planta. Los genes indicadores conocidos y adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se analiza al medir la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La potencia del promotor y/o el patrón de expresión luego se pueden comparar con los de un promotor de referencia (tal como el que se utiliza en los métodos de la presente invención). Alternativamente, la intensidad del promotor se puede analizar cuantificando los niveles de ARNm, o comparando los niveles de ARNm del ácido nucleico usado en los métodos de la presente invención con niveles de ARNm de genes housekeeping, tales como rARN 18S, mediante métodos conocidos en el estado de la téenica, tales como transferencia Northern con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid et al. , 1996 Genome Methods 6: 986-994).

Generalmente, por “promotor débil” se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por “nivel bajo” se entienden niveles de alrededor de 1/10,000 transcripciones a alrededor de 1 /100,000 transcripciones, a alrededor de 1/500,0000 transcripciones por célula. Por el contrario, un “promotor fuerte” dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel alto o de alrededor de 1 /10 transcripciones a alrededor de 1 /100 transcripciones a alrededor de 1 /1000 transcripciones por célula. En general, por “promotor de potencia media" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel más bajo que un promotor fuerte, en particular a un nivel que es, en todos los casos, inferior al obtenido bajo el control de un promotor 35S CaMV.

Como se usan en la presente, las expresiones “ligado operativamente” o "ligado funcionalmente" se usan en forma indistinta y se refieren a una ligadura funcional entre la secuencia de promotor y el gen de interés, de modo que la secuencia de promotor pueda realizar la transcripción directa del gen de interés.

Las expresiones "ligadura funcional" o "ligado funcionalmente" con respecto a los elementos reguladores significan, por ejemplo, la disposición secuencial de un elemento regulador (por ejemplo, un promotor) con una secuencia de ácidos nucleicos que se desea expresar y, de ser adecuado, otros elementos reguladores (por ejemplo, un terminador, NEENA o RENA, como se describen en la presente), de manera que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su función prevista de permitir, modificar, facilitar o influenciar la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. Como sinónimo, se pueden usar las expresiones “ligadura operativa” o “ligado operativamente”. El resultado de la expresión puede depender de la disposición de las secuencias de ácidos nucleicos con respecto al ARN sentido o antisentido. Para ello, la ligadura directa, en el sentido químico, no es un requisito necesario. Las secuencias genéticas de control, por ejemplo, las secuencias potenciadoras, también pueden ejercer su función en la secuencia objetivo de posiciones que están alejadas o, de hecho, de otras moléculas de ADN . Las disposiciones preferidas son aquellas en las que la secuencia de ácidos nucleicos que se expresará se posiciona de manera recombinante detrás de la secuencia que actúa como promotor, de manera que las dos secuencias se liguen de manera covalente entre sí. La distancia entre la secuencia de promotor y la secuencia de ácidos nucleicos recombinante que se expresará tiene, preferentemente, menos de 200 pares de bases, con especial preferencia, menos de 100 pares de bases, con muy especial preferencia, menos de 50 pares de bases. En una modalidad preferida, la secuencia de ácidos nucleicos que se transcribirá se ubica detrás del promotor, de manera que el inicio de la transcripción sea identico al inicio deseado del ARN quimérico de la invención. La ligadura funcional y una construcción de expresión se pueden generar por medio de téenicas de recombinación y clonación habituales descritas (por ejemplo, en Maniatis T, Fritsch EF y Sambrook J (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2.a Ed. , Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor (NY); Silhavy et al. ( 1984) Experiments with Gene Fusions, Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wilcy Interscience; Gelvin et al. (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, los Países Bajos). Sin embargo, también se pueden ubicar, entre las dos secuencias, otras secuencias que actúan, por ejemplo, como ligadores con sitios de escisión específicos para enzimas de restricción, o como péptidos de señal. La inserción de secuencias también puede generar la expresión de proteínas de fusión. Preferentemente, la construcción de expresión, que consiste en una ligadura de una región reguladora, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos y de promotores que se desea expresar, puede existir de forma integrada en un vector y puede estar insertado en el genoma de una planta, por ejemplo, mediante transformación.

Un “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que es activo en la transcripción durante la mayoría, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en la mayoría de las condiciones ambientales, en al menos una celula, un tejido o un órgano.

Un "promotor ubicuo" es activo en casi todos los tejidos o células de un organismo.

Un "promotor regulado por el desarrollo" es activo durante ciertas etapas del desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios del desarrollo.

Un "promotor inducible" ha inducido o aumentado la Iniciación de la transcripción en respuesta a un estímulo químico (para una reseña, véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. B i o I . , 48:89-108), ambiental o físico, o puede ser “inducible por estrés”, es decir, que se activa cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o “inducible por patógeno" es decir, que se activa cuando una planta se expone a diversos patógenos.

Un "promotor específico de órgano" o "específico de tejido" es un promotor capaz de iniciar preferentemente, la transcripción en ciertos órganos o tejidos, tales como hojas, raíces, tejido de semilla, etc. Por ejemplo, un “promotor específico de raíz” es un promotor activo durante la transcripción predominantemente en las raíces de las plantas, y se excluye, en gran medida, cualquier otra parte de una planta, aún mientras permite cualquier expresión con pérdida en estas otras partes de la planta. Los promotores capaces de Iniciar la transcripción solo en ciertas celulas se denominan, en la presente, “específicos de célula”.

Un "promotor específico de semilla" es activo durante la transcripción predominantemente en el tejido de semillas, pero no necesariamente en forma exclusiva en el tejido de las semillas (en casos de expresión con pérdida). El promotor específico de semilla puede ser activo durante el desarrollo de la semilla y/o durante la germinación. El promotor específico de semilla puede ser específico de endosperma/aleurona/embrión.

Un "promotor específico de tejido verde", como se define en la presente, es un promotor que es activo durante la transcripción predominantemente en el tejido verde, excluyendo en gran medida cualquier otra parte de una planta, aún mientras permite cualquier expresión con pérdida en estas otras partes de la planta.

Otro ejemplo de un promotor específico de tejido es un promotor específico de meristema, que es activo durante la transcripción predominantemente en tejido meristemático, excluyendo en gran medida cualquier otra parte de una planta, aún mientras permite cualquier expresión con pérdida en estas otras partes de la planta.

Terminador El término “terminador” abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad de transcripción que señala el procesamiento 3’ y la polladenilación de una transcripción primaria y la terminación de la transcripción. El terminador puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de planta o de T-ADN. El terminador a agregar puede derivar, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa o, alternativamente, de otro gen de planta o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariótico.

(Gen) marcador seleccionable/ Gen indicador Las expresiones “marcador seleccionable”, “gen marcador seleccionable” o “gen indicador” incluyen cualquier gen que confiere un fenotipo a una celula en la cual se expresa para facilitar la identificación y/o selección de las células que son transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácido nucleico mediante una serie de diferentes principios. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar a partir de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptl l que fosforila neomicina y canamicina, o hpt que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia, por ejemplo, a bleomicina, estreptomicina, tetracielina, cloramfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo, bar que confiere resistencia a Basta®; aroA o gox que confieren resistencia a glifosato, o los genes que confieren resistencia, por ejemplo, a ¡midazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proveen un rasgo metabólico (tales como manA que permite que las plantas usen mañosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos, tales como resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo, b-glucuronidasa, GUS o b-galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tales como el sistema de luciferina/luciferasa) o fluorescencia (proteína fluorescente verde, GFP, y sus derivados). Esta lista representa solo una pequeña cantidad de posibles marcadores. El experto en la téenica está familiarizado con estos marcadores. Se prefieren diferentes marcadores según el organismo y el método de selección.

Se sabe que luego de la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en las células vegetales, solo una minoría de las células absorbe el ADN exógeno y, si se desea, lo integra en su genoma, en función del vector de expresión y la técnica de transfección utilizados. Para identificar y seleccionar estos integrantes, por lo general, se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (tales como aquellos descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los cuales estos genes no sean funcionales mediante, por ejemplo, eliminación por metodos convencionales. Asimismo, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable se pueden introducir en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usar en los métodos de la invención, o de otro modo en un vector separado. Se pueden identificar las células que fueron transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, las células que integraron el marcador seleccionable sobreviven, mientras que las otras células mueren).

Debido a que los genes marcadores, en particular los genes de resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no son necesarios o no son deseados en la célula huésped transgénica, una vez que los ácidos nucleicos han sido introducidos con éxito, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos utiliza en forma ventajosa téenicas que permiten la eliminación o escisión de estos genes marcadores. Uno de esos métodos es conocido como co-transformación. El método de cotransformación utiliza dos vectores simultáneamente para la transformación, en donde un vector tiene el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo vector tiene el gen marcador. Una gran proporción de transformantes recibe o, en el caso de las plantas, comprende (hasta 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de la transformación con Agrobacterias, los transformantes, por lo general, reciben solo una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el T-ADN, que con frecuencia, representa el casete de expresión. Luego, los genes marcadores se pueden eliminar de la planta transformada mediante la realización de cruzas. En otro método, los genes marcadores integrados en un transposón se utilizan para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como teenología Ac/Ds). Los transformantes se pueden cruzar con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, en forma transitoria o estable. En algunos casos (aproximadamente 10%), el transposón salta fuera del genoma de la célula huésped una vez que se ha producido con éxito la transformación y se pierde. En otros casos, el transposón salta a una ubicación diferente. En estos casos, el gen marcador se debe eliminar mediante la realización de cruzas. En microbiología, se desarrollaron técnicas que posibilitan o facilitan la detección de dichos eventos. Otro método ventajoso es lo que se conoce como sistemas de recombinación, cuya ventaja es que se puede prescindir de la eliminación por cruza. El sistema más conocido de este tipo es el denominado sistema Cre/lox. Creí es una recombinasa que elimina las secuencias ubicadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, se lo elimina una vez que se ha producido con éxito la transformación mediante la expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son los sistemas HI N/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al. , J. Biol. Chem. , 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al. , J. Cell Biol. , 149, 2000: 553-566). Es posible una integración específica de sitio de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en el genoma de la planta. Obviamente, estos métodos también se pueden aplicar a microorganismos tales como levadura, hongos o bacterias.

T ransgénico/T ransgén/Recombinante A los fines de la invención, "transgénico", "transgén" o "recombinante" significan, por ejemplo, con respecto a una secuencia de ácidos nucleicos, un casete de expresión, una construcción genética o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con las secuencias de ácidos nucleicos, los casetes de expresión o los vectores de acuerdo con la invención, todas aquellas construcciones obtenidas por métodos recombinantes en los cuales (a) las secuencias de los ácidos nucleicos de flavodoxina o una parte de estas, o (b) las secuencias de control genético ligadas operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos de flavodoxina de acuerdo con la invención, por ejemplo, un promotor, o (c) a) y b) no se encuentran en su entorno genético natural o fueron modificadas por métodos recombinantes, por ejemplo, fueron modificadas y/o insertadas por el hombre, por ejemplo, mediante métodos de ingeniería genética.

La modificación puede adoptar la forma, por ejemplo, de una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. La frase entorno genético natural significa el locus cromosómico o genómico natural en la planta original o la presencia en una genoteca genómica o la combinación con el promotor natural.

La unión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido de tránsito de direccionamiento al plástido con un ácido nucleico que codifica una flavodoxina, como se define en la presente, que no está naturalmente ligado a ese péptido de tránsito crea una secuencia recombinante.

Un ácido nucleico recombinante, casete de expresión, construcción genética o construcción de vector comprenden, preferentemente, un gen natural y un promotor natural, un gen natural y un promotor no natural, un gen no natural y un promotor natural, o un gen no natural y un promotor no natural.

Preferentemente, en el caso de una genoteca, se retiene, al menos en parte, el entorno genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos. El ambiente flanquea la secuencia de ácidos nucleicos al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 bp, preferentemente, al menos 500 bp, preferentemente, en especial al menos 1000 bp, con máxima preferencia, al menos 5000 bp.

Un casete de expresión natural — por ejemplo la combinación natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína útil en los métodos de la presente invención, como se definió anteriormente— se convierte en un casete de expresión recombinante cuando este casete de expresión es modificado por el hombre mediante métodos de síntesis no naturales (“artificiales”), tales como tratamiento mutagénico. Se describen métodos adecuados, por ejemplo, en US 5.565.350, WO 00/15815 o US200405323. Además, un casete de expresión natural —por ejemplo, la combinación natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína útil en los métodos de la presente invención, como se definió anteriormente— se convierte en un casete de expresión recombinante cuando este casete de expresión no está integrado en el entorno genético natural, sino en un entorno genético diferente.

También se debe tener en cuenta que, en el contexto de la presente invención, las expresiones “ácido nucleico aislado" o “proteína aislada” se pueden considerar, en algunos casos, sinónimo de un “ácido nucleico recombinante” o “proteína recombinante’’, respectivamente, y se refieren a un ácido nucleico o una proteína que no se encuentra en su entorno genético natural y entorno celular, respectivamente. El gen aislado se puede aislar de un organismo o puede ser preparado por el hombre, por ejemplo, mediante síntesis química. En una modalidad, una secuencia de ácidos nucleicos aislada o una molécula de ácido nucleico aislada es una que no se encuentra en su entorno natural ni cerca de los ácidos nucleicos naturales; sin embargo, se encuentra física y funcionalmente conectada con otras secuencias de ácidos nucleicos o moleculas de ácidos nucleico y se halla como parte de una construcción de ácido nucleico, secuencia de vector o cromosoma.

Como se usa en la presente, el término “transgénico” se refiere a un organismo, por ejemplo, planta transgénica se refiere a un organismo, por ejemplo, una planta, célula vegetal, callo, tejido vegetal o parte de planta que contiene de manera exógena el ácido nucleico, construcción, vector o casete de expresión descritos en la presente o una parte de estos que se introduce preferentemente mediante procesos que no son esencialmente biológicos, preferentemente, mediante transformación mediada por Agrobacteria o bombardeo de partículas. Por ello, para los fines de la invención, una planta transgénica significa, como se indicó con anterioridad, que los ácidos nucleicos descritos en la presente no están presentes o no se originan en el genoma de esa planta, o están presentes en el genoma de esa planta, pero no en su entorno genético natural en el genoma de la planta, es posible que los ácidos nucleicos se expresen de manera homologa o heteróloga. Sin embargo, como se mencionó, transgénico también significa que, mientras que los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o utilizados en el método de la invención se encuentran en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia fue modificada con respecto a la secuencia natural y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales fueron modificadas. "Transgénico" significa que se produce la expresión, en las plantas, de las secuencias de ácidos nucleicos naturales en un entorno genético no natural en el genoma, es decir, la expresión homologa, o la expresión heteróloga de secuencias de ácidos nucleicos no naturales. Las plantas transgénicas preferidas se mencionan en la presente.

Modulación El término “modulación” significa, con respecto a la expresión o expresión génica, un proceso en el que el nivel de expresión es cambiado por dicha expresión génica en comparación con la planta de control; el nivel de expresión se puede aumentar o disminuir. La expresión original no modulada puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN (ARNr, ARNt) o ARNm estructural con la posterior traducción. A los fines de la presente invención, la expresión original no modulada también puede ser la ausencia de cualquier expresión. Las expresiones “modulación de la actividad” o "modular la expresión" significan cualquier cambio de expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención y/o proteínas codificadas, que genera un aumento o una disminución de los rasgos relacionados con el rendimiento, tales como un aumento o una disminución del rendimiento de semillas y/o del crecimiento de las plantas. La expresión puede aumentar desde cero (ausencia de expresión o expresión no medible) hasta una cierta cantidad, o puede disminuir desde una cierta cantidad hasta cantidades pequeñas no medibles o hasta cero.

Expresión Los términos “expresión” o “expresión génica” significan la transcripción de un gen específico o genes específicos, o construcción genética específico. En particular, los términos “expresión” o “expresión génica” significan la transcripción de uno o más genes o construcción genética en ARN (ARNr, ARNt) o ARNm estructural con o sin la posterior traducción del último en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y el procesamiento del producto de ARNm resultante. Las expresiones “expresión” o “expresión génica” también pueden incluir la traducción del ARNm y, con ella, la síntesis de la proteína codificada, es decir, la expresión de la proteína.

Mayor expresión/expresión meiorada/sobreexpresión Como se usan en la presente, las expresiones “expresión aumentada”, "expresión mejorada" o “sobreexpresión” significan cualquier forma de expresión adicional al nivel de expresión original del tipo silvestre. A los fines de la presente invención, el nivel de expresión original del tipo silvestre también puede ser cero, es decir, ausencia de expresión o expresión no medible. La referencia en la presente a "expresión aumentada”, "expresión mejorada" o "sobreexpresión" significan un aumento de la expresión génica y/o, con respecto a los polipéptidos, un aumento de los niveles de polipéptidos y/o actividad de polipéptidos, con respecto a las plantas de control. El aumento de la expresión, de los niveles de polipéptidos o de la actividad de los polipéptidos es de, en orden creciente de preferencia, al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 100% o incluso más en comparación con las plantas de control. El aumento de la expresión puede ser, en orden creciente de preferencia, al menos 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% o más en comparación con las plantas de control. Cuando las plantas de control tienen muy poca expresión, niveles de polipéptidos o actividad de polipéptidos de la secuencia en cuestión, y/o el gen recombinante se encuentra bajo el control de elementos reguladores fuertes, el aumento de expresión, niveles de polipéptidos o actividad de polipéptidos puede ser de al menos 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, 2000 veces, 3000 veces, 5000 veces, 10 000 veces, 20 000 veces, 50 000 veces, 100 000 veces o incluso más en comparación con las plantas de control .

Los métodos para aumentar la expresión de genes o productos génicos están documentados en el estado de la téenica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por promotores adecuados, el uso de potenciadores de la transcripción o de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que actúan como elementos promotores o potenciadores se pueden introducir en una posición adecuada (en general, corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido, a fin de reguiar en forma ascendente la expresión de un ácido nucleico que codifica ei polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos se pueden alterar ¡n vivo mediante mutación, eliminación y/o sustitución (véase, Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al. , W09322443) o se pueden introducir promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y distancia adecuadas de un gen de la presente invención, a fin de controlar la expresión del gen.

Si se desea obtener la expresión de un polipéptido, en general, es conveniente incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificante de polinucleótidos. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de planta o de T-ADN. La secuencia del terminal 3' que se desea agregar puede derivar, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa o, alternativamente, de otro gen vegetal o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariótico.

También se puede agregar una secuencia intrónica a la región 5' no traducida (UTR) o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el c itosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción tanto en las construcciones de expresión vegetales y animales aumenta la expresión génica a nivel del ARNm y de las proteínas hasta 1000 veces (Buchman and Berg ( 1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Ca I lis et al. ( 1987) Genes Dev 1 : 1 183-1200). En general, la mejora intrónica de la expresión génica es mayor cuando se coloca cerca del terminal 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones del maíz intrón Adh 1-S 1 , 2 y 6, el intrón Bronze-1 es conocido en el estado de la téenica. Para información general véase: The Maize Handbook, Capítulo 1 16, Freeling y Walbot, Eds. , Springer, N.Y. (1994).

Para lograr un aumento de la expresión o sobreexpresión de un polipéptido, con frecuencia el ácido nucleico que codifica este polipéptido se sobreexpresa en orientación sentido con una señal de poliadenilación. Pueden usarse intrones u otros elementos potenciadores, además de un promotor adecuado para dirigir la expresión con el patrón de expresión previsto. En contraposición, la sobreexpresión de la misma secuencia de ácidos nucleicos como construcción antisentido no resultará en el aumento de la expresión de la proteína, sino en la disminución del a expresión de la proteína.

Menor expresión La referencia en la presente a “menor expresión” o “reducción o eliminación considerable" de la expresión significa una disminución en la expresión de un gen endógeno y/o en los niveles de polipéptidos y/o en la actividad de polipéptidos con respecto a las plantas de control. La reducción o eliminación considerable es, en orden creciente de preferencia, al menos, 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80% , 85%, 90% o 95%, 96%, 97% , 98%, 99% o más de reducción en comparación con las plantas de control.

T ransformación Los términos “introducción” o “transformación”, como se indican en la presente, abarcan la transferencia de un polinucleótido exógeno a una célula huésped, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido vegetal capaz de propagación clonal posterior, ya sea por organogénesis o embriogénesis, se puede transformar con una construcción genética de la presente invención, y se puede regenerar una planta completa a partir de él. El tejido particular elegido variará según los sistemas de propagación clonal disponibles y más adecuados para la especie particular a transformar. Los ejemplos de tejidos diana incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, brotes axilares y meristemas de raíz) y tejido del meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotilo). El polinucleótido se puede introducir en forma transitoria o estable en una célula huésped y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, se lo puede integrar en el genoma del huésped. La célula vegetal transformada resultante luego se puede utilizar para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas del oficio de nivel medio. De manera alternativa, una célula vegetal que no se puede regenerar en una planta puede seleccionarse como célula huésped, es decir, la célula vegetal transformada resultante no tiene la capacidad de regenerarse en una planta (completa).

La transferencia de genes exógenos al genoma de una planta se denomina transformación. En la actualidad, la transformación de especies vegetales es una teenica muy habitual. De manera ventajosa, se puede utilizar cualquiera de los diversos métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula ancestral adecuada. Los métodos descritos para la transformación y regeneración de las plantas a partir de tejidos o células vegetales se pueden usar para la transformación transitoria o estable. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la absorción de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación con virus o polen y microproyección. Los métodos se pueden seleccionar del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al. , (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (S h i I lito R. D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1 102); micromyección en material vegetal (Crossway A et al. , (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein TM et al. , (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrativos) y similares. Las plantas transgénicas, incluso las plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacterium. Un método de transformación conveniente es la transformación en la planta. Con este fin, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen en las semillas de la planta o inocular el meristema de la planta con agrobacterias. Se ha demostrado que es particularmente oportuno de acuerdo con la invención permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe en la planta intacta o al menos en los primordios de la flor. La planta se cultiva posteriormente hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los métodos para la transformación de arroz mediada por Agrobacterium incluyen métodos muy conocidos para la transformación del arroz, tales como los descritos en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente europea EP 1 198985 A1 , Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491 -506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271 -282, 1994), cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como se describe en Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129(1 ): 13-22, 2002), cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Dichos métodos se describen también a modo de ejemplo en B. Jenes et al. , Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991 ) 205-225). Los ácidos nucleicos o la construcción que se desean expresar se clonan, preferentemente, en un vector adecuado para la transformación de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, pBin 19 (Bevan et al. , Nucí. Acids Res. 12 (1984) 871 1 ). Las agrobacterias transformadas por dicho vector luego se pueden utilizar de la manera conocida para la transformación de plantas, tales como plantas utilizadas como modelo, como Arabidopsis (dentro del alcance de la presente invención, Arabidopsis thaliana no se considera una planta de cultivo) o plantas de cultivo, tales como las plantas de tabaco, por ejemplo, mediante la inmersión de hojas machacadas u hojas picadas en una solución de agrobacterias y, luego, el cultivo en un medio adecuado. La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens se describe, por ejemplo, en Hofgen y Willmitzer en Nucí. Acid Res. ( 1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, de F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Además de la transformación de células somáticas, que luego se deben regenerar en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemas de plantas y, en particular, las células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, y producen las plantas transgénicas. De este modo, por ejemplo, las semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y las semillas se obtienen a partir de las plantas en desarrollo, de las cuales cierta proporción es transformada y, por lo tanto, transgénica [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208: 1 -9; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N- H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289] Los métodos alternativos se basan en la eliminación reiterada de las inflorescencias y la incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con las agrobacterias transformadas, por lo cual las semillas transformadas también se pueden obtener en un momento posterior (Chang (1994). Plant J . 5: 551 -558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente eficaz es el método de infiltración con vacío con sus modificaciones, tal como el método de “inmersión floral”. En el caso de infiltración con vacío de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión de agrobacterias [Bechthold, N (1 993). C R Acad Sci París Life Sci, 316: 1 194-1 199], mientras que en el caso del método de “inmersión floral” el tejido floral en desarrollo se incuba por breve tiempo con una suspensión de agrobacterias tratada con tensioactivos [Clough, SJ y Bent AF ( 1998) The Plant J. 16, 735-743]. En ambos casos se cosecha una cierta proporción de semillas transgénicas y estas semillas se pueden distinguir de las semillas no transgénicas por el cultivo en las condiciones selectivas antes descritas. Además, la transformación estable de los plástidos es conveniente, porque los plástidos se heredan por vía materna en la mayoría de los cultivos, lo cual reduce o elimina el riesgo de flujo de transgenes mediante polen. Por lo general, la transformación del genoma del cloroplasto se obtiene mediante un proceso que se representa en forma esquemática en Klaus et al. , 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229] En síntesis, las secuencias por transformar se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre las secuencias flanqueadoras homologas del genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueadoras homologas dirigen la integración específica de sitio en el plastoma. La transformación de los plástidos ha sido descrita para diferentes especies de plantas y se provee una reseña en Bock (2001 ) Transgenlc plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 21 de septiembre de 2001 ; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21 , 20-28. Recientemente se ha informado otro progreso bioteenológico en forma de transformantes de plástidos libres de marcadores, que se pueden producir mediante un gen marcador co-integrado transitorio (Klaus et al. , 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

Las células vegetales modificadas genéticamente se pueden regenerar mediante todos los métodos conocidos por el experto en la técnica. Se pueden encontrar métodos adecuados en las publicaciones antes mencionadas de S. D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hofgen y Willmitzer. De manera alternativa, las células vegetales modificadas genéticamente no se pueden regenerar en una planta entera.

Generalmente, después de la transformación, las células vegetales o los agrupamientos celulares se seleccionan para determinar la presencia de uno o más marcadores codificados por genes expresables en plantas co-transferidos con el gen de interés, luego de lo cual el material transformado se regenera en una planta entera. Para seleccionar las plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformación se somete, en general, a condiciones selectivas a fin de poder distinguir las plantas transformadas de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas del modo antes descrito se pueden plantar y, luego de un período de crecimiento inicial, se pueden someter a una selección adecuada mediante pulverización. Otra posibilidad consiste en cultivar las semillas, en caso de ser adecuado, luego de la esterilización, en placas de agar mediante el uso de un agente de selección adecuado a fin de que solo las semillas transformadas puedan crecer hasta convertirse en plantas. De modo alternativo, las plantas transformadas se controlan para detectar la presencia de un marcador seleccionable, tales como los descritos en la presente.

Luego de la regeneración y transferencia de ADN, las plantas posiblemente transformadas también se pueden evaluar, por ejemplo, mediante análisis Southern, para determinar la presencia del gen de interés, la cantidad de copias y/o la organización genómica. De modo alternativo o adicional, se pueden controlar los niveles de expresión del ADN recién introducido mediante análisis Northern y/o Western; ambas téenicas son conocidas por las personas del oficio de nivel medio.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar por diversos medios, tales como propagación clonal o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, se puede autocruzar una planta transformada de primera generación (o T1 ) y seleccionar transformantes homocigotas de segunda generación (o T2), y las plantas T2 luego se pueden propagar tambien mediante téenicas de reproducción clásicas. Los organismos transformados generados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y no transformadas; transformantes clónales (por ejemplo, todas las células se transforman para que contengan el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado en un acodo no transformado).

En esta solicitud, una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal transformada con o indistintamente transformada por una construcción, o transformada con o mediante un ácido nucleico significa una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal que tiene dicha construcción o dicho ácido nucleico como un transgén debido al resultado de la introducción de dicha construcción o ácido nucleico mediante medios biotecnológicos. Por lo tanto, la planta, parte de planta, semilla o célula vegetal comprende dicha construcción recombinante o dicho ácido nucleico recombinante. Cualquier planta, parte de planta, semilla o célula vegetal que ya no contiene dicha construcción recombinante o dicho ácido nucleico recombinante luego de la introducción en el pasado se denomina segregante nulo, nulicigota o control nulo, pero no se considera una planta, parte de planta, semilla ni célula vegetal transformada con dicha construcción o con dicho ácido nucleico dentro del significado de la presente solicitud.

Marcación por activación de T-ADN La marcación por "activación de T-ADN" (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353) incluye la inserción de T-ADN, que usualmente contiene un promotor (también puede ser un potenciador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de Interés o 10 kb corriente arriba o corriente abajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirige la expresión del gen objetivo. En general, la regulación de la expresión del gen objetivo por su promotor natural se altera, y el gen cae bajo el control del promotor recién introducido. El promotor está típicamente incluido en un T-ADN . Este T-ADN se inserta en forma aleatoria en el genoma de la planta, por ejemplo, mediante infección con Agrobacterium, y conduce a la expresión modificada de los genes cerca del T-ADN insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de los genes cercanos al promotor introducido.

TILLI NG El término “TI LLI NG” es la abreviatura de "Targeted Induced Local Lesions In Genomes" (Lesiones locales inducidas dirigidas en genomas) y se refiere a una teenología de mutagénesis útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificada. TILLING también permite la selección de plantas que portan dichos variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir expresión modificada, ya sea en potencia o ubicación o duración (por ejemplo, si las mutaciones afectan al promotor). Estas variantes mutantes pueden exhibir mayor actividad que la exhibida por el gen en su forma natural. TILLI NG combina mutagenesis de alta densidad con métodos de barrido de alto rendimiento. Las etapas que habitualmente se siguen en TILLI NG son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP y Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH , Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al. , (1994) In Mcyerowitz EM , Somerville CR, eds, Arabidopsis. Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J y Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91 -104); (b) preparación de ADN y agrupamiento de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización y apareamiento para permitir la formación de heterodúplex; (e) DH PLC, cuando se detecta la presencia de un heterodúplex en un grupo como un pico adicional en el cromatograma; (f) identificación del individuo mutante; y (g) secuenciación del producto de PCR mutante. Los métodos para TI LLI NG son muy conocidos en el estado de la téenica (McCallum et al. , (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; reseña de Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Recombinación homologa La "recombinación homologa" permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homologa es una teenología estándar que se usa en forma rutinaria en las ciencias biológicas para organismos inferiores, tales como levadura o el musgo Physcomitrella. Los métodos para realizar la recombinación homologa en las plantas han sido descritos no solo para las plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para las plantas de cultivo, por ejemplo, arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; l ida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8) y hay enfoques que son aplicables en general, independientemente del organismo objetivo (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

Rasgos relacionados con el rendimiento Un "rasgo relacionado con el rendimiento" es un rasgo o una característica que se relaciona con el rendimiento de la planta. Los rasgos relacionados con el rendimiento pueden comprender uno o más de la siguiente lista no limitativa de características: tiempo de floración temprano, rendimiento, biomasa, rendimiento de semilla, vigor temprano, índice de verdor, tasa de crecimiento, rasgos agronómicos, por ejemplo, tolerancia a la inmersión (que genera mayor rendimiento del arroz), eficacia en el uso del agua (WUE), eficacia en el uso de nitrógeno (NUE), etc.

La expresión “uno o más rasgos relacionados con el rendimiento” se refiere a un rasgo relacionado con el rendimiento, o a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más rasgos relacionados con el rendimiento de una planta, en comparación con una planta de control.

La referencia en la presente a "mejores rasgos relacionados con el rendimiento" significa un aumento, con respecto a las plantas de control, de un rasgo relacionado con el rendimiento, por ejemplo, de vigor temprano, de rendimiento de la semilla y/o de biomasa, de una planta entera o de una o más partes de una planta, que pueden incluir (i) partes aéreas, preferentemente, partes aéreas cosechables y/o (ii) partes subterráneas, preferentemente, partes subterráneas cosechables.

En particular, las partes cosechables son raíces, tales como raíces principales, tallos, remolachas, hojas, flores o semillas, y la realización de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen mayor rendimiento de semillas con respecto al rendimiento de semillas de las plantas de control y/o mayor biomasa aérea, en particular, biomasa del tallo con respecto a la biomasa aérea, en particular, biomasa del tallo de las plantas de control y/o mayor biomasa de raíces con respecto a la biomasa de raíces de las plantas de control y/o mayor biomasa de remolacha con respecto a la biomasa de remolacha de las plantas de control. Además, en particular se contempla que el contenido de azúcar (en particular, el contenido de sacarosa) en las partes aéreas, en particular en el tallo (en particular, de las plantas de caña de azúcar) y/o en las partes subterráneas, en particular en las raíces, que incluyen las raíces principales y los tubérculos, y/o en la remolacha (en particular, en la remolacha azucarera) aumenta con respecto al contenido de azúcar (en particular, el contenido de sacarosa) en las partes correspondientes de la planta de control.

A lo largo de la presente solicitud, la tolerancia y/o resistencia de una planta a uno o más productos agroquímicos, por ejemplo, tolerancia a herbicidas, no se considera un rasgo relacionado con el rendimiento en el sentido que tiene este término en la presente solicitud. Una tolerancia y/o resistencia alterada de una planta a uno o más productos agroquímicos, por ejemplo, mejor tolerancia a los herbicidas, no es un “rasgo mejorado relacionado con rendimiento” como se usa en la presente solicitud.

En una modalidad particular de la presente invención, cualquier referencia a uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento pretende excluir la restauración de la expresión y/o actividad del polipéptido POI en una planta en la que la expresión y/o la actividad del polipéptido POI está reducida o impedida en comparación con la planta de tipo silvestre original o variedad original. Por ejemplo, la sobreexpresión del polipéptido POI en una variante de un mutante inactivado de una planta, en donde el polipéptido POI o un ortólogo o parálogo fue inactivado, no se considera una mejora de uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en el sentido de la presente invención.

Rendimiento En general, término “rendimiento” significa un producto mensurable de valor económico, típicamente relacionado con un cultivo, área y período específicos. Las partes individuales de plantas contribuyen directamente al rendimiento sobre la base de su cantidad, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado para un cultivo y año, el cual se determina dividiendo la producción total (incluye tanto la producción cosechada como la producción calculada) por metro cuadrado plantado.

En la presente, las expresiones “rendimiento de una planta” y "rendimiento vegetal" se usan de manera indistinta y se refieren a la biomasa vegetativa, tal como biomasa de raíces y/o brotes, a los órganos reproductivos y/o a los propágulos, tales como semillas, de esa planta.

Las flores en el maíz son unisexuales; las inflorescencias masculinas (panojas) se originan en el tallo apical y las inflorescencias femeninas (mazorcas) surgen de los ápices de yemas axilares. La inflorescencia femenina produce pares de espículas en la superficie de un eje central (mazorca). Cada una de estas espículas femeninas encierra dos florcillas fértiles, una de ellas generalmente madura en un grano de maíz luego de ser fertilizada. Por lo tanto, el aumento del rendimiento en el maíz se puede manifestar como uno o más de los siguientes; aumento de la cantidad de plantas establecidas por metro cuadrado, aumento de la cantidad de mazorcas por planta, aumento de la cantidad de hileras, cantidad de granos por hilera, peso del grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de la mazorca, aumento de la tasa de llenado de semillas, que es la cantidad de florcillas llenas (es decir, florcillas que contienen semillas) dividido entre la cantidad total de florcillas y multiplicado por 100), entre otros.

Las inflorescencias en las plantas de arroz se denominan panículas. Las panículas tienen espículas, que son la unidad básica de las panículas y consiste en un pedículo y en una florci lia. La florcilla se origina en el pedículo e incluye una flor cubierta por dos glumas protectoras: una gluma más grande (lema) y una gluma más corta (palea). Por lo tanto, si se toma el arroz como ejemplo, el aumento del rendimiento se puede manifestar como el aumento de uno o más de los siguientes: cantidad de plantas por metro cuadrado, cantidad de panículas por planta, longitud de la panícula, cantidad de espículas por panícula, cantidad de flores (o florcillas) por panícula; un aumento de la tasa de llenado de semillas, que es la cantidad de florcillas llenas (es decir, florcillas que contienen semillas dividido por la cantidad total de florcillas y multiplicado por 100); aumento del peso de mil granos, entre otros.

Tiempo de floración temprano Como se usa en la presente, las plantas que tienen un “tiempo de floración temprano” son plantas que comienzan a florecer antes que las plantas de control. Por lo tanto, este termino se refiere a plantas que muestran un inicio de floración más temprano. El tiempo de floración de las plantas se puede evaluar al contar la cantidad de días (“tiempo que tardan en florecer”) entre la siembra y el surgimiento de la primera inflorescencia. Por ejemplo, el "tiempo de floración" de una planta se puede determinar con el metodo descrito en WO 2007/093444.

Vigor temprano “Vigor temprano” se refiere al crecimiento activo, sano y equilibrado, especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y puede ser el resultado de un mejor estado físico de la planta debido, por ejemplo, a que las plantas se adaptan mejor a su medio ambiente (es decir, optimizan el uso de recursos de energía y los reparten entre los brotes y las raíces). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran mayor supervivencia de las plántulas y mejor establecimiento del cultivo, lo que habitualmente da como resultado campos muy uniformes (en donde el cultivo crece de manera uniforme, es decir, la mayoría de las plantas alcanza los diversos estadios del desarrollo considerablemente al mismo tiempo), y a menudo mejor y mayor rendimiento. Por lo tanto, el vigor temprano se puede determinar al medir varios factores, tales como peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de plantas que emergen, crecimiento de las plántulas, altura de las plántulas, longitud de raíces, biomasa de raíces y brotes y muchos otros.

Aumento de la tasa de crecimiento El aumento de la tasa de crecimiento puede ser específico de una o más partes de una planta (incluso semillas) o puede ser de casi la totalidad de la planta. Las plantas con mayor tasa de crecimiento pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede significar el tiempo necesario para que se desarrolle desde la semilla madura hasta la etapa en la cual la planta produjo semillas maduras, similares al material de inicio. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tales como velocidad de germinación, vigor temprano, tasa de crecimiento, índice de verdor, tiempo de floración y velocidad de maduración de la semilla. El aumento de tasa de crecimiento puede ocurrir en una o más etapas del ciclo de vida de una planta o durante considerablemente todo el ciclo de vida de la planta. El aumento de la tasa de crecimiento durante las etapas tempranas del ciclo de vida de una planta puede reflejar vigor mejorado. El aumento de la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta, lo cual permite sembrar las plantas más tarde y/o cosecharlas antes de lo que sería posible de otro modo (se puede obtener un efecto similar con tiempo de floración más temprano). Si se aumenta lo suficiente la tasa de crecimiento, esto puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo, sembrar y cosechar plantas de arroz seguido de la siembra y cosecha de otras plantas de arroz, todo dentro de un período de crecimiento convencional). De modo similar, si se aumenta lo suficiente la tasa de crecimiento, esto puede permitir la siembra adicional de semillas de distintas especies de plantas (por ejemplo, sembrar y cosechar plantas de maíz seguido, por ejemplo, de la siembra y cosecha opcional de soja, papa o cualquier otra planta adecuada). Tambien pueden ser posibles cosechas adicionales de los mismos rizomas, en el caso de algunas plantas de cultivo. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un aumento de la producción de biomasa anual por metro cuadrado (debido a un aumento de la cantidad de veces (por ejemplo, por año) que se puede cultivar y cosechar cualquier planta particular). Un aumento de la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que la de sus contrapartes de tipo silvestre, debido a que las limitaciones territoriales para el desarrollo de un cultivo con frecuencia están determinadas por condiciones ambientales adversas al momento de la plantación (estación temprana) o al momento de la cosecha (estación tardía). Dichas condiciones adversas se pueden evitar si se acorta el ciclo de cosecha. La tasa de crecimiento se puede determinar al derivar varios parámetros de las curvas de crecimiento, dichos parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 90% de su tamaño máximo), entre otros.

Rendimiento de semillas Un aumento del rendimiento de semillas se puede manifestar como uno o más de los siguientes: a) mayor biomasa de semillas (peso total de las semillas) que puede ser por semilla y/o por planta y/o por metro cuadrado; b) mayor cantidad de flores por planta; c) mayor cantidad de semillas; d) mayor tasa de llenado de semillas (que se expresa como la proporción entre la cantidad de florcillas llenas dividido entre la cantidad total de florcillas); e) mayor índice de cosecha, que se expresa como la proporción entre el rendimiento de las partes cosechables, tales como semillas, dividido por la biomasa de las partes aereas de la planta; y f) mayor peso de mil granos (TKW), que se extrapola de la cantidad de semillas contadas y su peso total. Un mayor TKW puede ser el resultado de un mayor tamaño de las semillas y/o peso de las semillas, y también puede ser el resultado de un mayor tamaño del embrión y/o endosperma.

Las expresiones “florcillas llenas” y “semillas llenas” se pueden considerar sinónimos.

Un mayor rendimiento de semillas también se puede manifestar como un mayor tamaño de las semillas y/o volumen de las semillas.

Asimismo, un mayor rendimiento de semillas tambien se puede manifestar como una mayor área de la semilla y/o longitud de la semilla y/o ancho de la semilla y/o perímetro de la semilla.

Indice de verdor Como se usa en la presente, el “índice de verdor” se calcula de imágenes digitales de plantas. Para cada píxel que pertenece a la planta objeto de la imagen, se calcula la proporción del valor de verde con respecto al valor de rojo (en el modelo RGB para la codificación de color). El índice de verdor se expresa como el porcentaje de píxeles para los cuales la proporción verde-rojo excede un umbral determinado. En condiciones normales de crecimiento, en condiciones de crecimiento con estrés salino y en condiciones de crecimiento con disponibilidad reducida de nutrientes, el índice de verdor de las plantas se mide en la última formación de imágenes antes de la floración. Por el contrario, en condiciones de crecimiento con estrés por sequía, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera formación de imágenes después de la sequía.

Biomasa Como se usa en la presente, el término “biomasa” se refiere al peso total de una planta o parte de una planta. El peso total puede medirse como peso seco, peso fresco o peso húmedo. Dentro de la definición de biomasa, se puede hacer una distinción entre la biomasa de una o más partes de una planta, que pueden incluir uno o más de los siguientes: partes aereas, tales como biomasa de brotes, biomasa de semillas, biomasa de hojas, etc. ; partes aéreas cosechables, tales como biomasa de brotes, biomasa de semillas, biomasa de tallos, biomasa de hojas, esquejes, etc. ; partes subterráneas, tales como biomasa de raíz, tubérculos, bulbos, etc. ; partes subterráneas cosechables, tales como biomasa de raíz, tubérculos, bulbos, etc. ; partes cosechables parcialmente subterráneas, tales como remolacha y otras áreas del hipocotilo de la planta, rizomas, estolones o rizomas reptantes; biomasa vegetativa, tal como biomasa de raíz, biomasa de brotes, etc. ; órganos reproductivos; y propágulos, tales como semillas.

Raíz En una modalidad preferida, a lo largo de la presente solicitud, cualquier referencia a "raíz“ como biomasa o partes cosechables, o como órgano, por ejemplo de mayor contenido de azúcar, deberá interpretarse como una referencia a las partes cosechables que están parcialmente insertadas o en contacto físico con el suelo, tales como remolacha y otras áreas del hipocotilo de una planta, rizomas, estolones o rizomas reptantes, así como las partes cosechables subterráneas, tales como raíces, raíces primarias, tubérculos o bulbos, sin incluir las hojas.

Resistencia al estrés El aumento de la tasa de rendimiento y/o de crecimiento ocurre si la planta se encuentre en condiciones sin estrés o si la planta está expuesta a varios tipos de estrés, en comparación con las plantas de control. Las plantas típicamente responden a la exposición al estrés mediante un crecimiento más lento. En condiciones de estrés severo, la planta puede incluso detener su crecimiento por completo. Por otra parte, el estrés leve se define en la presente como cualquier estrés al que está expuesta una planta que no causa el cese por completo del crecimiento de una planta sin la capacidad de reiniciar el crecimiento. El estrés leve, en el sentido de la invención, genera una reducción del crecimiento de las plantas estresadas de menos de 40%, 35%, 30% o 25%, con mayor preferencia, menos de 20% o 15%, en comparación con las planta de control en condiciones sin estrés. Debido a los adelantos en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con plaguicidas), no es frecuente encontrar distintos tipos de estrés severo en plantas de cultivo cultivadas. En consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés leve es a menudo una característica indeseable en la agricultura.

El “estres biótico” es el impacto negativo que se produce en las plantas por parte de organismos vivos, tales como bacterias, virus, hongos, nematodos, insectos u otros animales o plantas. “Estrés biótico” es, en general, el estrés causado por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, plantas, nematodos e insectos, u otros animales, que pueden generar efectos negativos en el crecimiento y/o rendimiento de la planta.

“Estrés abiótico” significa el impacto negativo de factores no vivos en la planta viva en un entorno específico El estrés abiótico se puede deber a sequía o exceso de agua, estrés anaeróbico, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y temperaturas cálidas, frías o de congelación. El "estrés abiótico" puede ser estrés osmótico causado por estrés hídrico, por ejemplo, debido a sequía, estrés salino o estrés por congelación. El estrés abiótico también puede ser estrés oxidativo o estrés por frío. “Estrés por congelación” se refiere a estrés debido a las temperaturas de congelación, es decir, temperaturas en las cuales las moléculas de agua disponibles se congelan y se convierten en hielo. “Estrés por frío”, también denominado “estrés por heladas”, se refiere a temperaturas frías, por ejemplo, temperaturas menores de 10° o, preferentemente, menores de 5°C, pero a las cuales las moléculas de agua no se congelan. Como se informó en Wang et al. (Planta (2003) 218: 1 -14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan de manera adversa el crecimiento y la productividad de la planta. Se sabe que el estrés por sequía, salinidad, temperaturas extremas y el estrés oxidativo están interconectados y pueden inducir el crecimiento y daño celular mediante mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describe un grado particularmente alto de “comunicación cruzada” entre estrés por sequía y estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o la salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, lo cual da como resultado la interrupción de la homeóstasis y la distribución iónica en la célula. El estrés oxidativo, que frecuentemente acompaña al estrés por alta o baja temperatura, por salinidad o por sequía, puede causar la desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos tipos de estrés ambientales a menudo activan vías de señalización celular y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas por estrés, la regulación en forma ascendente de antioxidantes, la acumulación de solutos compatibles y la detención del crecimiento. Como se usa en la presente, las condiciones “sin estrés” son las condiciones ambientales que permiten el crecimiento óptimo de las plantas. Los expertos en la téenica conocen las condiciones normales del suelo y climáticas para una ubicación determinada. Las plantas en condiciones óptimas de crecimiento (que crecen en condiciones sin estrés) usualmente rinden, en orden creciente de preferencia, al menos 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% o 75% de la producción promedio de dicha planta en un ambiente determinado. La producción promedio se puede calcular sobre la base de una cosecha y/o estación. Los expertos en la téenica conocen el rendimiento promedio de la producción de un cultivo.

In cremento/Me i ora/Aumento Los términos “incremento”, “mejora” o “aumento”, en el contexto de un rasgo relacionado con el rendimiento, son indistintos y significan, en el sentido de la solicitud, al menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% , 9% o 10%, preferentemente, al menos 15% o 20%, con mayor preferencia, 25%, 30%, 35% o 40% de incremento en los rasgos relacionados con el rendimiento en comparación con las plantas de control como se definen en la presente.

Reproducción asistida por marcador Dichos programas de reproducción algunas veces requieren la introducción de variaciones alélicas mediante el tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando, por ejemplo, mutagénesis EMS; alternativamente, el programa puede comenzar con una colección de variantes alélicas del denominado origen “natural” causado de manera no intencional. Luego se realiza la identificación de variantes alélicas, por ejemplo, mediante PCR. Luego sigue una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que produce mayor rendimiento. Generalmente, la selección se realiza mediante el control del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. El crecimiento se puede controlar en un invernadero o en el campo. Otras etapas opcionales incluyen la cruza de plantas en las cuales la variante alelica superior se identificó con otra planta. Esto se puede usar, por ejemplo, para realizar una combinación de características fenotípicas de interés.

Uso como sondas en Imapeo genético El uso de ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés para el mapeo genético y físico de genes requiere solamente una secuencia de ácidos nucleicos de al menos 15 nucleótidos de longitud. Estos ácidos nucleicos se pueden utilizar como marcadores de polimorfismos de longitud del fragmento de restricción (RFLP). Las transferencias Southern (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning , A Laboratory Manual) de ADN genómico vegetal digerido por restricción se pueden sondear con los ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés. Los patrones de banda resultantes luego se pueden someter a análisis genéticos mediante el uso de programas de computación tales como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1 : 1 74-181 ) a fin de construir un mapa genético. Además, los ácidos nucleicos se pueden usar para sondear transferencias Southern que contienen ADN genómico tratado con endonucleasa de restricción de un conjunto de individuos que representan los progenitores y la progenie de una cruza genética definida. Se observa la segregación de los polimorfismos de ADN y se usa para calcular la posición del ácido nucleico que codifica la proteína de interés en el mapa genético que se obtuvo previamente con esta población (Botstein et al. (1980) Am. J . Hum. Genet. 32:314-331 ).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes vegetales para usar en el mapeo genético se describen en Bernatzky y Tankslcy ( 1986) Plant Mol . Biol. Repórter 4: 37-41 . Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de cADN específicos mediante la metodolog ía descrita anteriormente o sus variaciones. Por ejemplo, para el mapeo se pueden usar poblaciones de intercruza F2, poblaciones de retrocruza, poblaciones apareadas al azar, líneas isogénicas cercanas y otros conjuntos de individuos. Tales metodolog ías son muy conocidas por las personas del oficio de nivel medio.

Las sondas de ácidos nucleicos también se pueden usar para el mapeo físico (es decir, la ubicación de secuencias en mapas físicos; véase Hoheisel et al. En: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y las referencias allí citadas).

En otra modalidad, las sondas de ácidos nucleicos se pueden usar en el mapeo de hibridación in situ por fluorescencia directa (FISH) (Trask (1991 ) Trends Genet. 7: 149-154). Si bien los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de clones grandes (varios kb a varios cientos de kb; véase Laan et al. ( 1995) Genome Res. 5: 13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir la realización del mapeo FI SH con sondas más cortas.

Se pueden realizar diversos métodos basados en la amplificación de ácidos nucleicos para el mapeo genético y físico mediante el uso de ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen la amplificación específica de alelos (Kazazian (1998) J. Lab. Clin. Med 1 1 :95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligadura específica de alelos (Landegren et al. (1988) Science 241 : 1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671 ), mapeo de híbrido por radiación (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y mapeo Happy (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para utilizar en la reacción de amplificación o en las reacciones de extensión de cebadores. El diseño de dichos cebadores es muy conocido por las personas del oficio de nivel medio. En los métodos que utilizan mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar diferencias de secuencias de ADN entre los progenitores de la cruza por mapeo en la región correspondiente con la secuencia de ácidos nucleicos de la presente. Sin embargo, esto generalmente no es necesario para los métodos de mapeo.

Planta Como se usa en la presente, el término “planta” abarca plantas enteras, antecesores y progenie de las plantas y partes de plantas, incluso semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluso tubérculos), flores y tejidos y órganos, en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de Interés. El término “planta” también abarca células de plantas, cultivos en suspensión, tejidos de callos, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Plantas de control La elección de plantas de control adecuadas es una parte rutinaria de la preparación experimental y puede incluir las correspondientes plantas de tipo silvestre o las correspondientes plantas sin el gen de interés. En general, la planta de control es de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que se evaluará. La planta de control también puede ser un nullcigota de la planta que se evaluará. Los nulicigotas (o las plantas de control nulas) son individuos que carecen del transgén por segregación. Además, las plantas de control se cultivan en las mismas condiciones de crecimiento que las plantas de la invención, es decir, cerca de las plantas de la invención y simultáneamente con ellas. Como se usa en la presente, una “planta de control” se refiere no solo a las plantas completas, sino también a las partes de las plantas, que incluyen semillas y partes de semillas.

Material de propagación El “material de propagación” es cualquier clase de órgano, tejido o célula de una planta capaz de desarrollarse en una planta completa. El “material de propagación” puede ser a base de la reproducción vegetal (también conocida como propagación vegetal, multiplicación vegetal o clonación vegetal) o reproducción sexual. Por lo tanto, los materiales de propagación pueden ser semillas o partes de órganos no reproductivos, como tallos u hojas. En particular, con respecto a Poaceae, los materiales de propagación adecuados también pueden ser secciones del tallo, es decir, estacas de tallos (como esquejes).

Pedúnculo Un “pedúnculo” es el tallo de una Poaceae y también se lo denomina “caña fresable”, en particular para la caña de azúcar de la especie Saccharum. En el contexto de Poaceae, “pedúnculo”, “tallo”, “brote” o “vástago” se usan de manera indistinta.

Un “esqueje” es una sección del tallo de una Poaceae, en particular, de la caña de azúcar de la especie Saccharum, que es adecuada para usarse como material de propagación. Las expresiones sinónimas de “esqueje” son “tallo de caña para sembrar”, “estaca”, “sección del pedúnculo” y “trozo de semilla”.

En adelante, la expresión “como se define en la reivindicación/el inciso X" pretende indicarle a la persona del oficio de nivel medio que aplique la definición descrita en el inciso/la reivindicación X. Por ejemplo, “un ácido nucleico como se define en el inciso 1’’ significa que se debe aplicar la definición dei ácido nucleico del inciso 1 al ácido nucleico. En consecuencia, las expresiones “como se define en el inciso” o “como se define en la reivindicación” se pueden reemplazar por la definición correspondiente de ese inciso o reivindicación, respectivamente.

Descripción detallada La presente invención muestra que aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico de flavodoxina que codifica un polipéptido de flavodoxina, usando un tipo de promotor particular y direccionamiento a plástidos, produce plantas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

Cualquier referencia de aquí en adelante a una “proteína útil en los métodos de la invención” significa un polipéptido de flavodoxina, como se define en la presente. Cualquier referencia de aquí en adelante a un “ácido nucleico útil en los métodos de la invención” significa un ácido nucleico capaz de codificar el polipéptido de flavodoxina con direccionamiento a plástidos. En una modalidad, cualquier referencia a una proteína, un ácido nucleico o una construcción de expresión "útiles en los métodos de la invención” debe interpretarse como proteínas, ácidos nucleicos o construcciones de expresión “útiles en los métodos, las construcciones vectores, las plantas, las plantas cosechables y los productos de la invención”. El ácido nucleico que se introducirá en una planta (y, por lo tanto, útil para realizar los métodos de la invención) es cualquier ácido nucleico que codifica el tipo de proteína que se describirá a continuación, en adelante también denominado "ácido nucleico POI", "gen ROG, "ácido nucleico de flavodoxina" o "gen de flavodoxina", que codifica preferentemente esa proteína con una señal de direccionamiento al plástido de una planta.

Cualquier referencia en la presente a “un promotor particular” significa un promotor de GOS2, como se define en la presente.

Por ello, un ácido nucleico de flavodoxina que codifica un polipéptido de flavodoxina es útil en las construcciones genéticas, métodos, plantas, partes cosechables y productos de la presente invención. Preferentemente, el ácido nucleico de flavodoxina es una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: (i) un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77% , 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC I D NO: 1 , 13 o 15, o un fragmento funcional, derivado, ortógolo o parálogo del mismo; (ii) la secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de (i); (iii) un ácido nucleico que codifica un polipeptido de flavodoxina que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEC I D NO: 2 o 16, o un fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo del mismo; preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; y (iv) una molécula de ácido nucleico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.

Con mayor preferencia, el ácido nucleico de flavodoxina aislado comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: (i) un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC I D NO: 1 , 1 3 o 15; (ii) la secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de (i); (iii) un ácido nucleico que codifica un polipeptido de flavodoxina que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEC I D NO: 2 o 16, preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; y (iv) una molécula de ácido nucleico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) en condiciones de hibridación muy rigurosas.

Los porcentajes de identidad de un ácido nucleico se expresan con referencia a la región nucleotídica total indicada en una secuencia que se describe específicamente en la presente.

En una modalidad preferida, el ácido nucleico de flavodoxina útil en los métodos, construcciones de vectores, plantas, partes cosechadles y productos de la invención codifica un polipéptido que comprende uno o más de los dominios y motivos enumerados en el Cuadro B, con mayor preferencia, el dominio PFAM PF00258, preferentemente, cuando se analiza con el software InterproScan descrito en el Ejemplo 2. También se prefiere una localización y/u orden de uno o más dominios y/o motivos enumerados en el Cuadro B dentro de la secuencia de polipéptidos del polipéptido de flavodoxina que es sustancialmente igual al que se muestra para SEC ID NO: 2 en la Figura 1 . Con máxima preferencia, el ácido nucleico de flavodoxina aislado comprende o consiste en una secuencia representada en SEC ID NO: 1 , 13 o 15, un complemento del mismo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina con SEC I D NO: 2 o 16, o una molécula de ácido nucleico que se híbrida con cualquiera de estas moléculas de ácido nucleico o una secuencia complementaria de estas en condiciones de hibridación rigurosas y, preferentemente, que codifica un polipéptido que comprende uno o más de los dominios y motivos enumerados en el Cuadro B, con mayor preferencia, el dominio PFAM PF00258, preferentemente, cuando se analiza con el software InterproScan descrito en el Ejemplo 2.

Los ácidos nucleicos de flavodoxina preferidos se indican en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. En una modalidad, el ácido nucleico de flavodoxina comprende una secuencia de ácidos nucleicos indicados en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Muy preferente como ácido nucleico de flavodoxina es una secuencia de ácidos nucleicos que comprende el gen de flavodoxina de Anabaena sp. , preferentemente, Anabaena PCC71 19, o Synechocystis sp. , preferentemente, Synechocystis sp. PCC 6803. El ácido nucleico de flavodoxina más preferido es una secuencia de ácidos nucleicos que comprende el gen de flavodoxina de Anabaena sp. , preferentemente, Anabaena PCC71 19.

En una modalidad, la invención se refiere a los métodos, construcciones de vectores, plantas, partes cosechadles y productos descritos en la presente, que comprenden el gen de flavodoxina de Anabaena optimizado por codón, como se describe en SEC ID NO: 13 que codifica la proteína de flavodoxina de SEC I D NO: 2 o un fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo del mismo, como se describe en la presente, en donde el polipéptido de flavodoxina, fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo se ligan a un péptido de tránsito, como se describe en la presente, y se ligan funcionalmente a un promotor adecuado para la expresión en las plantas. Los promotores adecuados que no son el promotor descrito en SEC ID NO: 7 se conocen en el estado de la téenica.

En una modalidad, la invención se refiere a los métodos, las construcciones de vectores, las plantas, las partes cosechables y los productos descritos en la presente, que comprenden el gen de flavodoxina de Synechocystis sp. PCC 6803 descrito en SEC ID NO: 15 o que codifica la proteína de flavodoxina de SEC ID NO: 16 o un fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo del mismo, como se describe en la presente, en donde el polipéptido de flavodoxina, fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo se ligan a un péptido de tránsito, como se describe en la presente, y se ligan funcionalmente a un promotor adecuado para la expresión en las plantas. Los promotores adecuados que no son el promotor descrito en SEC I D NO: 7 se conocen en el estado de la técnica. Las secuencias de los polipéptidos codificados se muestran en SEC ID NO: 16 y 18, con o sin un péptido de tránsito de FNR de arveja, respectivamente.

Otras variantes de ácidos nucleicos útiles para poner en práctica los métodos de la invención incluyen porciones de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de flavodoxina, fragmentos funcionales de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de flavodoxina, ácidos nucleicos que se hibridan con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de flavodoxina, variantes de empalme de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de flavodoxina, variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de flavodoxina y variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de flavodoxina obtenidos por transposición génica. Las expresiones "secuencia de hibridación", "variante de empalme", "variante alélica" y "transposición génica" son como se describen en la presente.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de flavodoxina no necesitan ser ácidos nucleicos de longitud completa, ya que la realización de los métodos de la invención no siempre depende del uso de secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa. De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta un fragmento funcional de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias, o una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias.

Se puede preparar un fragmento de un ácido nucleico, por ejemplo, realizando una o más eliminaciones en el ácido nucleico. Las porciones se pueden usar en forma aislada o se pueden fusionar con otras secuencias codificantes (o no codificantes) a fin de producir, por ejemplo, una proteína que combine varias actividades. Cuando se fusiona con otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido luego de la traducción puede ser más grande que el previsto para la porción de proteína.

Los fragmentos de un ácido nucleico de flavodoxina descrito en la presente codifican un polipéptido de flavodoxina, como se define en la presente, o al menos una parte de este, que tiene sustancialmente la misma actividad biológica que la secuencia de aminoácidos indicada en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Preferentemente, la porción es una porción de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias, o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Preferentemente, la porción tiene una longitud de al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 200, al menos alrededor de 300, al menos alrededor de 400, al menos alrededor de 500, al menos alrededor de 600, al menos alrededor de 700, al menos alrededor de 800, al menos alrededor de 900, al menos alrededor de 1000 o más nucleótidos, preferentemente nucleótidos consecutivos, preferentemente contados desde el extremo 5’ o 3’ del ácido nucleico, de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Preferentemente, el ácido nucleico de flavodoxina comprende al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 200, al menos alrededor de 300, al menos alrededor de 400, al menos alrededor de 500 nucleótidos, preferentemente nucleótidos consecutivos, preferentemente contados desde el extremo 5’ o 3’ del ácido nucleico o hasta la longitud total de secuencia de ácidos nucleicos indicada en SEC I D NO: 1 , 1 3 o 15.

Preferentemente, la porción del ácido nucleico de flavodoxina tiene una de longitud de alrededor de 400-425, alrededor de 425-450, alrededor de 450-475, alrededor de 475-500, alrededor de 500- 525, alrededor de 525-550, alrededor de 550-575, alrededor de 575- 600, alrededor de 625-650, alrededor de 650-675, alrededor de 675- 700, alrededor de 700-725, alrededor de 725-750, alrededor de 750- 775, alrededor de 775-800, alrededor de 800-825, alrededor de 825- 850, alrededor de 850-875, alrededor de 875-900, alrededor de 925- 950, alrededor de 950-975, alrededor de 975-1000 nucleótidos, preferentemente nucleótidos consecutivos, preferentemente contados desde el extremo 5’ o 3’ del ácido nucleico, de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Preferentemente, la porción del ácido nucleico de flavodoxina tiene una longitud de alrededor de 400-425, alrededor de 425-450, alrededor de 450-475, alrededor de 475-500 nucleótidos, preferentemente nucleótidos consecutivos, preferentemente contados desde el extremo 5’ o 3’ del ácido nucleico o hasta la longitud total de la secuencia de ácidos nucleicos indicada en SEC I D NO: 1 , 13 o 15.

Otra variante de ácido nucleico es un ácido nucleico capaz de hibridarse, en condiciones de rigurosidad reducida, preferentemente en condiciones de rigurosidad, con mayor preferencia en condiciones de alta rigurosidad, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se define en la presente, o con una porción como se define en la presente o con un complemento de cualquiera de los dos.

La secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias, o con una porción de cualquiera de estas secuencias, en donde una porción es como se define en la presente, o la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Con máxima preferencia, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico indicado en SEC I D NO: 1 , 13 o 15, o con el complemento de un ácido nucleico que codifica el polipéptido representado por SEC I D NO: 2 o 16, o con una porción del mismo. En una modalidad, las condiciones de hibridación son de rigurosidad media, preferentemente, rigurosidad alta, como se define en la presente.

Preferentemente, la secuencia de hibridación codifica un polipeptido con una secuencia de aminoácidos que comprende SEC I D NO: 2 o 16.

Las variantes de empalme preferidas son variantes de empalme de un ácido nucleico representado por SEC I D NO: 1 , 13 o 15, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEC I D NO: 2 o 16.

Además, las variantes de ácidos nucleicos también se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida a sitio. Hay varios métodos disponibles para lograr la mutagénesis dirigida a sitio, en donde los más comunes son los métodos basados en POR (Current Protocols in Molecular Biology. Wilcy Eds.). Los polipéptidos de flavodoxina que difieren de la secuencia de SEC I D NO: 2 o 16, por uno o varios aminoácidos (sustituciones, inserciones y/o eliminaciones, como se definen en la presente) también pueden ser útiles para aumentar el rendimiento de las plantas en los métodos, las construcciones y las plantas de la invención.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de flavodoxina pueden derivar de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico se puede modificar de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico mediante manipulación humana deliberada. Preferentemente, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de flavodoxina es de una bacteria, preferentemente, una cianobacteria, con máxima preferencia, de Anabaena.

En otra modalidad, la presente invención se extiende a ADN cromosómico recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos (que incluye un promotor particular usado) útil en los métodos de la invención, en donde el ácido nucleico está presente en el ADN cromosómico como resultado de métodos recombinantes, pero no en su entorno genético natural. En otra modalidad, el ADN cromosómico recombinante de la invención está comprendido en una célula vegetal. El ADN comprendido en una célula, en particular una célula con paredes celulares como una célula vegetal, está mejor protegido de la degradación o del daño que una secuencia de ácidos nucleicos desnuda. Lo mismo se aplica a una construcción de ADN comprendido en una célula huésped, por ejemplo, una célula vegetal.

En una modalidad preferida, la invención se refiere a composiciones que comprenden el ADN cromosómico recombinante de la invención y/o la construcción de la invención y una célula huésped, preferentemente una célula vegetal, en donde el ADN cromosómico recombinante y/o la construcción están comprendidos en la célula huésped, preferentemente, en una célula vegetal o célula huésped con pared celular. En otra modalidad, la composición comprende células huésped muertas, células huésped vivas o una mezcla de células huésped muertas y vivas, en donde el ADN cromosómico recombinante y/o la construcción de la invención pueden estar en las células huésped muertas y/o en las células huésped vivas. Opcionalmente, la composición puede comprender otras células huésped que no comprenden el ADN cromosómico recombinante de la invención ni la construcción de la invención. Las composiciones de la invención se pueden usar en procesos para multiplicar o distribuir el ADN cromosómico recombinante y/o la construcción de la invención, y/o alternativamente, para evitar que el ADN cromosómico recombinante y/o la construcción de la invención se desintegren y/o degraden, como se explicó con anterioridad. El ADN c romosó ico recombinante de la invención y/o la construcción de la invención se pueden usar como un marcador de calidad de las composiciones de la invención, como un indicador de origen y/o como indicación del productor.

Un polipéptido de flavodoxina descrito en la presente es útil en las construcciones genéticas, los métodos, las plantas, las partes cosechadles y los productos de la presente invención. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina es un polipéptido de flavodoxina bacteriano, por ejemplo, un polipéptido de flavodoxina cianobacteriano, tal como la flavodoxina de Anabaena cianobateria PCC71 19 (Fillat M. et al (1991 ) Biochem J. 280 187-191 ) o SEC I D NO: 2 o la flavodoxina de Synechocystis descrita en SEC ID NO: 16. Otros polipéptidos de flavodoxina adecuados incluyen flavodoxinas de bacterias anoxigénicas fotosintéticas, enterobacterias, diazótrofos y algas. Los ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de flavodoxina adecuados para usar de acuerdo con la presente invención se indican en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Si bien se prefiere un polipéptido de flavodoxina de tipo silvestre, un polipéptido de flavodoxina también puede ser un fragmento, muíante, derivado, variante o alelo de esa secuencia de tipo silvestre.

Los fragmentos, los mutantes, los derivados, las variantes y los alelos adecuados son aquellos que retienen las características funcionales del polipéptido codificado por el gen de flavoproteína de tipo silvestre, en especial, la capacidad de actuar como antioxidante. Los cambios en una secuencia para obtener un mutante, una variante o un derivado, pueden ser uno o más de los siguientes: adición, inserción, eliminación o sustitución de uno o más nucleótidos en el ácido nucleico, lo cual genera la adición, inserción, eliminación o sustitución de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado. Naturalmente, se incluyen cambios en el ácido nucleico que son irrelevantes para la secuencia de aminoácidos codificada.

Un polipéptido que es miembro de la familia de flavodoxina o que es una variante, un alelo, un derivado o un mutante de la secuencia de aminoácidos puede comprender una secuencia de aminoácidos que comparte más de alrededor de 30%, más de alrededor de 35%, más de alrededor de 40%, más de alrededor de 45%, más de alrededor de 55%, más de alrededor de 65%, más de alrededor de 70%, más de alrededor de 80%, más de alrededor de 90% o más de alrededor de 95%, preferentemente, más de alrededor de 96%, más de alrededor de 97%, más de alrededor de 98% o más de alrededor de 99% de identidad de secuencia con un polipéptido de flavodoxina codificado por un ácido nucleico de flavodoxina como se indica en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias.

Un polipéptido que es miembro de la familia de flavodoxina o que es una variante, un alelo, un derivado o un muíante de la secuencia de aminoácidos puede comprender una secuencia de aminoácidos que comparte más de alrededor de 30%, más de alrededor de 35%, más de alrededor de 40%, más de alrededor de 45%, más de alrededor de 55%, más de alrededor de 65 %, más de alrededor de 70%, más de alrededor de 80%, más de alrededor de 90% o más de alrededor de 95%, preferentemente, más de alrededor de 96%, más de alrededor de 97%, más de alrededor de 98% o más de alrededor de 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de flavodoxina de Anabaena PCC71 19.

En ciertas modalidades, un polipéptido de flavodoxina puede mostrar poca homología total, es decir, alrededor de 20%, alrededor de 25%, alrededor de 30%, alrededor de 35%, alrededor de 40% o alrededor de 45% con la secuencia de flavodoxina de Anabaena PCC71 19 (SEC I D NO: 2) o la flavodoxina de Synechocystis (SEC ID NO: 16), aunque tiene sustancialmente la misma actividad antioxidante. Sin embargo, en dominios o regiones funcionalmente importantes, la homología de aminoácidos puede ser mucho mayor. Por ejemplo, un polipéptido de flavodoxina comprende un dominio de fijación a FMN , que tiene una alta homología con el dominio de fijación a FMN de flavodoxina (un dominio tipo flavodoxina). Se pueden identificar dominios o regiones putativas funcionalmente importantes usando procesos biomformáticos, que incluyen la comparación de las secuencias de homólogos.

En una modalidad preferida, el polipéptido de flavodoxina útil en los métodos, construcciones de vectores, plantas, partes cosechadles y productos de la invención es un polipéptido que comprende uno o más de los dominios y motivos enumerados en el Cuadro B, con mayor preferencia, el dominio PFAM PF00258, preferentemente, cuando se analiza con el software InterproScan descrito en el Ejemplo 2. También se prefiere una localización y/u orden de uno o más dominios y/o motivos enumerados en el Cuadro B dentro de la secuencia de polipéptidos del polipéptido de flavodoxina que es sustancialmente igual al que se muestra para SEC I D NO: 2 en la Figura 1 .

Un polipéptido de flavodoxina de máxima preferencia es un polipéptido que comprende o consiste en la proteína de flavodoxina codificada por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias, preferentemente de Anabaena sp. , preferentemente Anabaena PCC71 19, o Synechocystis sp. , preferentemente Synechocystis sp. PCC 6803, con mayor preferencia, el polipéptido de SEC I D NO: 2 o 16 codificado por el ácido nucleico descrito en SEC ID NO: 1 , 13 o 15, respectivamente, y con máxima preferencia, el polipéptido de SEC I D NO: 2.

Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina es un polipéptido que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (i) un polipéptido que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEC I D NO: 2 o 16, preferentemente, o un fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo del mismo; preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; ii) un polipéptido codificado por un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC I D NO: 1 , 13 o 15, o un fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo del mismo; preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

Con mayor preferencia, el polipéptido de flavodoxina es un polipéptido que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (i) un polipeptido que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 2 o 16, o un fragmento funcional, derivado, ortógolo o parálogo del mismo; (ii) un polipéptido codificado por un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92% , al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC I D NO: 1 , 13 o 15, o un fragmento, derivado, ortógolo o parálogo del mismo. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente las plantas de control que no expresan el polipéptido de flavodoxina.

Los porcentajes de identidad de un polipéptido o una proteína se expresan con referencia a la secuencia de aminoácidos total que se describe específicamente en la presente.

Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina comprende al menos alrededor de 50, al menos alrededor de 75, al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 1 10, al menos alrededor de 120, al menos alrededor de 130, al menos alrededor de 140, al menos alrededor de 145, al menos alrededor de 150, al menos alrededor de 155, al menos alrededor de 160, al menos alrededor de 165 o al menos alrededor de 167 aminoácidos, preferentemente aminoácidos consecutivos, preferentemente contados desde el terminal N o el terminal C de la secuencia de aminoácidos o hasta la longitud total de la secuencia de aminoácidos indicada en SEC ID NO: 2 o 16. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina tiene sustancialmente la misma actividad biológica que SEC ID NO: 2 o 16. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente las plantas de control que no expresan el polipéptido de flavodoxina.

Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina comprende al menos alrededor de 50, al menos alrededor de 75, al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 1 10, al menos alrededor de 120, al menos alrededor de 130, al menos alrededor de 140, al menos alrededor de 145, al menos alrededor de 150, al menos alrededor de 155, al menos alrededor de 160, al menos alrededor de 165 o al menos alrededor de 167 aminoácidos, preferentemente aminoácidos consecutivos, preferentemente contados desde el terminal N o el terminal C de la secuencia de aminoácidos o hasta la longitud total de cualquiera de las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina tiene sustancialmente la misma actividad biológica que la secuencia respectiva del Cuadro 2 y/o el listado de secuencias. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente las plantas de control que no expresan el polipéptido de flavodoxina.

Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina comprende alrededor de 50-75, alrededor de 75-100, alrededor de 100-1 10, alrededor de 1 10-120, alrededor de 120-130, alrededor de 130-140, alrededor de 140-150, alrededor de 150-160, alrededor de 160-170 aminoácidos, preferentemente aminoácidos consecutivos, preferentemente contados desde el terminal N o el terminal C de la secuencia de aminoácidos o hasta la longitud total de cualquiera de las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina tiene sustancialmente la misma actividad biológica que la secuencia respectiva del Cuadro 2 y/o el listado de secuencias. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente las plantas de control que no expresan el polipéptido de flavodoxina.

Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina comprende alrededor de 50-75, alrededor de 75-100, alrededor de 100-1 10, alrededor de 1 10-120, alrededor de 120-130, alrededor de 130-140, alrededor de 140-150, alrededor de 150-160, alrededor de 160-170 aminoácidos, preferentemente aminoácidos consecutivos, preferentemente contados desde el terminal N o el terminal C de la secuencia de aminoácidos o hasta la longitud total de la secuencia de aminoácidos indicada en SEC ID NO: 2 o 16. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina tiene sustancialmente la misma actividad biológica que SEC I D NO: 2 o 16. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente las plantas de control que no expresan el polipéptido de flavodoxina.

Con mayor preferencia, el polipéptido de flavodoxina aislado comprende o consiste en SEC ID NO: 2 o 16, o es codificado por un ácido nucleico con SEC I D NO: 1 , 13 o 15, preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

Los polipéptidos codificados por las variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido de flavodoxina de SEC ID NO: 2 o 16, y cualquiera de las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos representadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y el uso de estos alelos naturales está comprendido en los métodos de la presente invención. Preferentemente, la variante alélica es una variante alélica de SEC I D NO: 1 , 13 o 15, o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEC ID NO: 2 o 16.

En otra modalidad, las secuencias de polipéptidos útiles en los métodos, construcciones, plantas, partes cosechables y productos de la invención tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones en comparación con la secuencia de SEC I D NO: 2 o 16, en donde las sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos pueden variar de 1 a 10 aminoácidos cada una.

La invención también provee construcciones genéticas, tales como construcciones de expresión o casetes de expresión, o construcciones de vectores que comprenden un ácido nucleico de flavodoxina. Preferentemente, estas construcciones genéticas son adecuadas para introducir y/o expresar, en las plantas, partes de plantas o células vegetales, ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de flavodoxina. Las construcciones de expresión se pueden insertar en construcciones de vectores, que pueden estar disponibles en el comercio, adecuados para la transformación en plantas o células huésped y para la expresión del gen de interés en las células trasformadas. La invención también provee el uso de una construcción genética como se define en la presente en los métodos de la invención. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención es una construcción de expresión o casete de expresión que comprende un ácido nucleico de flavodoxina.

Las construcciones genéticas de la invención pueden estar comprendidas en una célula huésped, una célula vegetal, una semilla, un producto agrícola, una planta o una parte de planta. Las plantas o las celulas huésped se transforman con una construcción genética, tal como una construcción de vector o un casete de expresión que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos de flavodoxina descritos en la presente.

En una modalidad, la construcción genética de la invención confiere mayor rendimiento o rasgos relacionados con el rendimiento a una planta cuando se lo introduce en ella; la planta expresa el ácido nucleico que codifica el polipéptido de flavodoxina comprendido en la construcción genética. En otra modalidad, la construcción genética d e la invención confiere mayor rendimiento o rasgos aumentados relacionados con el rendimiento a una planta, que comprende las células vegetales en las que se introdujo la construcción; las células vegetales expresan el ácido nucleico que codifica el polipéptido de flavodoxina comprendido en la construcción genética.

El experto en la téenica conoce los elementos genéticos que deben estar presentes en la construcción genética, a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huésped que contienen la secuencia de interés.

Más específicamente, la presente invención provee una construcción de expresión que comprende: (a) un ácido nucleico de flavodoxina que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se definió anteriormente; (b) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a), en donde la secuencia de control es, preferentemente, una secuencia de promotor; y opcionalmente (c) una secuencia terminadora de la transcripción.

Con máxima preferencia, la presente invención provee una construcción de expresión que comprende: (a) un ácido nucleico de flavodoxina que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se definió anteriormente; (b) una secuencia de ácidos nucleicos de tránsito que codifica un péptido de tránsito; (c) una secuencia de promotor, ligada operativamente al ácido nucleico de (a) y (b), en donde la secuencia de promotor comprende el promotor d e GOS2, preferentemente el promotor de GOS2 del arroz, o un fragmento funcional, una variante, un homólogo, un ortógolo o un parálogo del mismo; y opcionalmente, (d) una secuencia terminadora de la transcripción.

Preferentemente, el ácido nucleico de flavodoxina de la construcción de expresión comprende cualquiera de los ácidos nucleicos de flavodoxina descritos en la presente, preferentemente, como se indica en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias, o un fragmento funcional, variante, homólogo, ortólogo o parálogo del mismo. Preferentemente, el ácido nucleico de tránsito se selecciona de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los péptidos de tránsito descritos en la presente, preferentemente, como se indica en el Cuadro 3, o un fragmento funcional, una variante, un homólogo, un ortólogo o un parálogo del mismo.

Preferentemente, la secuencia de promotor comprende una secuencia de promotor descrita en la presente, preferentemente el promotor de GOS2, preferentemente el promotor de GOS2 del arroz, o un fragmento funcional, o variante, u homólogo, ortólogo o parálogo del mismo.

En una forma de realización preferida, cualquier referencia a un promotor GOS2 en la presente solicitud debe interpretarse como un promotor que en su contexto genético natural controla la expresión de un ácido nucleico que codifica un gen GOS2. Preferentemente, el promotor es de una planta dicotiledónea o monocotiledónea, con mayor preferencia, de Poaceae, aun con mayor preferencia, de arroz y, con máxima preferencia, el promotor con una secuencia como se describe en SEC I D NO: 7, o el promotor es una versión modificada en forma sintética de aquel, preferentemente, los promotores que se muestran en SEQ I D NO: 22 y 23 o los derivados de los mismos.

Preferentemente, el ácido nucleico de flavodoxina de la construcción de expresión comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: (i) un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 80% , al menos 85%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEQ I D NO: 1 , 13 o 15, en donde el ácido nucleico tiene, preferentemente, la misma actividad biológica que SEQ I D NO: 2 o 16, preferentemente, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido de flavodoxina que confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; la secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de (i); un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEC I D NO: 2 o 16, preferentemente, el polipéptido de flavodoxina confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; y una molécula de ácido nucleico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) en condiciones de hibridación rigurosas, en donde el ácido nucleico tiene, con preferencia, sustancialmente la misma actividad biológica que SEC I D NO: 2 o 16, o una secuencia complementaria del mismo, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido de flavodoxina que confiere uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

Con máxima preferencia, el ácido nucleico de flavodoxina de la construcción de expresión comprende o consiste en SEC ID NO: 1 , 13 o 15, un complemento del mismo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina con SEC I D NO: 2 o 16; o una molécula de ácido nucleico que se híbrida con cualquiera de estas moléculas de ácido nucleico en condiciones de hibridación rigurosas.

Aún otra modalidad se refiere a construcciones genéticas útiles en los métodos, las construcciones de vectores, las plantas, las partes cosechables y los productos de la invención, en donde la construcción genética comprende el ácido nucleico de flavodoxina de la invención ligado funcionalmente a un promotor, como se describe en la presente, y también ligado funcionalmente a uno o más de los siguientes: 1 ) ácidos nucleicos que mejoran la expresión de ácidos nucleicos (NEENA): a) como se describe en la solicitud de patente internacional publicada como WO201 1 /023537 en el Cuadro 1 , página 27 a página 28 y/o SEC ID NO: 1 a 19 y/o como se define en los artículos i) a vi) de la reivindicación 1 de dicha solicitud internacional; los N EENA se incorporan en la presente como referencia; y/o b) como se describe en la solicitud de patente internacional publicada como WO201 1 /023539 en el Cuadro 1 , página 27 y/o SEC I D NO: 1 a 19 y/o como se define en los artículos i) a vi) de la reivindicación 1 de dicha solicitud internacional; los NEENA se incorporan en la presente como referencia; y/o c) como consta o se describe en: i) la solicitud de prioridad europea presentada el 5 de julio de 201 1 como EP 1 1 172672.5, en el Cuadro 1 , página 27 y/o SEC I D NO: 1 a 14937, preferentemente, SEC I D NO: 1 a 5, 14936 o 14937 y/o como se define en los artículos i) a v) de la reivindicación 1 de dicha solicitud de prioridad europea; los NEENA se incorporan en la presente por referencia; y/o ii) la solicitud de prioridad europea presentada el 6 de julio de 201 1 como EP 1 1 172825.9, en el Cuadro 1 , página 27 y/o SEC I D NO: 1 a 65560, preferentemente, SEC I D NO: 1 a 3 y/o como se define en los artículos i) a v) de la reivindicación 1 de dicha solicitud de prioridad europea; los NEENA se incorporan en la presente por referencia; y/o d) o equivalentes que tienen sustancialmente el mismo efecto potenciador; y/o ligados funcionalmente a una o más moleculas de ácido nucleico potenciadoras de la confiabilidad (RENA), a) como consta o se describe en la solicitud de prioridad europea presentada el 15 de septiembre de 201 1 como EP 1 1 181420.8, en el Cuadro 1 , página 26 y/o SEC ID NO: 1 a 16 o 94 a 1 16666, preferentemente, SEC I D NO: 1 a 16 y/o como se define en los puntos i) a v) del artículo a) de la reivindicación 1 de dicha solicitud de prioridad europea; las moleculas RENA se incorporan en la presente como referencia; o b) equivalentes que tienen sustancialmente el mismo efecto potenciador.

Una modalidad preferida de la invención se refiere a una construcción genética útil en los métodos, las construcciones de vectores, las plantas, las partes cosechables y los productos de la invención, y comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina de la invención bajo el control de un promotor descrito anteriormente, en donde NEENA, RENA y/o el promotor son heterólogos con respecto a la molécula de ácido nucleico de flavodoxina de la invención.

Las construcciones genéticas — como las construcciones de expresión— descritos en la presente y las construcciones de vectores descritos en la presente son útiles en los métodos, las plantas, las partes cosechables y los productos de la invención.

Preferentemente, confieren un aumento de uno o más rasgos relacionados con el rendimiento cuando se introducen de manera estable en una planta, como se describe en la presente.

Preferentemente, las plantas que tienen la construcción de la invención muestran un aumento de uno o más rasgos relacionados con el rendimiento cuando se cultivan en condiciones sin estrés condiciones de sequía o condiciones de deficiencia de nitrógeno, con mayor preferencia, en condiciones sin estrés.

El promotor en una construcción genética descrito en la presente puede ser un promotor nativo o no nativo con respecto al ácido nucleico descrito en la presente, es decir, un promotor que no regula la expresión del ácido nucleico en su entorno genético natural.

Ventajosamente, se puede utilizar cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de SEC I D NO: 13, 14, 15 o 17, pero preferentemente, el promotor es de origen vegetal. Preferentemente, el promotor es un promotor constitutivo o ubicuo, un promotor regulado por el desarrollo, promotor inducible, promotor específico de órgano o específico de tejido, preferentemente, un promotor específico de raíz, promotor específico de semilla, promotor específico de endosperma, promotor específico de embrión, promotor específico de aleurona, promotor específico de tejido verde, promotor específico de tallo, de hoja o de meristema.

Ventajosamente, el promotor GOS2, como se define en la presente, da como resultado un aumento de uno o más rasgos relacionados con el rendimiento deseados mayor que cualquier otro promotor, ya sea natural o sintético, tales como promotores constitutivos o ubicuos, promotores regulados por el desarrollo, promotores inducibles, promotores específicos de órgano o específicos de tejido, por ejemplo, promotores específicos de raíz, promotores específicos de semilla, promotores específicos de endosperma, promotores específicos de embrión, promotores específicos de aleurona, promotores específicos de tejido verde, promotores específicos de tallo, de hoja o de meristema.

En una modalidad, el promotor GOS2 en una construcción genética descrita en la presente es un promotor constitutivo sustancialmente con el mismo patrón de expresión temporal y/o espacial y/o sustancialmente la misma intensidad de expresión que el promotor indicado en SEC I D NO: 7, y preferentemente es de origen vegetal o sintético.

Preferentemente, se usa un promotor GOS2, en donde un promotor GOS2 es un promotor constitutivo con intensidad de expresión media relacionado con el promotor GOS2 del arroz que se muestra en SEC I D NO: 7. Con mayor preferencia, la secuencia del promotor ligada operativamente al ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito y una flavodoxina como se define en la presente comprende el promotor GOS2, preferentemente, el promotor GOS2 del arroz o las versiones modificadas en forma sintética de éste, tales como las que se describen en SEC I D NO: 22 y 23, descritas en la solicitud de patente internacional PCT/I B201 1 /055412, publicada como O201 2077020, como SEC I D NO: 14 y 15, y las secuencias relacionadas, como se describen en las páginas 6 y 7 de dicha solicitud, que se incorporan en la presente, o un fragmento funcional, o variante, u homólogo, ortólogo o parálogo del promotor GOS2 del arroz. Con mayor preferencia, la secuencia del promotor consiste en el promotor GOS2, preferentemente, el promotor GOS2 del arroz (publicado en de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992 y la solicitud internacional WO 2004/065596), o un fragmento funcional, o variante, u homólogo, ortógolo o parálogo de aquel, y aún con mayor preferencia el promotor tiene la secuencia de SEC I D NO: 7, 22 o 23. En una modalidad, los fragmentos o las variantes funcionales de promotores preferidos tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, al menos 51 %, al menos 52%, al menos 53%, al menos 54%, al menos 55%, al menos 56%, al menos 57%, al menos 58%, al menos 59%, al menos 60%, al menos 61 %, al menos 62%, al menos 63%, al menos 64%, al menos 65%, al menos 66%, al menos 67%, al menos 68%, al menos 69%, al menos 70%, al menos 71 %, al menos 72%, al menos 73%, al menos 74%, al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81 %, al menos 82% , al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID NO: 7, 22 o 23, preferentemente, SEC ID NO: 7.

Preferentemente, la porción de la secuencia de promotor es una porción funcional de SEC I D NO: 7, 22 o 23, preferentemente SEC I D NO: 7. Preferentemente, la porción tiene una longitud de al menos alrededor de 400, al menos alrededor de 500, al menos alrededor de 600, al menos alrededor de 700, al menos alrededor de 800, al menos alrededor de 900, al menos alrededor de 1000, al menos alrededor de 1 100 o más nucleótidos, preferentemente nucleótidos consecutivos, preferentemente contados desde el extremo 5’ o 3’ del ácido nucleico, de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en SEC I D NO: 7, 22 o 23, preferentemente SEC ID NO: 7.

Preferentemente, la porción de la secuencia de promotor tiene una longitud de alrededor de 400-425, alrededor de 425-450, alrededor de 450-475, alrededor de 475-500, alrededor de 500-525, alrededor de 525-550, alrededor de 550-575, alrededor de 575-600, alrededor de 625-650, alrededor de 650-675, alrededor de 675-700, alrededor de 700-725, alrededor de 725-750, alrededor de 750-775, alrededor de 775-800, alrededor de 800-825, alrededor de 825-850, alrededor de 850-875, alrededor de 875-900, alrededor de 925-950, alrededor de 950-975, alrededor de 975-1000, alrededor de 1000-1025, alrededor de 1025-1 100, alrededor de 1 100-1 125, alrededor de 1 125-1 150, alrededor de 1 150-1 175, alrededor de 1 170-1 179 nucleótidos, preferentemente nucleótidos consecutivos, preferentemente contados desde el extremo 5’ o 3’ del ácido nucleico, de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en SEC I D NO: 2, 22 o 23, preferentemente, SEC I D NO: 7.

La secuencia de promotor preferida comprende o consiste en SEC I D NO: 7.

El peptido de tránsito codificado por el ácido nucleico de tránsito tiene, preferentemente, alrededor de 5, 10, 1 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54 o más de aminoácidos de longitud. Preferentemente, el péptido de tránsito dirige el transporte de una proteína a otras organelas dentro de la célula. Preferentemente, el péptido de tránsito dirige el polipéptido de flavodoxina al núcleo, mitocondria, matriz de mitocondria, retículo endoplasmático, cloroplastos, apicoplastos, cromoplasto, cianela, tilacoide, amiloplasto, peroxisoma, glioxisoma y/o hidrogenosoma. Con máxima preferencia, el péptido de tránsito dirige el polipéptido de flavodoxina a un plástido, preferentemente, a un cloroplasto. Preferentemente, el péptido de tránsito se escinde del polipéptido, preferentemente mediante una peptidasa de señal, después de que el polipéptido es transportado. En otra modalidad, el péptido de tránsito no se escinde del polipéptido después de que el polipéptido es transportado.

Un péptido de tránsito al cloroplasto adecuado para usarse de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención puede ser cualquier secuencia de péptidos que dirige un polipéptido al cloroplasto de una célula vegetal. Los péptidos adecuados pueden ser identificados con facilidad por un experto en la téenica; y algunos ejemplos se muestran en el Cuadro 3. Otros ejemplos son conocidos en el estado de la técnica.

En algunas modalidades preferidas, un péptido de tránsito puede comprender o consistir en el péptido de tránsito al cloroplasto de la ferredoxina-NADP+ reductasa que contiene FAD (FNR), con mayor preferencia, el FNR de arveja o Cyanophora paradoxa, en donde el péptido de tránsito tiene, aún con mayor preferencia, la secuencia indicada en SEC I D NO: 4 o 10, respectivamente. Su secuencia codificante se muestra preferentemente en SEC I D NO: 3, 8 o 9, respectivamente.

Se puede usar un ácido nucleico que codifica cualquier polipéptido de flavodoxina, como se definió anteriormente de acuerdo con la presente invención , con cualquier péptido de tránsito al cloroplasto adecuado, como se definió anteriormente. Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina no se fusiona a un péptido de tránsito al que se asocia naturalmente, es decir, se fusiona a un péptido de tránsito heterogéneo. Los polipéptidos de flavodoxina, que no se encuentran en las plantas, no se asocian naturalmente a los péptidos de tránsito al cloroplasto.

Una secuencia de ácidos nucleicos de tránsito preferida que codifica un péptido de tránsito se indica en SEC I D NO: 3, 8 o 9. Preferentemente, la secuencia de ácidos nucleicos de tránsito comprende o consiste en una secuencia de ácidos nucleicos de tránsito indicada en SEC I D NO: 3, 8 o 9, o fragmentos o variantes funcionales del mismo. Los fragmentos o las variantes de la secuencia de ácidos nucleicos de tránsito funcionales preferida tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 % , 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% , 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84% , 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID NO: 3, 8 o 9 o cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los peptidos de tránsito indicados en el Cuadro 3.

En una modalidad, el péptido de tránsito difiere de cualquier péptido de tránsito ligado naturalmente a las proteínas de flavodoxina del Cuadro 2 y/o del listado de secuencias.

Preferentemente, la porción de la secuencia de ácidos nucleicos de tránsito tiene una longitud de al menos alrededor de 15, al menos alrededor de 30, al menos alrededor de 45, al menos alrededor de 60, al menos alrededor de 75, al menos alrededor de 90, al menos alrededor de 120, al menos alrededor de 135, al menos alrededor de 150 o más nucleótidos, preferentemente nucleótidos consecutivos, preferentemente contados desde el extremo 5’ del ácido nucleico, de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en SEC I D NO: 3, 8 o 9.

Preferentemente, la porción de la secuencia de ácidos nucleicos de tránsito tiene, de longitud, de 15 a 45, alrededor de 24-60, alrededor de 60-75, alrededor de 75-102, alrededor de 102-126, alrededor de 126-150 nucleótidos, preferentemente nucleótidos consecutivos, preferentemente contados desde el extremo 5’ del ácido nucleico, de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en SEC I D NO: 3, 8 o 9.

Un peptido de tránsito preferido se indica en SEC I D NO: 4 o 10. Preferentemente, el péptido de tránsito comprende o consiste en un péptido de tránsito indicado en SEC I D NO: 4 o 10, o fragmentos o variantes funcionales del mismo. Los fragmentos funcionales o las variantes del péptido de tránsito preferidos tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 50% , 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 % , 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82% , 83% , 84%, 85% , 86%, 87%, 88% , 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEC I D NO: 4, o cualquiera de los péptidos de tránsito indicados en el Cuadro 3.

Preferentemente, el péptido de tránsito comprende al menos alrededor de 5, al menos alrededor de 10, al menos alrededor de 15, al menos alrededor de 20, al menos alrededor de 25, al menos alrededor de 30, al menos alrededor de 35, al menos alrededor de 40, al menos alrededor de 45 o al menos alrededor de 50 aminoácidos, preferentemente aminoácidos consecutivos, preferentemente contados desde el terminal N de la secuencia de aminoácidos o hasta la longitud total de la secuencia de aminoácidos indicada en SEC ID NO: 4 o 10.

Preferentemente, el péptido de tránsito comprende al menos alrededor de 5, al menos alrededor de 10, al menos alrededor de 15, al menos alrededor de 20, al menos alrededor de 25, al menos alrededor de 30, al menos alrededor de 35, al menos alrededor de 40, al menos alrededor de 45 o al menos alrededor de 50 aminoácidos, preferentemente aminoácidos consecutivos, preferentemente contados desde el terminal N o el terminal C, preferentemente desde el terminal N de la secuencia de aminoácidos o hasta la longitud total de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en el Cuadro 3.

Preferentemente, el péptido de tránsito comprende alrededor de 5 a 20, alrededor de 20-25, alrededor de 25-30, alrededor de 30-35, alrededor de 35-40, alrededor de 40-45, alrededor de 45-50 aminoácidos, preferentemente aminoácidos consecutivos, preferentemente contados desde el terminal N de la secuencia de aminoácidos o hasta la longitud total de la secuencia de aminoácidos indicada en SEC I D NO: 4 o 10.

Preferentemente, el péptido de tránsito comprende alrededor de 5 a 20, alrededor de 20-25, alrededor de 25-30, alrededor de 30-35, alrededor de 35-40, alrededor de 40-45, alrededor de 45-50 aminoácidos, preferentemente aminoácidos consecutivos, preferentemente contados desde el terminal N o el terminal C, preferentemente desde el terminal N de la secuencia de aminoácidos o hasta la longitud total de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en el Cuadro 3.

Otros péptidos de tránsito al cloroplasto preferidos se indican en el Cuadro 3.

Preferentemente, la construcción de expresión comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: (i) un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54% , 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75% , 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID NO: 5, 12, 14 o 17, o un fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo del mismo; (ii) un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56% , 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 6, 1 1 o 18, o un fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo del mismo; y/o (iii) la secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de (i) o (ii); y opcionalmente, una secuencia de promotor como se describe en la presente.

Preferentemente, la porción funcional del ácido nucleico que codifica un polipeptido de flavodoxina y un péptido de tránsito tiene una longitud de al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 200, al menos alrededor de 300, al menos alrededor de 400, al menos alrededor de 500, al menos alrededor de 600 o más nucleótidos, preferentemente nucleótidos consecutivos, preferentemente contados desde el extremo 5’ o 3’, preferentemente desde el extremo 5’ del ácido nucleico, de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en SEC ID NO: 5, 12, 14 o 17.

Preferentemente, la porción funcional del ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina y un péptido de tránsito tiene una longitud de alrededor de 400-425, alrededor de 425-450, alrededor de 450-475, alrededor de 475-500, alrededor de 500-525, alrededor de 525-550, alrededor de 550-575, alrededor de 575-600, alrededor de 625-650, alrededor de 650-675 nucleótidos, preferentemente nucleótidos consecutivos, preferentemente contados desde el extremo 5’ o 3’, preferentemente desde el extremo 5’ del ácido nucleico, de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en SEC I D NO: 5, 12, 14 o 17.

Con mayor preferencia, la construcción de expresión comprende una secuencia de ácidos nucleicos indicada en SEC ID NO: 5, 12, 14 o 17.

También se prefiere una construcción de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende un polipéptido de flavodoxina y una secuencia de tránsito que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% O 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 6, 1 1 o 18, o un fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo del mismo.

Preferentemente, el polipéptido que comprende un polipéptido de flavodoxina y una secuencia de tránsito comprende al menos alrededor de 140, al menos alrededor de 150, al menos alrededor de 160, al menos alrededor de 170, al menos alrededor de 180, al menos alrededor de 190, al menos alrededor de 200, al menos alrededor de 210, al menos alrededor de 220 aminoácidos, preferentemente aminoácidos consecutivos, preferentemente contados desde el terminal N o el terminal C, preferentemente desde el terminal N de la secuencia de aminoácidos o hasta la longitud total de la secuencia de aminoácidos indicada en SEC ID NO: 6, 1 1 o 18.

Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina comprende alrededor de 100-1 10, alrededor de 1 10-120, alrededor de 120-130, alrededor de 130-140, alrededor de 140-150, alrededor de 150-160, alrededor de 160-170, alrededor de 170-180, alrededor de 180-190, alrededor de 190-200, alrededor de 200-210, alrededor de 210-220 aminoácidos, preferentemente aminoácidos consecutivos, preferentemente contados desde el terminal N o el terminal C, preferentemente desde el terminal N de la secuencia de aminoácidos o hasta la longitud total de la secuencia de aminoácidos indicada en SEC I D NO: 6, 1 1 o 18.

Por ello, otra modalidad es un polipeptido de flavodoxina codificado por una construcción de expresión que comprende: (a) un ácido nucleico de flavodoxina que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se describe en la presente; y (b) una secuencia de ácidos nucleicos de tránsito que codifica un péptido de tránsito como se describe en la presente; en donde la construcción de expresión comprende una secuencia de promotor ligada funcionalmente a la secuencia de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de flavodoxina y la secuencia de ácidos nucleicos de tránsito, y en donde la secuencia de promotor comprende el promotor de GOS2, preferentemente, promotor de GOS2 del arroz o un fragmento funcional, una variante, un homólogo, un ortólogo o un parálogo del mismo.

Preferentemente, el polipéptido que comprende un polipéptido de flavodoxina y una secuencia de tránsito comprende un péptido de tránsito de la ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR) que contiene FAD de arveja y una proteína de flavodoxina de Anabaena sp. (PCC71 19).

Preferentemente, el polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de flavodoxina y una secuencia de tránsito comprende una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52% , 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65 %, 66 % , 67 %, 68 %, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 6, 1 1 o 18, o un fragmento funcional, derivado, ortólogo o parálogo de la misma.

Con mayor preferencia, el polipéptido que comprende un polipéptido de flavodoxina y una secuencia de tránsito comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos indicada en SEC ID NO: 6, 1 1 o 18.

En algunas modalidades preferidas, un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de flavodoxina y un péptido de direccionamiento al cloroplasto comprende o consiste, preferentemente, en la secuencia indicada en SEC ID NO: 6, 1 1 o 18. Una molécula de ácido nucleico adecuada que codifica el polipéptido de fusión comprende o consiste, preferentemente, en la secuencia indicada en SEC ID NO: 5, 12, 14 o 17.

Preferentemente, la construcción de expresión comprende un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de una ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR) que contiene FAD de arveja y una proteína de flavodoxina de Anabaena sp. (PCC71 19) y un promotor de GOS2, preferentemente, el promotor de GOS2 del arroz, preferentemente, la secuencia de promotor comprende o consiste en las secuencias de nucleótidos representadas en SEC I D NO: 7, 22 o 23, preferentemente SEC I D NO: 7.

Preferentemente, la construcción de expresión comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: (i) un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC I D NO: 5, 12, 14 o 17, o un fragmento, derivado, ortólogo o parálogo del mismo; (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende un polipéptido de flavodoxina y una secuencia de tránsito que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55% , 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66% , 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77% , 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEC I D NO: 6, 1 1 o 18, o un fragmento, derivado, ortólogo o parálogo del mismo; y (iii) la secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de (i) o (ii); y ligado operativamente a una secuencia de promotor que comprende, en orden creciente de preferencia, al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81 %, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90% , al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC I D NO: 7, 22 o 23, preferentemente SEC I D NO: 7.

Preferentemente, la construcción de expresión comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina como se representa en SEC I D NO: 5, 12, 14 o 17 y ligado operativamente a una secuencia de promotor como se indica en SEC I D NO: 7, 22 o 23, preferentemente SEC I D NO: 7.

Opcionalmente, se pueden utilizar una o más secuencias de terminación de la transcripción en la construcción introducida en una planta. Aquellos expertos en la téenica conocen las secuencias de terminadores que pueden ser adecuadas para utilizar en la realización de la invención. Preferentemente, la construcción comprende un casete de expresión que comprende una secuencia de promotor ligada operativamente al ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, y una secuencia terminadora de la transcripción. Preferentemente, la secuencia terminadora de la transcripción es un terminador de zeína (t-zeína) ligado al extremo 3’ de la secuencia codificante de flavodoxina. Con máxima preferencia, el casete de expresión comprende una secuencia que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad con la secuencia terminadora de zeína (t-zeína).

La construcción genética, construcción de vector o construcción de expresión descritas en la presente también pueden comprender una o más secuencias que codifican un marcador seleccionable.

Los marcadores seleccionables preferidos se pueden seleccionar de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que incorporan un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptll , que fosforila neomicina y canamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia, por ejemplo, a bleomicina, estreptomicina, tetracielina, cloramfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo, bar que confiere resistencia a Basta®; aroA o gox que confiere resistencia a glifosato, o los genes que confieren resistencia, por ejemplo, a imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proveen un rasgo metabólico (tales como manA, que permite que las plantas usen mañosa como única fuente de carbono o xilosa ¡somerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos, tales como resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo, b-glucuronidasa, GUS o b-galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tales como el sistema de luciferina/luciferasa) o fluorescencia (proteína fluorescente verde, GFP, y sus derivados) . Esta lista representa solo una pequeña cantidad de posibles marcadores. El experto en la téenica está familiarizado con estos marcadores. Se prefieren diferentes marcadores según el organismo y el método de selección.

Se sabe que en los intentos por integrar de manera estable o transitoria los ácidos nucleicos en las células vegetales, solo una minoría de las células absorbe el ADN exógeno y, si se desea, lo integra en su genoma, según el vector de expresión y la técnica de transfección que se utilicen. En general, para identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (como los descritos en la presente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores se pueden usar, por ejemplo, en mutantes en los cuales estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, eliminación por métodos convencionales. Asimismo, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable se pueden introducir en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usar en los métodos de la invención, o de otro modo en un vector separado. Se pueden identificar las celulas que se transfectaron de forma estable con el ácido nucleico introducido, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, las células que integraron el marcador seleccionable sobreviven, mientras que las otras células mueren).

Otra modalidad de la presente invención es una construcción de vector que comprende un ácido nucleico de flavodoxina, una construcción de expresión o casete de expresión que contienen el ácido nucleico de flavodoxina descrito en la presente.

Una modalidad preferida es una construcción de vector recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de tránsito descrita en la presente (preferentemente seleccionada de el Cuadro 3) y un polipéptido de flavodoxina descrita en la presente (la secuencia codificante se selecciona preferentemente de el Cuadro 2 y/o del listado de secuencias), y una secuencia de promotor descrita en la presente ligada operativamente a aquel (preferentemente como se representa en SEC ID NO: 7, 22 o 23, preferentemente SEC ID NO: 7), en donde la secuencia de promotor comprende el promotor de GOS2, preferentemente, el promotor de GOS2 del arroz, o un fragmento funcional, o variante, u homólogo, ortólogo o parálogo del mismo.

Otra modalidad preferida es una construcción de vector recombinante que comprende: (a) (i) un ácido nucleico de flavodoxina que tiene al menos 60%, preferentemente, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad de secuencia con SEC I D NO: 1 , 13 o 15, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; (ii) un ácido nucleico que codifica una proteína de flavodoxina que tiene al menos 60%, preferentemente, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad de secuencia con SEC I D NO: 2 o 16, un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; y/o (iii) un ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con (i) o (ii) o una secuencia complementaria del mismo; ligado operativamente a (b) una secuencia de promotor, en donde la secuencia de promotor comprende, preferentemente, el promotor de GOS2, preferentemente el promotor de GOS2 del arroz, o un fragmento funcional, variante, u homólogo, ortógolo o parálogo del mismo; y preferentemente, (c) una secuencia terminadora de la transcripción.

Además, se provee una construcción de vector recombinante que comprende: (a) (i) un ácido nucleico de flavodoxina que tiene al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad de secuencia con SEC I D NO: 1 , 13 o 15; (ii) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 2 o 16, preferentemente, SEC ID NO: 2; y/o (iii) un ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con (i) o (ii) o una secuencia complementaria del mismo; ligado operativamente a (b) una secuencia de promotor ligada operativamente al ácido nucleico de (a); preferentemente como se representa en SEC I D NO: 7, 22 o 23, preferentemente, SEC I D NO: 7, o un fragmento funcional del mismo, o un ortógolo o un parálogo del m ismo; y preferentemente, (c) una secuencia terminadora de la transcripción es otra modalidad de la invención.

Otra modalidad preferida es una construcción de vector recombinante que comprende: (a) (i) un ácido nucleico de flavodoxina que tiene al menos 60% , preferentemente, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1 , 13 o 15, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; (ii) un ácido nucleico que codifica una proteína de flavodoxina que tiene al menos 60%, preferentemente, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad de secuencia con SEC I D NO: 2 o 16, un fragmento funcional del m ismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; y/o (iii) un ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con (i) o (ii) o una secuencia complementaria del mismo; ligado operativamente a (b) una secuencia de ácidos nucleicos de tránsito que codifica un péptido de tránsito; preferentemente como se representa en SEC I D NO: 3, 8 o 9; (c) una secuencia de promotor ligada operativamente a los ácidos nucleicos de (a) y (b); preferentemente como se representa en SEC I D NO: 7, 22 o 23, preferentemente SEC ID NO: 7, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; y preferentemente, (d) una secuencia terminadora de la transcripción.

Además, se provee una construcción de vector recombinante que comprende: (a) (i) un ácido nucleico de flavodoxina que tiene al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad de secuencia con SEC I D NO: 1 , 13 o 15; (ii) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad de secuencia con SEC I D NO: 2 o 16; y/o (iii) un ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con (i) o (ii); ligado operativamente a (b) una secuencia de ácidos nucleicos de tránsito que codifica un péptido de tránsito; preferentemente como se representa en SEC I D NO: 3, 8 o 9, en donde el péptido de tránsito y la proteína codificados por el ácido nucleico de flavodoxina están funcionalmente enlazados entre sí; (c) una secuencia de promotor ligada operativamente a los ácidos nucleicos de (a) y (b); preferentemente como se representa en SEC I D NO: 7, 22 o 23, preferentemente SEC I D NO: 7; y preferentemente (d) una secuencia terminadora de la transcripción, en donde la secuencia terminadora de la transcripción está ligada funcionalmente al ácido nucleico de flavodoxina.

Una modalidad preferida de la presente invención es una construcción de vector q ue comprende SEC I D NO: 5, 12, 14 o 17. Preferentemente, el vector de expresión comprende SEC ID NO: 5, 12, 14 o 17 y la secuencia de promotor representada por SEC ID NO: 7, 2 2 o 2 3, p referentemente SEC I D NO: 7 ligado operativamente a SEC I D NO: 5, 12, 14 o 17.

Las construcciones de vectores de la invención también pueden incluir una secuencia de origen de replicación que es necesaria para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo de célula específica. Un ejemplo es cuando es necesario mantener una construcción genética en una célula bacteriana como elemento genético episomal (por ejemplo, una molécula de cósmido o plásmido) Los orígenes de replicación preferidos incluyen, entre otros, f 1 -o ri y colE 1.

Para detectar la transferencia exitosa de las secuencias de ácidos nucleicos como se usan en los métodos de la invención y/o la selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucleicos, es ventajoso usar genes marcadores (o genes indicadores). Por lo tanto, la construcción de vector puede comprender, opcionalmente, un gen marcador seleccionable. Los ejemplos de genes marcadores seleccionadles se describen en la presente. Los genes marcadores se pueden retirar o eliminar de la célula transgénica cuando dejan de ser necesarios. Las téenicas para retirar marcadores son conocidas en el estado de la técnica; en la presente se describen técnicas útiles para ello.

De acuerdo con otra modalidad, la presente invención provee un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende aumentar la expresión, en una planta, de un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se define en la presente, y opcionalmente, seleccionar las plantas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, y el polipéptido de flavodoxina se expresa específicamente mediante el uso de un promotor particular.

Otra modalidad de la presente invención es un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende aumentar la expresión, en una planta, de un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, y opcionalmente, seleccionar las plantas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, y el polipéptido de flavodoxina se expresa específicamente mediante el uso de un promotor particular y se dirige a los plástidos. Preferentemente, la expresión del ácido nucleico exógeno se encuentra bajo el control de una secuencia de promotor endógena o exógena.

Preferentemente, uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control, y preferentemente, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control, y preferentemente, mayor biomasa aérea, mayor biomasa subterránea, mayor rendimiento de semillas y/o mayor rendimiento de azúcar (como azúcar cosechable por planta, por peso fresco, por peso seco o por área) con respecto a las plantas de control.

En una modalidad preferida, se aumenta el rendimiento de las semillas.

En otra modalidad preferida, se aumenta la biomasa aérea.

La realización de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen un rasgo mejorado relacionado con el rendimiento con respecto al rasgo relacionado con el rendimiento de las plantas de control.

Los metodos de la invención para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas, como se describe en la presente, comprenden introducir, preferentemente mediante métodos recombinantes, y expresar en una planta los ácidos nucleicos y/o construcciones, como se define en la presente, y preferentemente, la etapa adicional de cultivar las plantas y, opcionalmente, la etapa de cosechar las plantas o partes de estas.

En una modalidad, el rasgo aumentado relacionado con el rendimiento es mayor rendimiento de semillas, preferentemente, mayor índice de cosecha, mayor llenado de semillas, mayor cantidad total de semillas, mayor peso total de las semillas y mejor tiempo, cantidad y calidad de floración. Con mayor preferencia, el rasgo aumentado relacionado con el rendimiento es mayor índice de cosecha, mayor llenado de semillas y/o mayor peso total de las semillas.

En otra modalidad, el rasgo aumentado relacionado con el rendimiento es mayor biomasa, en particular biomasa aérea, preferentemente biomasa de tallo con respecto a la biomasa aérea, y en particular, biomasa de tallo de las plantas de control, y/o mayor biomasa de raíz con respecto a la biomasa de raíz de las plantas de control y/o mayor biomasa de remolacha con respecto a la biomasa de remolacha de las plantas de control. Además, en particular se contempla que el contenido de azúcar (en particular, el contenido de sacarosa) en las partes aereas, en particular en el tallo (en particular, de las plantas de caña de azúcar) y/o en las partes subterráneas, en particular en las raíces, que incluyen las raíces principales y los tubérculos, y/o en la remolacha (en particular, en la remolacha azucarera) aumenta con respecto al contenido de azúcar (en particular, el contenido de sacarosa) en las partes correspondientes de la planta de control.

La biomasa aérea preferida es la biomasa del tallo. Una mayor biomasa de tallo se puede traducir en una mayor longitud del tallo, ancho o amplitud del tallo, densidad del tallo, peso del tallo, diámetro del tallo, cantidad de nodos y/o internodos, diámetro, cantidad o densidad de la vasculatura del tallo o haces vasculares, en particular, floema y/o xilema. Además, preferentemente, se mejora el contenido de savia del tallo. Por otra parte, se mejora el contenido de sacarosa, preferentemente, el contenido de sacarosa del tallo.

En particular, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones de estrés o sin estrés. Las condiciones de estrés son, preferentemente, condiciones de estrés abiótico, con mayor preferencia, sequía, salinidad y/o temperaturas frías o cálidas y/o uso de nutrientes debido a uno o más de los siguientes: deficiencia de nutrientes, tales como deficiencia de nitrógeno, con máxima preferencia, sequía y/o deficiencia de nitrógeno.

En una modalidad preferida, los métodos de la invención se realizan con plantas que necesitan mayor tolerancia al estrés abiótico, por ejemplo, tolerancia a la sequía, salinidad y/o temperaturas frías o cálidas y/o uso de nutrientes debido a la deficiencia de nutrientes, tal como la deficiencia de nitrógeno.

Por ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones de estrés, tales como sequía o sequía leve, para obtener plantas con mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control. Preferentemente, cuando se someten a estrés por sequía, las plantas transgénicas tienen mayor biomasa, preferentemente biomasa aérea, y/o mayor rendimiento de semillas con respecto a las plantas de control.

En otro ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones con estrés, tales como deficiencia de nutrientes, para obtener plantas con mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control. La deficiencia de nutrientes puede ser el resultado de la falta de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros. Preferentemente, cuando se someten a deficiencia de nutrientes, las plantas transgénicas tienen mayor biomasa, preferentemente biomasa aérea, y/o mayor rendimiento de semillas con respecto a las plantas de control.

Aún en otro ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones con estrés, tales como estrés salino, para obtener plantas con mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control. La expresión "estrés salino" no se restringe a la sal común (NaCI), sino que puede ser uno o más de los siguientes: NaCI, KCI, LiCI, MgCI2, CaCI2, entre otros. Preferentemente, cuando se someten a estres salino, las plantas transgénicas tienen mayor biomasa, preferentemente biomasa aérea, y/o mayor rendimiento de semillas con respecto a las plantas de control.

Aún en otro ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones con estrés, tales como estrés por frío o estrés por congelación, para obtener plantas con mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control. Preferentemente, cuando se someten a estrés por frío, las plantas transgénicas tienen mayor biomasa, preferentemente biomasa aérea, y/o mayor rendimiento de semillas con respecto a las plantas de control.

En otra modalidad preferida, los métodos de la presente invención se realizan en condiciones sin estrés.

En otra modalidad, se provee un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta uno o más de cualquiera de los ácidos nucleicos exógenos indicados en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias, o que comprende introducir y expresar en una planta un fragmento funcional, ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias, o (i) un ácido nucleico exógeno que tiene al menos 60% de identidad con SEC I D NO: 1 , 13 o 15, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; o (ii) un ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que tiene al menos 60% de identidad con SEC I D NO: 2 o 16, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; o (iii) un ácido nucleico exógeno capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con (i) o (ii) o una secuencia complementaria del mismo; o (iv) un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido con la actividad biológica de una flavodoxina o una ferredoxina; o (v) un ácido nucleico exógeno que codifica el mismo polipéptido que los ácidos nucleicos de (i) a (iv) anteriores, pero que difieren de los ácidos nucleicos de (i) a (iv) anteriores debido a la degeneración del código genético; o (vi) un ácido nucleico exógeno que combina las características de los ácidos nucleicos de dos de (i) a (iv) anteriores.

Preferentemente, el ácido nucleico exógeno también codifica cualquiera de los péptidos de tránsito indicados en el Cuadro 3.

Un método preferido para aumentar la expresión de un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina es mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina, aún con mayor preferencia, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, y el polipéptido de flavodoxina se dirige a los plástidos.

De acuerdo con una modalidad, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento, como se indica en la presente, en las plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se define en la presente, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, y el polipéptido de flavodoxina se dirige a los plástidos.

En otra modalidad, se provee un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas, que comprende introducir y expresar en una planta un fragmento funcional, un ortólogo, un parálogo o una variante de empalme de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias.

Aún en otra modalidad, se provee un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de uno o más de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias.

Por ello, una modalidad preferida es un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en una planta con respecto a una planta de control, que comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, en donde la expresión está bajo el control de una secuencia de promotor ligada operativamente al ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina. Preferentemente, la secuencia de promotor comprende la secuencia de nucleótidos del promotor de GOS2, preferentemente el promotor de GOS2 del arroz, o fragmentos funcionales o derivados de cualquiera de ellos. Preferentemente, el promotor de GOS2 comprende la secuencia de SEC I D NO: 7 , 22 o 23, preferentemente SEC I D NO: 7.

En una modalidad preferida, el péptido de tránsito dirige el polipéptido de flavodoxina a un plástido, preferentemente, a un cloroplasto. Preferentemente, el péptido de tránsito al cloroplasto se selecciona de los péptidos de tránsito enumerados en el Cuadro 3.

Preferentemente, el polipéptido de flavodoxina es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo de secuencias de ácidos nucleicos enumeradas en el Cuadro 2 y/o en el listado de secuencias. Con mayor preferencia, el polipéptido de flavodoxina es de Anabaena sp. , preferentemente Anabaena PCC71 19, o Synechocystis sp. , preferentemente Synechocystis sp. PCC 6803. Con máxima preferencia, el péptido de tránsito es codificado por: (i) un ácido nucleico exógeno que tiene al menos 60% de identidad con SEC ID NO: 1 , 13 o 15, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; (ii) un ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que tiene al menos 60% de identidad con SEC I D NO: 2 o 16, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; y/o (iii) un ácido nucleico exógeno capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con (i) o (ii) o una secuencia complementaria del mismo.

Es de máxima preferencia el polipéptido de flavodoxina codificado por: (i) un ácido nucleico exógeno que tiene al menos 60% de identidad con SEC ID NO: 1 , 13 o 15, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; (ii) un ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que tiene al menos 60% de identidad con SEC I D NO: 2 o 16, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; y/o (iii) un ácido nucleico exógeno capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con (i) o (ii) o una secuencia complementaria del mismo.

Un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en una planta con respecto a las plantas de control comprende, preferentemente, (a) transformar de manera estable una célula vegetal con un casete de expresión que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, en donde el polipéptido de flavodoxina es codificado por (i) un ácido nucleico exógeno que tiene al menos 60% de identidad con SEC I D NO: 1 , 13 o 15, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; (ii) un ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que tiene al menos 60% de identidad con SEC I D NO: 2 o 16, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; y/o (iii) un ácido nucleico exógeno capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con (i) o (ii) o una secuencia complementaria del mismo; en enlace funcional con una secuencia de promotor; (b) regenerar la planta de la célula vegetal; y (c) expresar el ácido nucleico exógeno.

Preferentemente, el péptido de tránsito se selecciona de los péptidos de tránsito indicados en el Cuadro 3, con mayor preferencia, es codificado por los ácidos nucleicos de SEC I D NO: 3, 8 o 9, o tiene la secuencia descrita en SEC I D NO: 4 o 10. Preferentemente, la secuencia de promotor comprende una secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC I D NO: 7, 22 o 23, preferentemente SEC I D NO: 7.

De manera alternativa al ácido nucleico de SEC I D NO: 9, se puede usar el ácido nucleico de SEC I D NO: 8 que codifica el péptido de tránsito de la variante de SEC ID NO: 10.

Preferentemente, la planta que se usa en el método de la presente invención es una planta dicotiledónea o monocotiledónea. Preferentemente, la planta es de Poaceae. Con mayor preferencia, la planta monocotiledónea es del género Saccharum, preferentemente seleccionada del grupo que consiste en Saccharum arundinaceum, Saccharum bengalense, Saccharum edule, Saccharum munja, Saccharum officinarum, Saccharum procerum, Saccharum ravennae, Saccharum robustum, Saccharum sinense, y Saccharum spontaneum.

La realización de los metodos de la invención genera plantas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento. En particular, la realización de los métodos de la invención genera plantas que tienen mayor vigor temprano y/o mayor rendimiento, en especial, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas con respecto a las plantas de control. Las expresiones "vigor temprano", "rendimiento", "biomasa" y "rendimiento de semillas" se describen en mayor detalle en la sección "Definiciones" de la presente.

Por ello, la presente invención provee un método para aumentar los rasgos relacionados con el rendimiento, en especial, la biomasa y/o el rendimiento de semillas de las plantas, con respecto a las plantas de control, cuyo método comprende aumentar la expresión, en una planta, de un ácido nucleico exógeno como se describe en la presente. Preferentemente, el ácido nucleico exógeno también codifica un péptido de tránsito, preferentemente, una secuencia de tránsito al cloroplasto. Preferentemente, el rasgo mejorado relacionado con el rendimiento comprende mejor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control, y preferentemente, mejor biomasa aérea y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la realización de los métodos de la invención genera plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento, con respecto a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un metodo para aumentar la tasa de crecimiento de las plantas, cuyo método comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se define en la presente.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas en condiciones sin estrés o en condiciones de estrés que tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en plantas cultivadas en condiciones sin estrés y/o en condiciones de estrés, cuyo método comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina. Preferentemente, el método comprende la etapa de introducir un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina, y preferentemente un péptido de tránsito, en esa planta, preferentemente bajo el control de una secuencia de promotor endógena o exógena, como se describe en la presente. Preferentemente, el rasgo mejorado relacionado con el rendimiento se obtiene en condiciones de estrés por sequía, estrés salino o deficiencia de nitrógeno.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas en condiciones de sequía que tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar los rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de sequía, en donde el método comprende aumentar la expresión, en una planta, de un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, y el polipéptido de flavodoxina se dirige a los plástidos.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, en particular en condiciones de deficiencia de nitrógeno, que tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar los rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, en donde el método comprende aumentar la expresión, en una planta, de un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, y el polipéptido de flavodoxina se dirige a los plástidos.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas en condiciones de estrés salino que tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar los rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de estrés salino, en donde el método comprende aumentar la expresión, en una planta, de un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, y el polipéptido de flavodoxina se dirige a los plástidos.

En una modalidad de la invención, se aumenta el rendimiento de las semillas.

En otra modalidad de la invención, se aumenta la biomasa aérea, preferentemente, la biomasa del tallo, pedúnculo y/o esqueje, con mayor preferencia, en Poaceae, aún c on mayor preferencia, en una especie Saccharum, con máxima preferencia, en la caña de azúcar, y opcionalmente la biomasa subterránea y/o el crecimiento radicular no aumentan en comparación con las plantas de control.

En otra modalidad, se aumenta el azúcar cosechable total, preferentemente, la glucosa, fructosa y/o sacarosa, preferentemente además de aumentar otros rasgos relacionados con el rendimiento, como se definen en la presente, por ejemplo, la biomasa, y con mayor preferencia, también además de aumentar el contenido de azúcar, preferentemente, el contenido de glucosa, fructosa y/o sacarosa.

Los métodos para aumentar la expresión de ácidos nucleicos o genes, o productos génicos, están documentados en el estado de la téenica, y se proporcionan ejemplos en la presente.

Como se mencionó anteriormente, un método preferido para modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina es mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina; sin embargo, los efectos de realizar el método, es decir, mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento, también se pueden lograr mediante otras técnicas conocidas, que incluyen, entre otras, rotulado por activación de T-ADN, TILLI NG y recombinación homologa. En la sección de definiciones se provee una descripción de estas técnicas.

Debido a que los genes marcadores, en particular los genes de resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no son necesarios o no son deseados en la célula huésped transgénica, una vez que los ácidos nucleicos han sido introducidos con éxito, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos utiliza en forma ventajosa técnicas que permiten la eliminación o escisión de estos genes marcadores. Uno de esos métodos es conocido como co-transformación. El método de co-transformación usa dos vectores simultáneamente para la transformación, en donde un vector tiene el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo vector tiene el/los gen(es) marcador(es). Una gran proporción de transformantes recibe o, en el caso de las plantas, comprende (hasta 40% o más de los transformantes) ambos vectores. En el caso de la transformación con Agrobacterias, los transformantes reciben, en general, solo una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el T-ADN, que, con frecuencia, representa el casete de expresión. Luego, los genes marcadores se pueden eliminar de la planta transformada mediante la realización de cruzas. En otro método, los genes marcadores integrados en un transposón se utilizan para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como teenología Ac/Ds). Los transformantes se pueden cruzar con una fuente de transposasa o se pueden transformar con una construcción de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, en forma transitoria o estable. En algunos casos (aproximadamente 10%), el transposón salta fuera del genoma de la célula huésped una vez que se ha producido con éxito la transformación y se pierde. En otros casos, el transposón salta a una ubicación diferente. En estos casos, el gen marcador se debe eliminar mediante la realización de cruzas. En microbiología, se desarrollaron técnicas que posibilitan o facilitan la detección de estos eventos. Otro método ventajoso es lo que se conoce como sistemas de recombinación, cuya ventaja consiste en que se puede prescindir de la eliminación por cruza. El sistema más conocido de este tipo es el denominado sistema Cre/lox. Creí es una recombinasa que elimina las secuencias ubicadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador está integrado entre las secuencias loxP, se lo elimina una vez que se ha producido con éxito la transformación mediante la expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son los sistemas HI N/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al. , J. Biol. Chem. , 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al. , J. Cell Biol. , 149, 2000: 553-566). Es posible una integración específica de sitio de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en el genoma de la planta. Obviamente, estos metodos también se pueden aplicar a microorganismos, tales como levadura, hongos o bacterias.

Una modalidad preferida de la presente invención es el uso de una construcción de expresión o un vector de expresión recombinante descrito en la presente en un método para obtener una planta transgénica que tiene un rasgo mejorado relacionado con el rendimiento, preferentemente, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control, y con mayor preferencia, mayor biomasa aérea y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control.

Por ello, una modalidad preferida es una planta transgénica, una parte de una planta transgénica o una célula vegetal transgénica que se puede obtener mediante un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en una planta, con respecto a las plantas de control, o mediante un método para obtener plantas transgénicas, como se describe en la presente, en donde la planta transgénica, parte de la planta transgénica o célula vegetal transgénica expresan un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina bajo el control de una secuencia de promotor, como se describe en la presente.

Preferentemente, la planta transgénica, parte de la planta transgénica o célula vegetal transgénica se transforman con una construcción de expresión o con un vector de expresión recombinante, como se describe en la presente.

En una modalidad preferida, la planta, parte de la planta, semilla, esqueje o propágulo de la invención tienen uno o más rasgos aumentados relacionados con el rendimiento en condiciones sin estrés y/o en condiciones de sequía y/o deficiencia de nitrógeno, con mayor preferencia, en condiciones sin estrés.

Con máxima preferencia, la planta transgénica, parte de la planta transgénica o célula vegetal transgénica tienen un rasgo mejorado relacionado con el rendimiento, preferentemente mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se definió anteriormente. En una modalidad, las células huésped de acuerdo con la invención son células vegetales, levadura, bacterias u hongos. Las células huésped bacterianas preferidas son Escherichia coli o Agrobacterium. Las plantas huésped para los ácidos nucleicos, construcciones, casetes de expresión o vectores usados en el método de acuerdo con la invención son, en principio, ventajosamente todas las plantas capaces de sintetizar los polipéptidos usados en el método de la invención. En una modalidad particular, las células vegetales de la invención sobreexpresan la molécula de ácido nucleico de la invención.

Por ello, una modalidad de la presente invención es un ácido nucleico exógeno que codifica un peptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, como se describe en la presente, ligado operativamente a una secuencia de promotor, preferentemente un promotor de GOS2, con mayor preferencia, el promotor de GOS2 del arroz, como se describe en la presente, comprendido en una célula huésped, en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en célula vegetal, célula bacteriana, célula de levadura, célula fúngica y célula de mam ífero, preferentemente, célula vegetal, con mayor preferencia, una célula Poaceae, aún con mayor preferencia, una célula del género Saccharum, con máxima preferencia, una célula de la caña de azúcar.

Los métodos de la invención se aplican de manera ventajosa a cualquier planta, en particular, a cualquier planta, como se define en la presente. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen, entre otras, achicoria, zanahoria, mandioca, trébol, soja, remolacha, remolacha azucarera, girasol, cañóla, alfalfa, colza, linaza, algodón, tomate, papa y tabaco. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, la planta es una planta monocotiledónea. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, la planta es un cereal. Los ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, farro, espelta, trigo einkorn, teff, sorgo milo y avena. En una modalidad particular, las plantas de la invención o que se usan en los metodos de la invención se seleccionan del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, soja, algodón, colza oleaginosa, que incluye cañóla, caña de azúcar, remolacha azucarera y alfalfa.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridíplantae, en particular, plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluso forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos para alimentación, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp. , Actinidia spp. , Abelmoschus spp. , Agave sisalana, Agropyron spp. , Agrostis stolonifera, Allium spp. , Amaranthus spp. , Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp. , Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp. , Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa spp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa spp. [cañóla, colza oleaginosa, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp. , Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp. , Carthamus tinctorius, Castanea spp. , Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp. , Citrullus lanatus, Citrus spp. , Cocos spp. , Coffea spp. , Colocasia esculenta, Cola spp. , Corchorus spp., Coriandrum sativum, Corylus spp. , Crataegus spp. , Crocos sativus, Cucúrbita spp. , Cucumis spp. , Cynara spp. , Daucus carota, Desmodium spp. , Dimocarpus iongan, Dioscorea spp. , Diospyros spp. , Echinochloa spp. , Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleífera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus spp., Eriobotrya japónica, Eucalyptus spp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp. , Fagus spp. , Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp. , Fragaria spp. , Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp. , Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp. , Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp. , Luffa acutangula, Lupinus spp. , Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp. , Malus spp. , Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp. , Manilkara zapote, Medicago sativa, Melilotus spp. , Mentha spp. , Miscanthus sinensis, Momordica spp. , Morus nigra, Musa spp. , Nicotiana spp. , Olea spp. , Opuntia spp. , Ornithopus spp. , Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum spp., Persea spp. , Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp. , Phleum pratense, Phoenix spp. , Phragmites australis, Physalis spp. , Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp. , Poa spp. , Popuius spp. , Prosopis spp. , Prunus spp. , Psidium spp. , Púnica granatum, Pyrus communis, Quercus spp. , Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp. , Ricinus communis, Rubus spp. , Saccharum spp. , Salix spp., Sambucus spp. , Secale cereale, Sesamum spp. , Sinapis spp., Solanum spp. ("por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp. , Syzygium spp. , Tagetes spp. , Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp. , Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. ('por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp. , Vicia spp. , Vigna spp. , Viola odorata, Vitis spp. , Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. , entre otros.

Las plantas preferidas son de Poaceae. Las plantas más preferidas son caña de azúcar, preferentemente, del genero Saccharum. Con mayor preferencia, una planta se selecciona del grupo que consiste en Saccharum arundinaceum, Saccharum bengalense, Saccharum edule, Saccharum munja, Saccharum officinarum, Saccharum procerum, Saccharum ravennae, Saccharum robustum, Saccharum sinense, y Saccharum spontaneum.

Con respecto a las secuencias de la invención o útiles en los métodos, las construcciones, las plantas, las partes cosechables y los productos de la invención, en una forma de realización, un ácido nucleico o una secuencia de polipéptidos que no se origina de plantas superiores se usan en los métodos de la invención o la construcción de expresión útiles en los métodos de la invención. En otra modalidad, un ácido nucleico o una secuencia de polipéptidos de origen vegetal se usan en los métodos, las construcciones, las plantas, las partes cosechables y los productos de la invención o en las construcciones de expresión útiles en los métodos de la invención, porque el ácido nucleico y los polipéptidos tienen la característica de un uso de codón optimizado para la expresión en las plantas y del uso de aminoácidos y sitios reguladores comunes en las plantas, respectivamente. Las plantas de origen pueden ser cualquier planta, pero son preferentemente las plantas que se describen en la presente. Aún en otra modalidad, una secuencia de ácidos nucleicos que no se origina de plantas superiores, sino que se altera artificialmente para que tenga el uso de codón de las plantas superiores se usa en la construcción de expresión útil en los métodos de la invención.

De acuerdo con otra modalidad, la presente invención provee un método para producir plantas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, en donde el método comprende las etapas de aumentar la expresión, en esa planta, de un ácido nucleico que codifica un poli pé ptid o de flavodoxina, como se describe en la presente, y opcionalmente, seleccionar plantas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento.

De acuerdo con otra modalidad, la presente invención provee un método para producir plantas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, en donde el método comprende las etapas de aumentar la expresión, en esa planta, de un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, como se describe en la presente, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor particular como se describe en la presente, y opcionalmente, seleccionar plantas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento.

Por ello, la invención también provee plantas o células vegetales transformadas con una construcción como se describe en la presente. En particular, la invención provee plantas transformadas con una construcción, como se define en la presente, en donde esas plantas tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento descrito en la presente.

Por lo tanto, una modalidad preferida es un método para producir una planta transgénica, parte de la planta transgénica o célula vegetal transgénica que tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente, mayor biomasa y/o rendimiento de semillas, que comprende: (a) introducir una construcción de vector recombinante, como se define en la presente, en una planta, parte de planta o célula vegetal; (b) generar una planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica de la planta transformada, parte de planta transformada o célula vegetal transformada; y (c) expresar el ácido nucleico exógeno que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina.

En una modalidad, los métodos para producir una planta transgénica, una parte de una planta transgénica o una célula vegetal transgénica que tiene rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, comprende la etapa de cosechar las semillas de la planta transgénica, plantarlas y cultivarlas hasta que se conviertan en plantas; las semillas comprenden el ácido nucleico exógeno que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina, y la secuencia de promotor ligada operativamente al mismo.

En otra modalidad, los métodos de la invención son métodos para obtener una planta transgénica de Poaceae, preferentemente una planta de la especie Saccharum, una parte transgénica de esta o una célula vegetal transgénica de esta, que tiene uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, que comprenden la etapa de cosechar esquejes de la planta transgénica, y plantarlos y cultivarlos hasta que se conviertan en plantas; los esquejes comprenden el ácido nucleico exógeno que codifica el polipéptido POI y la secuencia de promotor ligada operativamente al mismo.

La invención tambien provee un método para obtener plantas transgénicas que tienen mayor biomasa, preferentemente biomasa aérea y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control, que comprende introducir y expresar, en una planta, cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se define en la presente, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, y el polipéptido de flavodoxina se dirige a los plástidos.

Más específicamente, la presente invención provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, en particular, mayor biomasa y/o rendimiento de semillas, cuyo método comprende: (i) introducir y expresar en una planta o célula vegetal un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina o una construcción genética que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina; y (ii) cultivar la célula vegetal en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta, preferentemente que promuevan el crecimiento y desarrollo de las plantas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido de flavodoxina, como se define en la presente. Preferentemente, el ácido nucleico también codifica un péptido de tránsito que dirige la flavodoxina al plástido, y preferentemente, el ácido nucleico se liga operativamente a una secuencia de promotor descrita en la presente.

El cultivo de la célula vegetal en condiciones que promuevan el desarrollo y crecimiento de la planta puede o no incluir la regeneración y/o el crecimiento hasta la madurez. En consecuencia, en una modalidad particular de la invención, la célula vegetal transformada con el método de acuerdo con la invención se puede regenerar en una planta transformada. En otra modalidad particular, la célula vegetal transformada con el método de acuerdo con la invención no se puede regenerar en una planta transformada, es decir, células que no son capaces de regenerarse en una planta usando téenicas de cultivo celular conocidas en el estado de la técnica. Si bien, en general, las células vegetales tienen la característica de totipotencia, algunas células vegetales no se pueden usar para regenerar o propagar plantas intactas de esas células. En una modalidad de la invención, las células vegetales de la invención son esas células. En otra modalidad, las células vegetales de la invención son células vegetales que no se sustentan a sí mismas de manera autótrofa. Un ejemplo son las células vegetales que no se sustentan a sí mismas mediante la fotosíntesis sintetizando hidratos de carbono y proteínas de las sustancias inorgánicas, tales como agua, dióxido de carbono y sales minerales.

El ácido nucleico se puede introducir directamente en una célula vegetal o en la planta misma (incluso se lo puede introducir en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce, preferentemente, en una planta o célula vegetal mediante transformación. El término "transformación" se describe en mayor detalle en la sección "Definiciones" de la presente.

En una modalidad, la presente invención se extiende a cualquier célula vegetal o planta producida mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente y a todas las partes de la planta y sus propágulos.

La presente invención abarca plantas o sus partes (incluso semillas y/o esquejes) que se pueden obtener mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. Las plantas, partes de plantas o células vegetales comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se definió con anterioridad, preferentemente, en una construcción genética, tal como un casete de expresión. La presente invención también abarca la progenie de una célula, tejido, órgano o planta entera primarios transformados o transfectados, que fue producida mediante cualquiera de los métodos antes mencionados; el único requisito es que ia progenie exhiba sustancialmente las mismas características genotípicas y/o fenotípicas que las producidas por el progenitor en los métodos de acuerdo con la invención.

En otra modalidad, la invención se extiende a semillas y/o esquejes que comprenden, de manera exógena, los casetes de expresión de la invención, las construcciones genéticas de la invención o los ácidos nucleicos que codifican • el polipéptido de flavodoxina • y/o el fragmento funcional de flavodoxina, • derivado, • ortólogo, y/o • parálogo del mismo, Como se describe en la presente y ligados operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente. En general, una planta cultivada de las semillas o los esquejes de la invención también tendrá rasgos mejorados relacionados con el rendimiento.

La invención también se extiende a las partes cosechables de una planta transgénica de la presente invención, tales como semillas, hojas, frutos, flores, tallos, esquejes, raíces, rizomas, tubérculos y bulbos, en donde las partes cosechables comprenden la construcción de la invención y/o un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina ligado operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, y/o el polipéptido de flavodoxina, como se define en la presente, que se dirige al plástido, y que se expresa específicamente por el uso de un promotor particular.

En particular, las partes cosechables son raíces, tales como raíces primarias, rizomas, frutos, tallos, esquejes, remolachas, tubérculos, bulbos, hojas, flores y/o semillas.

Las partes cosechables preferidas son semillas y/o esquejes de tallos (como esquejes de caña de azúcar, entre otras).

En otra modalidad, las partes aéreas, las partes aéreas cosechables o la biomasa aérea significan la biomasa vegetativa aérea, lo cual no incluye semillas y/o frutos.

En otra modalidad, la invención se refiere a un grano de polen transgénico que comprende la construcción de la invención y/o un derivado haploide de la célula vegetal de la invención. Si bien en una modalidad particular el grano de polen de la invención no se puede usar para regenerar una planta intacta sin agregar más material genético y/o no es capaz de realizar la fotosíntesis, el grano de polen de la invención se puede usar para introducir el rasgo mejorado relacionado con el rendimiento en otra planta mediante la fecundación de un óvulo de la otra planta con un grano de polen vivo de la invención, producir una semilla del óvulo fecundado y cultivar una planta de la semilla resultante. Otros granos de polen se pueden usar como marcadores de origen geográfico y/o temporal.

La invención también se refiere a productos derivados u obtenidos de una planta transgénica descrita en la presente o una o más partes cosechables de una planta transgénica descrita en la presente, preferentemente derivados u obtenidos de manera directa de una o más partes cosechables de esa planta transgénica. Los productos preferidos son pellas secas, tallos prensados, esquejes, harinas o polvos, fibras, tela, papel o cartón que contienen fibras obtenidas de las plantas de la invención, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón, hidratos de carbono, que incluyen almidones, papel o cartón que contienen hidratos de carbono obtenidos de las plantas de la invención, savia, jugo, paja o proteínas. Los hidratos de carbono preferidos son almidones, celulosa y/o azúcares, preferentemente sacarosa. Otros productos preferidos son las fibras secas residuales, por ejemplo, del tallo (como el bagazo de la caña de azúcar después de la extracción del jugo de la caña), de la melaza o de la torta de filtro, preferentemente, de la caña de azúcar. Estos productos pueden ser productos agrícolas.

Preferentemente, el producto comprende — por ejemplo, como indicador de la calidad particular del producto— la construcción de la invención, un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido de flavodoxina, como se describe en la presente, y/o un polipéptido de flavodoxina exógeno, como se describe en la presente, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor particular como se describe en la presente y el polipéptido de flavodoxina se dirige a los plástidos, y se expresa específicamente por el uso de un promotor particular.

En otra modalidad, la invención se refiere a semillas molidas y/o tallos molidos contra la falsificación que tienen, como indicación del origen y/o como indicación del productor, una célula vegetal de la invención y/o la construcción de la invención, en donde el tallo molido es, preferentemente, un tallo molido de Poaceae, con mayor preferencia, caña de azúcar molida.

La invención también incluye métodos para la fabricación de un producto, que comprenden a) cultivar las plantas de la invención y b) obtener el producto de las plantas de la invención o partes de éstas, que incluyen tallos y/o semillas. En otra modalidad, los métodos comprenden las siguientes etapas: a) cultivar las plantas de la invención, b) retirar las partes cosechables, como se describen en la presente, de las plantas, y c) obtener el producto de las partes cosechables de las plantas de acuerdo con la invención. Preferentemente, el producto comprende la construcción genética, ácido nucleico y/o polipéptido de la invención, como se describe en la presente. Con mayor preferencia, el producto se obtiene de semillas o del tallo de la planta transgénica.

En una modalidad, el método para obtener un producto comprende: a) cultivar las plantas Poaceae de la invención, preferentemente, la planta es caña de azúcar; b) obtener el tallo de las plantas de la invención; y c) cortar el tallo en partes, preferentemente, en partes adecuadas como material de propagación, preferentemente, en uno o más esquejes. Preferentemente, los esquejes comprenden la construcción, ácido nucleico y/o polipéptido de la invención, como se describe en la presente.

En otra modalidad, el método para obtener un producto comprende: a) cultivar las plantas Poaceae de la invención, preferentemente, la planta es de una especie de Saccharum y, con mayor preferencia, caña de azúcar; b) obtener el tallo de las plantas de la invención o partes de estas; y c) extraer el jugo, preferentemente, el jugo de caña del tallo y/o extraer las fibras residuales después de la extracción del jugo; y de manera opcional, d) extraer azúcar, preferentemente sacarosa, del jugo del tallo.

En una modalidad, el método de la invención es un método para fabricar tela mediante las siguientes etapas; a) cultivar las plantas de la invención que son capaces de producir fibras que se pueden usar en la producción de tela, por ejemplo algodón, b) retirar las partes cosechables, como se describe en la presente, de las plantas, c) obtener fibras de esas partes cosechables, y d) producir tela de las fibras de c). Otra modalidad de la invención se refiere a un método para producir forraje para biorreactores, procesos de fermentación o plantas de biogás, que comprende a) cultivar las plantas de la invención, b) retirar las partes cosechables, como se describe en la presente, de las plantas, y c) producir forraje para biorreactores, procesos de fermentación o plantas de biogás. En una modalidad preferida, el método de la invención es un método para producir alcoholes de material vegetal, que comprende a) cultivar las plantas de la invención, b) retirar las partes cosechables, como se describe en la presente, de las plantas, c) opcionalmente producir forraje para procesos de fermentación, y d) luego de las etapas b) o c), producir uno o más alcoholes del forraje o partes cosechables, preferentemente usando microorganismos, tales como hongos, algas, bacterias o levadura, o cultivos celulares. Un ejemplo típico sería la producción de etanol usando partes cosechables que contienen hidrato de carbono, por ejemplo, semillas de maíz, partes del tallo de la caña de azúcar o partes de remolacha de la remolacha azucarera, o productos derivados de estos, por ejemplo, jugo o savia de la caña de azúcar o remolacha azucarera, almidón de maíz o jarabe de almidón de maíz. En una modalidad, el producto de obtiene del tallo de la planta transgénica. En otra modalidad, el producto de obtiene de la semilla de la planta.

En otra modalidad, el método de la invención es un método para la producción de uno o más polímeros, que comprende a) cultivar las plantas de la invención, b) retirar las partes cosechables, como se describe en la presente, de las plantas, c) producir uno o más monómeros de las partes cosechables, opcionalmente incluyendo productos intermediarios, y d) producir uno o más polímeros mediante la reacción de al menos uno de esos monómeros con otros monómeros o la reacción de esos monómeros entre sí. En otra modalidad, el método de la invención es un método para la producción de un compuesto farmacéutico, que comprende a) cultivar las plantas de la invención, b) retirar las partes cosechables, como se describe en la presente, de las plantas, c) producir uno o más monómeros de las partes cosechables, opcionalmente incluyendo productos intermediarios, y d) producir un compuesto farmaceutico de las partes cosechables y/o productos intermediarios. En otra modalidad, el método de la invención es un método para la producción de uno o más productos químicos, que comprende a) cultivar las plantas de la invención, b) retirar las partes cosechables, como se describe en la presente, de las plantas, c) producir uno o más bloques de construcción de productos químicos, tales como acetato, piruvato, lactato, ácidos grasos, azúcares, aminoácidos, nucleótidos, carotenoides, terpenoides o esteroides, de las partes cosechables, opcionalmente incluyendo productos intermediarios, y d) producir uno o más productos químicos mediante la reacción de al menos uno de esos bloques de construcción con otro bloque de construcción o la reacción de esos bloques de construcción entre sí.

La presente invención también se refiere a un producto que se obtiene mediante un método para fabricar un producto, como se describe en la presente.

En una modalidad, los productos obtenidos mediante los métodos de la invención son productos vegetales, tales como productos alimenticios, forraje, suplementos alimenticios, suplementos para forraje, fibras, cosméticos o productos farmacéuticos. En otra modalidad, los métodos para la producción se usan para obtener productos agrícolas, tales como fibras, extractos vegetales, polvos de molienda, tortas de prensado y otros materiales restantes despues de uno o más procesos de extracción, harina, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono, grasas, aceites, polímeros, vitaminas y similares. Los hidratos de carbono preferidos son azúcares, preferentemente, sacarosa. En una modalidad, el producto agrícola se selecciona del grupo que consiste en 1 ) fibras, 2) madera, 3) extractos vegetales, 4) polvos de molienda, tortas de prensado u otros materiales restantes después de uno o más procesos de extracción, 5) harina, 6) proteínas, 7) hidratos de carbono, 8) grasas, 9) aceites, 10) polímeros, por ejemplo, celulosa, almidón, lignina, lignocelulosa, y 1 1 ) combinaciones y/o mezclas de cualquiera de 1 ) a 10). En una modalidad preferida, el producto o el producto agrícola no comprenden, en general, células vegetales vivas, pero sí comprenden el casete de expresión, la construcción genética, la proteína y/o el polinucleótido, como se describe en la presente. Preferentemente, el producto comprende la construcción genética, ácido nucleico y/o polipéptido de la invención, como se describe en la presente.

Aún en otra modalidad, los polinucleótidos y/o los polipéptidos y/o las construcciones genéticas de la invención están comprendidos en un producto agrícola. En una modalidad particular, las secuencias de ácidos nucleicos y/o las secuencias proteicas y/o las construcciones genéticas de la invención se pueden usar como marcadores de productos, por ejemplo, cuando un producto agrícola se obtuvo mediante los métodos de la invención. El marcador se puede u sar para identificar un producto que se obtuvo mediante un proceso ventajoso que genera no solo mayor eficacia del proceso, sino tambien mejor calidad del producto, debido a una mayor calidad del material vegetal y de las partes cosechadles que se usan en el proceso. Los marcadores se pueden detectar mediante varios métodos conocidos en el estado de la téenica, por ejemplo, métodos basados en PCR para la detección de ácidos nucleicos o métodos basados en anticuerpos para la detección de proteínas.

Método para cultivar/Método para el mejoramiento de plantas/Método para la producción de variedad de plantas La presente invención también abarca el uso de construcciones que comprenden ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de flavodoxina y que se ligan operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, y el uso de estos polipéptidos de flavodoxina expresados específicamente por el uso de un promotor particular para mejorar, en las plantas, cualquiera de los rasgos relacionados con el rendimiento antes mencionados. Por ejemplo, las construcciones que comprenden ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de flavodoxina, y que están ligados operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, o los mismos polipéptidos de flavodoxinas expresados específicamente por el uso de un promotor particular se pueden usar en programas de reproducción en los que se identifica un marcador de ADN que se puede ligar genéticamente a una combinación de gen que codifica un polipéptido de flavodoxina- promotor, como se describe en ia presente. La combinación de ácidos nucleicos/gen -promotor de la invención o los mismos polipéptídos de flavodoxina expresados específicamente por el uso de un promotor particular se puede usar para definir un marcador molecular. Este marcador de ADN o proteína luego se puede usar en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, como se define en la presente en los métodos de la invención Además, las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido de flavodoxina ligado operativamente a un promotor particular, como se describe en la presente, pueden ser útiles en los programas de reproducción asistida por marcador. Las combinaciones de la invención entre un promotor particular y ácidos nucleicos que codifican polipéptídos de flavodoxina también se pueden usar como sondas para mapear de forma genética y física la ubicación genómica de los genes de los que son parte y como marcadores para los rasgos relacionados con esos genes y sus sitios de inserción. Esta información puede ser útil para la reproducción de plantas, a fin de desarrollar líneas con los fenotipos deseados.

Una modalidad preferida es un método para reproducir una planta con uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, que comprende, (a) cruzar una planta transgénica de la invención o una planta transgénica que se puede obtener mediante cualquiera de los métodos descrito en la presente, con una segunda planta; (b) obtener semillas de la cruza de la etapa (a); (c) plantar las semillas y cultivarlas hasta que se conviertan en plantas; y (d) seleccionar, de esas plantas, plantas que expresan de manera exógena el ácido nucleico que codifica el polipéptido de flavodoxina descrito en la presente, preferentemente que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina, en donde el ácido nucleico se liga funcionalmente, con preferencia, a una secuencia de promotor descrita en la presente.

Opcionalmente, el método de reproducción también comprende la etapa de (e) producir un material de propagación de las plantas que expresan el ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina, en donde el material de propagación comprende la construcción genética y/o la construcción de vector de la invención. Preferentemente, el material de propagación son esquejes del tallo o semillas.

Otra modalidad preferida es un método para mejorar la planta, que comprende, (a) obtener una planta transgénica mediante cualquiera de los métodos de la presente invención; (b) combinar en una célula vegetal el material genético de al menos una célula vegetal de la planta de a) con el material genético de al menos una célula que difiere en uno o más genes de las células vegetales de las plantas de a) o cruzando la planta transgenica de a) con una segunda planta; (c) obtener las semillas de al menos una planta generada de la célula vegetal de b) o la planta de la cruza de la etapa (b); (d) plantar las semillas y cultivarlas hasta que se conviertan en plantas; y (e) seleccionar, de esas plantas, plantas que expresan bajo el control de un promotor particular, como se describe en la presente, el ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina; y opcionalmente (f) producir un material de propagación de las plantas que expresan el ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina, en donde el material de propagación comprende la construcción genética y/o la construcción de vector de la invención.

Preferentemente, el material de propagación son esquejes del tallo o semillas.

En una modalidad, el contenido total de hidratos de carbono de almacenamiento de las plantas de la invención o sus partes y, en particular, de las partes cosechables de las plantas es mayor en comparación con las plantas de control y las partes correspondientes de las plantas de control. Los hidratos de carbono de almacenamiento son, preferentemente, azúcares, tales como sacarosa, fructosa y glucosa, y polisacáridos, tales como almidones, glucanos y fructanos. El contenido total de hidratos de carbono de almacenamiento y el contenido de grupos individuales o especies de hidratos de carbono se pueden medir de varias maneras conocidas en el estado de la teenica. Por ejemplo, la solicitud internacional publicada como W02006066969 describe, en los párrafos [79] a [1 17], un método para determinar el contenido de hidratos de carbono de almacenamiento total de la caña de azúcar, lo que incluye el contenido de fructano.

Otro método para la caña de azúcar es el siguiente: Las plantas transgénicas de caña de azúcar se cultivan durante 10 a 15 meses, en el invernadero o en el campo. Se usan condiciones estándares para el crecimiento de las plantas.

Se cosechan tallos de plantas de caña de azúcar que tienen de 10 a 15 meses y más de 1 0 internodos. Después de que se retiraron todas las hojas, los internodos del tallo se enumeran desde la parte superior (= 1 ) hasta la parte inferior (por ejemplo = 36). Se extrae un disco de tallo de 1 -2 g de peso desde la mitad de cada internodo. Luego, los discos de tallo de 3 internodos se combinan para obtener una muestra y se congelan en nitrógeno líquido. Para la extracción de azúcar, los discos de tallo primero se desmenuzan en una mezcladora Waring (de Waring, New Hartford, Connecticut, E. U.A.). Los azúcares se extraen agitándolos durante una hora a 95°C en 10 mM de regulador de pH de fosfato de sodio a pH 7,0. Luego, los sólidos se retiran mediante filtración a traves de un tamiz de 30 pm. A continuación, la solución resultante se usa para la determinación del azúcar (véase a continuación).

Las plantas transgénicas de caña de azúcar se cultivan durante 10 a 15 meses. En cada caso, se desfolian un tallo de caña de azúcar de la línea transgénica y una planta de caña de azúcar de tipo silvestre, el tallo se divide en segmentos de 3 internodos, y estos segmentos de internodos se congelan en nitrógeno líquido en un recipiente plástico sellado de 50 mi. Se determina el peso fresco de las muestras. La extracción para la determinación del azúcar se realiza como se describe a continuación.

El contenido de glucosa, fructosa y sacarosa en el extracto obtenido de acuerdo con el método de extracción de azúcar descrito anteriormente se determina de manera fotométrica en un ensayo enzimático mediante la conversión de NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) en NADH (nicotinamida adenina dinucleótido reducida). Durante la reducción, se pierde el carácter aromático en el anillo de nicotinamida y, por ello, el espectro de absorción cambia. Este cambio en el espectro de absorción se puede detectar de manera fotométrica. La glucosa y la fructosa presentes en el extracto se convierten en glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato mediante la enzima hexoqumasa y adenosina trifosfato (ATP). Posteriormente, la glucosa-6-fosfato se oxida mediante la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para obtener 6-fosfogluconato. En esta reacción, se reduce NAD+ para obtener NADH , y la cantidad de NADH formada se determina de manera foto etrica. La relación entre la NADH formada y la glucosa presente en el extracto es 1 : 1 , a fin de que el contenido de glucosa se pueda calcular del contenido de NADH usando el coeficiente de absorción molar de NADH (6.3 1 por mmol y por cm de haz de luz). Después de la oxidación completa de glucosa-6-fosfato, la fructosa-6-fosfato, que también se había formado en la solución, se convierte mediante la enzima fosfoglucoisomerasa en glucosa-6-fosfato que, a su vez, se oxida para obtener 6-fosfogluconato. Nuevamente, la relación entre fructosa y la cantidad de NADH formada es 1 : 1 . Luego, la sacarosa presente en el extracto se escinde mediante la enzima sucrasa (Megazima) para obtener glucosa y fructosa. Las moléculas de glucosa y fructosa liberadas se convierten, con las enzimas antes mencionadas, en la reacción dependiente de NAD+ para obtener 6-fosfogluconato. La conversión de una molécula de sacarosa en 6-fosfogluconato da como resultado dos moléculas de NADH. La cantidad de NADH f ormada también se determina de manera fotométrica y se usa para calcular el contenido de sacarosa usando el coeficiente de absorción molar de NADH.

Los tallos de la caña de azúcar se dividen en segmentos que tienen, en cada caso, tres internodos, como se especificó anteriormente. Los internodos se enumeran desde la parte superior hasta la parte inferior (parte superior = internodo 1 , parte inferior = internodo 21 ) .

Además, las plantas de caña de azúcar transgénicas se pueden analizar usando cualquier método conocido en el estado de la téenica, que incluyen, por ejemplo: • The Sampling of Sugar Cañe by the Full Width Hatch Sampler; ICUMSA (Comisión I nternacional de Métodos Uniformes del Análisis del Azúcar, http://www. icumsa.org/index.php?id=4) método GS 5-5 ( 1994) disponible de Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlín (http://www. bartens.com/) • The Sam pling of Sugar Cañe by the Corer Method; ICUMSA método GS 5-7 (1994) disponible de Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlín (http://www. bartens.com/) • The Determination of Sucrose by Gas Chromatography in Molasses and Factory productos - Official; and Cañe Juice; ICUMSA método GS 4/7/8/5-2 (2002) disponible de Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlín (http://www.bartens.com/) • The Determination of Sucrose, Glucose and Fructose by HPLC - in Cañe Molasses-and Sucrose in Beet Molasses; ICUMSA método GS 7/4/8-23 (201 1 ) disponible de Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlín (http://www. bartens. com/) • The Determination of Glucose, Fructose and Sucrose in Cañe Juices , Syrups and Molasses, and of Sucrose in Beet Molasses by High Performance Ion Chromatography; ICUMSA método GS 7/8/4-24 (201 1 ) disponible de Verlag Dr. Albert Bartens KG, Lückhoffstr. 16, 14129 Berlín (http://www. bartens.com/).

Para cultivos que no son caña de azúcar, se conocen métodos similares en el estado de la téenica o se pueden adaptar con facilidad de otro método conocido para otro cultivo.

En una modalidad, las plantas de control no contienen un casete de expresión de la invención y, por ello, no comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, como se describe en la presente, ligado operativamente a un promotor particular, como se define en la presente.

En otra modalidad, las plantas de control tienen una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, pero esta secuencia de ácidos nucleicos no se liga funcionalmente al promotor que se usa en las construcciones, vectores, plantas, usos y métodos de la presente invención, es decir, la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos no se encuentra bajo el control de ese promotor.

Además, la presente invención se refiere a las siguientes modalidades específicas, en donde la expresión “como se define en la reivindicación/el inciso X" pretende indicarle a la persona del oficio de nivel medio que aplique la definición descrita en el inciso/la reivindicación X. Por ejemplo, “un ácido nucleico como se define en el ítem 1” significa que se debe aplicar la definición del ácido nucleico del inciso 1 al ácido nucleico. En consecuencia, las expresiones “como se define en el inciso” o “como se define en la reivindicación se pueden reemplazar por la definición correspondiente de ese inciso o reivindicación, respectivamente.

Modalidades específicas: 1 . Un metodo para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en una planta con respecto a una planta de control, que comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, en donde la expresión está bajo el control de una secuencia de promotor ligada operativamente al ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina, y en donde la secuencia de promotor comprende la secuencia de nucleótidos de un promotor de GOS2, preferentemente, un promotor de GOS2 del arroz; o fragmentos funcionales o derivados de estos. 2. El método de acuerdo con la modalidad 1 , en donde la secuencia de nucleótidos del promotor de GOS2 comprende, al menos, 70% de la secuencia representada por SEC ID NO: 7. 3. El método de acuerdo con las modalidades 1 o 2, en donde el péptido de tránsito dirige el polipéptido de flavodoxina a un plástido, preferentemente, a un cloroplasto. 4. El método de acuerdo con la modalidad 3 , en donde el péptido de tránsito al cloroplasto se selecciona de los péptidos de tránsito enumerados en el Cuadro 4 u homólogos de éstos. 5. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 4, en donde el polipéptido de flavodoxina es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo de secuencias de ácidos nucleicos enumeradas en el Cuadro 3 u homólogos de estas.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 5, en donde el polipéptido de flavodoxina es de Anabaena sp. , preferentemente, Anabaena PCC71 19.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 6, en donde el polipéptido de flavodoxina es codificado por, (i) un ácido nucleico exógeno que tiene, al menos, 60% de identidad con SEC I D NO: 1 , 1 3 o 15, o un fragmento funcional del mismo, o un ortógolo o parálogo del mismo; o (ii) un ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que tiene, al menos, 60% de identidad con SEC I D NO: 2 o 16, preferentemente, o un fragmento funcional del mismo, o un derivado, ortógolo o parálogo del mismo; o (iii) un ácido nucleico exógeno capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con (i) o (ii) o una secuencia complementaria del mismo; o (iv) un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido con la actividad biológica de una flavodoxina o una ferredoxina; o (v) un ácido nucleico exógeno que codifica el mismo polipéptido que los ácidos nucleicos de (i) a (iv) anteriores, pero que difieren de los ácidos nucleicos de (i) a (iv) anteriores, debido a la degeneración del código genético; o (vi) un ácido nucleico exógeno que combina las características de los ácidos nucleicos de dos de (i) a (iv) anteriores.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 7, que comprende: (a) transformar de manera estable una célula vegetal con un casete de expresión que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, en donde el polipéptido de flavodoxina es codificado por, (i) un ácido nucleico exógeno que tiene, al menos, 60% de identidad con SEC ID NO: 1 , 13 o 15, o un fragmento funcional del mismo, o un ortógolo o parálogo del mismo; (ii) un ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que tiene, al menos, 60% de identidad con SEC ID NO: 2 o 16, preferentemente, o un fragmento funcional del mismo, un ortógolo o un parálogo del mismo; y/o (iii) u n ácido nucleico exógeno capaz de hlbridarse en condiciones rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con (i) o (ii) o una secuencia complementaria del mismo; (iv) un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido con la actividad biológica de una flavodoxina o una ferredoxina; o (v) un ácido nucleico exógeno que codifica el mismo polipéptido que los ácidos nucleicos de (i) a (iv) anteriores, pero que difieren de los ácidos nucleicos de (i) a (iv) anteriores, debido a la degeneración del código genético; o (vi) un ácido nucleico exógeno que combina las características de los ácidos nucleicos de dos de (i) a (iv) anteriores; en donde el ácido nucleico exógeno se encuentra en enlace funcional con una secuencia de promotor que comprende la secuencia de nucleótidos del promotor de GOS2, preferentemente, el promotor de GOS2 del arroz, o un fragmento funcional del mismo, un ortólogo o parálogo del mismo; (b) regenerar la planta de la célula vegetal; y (c) expresar el ácido nucleico exógeno. 9. Método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 8, en donde uno o más de los rasgos mejorados relacionados con el rendimiento comprenden mayor biomasa con respecto a las plantas de control, y preferentemente, comprenden mayor biomasa aérea con respecto a las plantas de control. 10. Método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 9, en donde uno o más de los rasgos mejorados relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estres o condiciones de estrés abiótico. 1 1 . Método de acuerdo con la modalidad 10, en donde uno o más de los rasgos mejorados relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de estrés por sequía, estrés salino o deficiencia de nitrógeno. 12. Construcción de expresión que comprende: (i) un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito como se define en cualquiera de las modalidades 3 o 4 y un polipéptido de flavodoxina como se define en cualquiera de las modalidades 5 a 8; (ii) una secuencia de promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (i) como se define en las modalidades 1 o 2; y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de la transcripción. 13. Vector de expresión recombinante que comprende la construcción de expresión de acuerdo con la modalidad 12. 14. Uso de una construcción de expresión de acuerdo con la modalidad 12 o un vector de expresión recombinante de acuerdo con la modalidad 13 en un método para hacer una planta transgénica que tiene uno o más rasgos relacionados con el rendimiento, preferentemente mayor biomasa, con respecto a las plantas de control, y con mayor preferencia, mayor biomasa aérea con respecto a las plantas de control. 15. Método para la producción de una planta transgénica, parte de planta transgenica o célula vegetal transgénica que tiene uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente, mayor biomasa, que comprende: (a) introducir una construcción de vector recombinante de acuerdo con la modalidad 13 en una planta, una parte de planta o una célula vegetal; (b) generar una planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica célula de la planta transformada, parte de planta transformada o célula vegetal transformada; y (c) expresar el ácido nucleico exógeno que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina.

El método de la modalidad 15, que también comprende la etapa de cosechar el material de propagación de la planta transgénica y plantar el material de propagación, y cultivar el material de propagación hasta obtener plantas, en donde el material de propagación comprende el ácido nucleico exógeno que codifica el péptido de tránsito, el polipéptido de flavodoxina y la secuencia de promotor ligada operativamente al mismo. Planta transgénica, parte de planta transgénica, o célula vegetal transgénica que se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 1 1 , 15 o 16, en donde la planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica expresan un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina bajo el control de una secuencia de promotor como se define en cualquiera de las modalidades 1 a 8. 18. Planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica transformadas con una construcción de expresión de acuerdo con la modalidad 12 o con un vector de expresión recombinante de acuerdo con la modalidad 13, y que comprenden la secuencia de promotor ligada operativamente al ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina, cada uno de ellos, como se definen en cualquiera de las modalidades 1 a 8. 19. Planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica de acuerdo con las modalidades 17 o 18, en donde la planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica tiene uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, preferentemente, mayor biomasa, con respecto a las plantas de control. 20. Parte cosechable de una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 17 a 19, en donde la parte cosechable es un órgano aéreo, preferentemente, el tallo o partes del mismo. 21 . Producto producido de una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 17 a 19, o de la parte cosechable de una planta transgénica de acuerdo con la modalidad 20. 22. Un método para fabricar un producto, que comprende las etapas de cultivar las plantas transgenicas de acuerdo con cualquiera de las modalidades 17 a 19 y obtener el producto de dichas plantas o partes, preferentemente, el tallo, de la planta.

Un método para mejorar las plantas, que comprende, a) obtener una planta transgénica mediante el método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 11 , 15 o 16; b) combinar en una célula vegetal el material genético de al menos una célula vegetal de la planta de a) con el material genético de al menos una célula que difiere en uno o más genes de las células vegetales de las plantas de a) o cruzando la planta transgénica de a) con una segunda planta; c) obtener las semillas de al menos una planta generada de la célula vegetal de b) o la planta de la cruza de la etapa (b); d) plantar las semillas y cultivarlas hasta que se conviertan en plantas; y e) seleccionar de dichas plantas, plantas que expresan el ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina; y, opcionalmente, f) producir un material de propagación de las plantas que expresan el ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina.

La construcción de expresión de acuerdo con la modalidad 12 o un ADN cromosómico recombinante que comprende un casete de expresión que comprende un promotor definido en la modalidad 12, inciso (ii) un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito unido a una flavodoxina definida en la modalidad 12, inciso (i) y una secuencia de terminación de la transcripción en enlace funcional, en donde la construcción o el ADN cromosómico recombinante está comprendido en una célula vegetal.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 1 1 , 15, 16, 22 o 23, o la planta transgénica, parte de planta transgénica, o célula vegetal transgénica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 17 a 19, o el uso de acuerdo con la modalidad 14, la parte cosechable de acuerdo con la modalidad 20, o el producto de acuerdo con la modalidad 21 , o la construcción o ADN cromosómico recombinante de la modalidad 24, en donde la célula vegetal es del grupo que consiste en frijoles, soja, arvejas, trébol, kudzu, lúceme, lentejas, lupinos, algarrobas, maní, arroz, trigo, maíz, cebada, arabidopsis, lenteja, banana, colza oleaginosa, lo que incluye cañóla, algodón, papa, caña de azúcar, alfalfa, remolacha azucarera, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer ( Triticum dicoccum o farro), espelta, trigo einkorn ( triticum monococcum, trigo escaña cultivada), teff, milo y avena, o la planta se selecciona de estos.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 1 1 , 15, 16, 22 o 23, o la planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 17 a 19, o el uso de acuerdo con la modalidad 14, la parte cosechable de acuerdo con la modalidad 20, o el producto de acuerdo con la modalidad 21 , o la construcción o ADN cromosómico recombinante de la modalidad 24 en donde la planta es Poaceae o la celula vegetal es de esta, preferentemente, del género saccharum, con mayor preferencia, seleccionada del grupo que consiste en Saccharum arundinaceum, Saccharum bengalense, Saccharum edule, Saccharum munja, Saccharum officinarum, Saccharum procerum, Saccharum ravennae, Saccharum robustum, Saccharum sinense y Saccharum spontaneum .

La presente invención se describirá a continuación con referencia a los siguientes ejemplos, que se brindan solo a modo ilustrativo. Los siguientes ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invención.

En particular, las plantas que se usan en los experimentos descritos se usan porque las plantas de Arabidopsis, tabaco, arroz y maíz son plantas modelo para analizar los transgenes. Se usan ampliamente en la téenica para lograr un análisis relativamente fácil, a la vez que tienen buena transferabilidad de los resultados a otras plantas usadas en la agricultura, tales como maíz, trigo, arroz, soja, algodón, colza oleaginosa, lo que incluye cañóla, caña de azúcar, remolacha azucarera y alfalfa u otros cultivos dicotiledóneos o monocotiledóneos.

A menos que se indique de otro modo, la presente invención usa téenicas y métodos convencionales de biología vegetal, biología molecular, biomformática y reproducción de plantas.

Manipulación de ADN : a menos que se indique de otro modo, las técnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con los protocolos estándares descritos en (Sambrook (2001 ) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3.a edición Coid Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y métodos estándares para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax ( 1993) de R. D. D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications (UK).

Ejemplo 1 : Identificación de secuencias relacionadas con SEC ID NO: 1 v SEC ID NO: 2 Se identificaron secuencias (de cADN de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con SEC I D NO: 1 y SEC I D NO: 2 entre aquellas que se mantienen en la base de datos Entrez Nucleotides en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) mediante el uso de herramientas de búsqueda de secuencias en base de datos, tales como Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J . Mol. Biol. 215:403-410; y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). El programa se usa para encontrar regiones de similitud local entre secuencias mediante la comparación de secuencias de ácidos nucleicos o polipeptidos con bases de datos de secuencias y mediante el cálculo de la importancia estadística de las comcidencias. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico de SEC ID NO: 1 se usa para el algoritmo TBLASTN, con parámetros predeterminados y se activó el filtro para ignorar las secuencias de baja complejidad. El resultado del análisis se observó mediante comparación de pares y se lo calificó de acuerdo con el puntaje de probabilidad (valor E); el puntaje refleja la probabilidad de que una alineación en particular se produzca al azar (cuanto menor es el valor E, más importante es la coincidencia). Además de los valores E, las comparaciones también se calificaron por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere a la cantidad de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos) comparadas a lo largo de una longitud particular. En algunos casos, los parámetros predeterminados se pueden ajustar para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo, se puede aumentar el valor E para mostrar coincidencias menos rigurosas. De este modo, se pueden identificar coincidencias coincidencias casi exactas.

Ejemplo 2: Identificación de dominios comprendidos en secuencias de polipéptidos útiles para la realización de los métodos de la invención La base de datos I ntegrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos de firmas que se utilizan habitualmente para búsquedas basadas en texto y en secuencias. La base de datos InterPro combina estas bases de datos, que usan diferentes metodologías y diversos grados de información biológica sobre proteínas bien caracterizadas, para derivar proteínas características. Las bases de datos colaboradoras incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRI NTS, ProDom y Pfam, Smart y TIGRFAM . Pfam es una gran colección de alineaciones de secuencias múltiples y modelos de Markov ocultos que abarcan muchos dominios y familias de proteínas comunes. Pfam se encuentra en el servidor de Sanger I nstitute en el Reino Unido. InterPro se encuentra en el European Biomformatics Institute en el Reino Unido.

Los resultados de la búsqueda por I nterPro (véase Zdobnov E. M. y Apweiler R. ¡ "I nterProScan - an integration platform for the signature-recognition methods in InterPro."; Bioinformatics, 2001 , 17(9): 847-8; base de datos InterPro, versión 36.0, 23 de febrero de 2012 de las secuencias de polipéptidos representadas por SEC ID NO: 2 se presentan en el Cuadro B y en la Figura 1 .

Cuadro B: Resultados de la búsqueda por I nterPro (números de acceso principales) de la secuencia de polipeptidos representada por SEC I D NO: 2.

Un análisis de repetición mediante el uso del software InterproScan, versión 4.8, base de datos InterPro, versión 41 del 13 de febrero de 2013, arrojó los dominios y motivos enumerados en el Cuadro B con las coordinadas proporcionadas en la última columna del Cuadro B, y además, se detectaron los dominios y motivos PI RSF038996, G3DSA:3.40.50.360, PTHR301 12, SSF52218.

En una modalidad, un polipéptido relacionado con flavodoxin comprende un dominio conservado (o motivo) con al menos 70%, 71 %, 72% , 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un dominio conservado del Cuadro B.

Ejemplo 3: Clonación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifican flavodoxina Construcción de transformación de arroz: El ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina (SEC I D NO: 5) se sintetizó de modo que incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway (Life Technologies GmbH , Frankfurter StraBe 129B, 64293 Darmstadt, Alemania).

De manera alternativa, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica flavodoxina se puede amplificar por PCR usando como molde la genoteca de ADNc en caso de los eucariotes o ADN genómico para procariotes, como Anabaena. La PCR se realizó con ADN polimerasa Taq disponible en el comercio en condiciones estándares, usando 200 ng de molde en una mezcla de PCR de 50 mI. Los cebadores que se utilizaron incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway. El fragmento de PCR amplificado se purifica también mediante métodos estándares. Luego se realiza la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento de PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología de Gateway, un “clon de entrada”, pFLD. El plásmido pDONR201 se puede comprar en Invitrogen, como parte de la teenología Gateway®.

Un ácido nucleico que fusiona el ácido nucleico (SEC I D NO: 3) para el péptido de tránsito de FNR de arveja con la secuencia codificante (SEC I D NO: 2) de flavodoxina de Anabaena también se puede generar como se describe en los párrafos

[0075] y

[0076] en la página 8 de la patente europea EP 1 442 127; dichos párrafos se incorporan en la presente como referencia. La secuencia de ácidos nucleicos resultante se puede unir a los sitios attB para permitir la recombinación Gateway.

El clon de entrada que comprende la flavodoxina sintetizada que codifica el ácido nucleico de SEC I D NO: 1 , 13 o 15 (ligado al ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito como se muestra en SEC I D NO: 5, 14 y 17, respectivamente, luego se usó en una reacción LR con un vector de destino usado para la transformación. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites de T-ADN: un marcador seleccionable vegetal; un casete de expresión del marcador controlable; y un casete Gateway para la recombinación LR in vivo con la secuencia de ácidos nucleicos de interés ya clonada en el clon de entrada Un promotor GOS2 (SEC ID NO: 7) para la expresión específica se ubicó corriente arriba de este casete de Gateway. Dicho promotor se amplifica mediante PCR usando ADN genómico de Oryza sativ. De manera alternativa, se puede sintetizar.

Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante GOS2: :TP: :flavodoxina (Figura 2) que comprende la combinación (SEC ID NO: 19, 20 o 21 ) del promotor de SEC I D NO: 7 con el ácido nucleico del péptido de tránsito de SEC ID NO 3 y el ácido nucleico de flavodoxina (SEC I D NO: 1 , 13 o 15, respectivamente) se transformó en una cepa de Agrobacterium adecuada de acuerdo con los métodos conocidos en el estado de la téenica.

Como alternativa, el promotor GOS2 y el ácido nucleico que codifica el peptido de tránsito y la flavodoxina Anabaena (SEC ID NO; 5 - o el codón optimizado para plantas superiores, como se muestra en SEC ID NO: 14) o que codifica el péptido de tránsito y la flavodoxina Synechocystis ( SEC I D NO: 17) se sintetizan como una pieza y se insertan en un vector binario para la transformación mediada por Agrobacterium, o en dos o más piezas ligadas entre sí o agrupadas en un casete de expresión dentro de un vector, por ejemplo, un vector binario.

Construcción de expresión de caña de azúcar Para la expresión del ácido nucleico que codifica la proteína de fusión (del péptido de tránsito de Cyanophora paradoxa y flavodoxina de Anabaena) como se muestra en SEC I D NO: 1 1 bajo el control del promotor de GOS2, se sintetizaron la secuencia de promotor de GOS2 (SEC I D NO: 7), el ácido nucleico de SEC I D NO: 9 que codifica el péptido de tránsito (SEC I D NO: 10) y el ácido nucleico de SEC I D NO: 1 que codifica la flavodoxina de Anabaena de SEC ID NO: 2 ligados a la secuencia del terminador de zeína del maíz. El casete de expresión resultante se muestra en SEC I D NO: 12. Para mejorar la eficacia de selección de las plantas transformadas con respecto a las plantas no transformadas, se incluyeron en la construcción para el bombardeo de partículas un casete del marcador de selección que comprende un promotor de ubiquitina del maíz que controla la expresión del marcador de selección nptll y el terminador NOS. Las plantas de caña de azúcar se transformaron con el casete de expresión que se muestran en SEC I D NO: 12 mediante bombardeo de partículas. Dicho casete de expresión tambien se puede usar para la transformación mediada por Agrobacterium de caña de azúcar u otras plantas después de la inserción en un vector binario y la introducción en Agrobacteria.

La construcción que comprende los casetes de expresión para el casete del marcador seleccionable y la expresión del péptido de tránsito-flavodoxina se pueden aislar del vector según sea necesario y usar para el bombardeo de partículas de células de caña de azúcar como se describe a continuación.

Ejemplo 4: Transformación de plantas Transformación del arroz Se usó Agrobacterium que contenía el vector de expresión para transformar plantas de Oryza sativa. Se quitaron las cáscaras de las semillas secas maduras del cultivar de arroz japonés Nipponbare. La esterilización se realizó mediante la incubación durante 1 minuto en 70% de etanol, seguido de 30 a 60 minutos, preferentemente 30 minutos, en solución de hipoclorito de sodio (según el grado de contaminación); luego, se lavó de 3 a 6 veces, preferentemente 4 veces, con agua estéril destilada. Las semillas estériles luego se germinaron en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callos). Después de la incubación a la luz durante 6 días, los callos derivados de escutelo se transformaron con Agrobacterium, como se describe a continuación en la presente.

La cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene el vector de expresión se utilizó para el cocultivo. Se inoculó Agrobacterium en un medio AB con los antibióticos apropiados, y se cultivó durante 3 días a 28°C. Luego, se recogieron las bacterias y se suspendieron en un medio de cocultivo líquido a una densidad (OD60o) de alrededor de 1 . Los callos se sumergieron en la suspensión durante 1 a 15 minutos. Los tejidos de los callos se secan en un papel de filtro y se transfieren a un medio de cocultivo solidificado durante 3 días en la oscuridad a 25°C. Después de lavar el Agrobacterium, los callos se cultivan en un medio que contiene 2,4-D durante 10 a 14 dias (tiempo de crecimiento para índica: 3 semanas) a la luz a 28°C -32°C en presencia de un agente de selección. Durante este período, se desarrollaron islas de callos resistentes que crecieron rápidamente. Después de transferir este material a un medio de regeneración, se liberó el potencial embriogénico, y se desarrollaron brotes en las siguientes 4 a 6 semanas. Se retiraron los brotes de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contenía auxina, desde el cual se transfirieron al suelo. Los brotes endurecidos se cultivaron en condiciones de alta humedad y días cortos en un invernadero.

La transformación de índica del cultivar de arroz también se puede realizar de modo similar al descrito anteriormente, de acuerdo con las téenicas conocidas por los expertos.

Se generaron de 35 a 90 transformantes de arroz T0 independientes para una construcción. Los transformantes primarios se transfirieron de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero. Despues de un análisis de PCR cuantitativo para verificar el número de copias del inserto de T-ADN, solo se conservaron las plantas transgénicas de única copia que presentan tolerancia al agente de selección para cosechar la semilla T1 . Las semillas luego se cosecharon de tres a cinco meses después del trasplante. El método produjo transformantes de único locus en una proporción de más de 50% (Aldemita y Hodgesl 996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Como alternativa, las plantas de arroz se pueden generar de acuerdo con el siguiente método: El Agrobacterium que contiene el vector de expresión se utiliza para transformar plantas de Oryza sativa. Se retiran las cáscaras de las semillas secas maduras del cultivar de arroz japónica Nipponbare. La esterilización se realiza mediante la incubación durante un minuto en 70% de etanol, seguido de 30 minutos en 0,2% de HgCI2, seguido de 6 lavados de 15 minutos con agua estéril destilada. Las semillas estériles luego se germinan en un medio que contiene 2,4-D (medio de inducción de callos). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se escinden los callos embriogénicos derivados de escutelo y se propagan en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplican o se propagan por subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Las piezas de callos embriogénicos se subcultivan en medio nuevo 3 días antes del cocultivo (para estimular la actividad de división celular).

La cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene el vector de expresión se utiliza para el cocultivo. Se inocula Agrobacterium en un medio AB con los antibióticos apropiados y se cultiva durante 3 días a 28°C. Luego se recogen las bacterias y se suspenden en un medio de cocultivo liquido a una densidad (OD600) de alrededor de 1 . La suspensión luego se transfiere a una placa de Petri y los callos se sumergen en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos de los callos luego se secan en un papel de filtro y se transfieren a un medio de cocultivo solidificado, y se incuban durante 3 días en la oscuridad a 25°C. Los callos cocultivados se cultivan en un medio que contiene 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28°C en presencia de un agente de selección. Durante este período, se desarrollan islas de callos resistentes que crecen rápidamente. Después de transferir este material a un medio de regeneración e incubación a la luz, se libera el potencial embriogénico y se desarrollan brotes en las siguientes cuatro a cinco semanas. Se retiran los brotes de los callos y se incuban durante 2 a 3 semanas en un medio que contiene auxina desde el cual se transfieren al suelo. Los brotes endurecidos se cultivan en condiciones de alta humedad y días cortos en un invernadero.

Se generan aproximadamente de 35 a 90 transformantes de arroz T0 independientes para una construcción. Los transformantes primarios se transfieren de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero. Después de un análisis de PCR cuantitativo para verificar el número de copias del inserto de T-ADN, solo se conservan las plantas transgénicas de única copia que presentan tolerancia al agente de selección para cosechar la semilla T1 . Las semillas luego se cosechan de tres a cinco meses después del trasplante. El método produjo transformantes de único locus en una proporción de más de 50% (Aldemita y Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Transformación de maíz La transformación del maíz (Zea mays) se realiza con una modificación del método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación depende del genotipo en el maíz y sólo genotipos específicos pueden ser transformados y regenerados. La línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o los híbridos con A188 como progenitor son una buena fuente de material donante para la transformación, pero también se pueden utilizar exitosamente otros genotipos. Las espigas se cosechan de la planta de maíz aproximadamente 1 1 días después de la polinización (DAP) cuando el embrión inmaduro tiene una longitud de alrededor de 1 a 1 ,2 mm. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan por medio de organogénesis. Los embriones extraídos se cultivan en medio de inducción de callos, luego en medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, pero se pueden utilizar varios marcadores de selección). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25°C durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollan los brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizamiento de maíz y se incuban a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de trigo La transformación del trigo se realiza con el metodo descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. Habitualmente, se usa el cultivar Bobwhite (disponible de CIMMYT, México) para la transformación. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan por medio de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones se cultivan in vitro en medio de inducción de callos, luego en medio de regeneración, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, pero se pueden utilizar varios marcadores de selección). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25°C durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollan los brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizamiento y se incuban a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de soja La soja se transforma de acuerdo con una modificación del método descrito en la patente US 5.164.310 de Texas A&M. Diversas variedades de soja comercial son susceptibles de transformación con este método. Habitualmente, se usa el cultivar Jack (disponible de Illinois Seed foundation) para la transformación. Las semillas de soja se esterilizan para la siembra in vitro. Se extraen el hipocotilo, la radícula y un cotiledón de plántulas jóvenes de siete días. El epicotilo y el cotiledón restante se cultivan adicionalmente para que desarrollen nodulos axilares. Estos nodulos axilares se extraen y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión. Después del tratamiento de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren al medio de selección. Los brotes regenerados se extraen y se colocan en un medio de alargamiento de brotes. Los brotes cuya longitud no excede 1 cm se colocan en medio de enraizamiento hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de colza/canola Los pecíolos cotiledonarios y los hipocotilos de plántulas jóvenes de 5-6 días se utilizan como explantes para el cultivo de tejido y se transforman de acuerdo con Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). El cultivar comercial Westar (Agriculture Cañada) es la variedad estándar que se utiliza para la transformación, pero también se pueden utilizar otras variedades. Las semillas de cañóla se esterilizan en superficie para la siembra in vitro. Los explantes de pecíolos cotiledonarios con el cotiledón unido se extraen de las plántulas in vitro y se inoculan con Agrobacterium (que contiene el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante del pecíolo en la suspensión bacteriana. Los explantes luego se cultivan durante 2 días en medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, 3% de sacarosa, 0,7% de Phytagar a 23°C, 16 horas de luz. Después de dos días de cocultivo con Agrobacterium, los explantes de pecíolos se transfieren a medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días, y luego se cultivan en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración de los brotes. Cuando los brotes tienen 5 - 10 mm de longitud, se los corta y transfiere a medio de alargamiento de brotes (MSBAP-0,5, que contiene 0,5 mg/l de BAP). Los brotes de alrededor de 2 cm de longitud se transfieren al medio de enraizamiento (MS0) para la inducción de raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de alfalfa Se transforma un clon regenerador de alfalfa (Medicago sativa) con el método de (McKersie et al. , 1999 Plant Physiol 1 19: 839-847). La regeneración y transformación de alfalfa dependen del genotipo y, por lo tanto, se requiere una planta regeneradora. Se han descrito métodos para obtener plantas regeneradoras. Por ejemplo, estas se pueden seleccionar del cultivar Rangelander (Agriculture Cañada) o de cualquier otra variedad de alfalfa comercial como se describe en Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 1 1 1 -1 12). Alternativamente, se seleccionó la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) para usar en el cultivo de tejidos (Walker et al. , 1978 Am J Bot 65:654-659). Los explantes de pecíolos se cocultivan, durante la noche, con un cultivo de C58C1 pMP90 de Agrobacterium tumefaciens (McKersie et al. , 1999 Plant Physiol 1 19: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se cocultivan durante 3 días en la oscuridad en medio de inducción SH que contiene 288 mg/l de Pro, 53 mg/l de tioprolina, 4, 35 g/l de K2S04 y 100 mm de acetosiringinona. Los explantes se lavan en medio Murashige-Skoog de concentración media (Murashige y Skoog, 1962) y se colocan en placas en el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona, pero con un agente de selección adecuado y antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfieren a medio de desarrollo BOÍ2Y que no contiene reguladores del crecimiento, ni antibióticos y 50 g/l de sacarosa.

Posteriormente, los embriones somáticos se germinan en medio Murashige-Skoog de concentración media. Las plántulas con raíces se trasplantan a macetas y se cultivan en un invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de algodón El algodón se transforma con Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con el metodo descrito en US 5.159.135. Las semillas de algodón se esterilizan en superficie en 3% de solución de hipoclorito de sodio durante 20 minutos y se lavan en agua destilada con 500 mg/ml de cefotaxima. Luego se transfieren las semillas al medio SH con 50 pg/ml de benomilo para la germinación. Se extraen los hipocotilos de las plántulas que tienen de 4 a 6 días, se los corta en trozos de 0, 5 cm y se los coloca en 0, 8% de agar. Se usa una suspensión de Agrobacterium (aprox. 108 células por mi, diluidas de un cultivo de toda la noche transformado con el gen de interés y marcadores de selección adecuados) para la inoculación de los explantes de hipocotilos. Después de 3 días a temperatura ambiente y luz, los tejidos se transfieren a un medio sólido (1 ,6 g/l de Gelrite) con sales Murashige y Skoog con vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151 -158 (1968)), 0, 1 mg/l de 2,4-D, 0, 1 mg/l de 6-furfurilaminopurina y 750 pg/ml de MgCL2, y con 50 a 100 pg/ml de cefotaxima y 400-500 pg/ml de carbenicilina para eliminar las bacterias residuales. Se aíslan las líneas celulares individuales despues de dos a tres meses (con subcultivos cada cuatro a seis semanas) y se cultivan adicionalmente en un medio selectivo para la amplificación del tejido (30°C, fotoperíodo de 16 horas). Posteriormente, los tejidos transformados se cultivan adicionalmente en medio no selectivo durante 2 a 3 meses para que se generen embriones somáticos. Los embriones de aspecto saludable de al menos 4 mm de longitud se transfieren a tubos con medio SH en vermiculita fina, suplementado con 0, 1 mg/l de ácido indol acético, 6 furfurilaminopurina y ácido giberélico. Los embriones se cultivan a 30°C con un fotoperíodo de 16 horas, y los plantines en la etapa de 2 a 3 hojas se transfieren a macetas con vermiculita y nutrientes. Las plantas se vuelven más resistentes y posteriormente se las transfiere al invernadero para continuar el cultivo.

Transformación de la remolacha azucarera Las semillas de la remolacha azucarera (Beta vulgaris L. ) se esterilizan en 70% de etanol durante un minuto, y luego 20 minutos de agitación en 20% de lej ía de hipoclorito, por ejemplo, lejía regular Clorox® (disponible en el comercio de Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, EE. U U.). Las semillas se enjuagan con agua estéril, se secan al aire y, luego, se colocan en placas en un medio de germinación (medio basado en Murashige y Skoog (MS)) (Murashige, T. , y Skoog , 1962. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497) que incluye vitaminas B5 (Gamborg et al. ; Exp. Cell Res. , vol. 50, 151 -8.) suplementado con 10 g/l de sacarosa y 0,8% de agar). Básicamente, ei tejido de los hipocotilos se usa para la iniciación de cultivos de brotes de acuerdo con Husscy y Hepher (Hussey, G. , y Hepher, A., 1978. Annals of Botany, 42, 477-9) y se mantienen en un medio basado en MS suplementado con 30 g/l de sacarosa más 0,25 mg/l de becilamino purina y 0, 75% de agar, pH 5, 8 a 23-25°C, con un fotoperíodo de 16 horas. La cepa de Agrobacterium tumefaciens que tiene un plásmido binario que alberga un gen del marcador seleccionable, por ejemplo, nptl l , se usa en los experimentos de transformación. Un día antes de la transformación, se desarrolla un cultivo líquido de LB, que incluye antibióticos, en un agitador (28°C, 150 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica (O. D.) a 600 nm de ~1. Los cultivos bacterianos desarrollados durante la noche se centrifugan y resuspenden en un medio de inoculación (O. D. ~1 ) que incluye Acetosyringone, pH 5,5. El tejido a base de brotes se corta en rodajas (1 ,0 cm x 1 ,0 cm x 2, 0 mm aproximadamente). El tejido se sumerge durante 30 segundos en un medio líquido de inoculación bacteriana. El exceso de líquido se retira mediante secado con papel de filtro. El cocultivo ocurre durante 24-72 horas en un medio basado en MS, que incluye 30 g/l de sacarosa, seguido de un período no selectivo, que incluye el medio basado en MS, 30 g/l de sacarosa con 1 mg/l de BAP para inducir el desarrollo de brotes y cefotaxim para eliminar Agrobacterium. Luego de 3-10 días, los explantes se transfieren a un medio selectivo similar que alberga, por ejemplo, canamicina o G41 8 (50-100 mg/l dependiente de genotipo). Los tejidos se transfieren a un nuevo medio cada 2-3 semanas para mantener la presión de selección. La muy rápida iniciación de los brotes (luego de 3-4 días) indica la regeneración de meristemas existentes, en lugar de la organogénesis de meristemas transgénicos recién desarrollados. Los brotes pequeños se transfieren luego de varias rondas de subcultivo al medio de inducción de raíces que contiene 5 mg/l de NAA y canamicina o G418. Se realizan etapas adicionales para reducir el potencial de generar plantas transformadas que sean quiméricas (parcialmente transgénicas). Las muestras de tejido de los brotes regenerados se usan para el análisis de ADN . Otros métodos de transformación de la remolacha azucarera se conocen en el arte, por ejemplo, los de Linscy & Gallois (Linsey, K. , y Gallois, P. , 1990. Journal of Experimental Botany; vol. 41 , No. 226; 529-36) o los métodos publicados en la solicitud internacional publicada como W09623891 A.

Transformación de la caña de azúcar Los husos se aíslan de plantas de caña de azúcar de 6 meses cultivadas en el campo (Arencibia et al. , 1998. Transgenic Research, vol. 7, 213-22; Enriquez-Obregon et al., 1998. Planta, vol. 206, 20-27). El material se esteriliza por inmersión en 20% de lejía de hipoclorito, por ejemplo, lej ía regular Clorox® (disponible en el comercio de Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, E. U.A.) durante 20 minutos. Las secciones transversales de alrededor de 0,5 cm se colocan en el medio en la dirección de relleno. El material vegetal se cultiva durante 4 semanas en un medio basado en MS (Murashige, T , y Skoog, 1962. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497), que incluye vitaminas B5 (Gamborg, O. , et al. , 1968. Exp. Cell Res. , vol. 50, 151 -8) suplementado con 20 g/l de sacarosa, 500 mg/l de hidrolisado de caseína, 0,8% de agar y 5 mg/l de 2,4-D a 23°C en la oscuridad. Los cultivos se transfieren luego de 4 semanas a un nuevo medio identico. La cepa de Agrobactarium tumafacians que tiene un plásmido binario que alberga un gen del marcador seleccionable, por ejemplo, hpt, se usa en los experimentos de transformación. Un día antes de la transformación, se desarrolla un cultivo líquido de LB, que incluye antibióticos, en un agitador (28°C, 150 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica (O.D.) a 600 nm de ~0,6. Los cultivos bacterianos desarrollados durante la noche se centrifugan y resuspenden en un medio de inoculación basado en MS (O. D. ~0,4) que incluye acetosyringone, pH 5,5. Los trozos de callos embriogénicos de caña de azúcar (2-4 mm) se aíslan sobre la base de las características morfológicas como estructura compacta y color amarillo, y se secan durante 20 minutos en la campana de flujo, seguido de inmersión en un medio líquido de inoculación bacteriana durante 10-20 minutos. El exceso de líquido se retira mediante secado con papel de filtro. El co-cultivo ocurre durante 3-5 días en la oscuridad sobre papel de filtro, que se coloca en la parte superior del medio basado en MS, que incluye vitaminas B5, que contiene 1 mg/l de 2,4-D. Después del co-cultivo, los callos se lavan con agua estéril, seguido de un período de cultivo no selectivo en un medio similar que contiene 500 mg/l de cefotaxima para eliminar las células de Agrobacterium restantes. Luego de 3-10 días, los explantes se transfieren al medio selectivo basado en MS, que incluye vitaminas B5, que contiene 1 mg/l de 2,4-D, durante otras 3 semanas y que alberga 25 mg/l de higromicina (dependiente de genotipo). Todos los tratamientos se realizan a 23°C en condiciones de oscuridad. Los callos resistentes también se cultivan en un medio que carece de 2,4-D, que incluye 1 mg/l de BA y 25 mg/l de higromicina, en un fotoperíodo de 16 horas de luz; esto genera el desarrollo de estructuras de brotes. Los brotes se aíslan y cultivan en un medio selectivo de enraizamiento (basado en MS , que incluye 20 g/l de sacarosa, 20 mg/l de higromicina y 500 mg/l de cefotaxima). Las muestras de tejido de los brotes regenerados se usan para el análisis de ADN. Otros métodos de transformación de la caña de azúcar se conocen en el arte, por ejemplo, de la solicitud internacional publicada como WO2010/151634A y la patente europea concedida EP1831378.

Para la transformación mediante bombardeo de partículas, la inducción de los callos y la transformación de la caña de azúcar se pueden realizar con el método de Snyman et al. (Snyman et al., 1996, S. Afr. J. Bot 62, 151 -154). La construcción se puede cotransformar con el vector pEmuKN , que expresó el gen nptll (Beck et al. Gene 19, 1982, 327-336; N. ° de acceso a Gen-Bank V00618) bajo el control del promotor pEmu (Last et al. (1991 ) Theor. Appl. Genet. 81 , 581 -588). Las plantas se generan con el método de Snyman et al. 2001 (Acta Horticulturae 560, (2001 ), 105-108).

Ejemplo 5: Procedimiento de evaluación de la caña de azúcar Plantas de arroz 5.1 Preparación de la evaluación Se generaron de 35 a 90 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfirieron de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero para el cultivo y la cosecha de la semilla T1 . Se retuvieron nueve eventos, de los cuales la progenie de T1 segregó 3: 1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos, se seleccionaron aproximadamente seis plántulas T1 que contenían el transgén (heterocigotas y homocigotas) y aproximadamente seis plántulas T1 que no tenían el transgén (nulicigotas) mediante el control de la expresión del marcador visual. Las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotas se cultivaron lado a lado en posiciones al azar. Las condiciones del invernadero fueron de días cortos (12 horas de luz), 28°C a la luz y 22°C en la oscuridad, y humedad relativa de 70%. Las plantas cultivadas en condiciones sin estrés se regaron en intervalos regulares para asegurar que el agua y los nutrientes no fueran limitantes y para satisfacer las necesidades de las plantas a fin de que completaran su crecimiento y desarrollo, a menos que se hayan usado en un ensayo de estrés.

Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

También se evaluaron eventos T1 en la generación T2 de acuerdo con el mismo procedimiento de evaluación que para la generación T1 , por ejemplo, con menos eventos y/o con más individuos por evento.

Control de sequía Ensayo de sequía temprana Las plantas T1 o T2 se germinaron en condiciones normales y se transfirieron a tierra para maceta, como se hace habitualmente. Después de colocarlas en las macetas, las plantas se transfirieron a una sección "seca", donde dejaron de recibir irrigación. Se insertaron sondas de humedad del suelo en macetas elegidas al azar para controlar el contenido de agua en el suelo (SWC). Cuando el SWC era inferior a ciertos umbrales, las plantas se regaron nuevamente de forma automática y continua hasta alcanzar de nuevo un nivel normal. A continuación, las plantas se transfirieron nuevamente a condiciones normales. El ciclo de sequía se repitió dos veces durante la etapa vegetativa; el segundo ciclo empezó poco después de volver a regarlas, después de que se completó el primer ciclo de sequía. Se tomaron imágenes de las plantas antes y después de cada ciclo de sequía.

El resto del proceso de cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) fue igual que para las plantas no cultivadas en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registraron tal como se detalló para el crecimiento en condiciones normales.

Ensayo de sequía para la reproducción Se cultivaron plantas de semillas T2 en tierra para maceta en condiciones normales hasta que alcanzaron la etapa de esplgazón. Luego se las transfirió a una sección “seca” donde dejaron de recibir irrigación. Se insertan sondas de humedad del suelo en macetas elegidas al azar para verificar el contenido de agua en el suelo (SWC). Cuando el SWC fue inferior a ciertos umbrales, las plantas se regaron nuevamente de forma automática y continua hasta alcanzar de nuevo un nivel normal. A continuación, las plantas se transfirieron nuevamente a condiciones normales. El resto del proceso de cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) fue igual que para las plantas no cultivadas en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registraron tal como se detalló para el crecimiento en condiciones normales.

Control de la eficacia en el uso de nitrógeno Se cultivaron plantas T1 o T2 en tierra para maceta en condiciones normales excepto por la solución de nutrientes. Las macetas se regaron, desde que fueron trasplantadas hasta su maduración, con una solución de nutrientes específica con contenido reducido de nitrógeno N (N), usualmente de 7 a 8 veces menos. El resto del proceso de cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) fue igual que para las plantas no cultivadas en condiciones de estres abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registraron como se detalló para el crecimiento en condiciones normales.

Control de estrés salino Las plantas T1 o T2 se cultivan en un substrato hecho de fibras de coco y partículas de arcilla cocida (Argex) (proporción 3 a 1 ). Se usa una solución normal de nutrientes durante las primeras dos semanas después de trasplantar los plantines al invernadero. Después de las dos primeras semanas, se agregan 25 mM de sal (NaCI) a la solución de nutrientes hasta que se cosechan las plantas. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento en condiciones normales.

Caña de azúcar 5.2.1 Las plantas transgénicas de caña de azúcar generadas como se describió en el Ejemplo 4 y que expresan el gen de flavodoxina fusionado con un péptido de tránsito, se cultivan durante 10 a 15 meses, ya sea en el invernadero o en el campo. Se usan condiciones estándares para el crecimiento de las plantas. 5.2.2 Método de extracción de azúcar La extracción del azúcar se realiza usando métodos estándares, por ejemplo, como los que se describieron anteriormente. 5.2.3 Peso fresco y biomasa El peso fresco y la biomasa verde se miden usando un método estándar, por ejemplo, como los que se describieron anteriormente. 5.2.4 Determinación del azúcar (glucosa, fructosa y sacarosa) El contenido de glucosa, fructosa y sacarosa en el extracto obtenido de acuerdo con el método de extracción de azúcar descrito anteriormente se determina mediante uno de los métodos estándares, por ejemplo, como los que se describieron anteriormente. 5.3 Análisis estadístico de los datos experimentales de la planta de arroz: Prueba F Se utilizó ANOVA (análisis de variantes) de dos factores como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de la planta. Se realizó una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se realizó para controlar el efecto del gen en todos los eventos de transformación y para verificar el efecto total del gen, también conocido como efecto global del gen. El umbral de significancia para un efecto global y verdadero del gen se fijó en un nivel de probabilidad de 5% para la prueba F. Un valor significativo de la prueba F indica un efecto del gen, es decir, que no es sólo la mera presencia o posición del gen lo que causa las diferencias en el fenotipo. 5.4 Parámetros medidos en arroz Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048 x 1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes, como se describe en WO2010/031780. Se usaron estas mediciones para determinar parámetros diferentes.

Medición de parámetros relacionados con la biomasa Se determinó el área aérea de la planta (o biomasa del follaje) al contar la cantidad total de píxeles en las imágenes digitales de las partes aéreas de las plantas diferenciadas del fondo. Este valor se promedió para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración. Los experimentos muestran que el área aérea de la planta medida de este modo se correlaciona con la biomasa de las partes aéreas de la planta. El área aérea es el área medida en el punto de tiempo en el cual la planta ha alcanzado su máxima biomasa de follaje (área máx.).

El aumento en la biomasa de la raíz se expresa como un aumento en la biomasa total de la raíz (medida como la biomasa máxima de las raíces observada durante el ciclo de vida de una planta); o como un aumento en el índice de raíz/brote, medido como la relación entre la masa de la raíz y la masa del brote durante el período de crecimiento activo de la raíz y del brote. En otras palabras, se define el índice de raíz/brote como la relación de la rapidez del crecimiento de la raíz con la rapidez del crecimiento del brote en el período del crecimiento activo de la raíz y el brote. La biomasa de raíz se puede determinar con el método descrito en WO 2006/029987.

Se midió la altura de la planta. Una fuerte indicación de la altura de la planta es la medición de la ubicación del centro de gravedad, es decir, determinar la altura (en m) del centro de gravedad de la biomasa del follaje. Esto evita la influencia de una sola hoja erguida, sobre la base de la asíntota del ajuste de curvas o, si el ajuste es insatisfactorio, sobre la base del máximo absoluto.

Parámetros relacionados con el tiempo de desarrollo El vigor de surgimiento (“Vig. Surg.”) indica el crecimiento temprano de la planta. Es la biomasa aérea de la planta una semana después de la reubicación de las plántulas establecidas de sus bandejas de germinación a sus macetas finales. Es el área (en mm2) cubierta por biomasa de follaje en la formación de imágenes. Se determinó contando la cantidad total de píxeles de las partes aéreas de las plantas diferenciadas del fondo. Este valor se promedió para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración.

El "tiempo en florecer" de la planta se puede determinar con el método descrito en WO 2007/093444.

El parámetro “primera panícula” proporciona la cantidad total de panículas en el primer brote.

El parámetro “flores por panícula” se calcula estimando una cantidad promedio de florcillas por panícula en una planta. Se calcula mediante la cantidad total de semillas dividida entre el valor del parámetro de primera panícula.

El verdor antes de la floración indica el verdor de una planta antes de la floración. Es la proporción (expresada como %) de los píxeles verdes y verdes oscuros en la última formación de imágenes antes de la floración.

Medición de parámetros relacionados con las semillas Las panículas primarias maduras se cosecharon, contaron, embolsaron, rotularon con códigos de barras y luego se secaron durante tres días en un horno a 37°C. Luego las panículas se trillaron, y todas las semillas se recogieron y contaron. En general, las semillas se cubren con una cubierta externa seca, la cáscara. Las cáscaras llenas (también denominadas en la presente florecillas llenas) se separaron de las vacías con un dispositivo de soplado de aire. Las cáscaras vacías se descartaron, y la fracción restante se contó nuevamente. Las cáscaras llenas se pesaron en una balanza analítica.

La cantidad total de semillas se determinó al contar la cantidad de cáscaras llenas que permanecieron despues de la etapa de separación. El peso total de las semillas se midió pesando todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta.

Se determinó la cantidad total de semillas (o florecillas) por planta al contar la cantidad de cáscaras (llenas o no) cosechadas de una planta.

El peso de mil granos (TKW) se extrapola a partir de la cantidad de semillas contadas y su peso total.

El índice de cosecha (H l) en la presente invención se define como la relación entre el peso total de la semilla y el área aérea (mm2), multiplicado por un factor 106.

La cantidad de flores por panícula, como se define en la presente invención, es la relación entre la cantidad total de semillas y la cantidad de panículas primarias maduras.

La "tasa de llenado de semillas” o “tasa de llenado” era la proporción (expresada como %) de la cantidad de semillas llenas (es decir, florecillas que contienen semillas) sobre la cantidad total de semillas (es decir, la cantidad total de florecillas). En otras palabras, la tasa de llenado de semillas es el porcentaje de florecillas que se llenan con semillas.

Ejemplo 6: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas transqenlcas 6.1 Plantas de arroz Experimento 1: Tres genes de flavodoxina analizados bajo condiciones estándares y condiciones de sequía para la reproducción Mediante el uso del promotor GOS2 de SEC ID NO: 7 y el ácido nucleico de SEC I D NO: 3 que codifica el péptido de tránsito FNR de arveja, se expresaron tres secuencias de ácido nucleico de flavodoxina (SEC ID NO: 1 , 13 y 1 5) en las plantas de arroz transgénicas generadas como se describió anteriormente bajo condiciones estándares y de sequía (véase el ejemplo 5). Las tres secuencias de ácidos nucleicos eran • una secuencia de flavodoxina de tipo silvestre Nostoc sp. PCC 71 19 anabaena sp (SEC I D NO: 1 ), • flavodoxina de tipo silvestre Synechocystis sp. PCC 6803 (SEC ID NO: 15), y • una flavodoxina Nostoc anabaena optimizada para el uso del codón vegetal (SEC I D NO: 13).

Cuadro la: Resultados de tres flavodoxinas bajo condiciones estándares Cuadro Ib: Resultados de tres flavodoxinas bajo condiciones de sequía para la reproducción TWS peso total de semillas; TTF tiempo para florecer Experimento 2: Flavodoxina Nostoc anabaena bajo condiciones de sequía para la reproducción Se analizaron nuevamente las plantas de arroz que tienen la construcción que comprende el ácido nucleico de la flavodoxi na Nostoc anabaena (SEC I D NO: 1 ) ligado al promotor GOS2 de SEC ID NO: 7 y el ácido nucleico de SEC ID NO: 3 que codifica un péptido de tránsito bajo condiciones de sequía para la reproducción, y se midieron los parámetros adicionales.

Cuadro II: Resultados de Flavodoxína Nostoc anabaena bajo condiciones de sequía para la reproducción TWS Peso total de semillas; TTF Tiempo en florecer; área máx. Área máxima; Hl índice de cosecha; Vig . Surg . Vigor de surgimiento Experimento 3: Flavodoxína de Nostoc anabaena bajo condiciones estándares, de sequía temprana y de poco nitrógeno Se analizaron las plantas de arroz que tienen la construcción que comprende el ácido nucleico de la flavodoxína Nostoc anabaena (SEC I D NO: 1 ) ligado al promotor GOS2 de SEC ID NO: 7 y el ácido nucleico de SEC I D NO: 3 que codifica un péptido de tránsito en condiciones estándares, de sequía temprana y de poco nitrógeno. Se midieron los parámetros adicionales.

Cuadro III : Parámetros del rendimiento de semillas y rendimiento de biomasa en tres condiciones a) Condiciones estándares b) sequía temprana c) poco nitrógeno TWS Peso total de semillas; TTF Tiempo en florecer; área máx. Área máxima; Hl Indice de cosecha; Vig. Surg. Vigor de surgimiento En todos los experimentos, se usaron plantas de control que no tienen la construcción para la sobreexpresión de la flavodoxina. 6. 1.2 Resumen de resultados de varios experimentos Peso total de semillas: El Cuadro 4 resume el peso de semillas de las plantas de arroz que expresan la flavodoxina de tipo silvestre Nostoc anabaena bajo el control del promotor GOS2 en las diversas condiciones analizadas.

Cuadro IV: Resumen del peso de semillas de diversos experimentos El peso total de semillas y la tasa de llenado de las plantas de arroz aumentaron en todos los experimentos.

Bajo c ondiciones de estrés ambiental, como la sequía durante la etapa de reproducción o la limitación de nitrógeno y bajo condiciones sin estrés, la biomasa aérea de las plantas aumentó, como lo indicó el valor de área máx. de las plantas.

Resumen de otros parámetros medidos, pero no mostrados en los cuadros anteriores: La cantidad total de semillas y el valor de la primera panícula aumentaron bajo condiciones estándares y, en menor medida, bajo condiciones de sequía. Las flores por panícula, el índice de raíz/brote, el verdor antes de la floración, la biomasa de raíz y el peso de mil granos se vieron ampliamente inafectados en todas las condiciones. 6. 1.3 Síntesis Las construcciones de flavodoxina del péptido de tránsito GOS2 expresados en plantas de arroz transgénicas en diversas condiciones dieron como resultado un aumento de los parámetros del rendimiento de semillas y de la biomasa aérea. En todas las condiciones experimentales, el peso total de semillas de las plantas de arroz que expresan flavodoxina de tipo silvestre Nostoc anabaena bajo el control del promotor GOS2 ligadas a un péptido de tránsito como se describe en la presente aumentó en un 13, 5% en comparación con una de las plantas de control que no tienen esta construcción. El peso total de semillas y la tasa de llenado de las plantas de arroz transgenicas aumentaron en comparación con las plantas de control bajo todas las condiciones analizadas. El área máxima de biomasa aérea como una indicación de rendimiento de biomasa aumentó en la mayoría de las condiciones analizadas. os de ácidos nucleicos de flavodoxina descritos en las páginas 35-38 l l i i i | i i i i | | i i de péptidos de tránsito al cloroplasto descritos las páginas 39-45 . i , i i . l I ll i ll , l | l [ l l l , . .. l i l i l l i l i - I i i l , i i , l i i l i l l il i i ,

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Un método para mejorar uno o más rasgos relacionados con el rendimiento en una planta con respecto a una planta de control, el cual comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, en donde la expresión está bajo el control de una secuencia de promotor ligada operativamente al ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina, y en donde la secuencia de promotor comprende la secuencia de nucleótidos de un promotor de GOS2, preferentemente, un promotor de GOS2 del arroz; o sus fragmentos funcionales o derivados.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la secuencia de nucleótidos del promotor de GOS2 comprende, al menos, 70% de la secuencia representada por SEC I D NO: 7.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el péptido de tránsito dirige el polipéptido de flavodoxina a un plástido, preferentemente, a un cloroplasto.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el péptido de tránsito de c loroplasto se selecciona de los péptidos de tránsito enumerados en el Cuadro 3 u homólogos de éstos.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el polipéptido de flavodoxina es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo de secuencias de ácidos nucleicos enumeradas en el Cuadro 2 u homólogos de estas.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el polipéptido de flavodoxina es de Anabaena sp. , preferentemente, Anabaena PCC71 19, o de Synechocystis sp, preferentemente, Synechocystis sp PCC 6803.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende: (a) transformar de manera estable una célula vegetal con un casete de expresión que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina, en donde el ácido nucleico exógeno está en enlace funcional con una secuencia de promotor que comprende la secuencia de nucleótidos del promotor de GOS2 definida en las reivindicaciones 1 o 2, o un fragmento funcional de ésta, un ortólogo o parálogo de ésta; (b) regenerar la planta de la célula vegetal; y (c) expresar el ácido nucleico exógeno.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde uno o más de los rasgos mejorados relacionados con el rendimiento comprenden una biomasa mejorada con respecto a las plantas de control y, preferentemente, una biomasa aérea mejorada y/o rendimiento de semillas con respecto a las plantas de control.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde uno o más de los rasgos mejorados relacionados con el rendimiento es el mayor rendimiento de semillas de las plantas, en comparación con las plantas de control.

10. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde uno o más de los rasgos mejorados relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estrés.

1 1 . El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde uno o más de los rasgos mejorados relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de estrés abiótico, preferentemente, estrés por sequía, estrés salino y/o deficiencia de nitrógeno.

12. Una construcción de expresión que comprende: (i) un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito definido en cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4 y un polipéptido de flavodoxina; (ii) una secuencia de promotores capaz de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (i) como se define en las reivindicaciones 1 o 2; y, opcionalmente, (iii) una secuencia de terminación de la transcripción.

13. Vector de expresión recombinante que comprende la construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 12.

14. Uso de una construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 12 o un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 13, en un método para hacer una planta transgénica que tiene uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento con respecto a plantas de control, preferentemente, mayor biomasa, y con mayor preferencia, mayor biomasa aerea y/o rendimiento de semillas con respecto a las plantas de control.

1 5. Un método para la producción de una planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica que tiene uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, con respecto a plantas de control, preferentemente, mayor biomasa, el cual comprende: (a) introducir una construcción de vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 13 o una construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 12 en una planta, una parte de planta o una célula vegetal; (b) generar una planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica de la planta transformada, parte de planta transformada o célula vegetal transformada; y (c) expresar el ácido nucleico exógeno que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina.

16. El método de la reivindicación 15, que además comprende la etapa de cosechar el material de propagación de la planta transgénica y plantar el material de propagación, y cultivar el material de propagación hasta obtener plantas, en donde el material de propagación comprende el ácido nucleico exógeno que codifica el péptido de tránsito, el polipéptido de flavodoxina y la secuencia de promotor ligada operativamente al mismo.

17. Planta transgénica, parte de planta transgénica, o célula vegetal transgénica que se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , 15 o 16, en donde la planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica expresan un ácido nucleico exógeno que codifica un péptido de tránsito y un polipéptido de flavodoxina bajo el control de una secuencia de promotor c omo se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

18. Planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica transformada con una construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 12 o con un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 13, y que comprende la secuencia de promotor ligada operativamente al ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina, cada uno de ellos como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

19. Planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica de acuerdo con las reivindicaciones 17 o 18, en donde la planta transgénica, parte de planta transgénica o célula vegetal transgénica comprende la construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 12 y tiene uno o más rasgos mejorados relacionados con el rendimiento, preferentemente, una biomasa mejorada con respecto a las plantas de control, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o biomasa aérea.

20. Parte cosechable de una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde la parte cosechable comprende la construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 12 y es un órgano aereo, preferentemente, semillas y/o el tallo o partes de los mismos.

21 . Producto producido de una planta transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o de la parte cosechable de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el producto comprende la construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 12.

22. Un método para fabricar un producto, que comprende las etapas de cultivar las plantas transgénicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 y obtener el producto de dichas plantas o partes, preferentemente, las semillas y/o el tallo de la planta.

23. Un método para mejorar las plantas, el cual comprende: a) obtener una planta transgénica mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , 15 o 16; b) combinar en una célula vegetal el material genético de al menos una célula vegetal de la planta de a) con el material genético de al menos una célula que difiere en uno o más genes de las células vegetales de las plantas de a) o cruzar la planta transgénica de a) con una segunda planta; c) obtener las semillas de ai menos una planta generada de la célula vegetal de b) o la planta de la cruza de la etapa (b); d) plantar las semillas y cultivarlas hasta que se conviertan en plantas; y e) seleccionar de dichas plantas, plantas que expresan el ácido nucleico que codifica el peptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina; y, opcionalmente, f) producir un material de propagación de las plantas que expresan el ácido nucleico que codifica el péptido de tránsito y el polipéptido de flavodoxina.

24. La construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 12 o un ADN cromosómico recombinante que comprende un casete de expresión que comprende un promotor definido en la reivindicación 12 inciso ( i i ) , un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito unido a una flavodoxina definida en la reivindicación 12, inciso (i) y una secuencia de terminación de transcripción en enlace funcional, en donde la construcción o el ADN cromosómico recombinante está comprendido en una célula vegetal.

25. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , 15, 16, 22 o 23, o la planta transgénica, parte de planta transgénica, o célula vegetal transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o el uso de acuerdo con la reivindicación 14, la parte cosechable de acuerdo con la reivindicación 20, o el producto de acuerdo con la reivindicación 21 , o la construcción o ADN cromosómico recombinante de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la célula vegetal es de o la planta se selecciona del grupo que consiste en frijoles, soja, arvejas, trébol, kudzu, lucerna (alfalfa), lentejas, lupinos, algarrobas, maní, arroz, trigo, maíz, cebada, arabidopsis, lenteja, banana, colza oleaginosa, lo que incluye cañóla, algodón, papa, caña de azúcar, alfalfa, remolacha azucarera, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, trigo einkorn, teff, milo y avena.