CN102781957A - 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一般涉及分子生物学领域并涉及用于增强植物中多种经济学上重要的产量相关性状的方法。具体而言，本发明涉及通过调节植物中编码POI（目的蛋白质）多肽的核酸的表达增强植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码POI多肽的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了迄今为止未知的POI编码核酸，和包含可用于实施本发明方法的所述POI编码核酸的构建体。

Description

具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法

引入作为参考的是以下优先权申请：US 61/308315和EP 10154794.1。

本发明一般涉及分子生物学领域，并涉及通过调节植物中编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP，在下文中也称为POI)的核酸的表达来增强植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供用于本发明方法的构建体。

具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自农作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物结构（例如苗的数目）、种子产生，和叶衰老等。根发育、养分摄入、胁迫耐受性和早期萌发势（early vigor）也可以是决定产量的重要因素。优化上述因素因而可以促使增加作物产量。

在田地条件下，植物性能，例如生长、发育、生物量积累和种子产生取决于植物对许多环境条件、变化和胁迫的耐受性和适应性能力。

农业生物技术人员使用几个参数的测量结果，其表明转基因对农作物产量的潜在影响。对于饲料作物，像苜蓿、青贮饲料和干草，植物生物量与总产量相关。然而对于谷类作物，其他参数已经用于评估产量，如植物大小，如通过总植物干重和鲜重、地上和地上干重和鲜重、叶片面积、茎体积、植物高度、叶长、根长、分蘖数目和叶数目测定。早期发育阶段的植物大小通常与发育晚期的植物大小相关。具有较大叶片面积的较大植物通常比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，并因此将可能在相同的期间内获得更多的重量。植物大小和生长速率具有强的遗传组分，并因此对于不同基因型范围，一种环境条件下的植物大小有可能与另一种环境条件下的大小相关。这样，标准环境可用于近似田地中农作物遇到的不同的和动态的环境。显示一种非生物胁迫耐受性的植物经常显示对另一种环境胁迫的耐受性。在机制水平上未了解交叉耐受性的这种现象。然而，合理地预期因表达转基因而对低温，例如冰冷温度和/或冰冻温度显示增强的耐受性的植物也对干旱和/或盐和/或其他非生物胁迫显示耐受性。已经表征了参与植物中胁迫应答、水分利用和/或生物量的一些基因，但迄今为止，培育具有提高产量的转基因农作物上的成功受到限制。

结果，需要鉴定这样的基因，当过表达或下调时其赋予在最佳和/或次优生长条件下对多种胁迫的增加的耐受性和/或提高的产量。

目前已经发现，可通过调节植物中编码POI（目的蛋白质）多肽的核酸的表达在植物中增加产量并增强多种产量相关性状。

发明概述

令人惊奇的是，目前已经发现调节编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)的核酸的表达产生了这样的植物，其相对于对照植物具有提高的产量和产量相关性状，特别是如通过总重量和种子数测定的种子和/或根产量，和提高的产量相关性状，特别是种子饱满率、饱满种子数，苗和/或根生物量。

根据一个实施方案，提供了用于改善植物相对于对照植物的产量相关性状的方法，其包括调节植物中编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)的核酸的表达。

因此根据本发明，此处鉴定的基因可用于增强产量相关性状。可在田地试验中测定转基因植物及其合适的对照植物的增加的产量。或者，可在最佳的受控生长条件下的模式植物中测定转基因增加产量的能力。可通过测量以下表型的任何一种或任何组合来测定相比于对照植物增加的产量性状：植物干的可收获部分的产量、植物干的地上可收获部分的产量、植物地下干的可收获部分的产量、植物鲜重可收获部分的产量、植物地上鲜重可收获部分的产量、植物地下鲜重可收获部分的产量、植物果实（鲜的和干的）的产量、种子（鲜的和干的）的产量、谷粒干重等。可通过以下方面显示植物提高的固有产量能力：种子产量的提高（例如，增加的种子/谷粒大小、增加的穗数、每穗增加的种子数、种子饱满的提高、种子组成的改善等）；固有生长和发育的改善（例如植物高度、植物生长速率、荚果数、节间数、开花时间、荚果落粒、结瘤和固氮的效率、碳同化效率、幼苗活力/早期萌发势的改善、提高的萌发效率、植物结构的改善、细胞周期修饰等）。

也可改善产量相关性状，以增加植物对非生物环境胁迫的耐受性。非生物胁迫包括干旱、低温、盐度、渗透胁迫、遮蔽、高植物密度、机械胁迫和氧化胁迫。可监测以决定对非生物环境胁迫的增强的耐受性的额外表型包括，但不限于萎蔫；叶变褐；膨压；叶或针叶下垂和/或脱落；叶或针叶的过早衰老；叶或针叶中叶绿素损失和/或叶黄化。可在田地试验中的农作物中或在受控生长条件下的模式植物中监测上述任何产量相关表型，以阐明转基因植物对非生物环境胁迫具有增加的耐受性。

定义

多肽/蛋白质

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，并指通过肽键连接在一起的任何长度聚合形式的氨基酸。

多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中互换使用，并指任何长度聚合的未分支形式的核苷酸——核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者的组合。

同源物

蛋白质的“同源物”包括相对于讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并与其来源的未修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。

缺失指从蛋白质中去除一个或多个氨基酸。

插入指一个或多个氨基酸残基引入到蛋白质中预定位置上。插入可包含N末端和/或C末端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。一般地，氨基酸序列内的插入比N末端或C末端融合小约1到10个残基。N末端和/或C末端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂交系统的转录激活子的结合域或激活域、噬菌体外壳蛋白、（组氨酸）-6-标签、谷胱甘肽S转移酶标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、

表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。

替换指蛋白质的氨基酸用具有相似性质（如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性）的其他氨基酸替换。氨基酸替换通常是单个残基的替换，但根据置于多肽上的功能限制可以是成簇的，并且可以在1到10个氨基酸范围内；插入一般是大约1到10个氨基酸残基的插入。氨基酸替换优选保守氨基酸替换。保守替换表为本领域所熟知（参阅例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman和Company(编辑)以及下文的表1）。

表1：保守氨基酸替换的实例

残基	保守替换	残基	保守替换
				Ala	Ser	Leu	Ile;Val
Arg	Lys	Lys	Arg;Gln
				Asn	Gln;His	Met	Leu;Ile
Asp	Glu	Phe	Met;Leu;Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr;Gly
Cys	Ser	Thr	Ser;Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp;Phe
				His	Asn;Gln	Val	Ile;Leu
Ile	Leu,Val

可使用本领域所熟知的肽合成技术，如固相肽合成等，或通过重组DNA操作容易地进行氨基酸替换、缺失和/或插入。用于操作DNA序列以产生蛋白质替换、插入或缺失变体的方法为本领域所熟知。例如，用于在DNA预定位点产生替换突变的技术为本领域技术人员所熟知，并包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB,Cleveland,OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene,San Diego,CA)、PCR介导的定点诱变或其他定点诱变方案。

衍生物

“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，其相比于天然发生形式蛋白质（如目的蛋白质）的氨基酸序列，包含氨基酸用非天然发生氨基酸残基的替换，或非天然发生氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，其相比于天然发生形式多肽的氨基酸序列包含天然发生的改变的（糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、豆蔻酰化、硫酸化等）或非天然改变的氨基酸残基。衍生物相比于其来源氨基酸序列还可包含一个或多个氨基酸替换或添加，例如共价或非共价结合的氨基酸序列的报告分子或其他配体（如结合以利于其检测的报告分子），和相对于天然发生蛋白质的氨基酸序列的非天然发生氨基酸残基。此外，“衍生物”还包括天然发生形式蛋白质与标签肽，如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合(对于标签肽的综述，参阅Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)。

直向同源物/旁系同源物

直向同源物和旁系同源物包括用于描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是通过祖先基因复制来源的同一物种内的基因；直向同源物是来自通过物种形成的不同生物的基因，并也来自共同的祖先基因。

结构域，基序/共有序列/标记

术语“结构域”指沿进化相关蛋白质序列比对的特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其他位置上的氨基酸在同源物之间不同，特定位置上高度保守的氨基酸表示很可能在蛋白质结构、稳定性或功能上至关重要的氨基酸。通过其在蛋白质同源物家族比对序列中的高度保守鉴定，它们可用作确定讨论的任何多肽是否属于前面鉴定的多肽家族的标志。

术语“基序”或“共有序列”或“标记”指进化上相关蛋白质序列中短的保守区域。基序通常是结构域的高度保守部分，但也可包括结构域的仅部分，或可定位在保守结构域之外（如果基序的所有氨基酸位于定义的结构域之外）。

存在鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,5857-5864;Letunic等(2002)Nucleic Acids Res30,242-244),InterPro(Mulder等,(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation.ISMB-94;Proceedings 2nd International Conference onIntelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.,编辑,第53-61页,AAAI Press,Menlo Park;Hulo等,Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))，或Pfam(Bateman等,NucleicAcids Research 30(1):276-280(2002))。在ExPASy蛋白质组服务器上可获得用于计算机分析蛋白质序列的一组工具(Swiss Institute ofBioinformatics(Gasteiger等,ExPASy:the proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis,Nucleic Acids Res.31:3784-3788(2003))。还可使用常规技术，如通过序列比对鉴定结构域或基序。

用于序列比对比较的方法为本领域所知，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J Mol Biol 48:443-453)来发现两条序列的总体（即横跨完整序列）比对，其使配对数量最大化并使空位数量最小化。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215:403-10)计算百分比序列同一性，并对两条序列之间的相似性进行统计学分析。可通过National Centre forBiotechnology Information(NCBI)公开获得用于进行BLAST分析的软件。例如使用ClustalW多序列比对算法(版本1.83)，利用默认配对比对参数和百分比的计分方法容易地鉴定同源物。也可使用在MatGAT软件包中可得到的一种方法测定相似性和同一性的总体百分比(Campanella等,BMCBioinformatics.2003 Jul 10;4:29.MatGAT:an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences.)。如对本领域技术人员显而易见的是，可进行较少的人工编辑，以优化保守基序之间的比对。此外，除了使用全长序列鉴定同源物，还可使用特定结构域。可在完整核酸或氨基酸序列或在所选结构域或保守基序上，使用上文提及的程序使用默认参数测定序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法特别有用(Smith TF,Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1);195-7)。

交互BLAST

通常，这包括第一次BLAST，涉及针对任何序列数据库，如公共可得的NCBI数据库进行BLASTing查询序列（例如使用实例部分表A中列出的任何序列）。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX（使用标准默认值），当从蛋白质序列开始时一般使用BLASTP或TBLASTN（使用标准默认值）。可任选地过滤BLAST结果。任一过滤结果或非过滤结果的全长序列然后可针对来自查询序列来源的生物体序列反向BLAST（第二次BLAST）。然后比较第一次和第二次BLAST的结果。如果来自第一次blast的高阶命中与查询序列来自同一物种，则鉴定了旁系同源物，反向BLAST然后理想地导致查询序列位于最高命中中；如果来自第一次blast的高阶命中不与查询序列来自同一物种，则鉴定了直向同源物，并优选在反向BLAST后导致查询序列位于最高命中中。

高阶命中是具有低E值的那些数据。E值越低，得分越显著（或者换言之，偶然发现命中的机会就越低）。E值的计算为本领域所知。除了E值，也通过百分比同一性对比较计分。百分比同一性指两条比较的核酸（或多肽）序列在特定长度上相同核苷酸（或氨基酸）的数量。在大家族的情况下，可使用ClustalW，然后构建邻接树，以帮助显示相关基因的聚类并鉴定直向同源物和旁系同源物。

杂交

如本文定义的术语“杂交”是其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可完全在溶液中发生，即两条互补核酸在溶液中。杂交过程也可与固定在基质，如磁珠、Sepharose珠或任何其他树脂上的互补核酸进行。杂交过程还可与固定在固相支持体，如硝基纤维素或尼龙膜上的或通过例如光刻固定到含硅玻璃支持物（后者称为核酸阵列或微阵列或核酸芯片）的一条互补核酸进行。为了允许杂交进行，核酸分子一般通过热或化学变性以熔解双链成为两条单链和/或从单链核酸中去除发夹结构或其他二级结构。

术语“严格性”指发生杂交的条件。杂交的严格性受如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组分等条件的影响。一般地，在确定的离子强度和pH下对特定序列选择低于解链温度(T_m)约30°C的低严格条件。中严格条件是温度低于T_m 20°C，高严格条件是温度低于T_m的10°C。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高度序列相似性的杂交序列。然而，核酸可在序列上有偏差，但由于遗传密码的简并性仍然编码基本相同的多肽。因此，有时候需要中等严格杂交条件来鉴定此类核酸分子。

T_m是确定的离子强度和pH下的温度，在所述温度下50%的靶序列与完全匹配的探针杂交。T_m依赖于溶液条件和碱基组成以及探针长度。例如，更长的序列在更高温度下特异性杂交。从低于T_m约16°C高至32°C获得杂交的最大速率。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥，由此促进杂合体形成；该效应在高达0.4M的钠浓度下可见（对于更高的浓度，该效应可忽略）。每百分之一的甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的熔解温度0.6到0.7°C，并且加入50%甲酰胺允许杂交在30到45°C下进行，尽管杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率和双链体的热稳定性。平均起来对大的探针而言，Tm每%碱基错配降低约1°。可使用以下方程式根据杂合体类型计算Tm：

1)DNA-DNA杂合体(Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.,138:267-284,1984):

T_m＝81.5°C+16.6xlog₁₀[Na⁺]^a+0.41x%[G/C^b]–500x[L^c]^-1–0.61x%甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂合体:

Tm=79.8+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(%G/C^b)+11.8(%G/C^b)²-820/L^c

3)寡DNA或寡RNA^d杂合体:

对于<20个核苷酸:T_m=2(I_n)

对于20–35个核苷酸:T_m=22+1.46(I_n)

^a或对于其他一价阳离子，但仅在0.01–0.4M范围内准确。

^b仅在30%到75%范围内对%GC准确。

^cL＝碱基对中双链体的长度。

^d寡聚物，寡核苷酸;I_n=引物的有效长度=2×(G/C的数量)+(A/T的数量)。

可使用许多已知技术中的任何一种，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，向杂交缓冲液中加入异源RNA、DNA和SDS，并用RNA酶进行处理来控制非特异性结合。对于非同源探针，可通过改变以下中的一种(i)渐进性降低退火温度（例如从68°C到42°C）或(ii)渐进性降低甲酰胺浓度（例如从50%到0%）进行一系列杂交。技术人员知道可在杂交过程中改变并且维持或改变严格条件的多种参数。

除了杂交条件，杂交的特异性通常也依赖于杂交后洗涤的功能。为了去除因非特异性杂交引起的背景，用稀盐溶液洗涤样品。该洗涤的临界因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，洗涤严格性就越高。洗涤情况通常在杂交严格性下或低于杂交严格性下进行。阳性杂交产生至少两倍背景的信号。一般地，如上文描述了用于核酸杂交测定或基因扩增检测方法的合适的严格条件。也可选择更高或更低的严格条件。技术人员知道可在洗涤过程中改变和维持或改变严格条件的多种参数。

例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50%甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格性杂交条件的实例包括在50℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50%甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0%SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5%焦磷酸钠。

为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等（2001）Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.（1989和每年更新版本）。

剪接变体

如本文中所用的术语”剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物学活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段来实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的（参阅例如Foissac和Schiex（2005），BMC Bioinformatics.；6：25）。

等位变体

等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性（SNP）和小插入/缺失多态性（INDEL）。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多态性株系中序列变体的最大集合。

内源基因

本文中参考的“内源”基因不仅仅指如在植物中以其天然形式（即没有任何人类干预）存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后（再）引入植物（转基因）的相同基因（或基本上同源的核酸/基因）。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。分离的基因可以分离自生物或者可以是人造的，例如，通过化学合成。

基因改组/定向进化

基因改组或定向进化由DNA改组后跟适当的筛选和/或选择的重复组成，以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等,(2004)Science 304(5674):1151-4;美国专利5,811,238和6,395,547)。

构建体

额外的调节序列可包括转录以及翻译增强子。本领域技术人员将知道适合用于进行本发明的终止子和增强子序列。也可向5'非翻译区(UTR)或在编码区添加内含子序列，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信息的量，如定义部分中所述。其他控制序列（除了启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3'UTR和/或5'UTR区域）可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。本领域技术人员将知道这些序列或可容易地获得这些序列。

本发明的遗传构建体可进一步包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是当在细菌细胞中需要维持遗传构建体作为游离型遗传元件（例如质粒或粘粒分子）时。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。

为了检测如本发明方法中使用的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，有利地使用标记基因（或报告基因）。因此，遗传构建体可任选地包含选择标记基因。在本文“定义”部分中更详细地描述了选择标记。一旦不再需要它们，可从转基因细胞中去除或切除标记基因。用于标记去除的技术为本领域所知，在上文定义部分中描述了有用的技术。

调节元件/控制序列/启动子

术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”在本文中均互换使用，并在宽泛上下文中指能够实现其连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”通常指定位在基因转录起始上游的核酸控制序列，并且其参与识别并结合RNA聚合酶和其他蛋白质，由此指导有效连接的核酸的转录。上述术语包括来自典型真核基因组基因的转录调节序列（包括准确的转录起始所需的TATA盒，有或没有CCAAT盒序列）和额外的调节元件（即，上游激活序列、增强子和沉默基因），其响应发育和/或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达。该术语中还包括典型的原核基因的转录调节序列，在该情况下其可包括–35盒序列和/或–10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中的核酸分子表达。

“植物启动子”包含调节元件，其介导植物细胞中编码序列区段的表达。因此，植物启动子不需要是植物来源，而是可来源于病毒或微生物，例如来自攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”也可来源于植物细胞，例如来自转化有待在本文所述本发明方法中表达的核酸序列的植物。这还应用于其他“植物”调节信号，如“植物”终止子。通过一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失修饰用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游，而不干扰任一启动子、可读框(ORF)或3'-调节区（如终止子）或远离ORF的其他3'调节区的功能或活性。还可能的是通过修饰其序列可增强启动子的活性，或者用更具活性的启动子，甚至来自异源生物的启动子完全替换它们。对于在植物中的表达，如上述，核酸分子必须有效连接或包含合适的启动子，其在正确时间点上并以需要的空间表达模式及时表达基因。

为了鉴定功能等同的启动子，例如通过将启动子有效连接到报告基因上并在植物的多个组织中测定报告基因的表达水平和模式来分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式。合适的众所周知的报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测定β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性来测定启动子的活性。然后可将启动子强度和/或表达模式与参考启动子（如在本发明方法中使用的启动子）的强度和/或表达模式进行比较。或者，可使用本领域已知的方法，例如Northern印记与放射自显影图的密度分析、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等,1996 Genome Methods6:986-994)，通过定量mRNA水平或通过比较用于本发明方法中的核酸的mRNA水平与管家基因如18S rRNA的mRNA水平测定启动子的强度。一般地，“弱启动子”表示驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”表示每个细胞约1/10,000转录物到约1/100,000转录物，到约1/500,0000转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列以高水平表达，或以每个细胞约1/10转录物到约1/100转录物到约1/1000转录物的水平表达。一般地，“中等强度启动子”表示驱动编码序列以比强启动子低的水平，特别在所有情况下以低于在35S CaMV启动子控制下获得的水平表达的启动子。

有效连接

如本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能连接，以便启动子序列能够起始目的基因的转录。

组成型启动子

“组成型启动子”指在大多数，但不必是全部生长和发育阶段中并在大多数环境条件下，在至少一个细胞、组织或器官中有转录活性的启动子。下文中的表2a给出了组成型启动子的实例。

表2a：组成型启动子的实例

遍在启动子

遍在启动子在生物体的基本上所有组织或细胞中均有活性。

发育调节的启动子

发育调节的启动子在特定发育阶段或在经历发育变化的植物部分中有活性。

诱导型启动子

诱导型启动子响应化学刺激(对于综述参阅Gatz 1997,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,48:89-108)、环境刺激或物理刺激诱导或增强转录起始，或可以是“胁迫诱导型的”，即当植物暴露于多种胁迫条件下时被激活，或是“病原体诱导型的”，即当植物暴露于多种病原体时激活。

器官特异性/组织特异性启动子

器官特异性或组织特异性启动子是在特定器官或组织，如叶、根、种子组织等中能够优先起始转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是主要在植物根中有转录活性的启动子，基本上排除植物任何其他部分，但仍然允许在这些其他植物部分中有任何渗漏表达。能够在特定细胞中起始转录的启动子在本文中称为“细胞特异性的”。

下文表2b中列出了根特异性启动子的实例：

表2b：根特异性启动子的实例

种子特异性启动子是主要在种子组织中有转录活性的启动子，但不必限于种子组织（在渗漏表达的情况下）。种子特异性启动子在种子发育和/或萌发过程中有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚胎特异性的。种子特异性（胚乳/糊粉/胚特异性的）启动子的实例示于下文的表2c到表2f中。在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2,113-125,2004)中给出了种子特异性启动子的其他实例，所述公开内容如同完全阐明一样在此处以其整体引入作为参考。

表2c：种子特异性启动子的实例

表2d：胚乳特异性启动子的实例

表2e：胚特异性启动子的实例：

基因来源	参考文献
		稻OSH1	Sato等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:8117-8122,1996
KNOX	Postma-Haarsma等,Plant Mol.Biol.39:257-71,1999
		PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
		PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

表2f：糊粉特异性启动子的实例：

此处定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中（基本上排除了植物的任何其他部分）有转录活性的启动子，同时仍然允许这些其他植物部分中的任何泄漏表达。

在下文表2g中显示了可用于进行本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例。

表2g：绿色组织特异性启动子的实例

基因	表达	参考文献
			玉米正磷酸盐二激酶	叶特异性的	Fukavama等,2001
玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶	叶特异性的	Kausch等,2001
			稻磷酸烯醇丙酮酸羧化酶	叶特异性的	Liu等,2003
稻小亚基Rubisco	叶特异性的	Nomura等,2000
			稻β扩展蛋白EXBP9	苗特异性的	WO 2004/070039
木豆小亚基Rubisco	叶特异性的	Panguluri等,2005
			豌豆RBCS3A	叶特异性的

组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织（基本排除植物的任何其他部分）中有转录活性，同时仍然允许这些其他植物部分中的任何泄漏表达。在下文表2h中显示了可用于进行本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例。

表2h：分生组织特异性启动子的实例

终止子

术语“终止子”包括控制序列，其为转录单位末端的DNA序列，并且用作初级转录物的3’加工和多腺苷酸化和转录终止的信号。终止子可来自天然基因，来自多种其他植物基因，或来自T-DNA。待加入的终止子可来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或来自另一植物基因，或较不优选地来自任何其他真核基因。

选择标记（基因）/报告基因

“选择标记”、“选择标记基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任何基因，在所述细胞中其表达以利于鉴定和/或选择转染或转化有本发明核酸构建体的细胞。这些标记基因使得能够鉴定核酸分子通过一系列不同原理的成功转移。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可见选择。选择标记基因的实例包括赋予对抗生素（如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、大观霉素或杀稻瘟菌素抗性的基因）、除草剂（例如提供对

抗性的bar；提供针对草甘膦抗性的aroA或gox，或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺酰脲类抗性的基因），或提供代谢性状的基因（如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或用于利用木糖的木糖异构酶或抗营养物标记，如对2-脱氧葡萄糖的抗性）抗性的基因。可见标记基因的表达导致颜色（例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶以及其有色的底物，例如X-Gal）、发光（如萤光素/萤光素酶系统）或萦光（绿色萦光蛋白、GFP及其衍生物）的形成。该列表仅代表了少量可能的标记。技术人员熟悉这些标记。根据生物体和选择方法优选不同的标记。

已知稳定或瞬时整合核酸到植物细胞中后，仅少数细胞吸收外源DNA，并且需要时，根据所用的表达载体和所用的转染技术将其整合到细胞基因组中。为了鉴定并选择这些整合体，编码选择标记（如上文描述的标记）的基因一般与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记例如可用于突变体中，所述突变体中例如通过常规方法缺失这些基因而使得其没有功能。此外，编码选择标记的核酸分子可引入宿主细胞中位于包含编码本发明多肽的序列的同一载体上，或用于本发明的方法中，或在分开的载体中。例如通过选择可鉴定已经稳定转染了引入的核酸的细胞（例如，已经整合了选择标记的细胞存活，而其他细胞死亡）。

一旦核酸已经成功引入，转基因宿主细胞中不再需要或不想要标记基因，特别是对抗生素和除草剂具有抗性的基因，用于引入核酸的本发明方法有利地使用使得能够去除或切除这些标记基因的技术。一种该方法是称为共转化的方法。共转化方法同时使用两种载体用于转化，一种载体携带本发明的核酸，第二种载体携带标记基因。大部分转化体接受，或在植物情况下包含（高达40%或更多的转化体）两种载体。在用农杆菌（Agrobacteria）转化的情况下，转化体一般仅接受部分载体，即在T-DNA侧翼的序列，其一般代表表达盒。然后可通过进行杂交从转化的植物中去除标记基因。在另一方法中，整合到转座子中的标记基因用于与想要的核酸一起转化（称为Ac/Ds技术）。转化体可与转座酶源杂交，或转化体可瞬时或稳定转化赋予转座酶表达的核酸构建体。在一些情况下（约10%），一旦转化成功发生，转座子就跳出宿主细胞的基因组，并丢失。在其他情况下，转座子跳到不同位置上。在这些情况下，必须通过进行杂交去除标记基因。在微生物学中，发展了可能或利于检测此类事件的技术。其他有利的方法依赖于称为重组系统的系统；其优势在于可免除通过杂交去除。这种类型的最佳的已知系统是称为Cre/lox的系统。Cre1是去除定位在loxP序列之间的序列的重组酶。如果标记基因整合到loxP序列之间，一旦转化成功发生了，其通过表达重组酶被去除。其他的重组系统是HIN/HIX,FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等,J.Biol.Chem.,275,2000:22255-22267;Velmurugan等,J.Cell Biol.,149,2000:553-566)。本发明核酸序列位点特异性整合到植物基因组中是可能的。天然地，这些方法也可应用于微生物，如酵母、真菌或细菌。

转基因的/转基因/重组的

为了本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”表示例如核酸序列、表达盒、基因构建体或包含核酸序列的载体，或转化有本发明核酸序列、表达盒或载体的生物体，所有那些构建由重组方法产生，在所述方法中

(a)编码用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或

(b)有效连接本发明核酸序列的遗传对照序列，例如启动子，或

(c)a)和b)

不位于其天然遗传环境中，或已经通过重组方法修饰，修饰可以采取例如替换、添加、缺失、倒置或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为表示原始植物中的天然基因组或染色体位点或存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，优选至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。环境位于核酸序列至少一侧并具有至少50bp，优选至少500bp，尤其优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。当该表达盒通过非天然的合成（“人造”）方法，例如诱变处理进行修饰时，天然发生的表达盒－例如核酸序列的天然启动子与如上述编码用于本发明方法的多肽的相应核酸序列的天然的组合－变成了转基因表达盒。合适的方法描述于例如US 5,565,350或WO 00/15815中。

用于本发明目的的转基因植物因此理解为如上用于本发明方法的核酸不在所述植物基因组中其天然基因座上，核酸可能同源表达或异源表达。然而，如上提及，转基因还表示尽管本发明的核酸或用于本发明方法中的核酸位于植物基因组中其天然位置，序列关于天然序列已经被修饰了，和/或天然序列的调节序列已经被修饰了。转基因优选理解为指本发明的核酸在基因组中非天然基因座上的表达，即发生核酸的同源，或优选异源表达。在本文中提及了优选的转基因植物。

在本发明的一个实施方案中，“分离的”核酸序列位于非天然染色体周围。

调节

术语“调节”表示与表达或基因表达相关的过程，其中所述基因表达改变了相比于对照植物的表达水平，表达水平可以升高或降低。原始未调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何种类的表达，随后进行翻译。术语“调节活性”或术语“调节表达”表示本发明核酸序列或编码蛋白质表达的任何改变，其导致植物产量增加和/或生长增加。

表达

术语“表达”或“基因表达”表示一个特定基因或多个特定基因或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其表示一个基因或多个基因或遗传构建体转录成为结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，随后翻译成蛋白质或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。

升高的表达/过表达

如本文所用的术语“升高的表达”或“过表达”表示原始野生型表达水平以外的任何形式的表达。

用于提高基因或基因产物表达的方法在本领域中得到了很好的记载，并包括例如由适当启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。用作启动子或增强子元件的分离核酸可引入非异源形式的多核苷酸的适当位置（通常是上游）中，以上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源启动子在体内通过突变、缺失和/或替换而改变（参阅US 5,565,350;Zarling等,WO9322443），或分离的启动子可以适当方向并远离本发明基因引入植物细胞中，以控制基因的表达。

如果希望多肽表达，一般希望在多核苷酸编码区3'-末端包括多腺苷酸化区域。多腺苷酸化区域可来自天然基因，来自多种其他植物基因，或来自T-DNA。待加入的3'末端序列可来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或来自另一植物基因，或较不优选地来自任何其他真核基因。

还可以向5'非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信息的量。已经显示在植物和动物表达构建体的转录单位中包括可剪接内含子在mRNA和蛋白质水平上增加基因表达高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405;Callis等(1987)Genes Dev 1:1183-1200)。当置于转录单位5'末端附近时，基因表达的这种内含子增强通常最高。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，以及Bronze-1内含子的使用为本领域所知。对于一般信息参阅：The Maize Handbook,第116章,Freeling和Walbot,编辑,Springer,N.Y.(1994)。

降低的表达

本文认为“降低的表达”或表达的“降低或基本消除”表示相对于对照植物，内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性的降低。降低或基本消除优选相比于对照植物以递增优选顺序为至少10%、20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%、96%、97%、98%、99%或更高。

对于植物中内源基因表达的降低或基本消除，需要足够长的核酸序列的基本上邻近的核苷酸。为了进行基因沉默，这应该少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或更少的核苷酸，或者这可以多到完整基因（包括部分或全部的5’和/或3’UTR）。基本上邻近的核苷酸序列可来自编码目的蛋白质的核酸（靶基因），或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上邻近的核苷酸序列能够与靶基因（有义链或反义链）形成氢键，更优选地，基本上邻近的核苷酸序列与靶基因（有义链或反义链）具有以递增优选顺序50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。编码（功能）多肽的核酸序列不是本文讨论用于降低或基本消除内源基因表达的多种方法所需的。

表达的这种降低或基本消除可使用常规工具和技术实现。用于降低或基本消除内源基因表达的优选方法是通过在植物中引入并表达遗传构建体，其中将核酸（在该情况下是来自目的基因，或来自能够编码任何一个目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的基本邻近的核苷酸序列）作为反向重复（部分或完全）克隆到所述遗传构建体中，通过间隔区（非编码DNA）分开。

在该优选方法中，通过RNA介导的沉默使用核酸或其部分（在该情况下是来自目的基因，或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任一核酸的基本邻近的核苷酸序列），优选能够形成发夹结构的反向重复降低或基本消除内源基因的表达。将反向重复克隆到包含对照序列的表达载体中。非编码DNA核酸序列（间隔区，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多聚接头等）定位在形成反向重复的两条反向核酸之间。反向重复转录后，形成（部分或完全）具有自我互补结构的嵌合RNA。该双链RNA结构称为发夹RNA(hpRNA)。hpRNA被植物加工成可掺入到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中的siRNAs。RISC进一步切割mRNA转录物，由此基本降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。对于更多一般细节参阅例如，Grierson等(1998)WO 98/53083;Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。

本发明方法的执行不依赖于在植物中引入和表达遗传构建体，其中核酸作为反向重复序列克隆到该构建体中，但任何一种或多种众所周知的“基因沉默”方法可用于达到相同效果。

用于降低内源基因表达的一个此类方法是RNA介导的基因表达沉默（下调）。在该情况下，植物中的沉默通过与靶内源基因基本相似的双链RNA序列(dsRNA)触发。该dsRNA进一步通过植物加工成约20到约26个核苷酸，称为短干扰RNAs(siRNAs)。siRNAs掺入到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中，其切割内源靶基因的mRNA转录物，由此基本降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。

RNA沉默方法的另一实例涉及核酸序列或其部分（在该情况下是来自目的基因，或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何一个核酸的基本邻近的核苷酸序列）以有义方向引入植物中。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因此至少一个拷贝的核酸序列将引物植物中。额外的核酸序列将降低内源基因的表达，产生称为共抑制的现象。如果几个额外拷贝的核酸序列引入植物中，那么基因表达的降低将更明显，因为在高转录物水平与共抑制触发之间存在正相关性。

RNA沉默方法的另一实例涉及使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选与待沉默的内源基因互补。互补性可定位于基因的“编码区”和/或“非编码区”。术语“编码区”指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域。术语“非编码区”指在转录但不翻译成氨基酸的编码区侧翼的5'和3'序列（也称作5'和3'非翻译区）。

可根据Watson和Crick碱基配对原则设计反义核酸序列。反义核酸序列可与完整的核酸序列（在该情况下是来自目的基因，或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任一核酸的基本邻近核苷酸序列）互补，但也可以是仅与核酸序列（包括mRNA 5’和3’UTR）一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可与编码多肽的mRNA转录物翻译起始位点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度为本领域所知，并且长度可从约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少核苷酸开始。可使用化学合成和酶连接反应，使用本领域已知的方法构建本发明的反义核酸序列。例如，可使用天然发生的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学合成反义核酸序列（例如，反义寡核苷酸序列），设计所述修饰核苷酸来增加分子的生物学稳定性或增加反义和有义核酸序列之间形成的双链体的物理稳定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例为本领域所熟知。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和“帽化”以及类似物如次黄嘌呤核苷对一个或多个天然发生核苷酸的取代。核苷酸的其他修饰为本领域所熟知。

可使用其中已经以反义方向（即从插入的核酸转录的RNA将是目的靶核酸的反义方向）亚克隆了核酸序列的表达载体在生物学上产生反义核酸序列。优选地，通过包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子的稳定整合的核酸构建体在植物中产生反义核酸序列。

在本发明方法中用于沉默的核酸分子（无论引入植物中或在原位产生）与mRNA转录物和/或编码多肽的基因组DNA杂交或结合，由此例如通过抑制转录和/或翻译抑制蛋白质的表达。杂交可以是通过常规核苷酸互补性形成双链体，或例如，在结合DNA双链体的反义核酸序列的情况下，通过双螺旋的大沟中特异的相互作用来形成稳定双链体。可通过转化或在特定组织位点上直接注射将反义核酸序列引入植物中。或者，可修饰反义核酸序列，以靶向所选细胞，然后全身施用。例如，对于全身施用，可修饰反义核酸序列，使得它们例如通过将反义核酸序列连接到结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体上而特异性结合在所选细胞表面上表达的受体或抗原。也可使用本文描述的载体将反义核酸序列递送到细胞中。

根据另一方面，反义核酸序列是a-异头核酸序列。a-异头核酸序列与互补RNA形成特异性双链杂合体，与常见的b-单位相反，在所述互补RNA中，链彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15:6625-6641)。反义核酸序列还可包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15,6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215,327-330)。

也可使用核酶进行内源基因表达的降低或基本消除。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够切割与其具有互补区的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶（例如，锤头状核酶（描述于Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334,585-591中））可用于催化切割编码多肽的mRNA转录物，由此基本降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。可设计对核酸序列具有特异性的核酶（参阅例如：Cech等美国专利号4,987,071;和Cech等美国专利号5,116,742）。或者，对应于核酸序列的mRNA转录物可用于从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261,1411-1418)。用于植物中基因沉默的核酶的用途为本领域所知(例如,Atkins等(1994)WO94/00012;Lenne等(1995)WO 95/03404;Lutziger等(2000)WO00/00619;Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。

也可通过插入诱变（例如，T-DNA插入或转座子插入）或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J 20(3):357-62)、(Amplicon VIGS WO98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)中所述的策略实现基因沉默。

如果在内源基因上有突变和/或在随后引入植物中的分离的基因/核酸上有突变，那么也可发生基因沉默。非功能多肽可引起降低或基本消除。例如，多肽可结合多种相互作用的蛋白质；一个或多个突变和/或截短因此可提供仍然能够结合相互作用蛋白质（如受体蛋白质）但不能显示其正常功能（如信号转导配体）的多肽。

用于基因沉默的另一方法是通过靶向与基因调节区（例如启动子和/或增强子）互补的核酸序列，以在靶细胞中形成防止基因转录的三螺旋结构。参阅Helene,C.,Anticancer Drug Res.6,569-84,1991;Helene等,Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-36 1992;和Maher,L.J.Bioassays 14,807-15,1992。

其他方法，如使用针对内源多肽的抗体抑制其在植物中的功能，或在多肽参与的信号途径中进行干扰为技术人员所熟知。具体而言，可以想像人造分子可用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与的信号途径。

或者，可设置筛选程序来鉴定植物群体中基因的天然变体，所述变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可用于例如进行同源重组。

人造的和/或天然的微小RNAs(miRNAs)可用于敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源miRNAs通常是19-24个核苷酸长的单链小RNA。它们主要调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数植物微小RNAs(miRNAs)与其靶序列具有完全或近乎完全的互补性。然而，存在具有高达5个错配的天然靶标。它们通过切丁酶家族双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的更长非编码RNA加工得到。加工时，它们通过结合其主要组分Argonaute蛋白质掺入到RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。MiRNAs作为RISC的特异性组分起作用，因为它们在细胞质中与靶核酸，大多数情况下与mRNAs进行碱基配对。随后的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。miRNA过表达的结果因此经常在靶基因的降低的mRNA水平上得到反映。

可特异地遗传改造长度通常是21个核苷酸的人造微小RNA(amiRNAs)，以负调节单个或多个目的基因的表达。植物微小RNA靶标选择的决定因素为本领域所熟知。已经定义了靶标识别的经验参数，并且其可用于帮助设计特异性amiRNAs(Schwab等,Dev.Cell 8,517–527,2005)。公众也可获得用于设计并产生amiRNAs及其前体的便利工具(Schwab等,Plant Cell 18,1121-1133,2006)。

对于最佳操作，用于在植物中降低内源基因表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列来转化单子叶植物，来自双子叶植物的核酸序列来转化双子叶植物。优选地，来自任何给定植物种类的核酸序列引入同一物种中。例如，来自稻的核酸序列转化到稻植物中。然而，待引入的核酸序列不是绝对需要来源于与其引入的植物相同的植物种类。内源靶基因和待引入核酸之间具有基本同源性就足够了。

上文描述的是用于降低或基本消除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域的技术人员将容易地能够调整上述方法用于沉默，以通过例如使用适当启动子实现整株植物或其部分中内源基因表达的降低。

转化

本文涉及的术语“引入”或“转化”包括外源多核苷酸转移到宿主细胞中，不考虑用于转移的方法。可用本发明的遗传构建体转化能够随后通过器官发生或胚胎发生进行克隆繁殖的植物组织，并且从其可再生整株植物。选择的特定组织根据转化的特定物种可得到的并最适合的克隆繁殖系统而变化。示例性组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存的分生组织（例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织），和诱导的分生组织（例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织）。多核苷酸可瞬时或稳定引入宿主细胞中，或可例如作为质粒非整合地维持。或者，其可整合到宿主基因组中。所得的转化植物细胞然后可用于以本领域技术人员已知的方式再生转化的植物。

外源基因转移到植物的基因组中称为转化。植物物种的转化目前是十分常规的技术。有利地，几种转化方法中的任何一种均可用于向合适的祖先细胞中引入目的基因。可以利用描述用于从植物组织或植物细胞转化并再生植物的方法来瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学试剂、直接将DNA注射到植物中、基因枪轰击、使用病毒或花粉转化和显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens,F.A.等,(1982)Nature 296,72-74;Negrutiu I等(1987)PlantMol Biol 8:363-373)；原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol 3,1099-1102)；显微注射到植物材料(Crossway A等,(1986)Mol.Gen Genet 202:179-185)；DNA或RNA包被的颗粒轰击(Klein TM等,(1987)Nature 327:70)；用（非整合）病毒感染等。优选通过农杆菌介导的转化产生转基因植物，包括转基因农作物。有利的转化方法是植物中的转化。为此，例如可以允许农杆菌在植物种子上作用或用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明已经证明了尤其便利的是允许转化农杆菌的悬浮液作用于完整植物或至少花原基。植物随后生长直至获得处理植物的种子(Clough和Bent,Plant J.(1998)16,735–743)。用于农杆菌介导转化稻的方法包括众所周知用于稻转化的方法，如在任何以下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP 1198985A1、Aldemita和Hodges(Planta 199:612-617,1996);Chan等(Plant Mol Biol 22(3):491-506,1993),Hiei等(Plant J 6(2):271-282,1994)，其公开内容在本文引入作为参考，如同完全阐明一样。在玉米转化的情况下，在Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6):745-50,1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1):13-22,2002)中描述了优选的方法，其公开内容在本文引入作为参考，如同完全阐明一样。例如B.Jenes等,Techniques for Gene Transfer,Transgenic Plants,第1卷,Engineeringand Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述了所述方法。待表达的核酸或构建体优选克隆到载体中，其适合于转化根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），例如pBin19(Bevan等,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由该载体转化的农杆菌然后以已知方式（例如通过在农杆菌溶液中进入有伤痕的叶片或剁碎的叶片，然后在合适培养基中培养它们）用于转化植物，如作为模型的植物，像拟南芥（拟南芥在本发明范围内，但不认为其是农作物），或农作物，如烟草植物。通过根癌农杆菌转化植物例如由

和Willmitzer在Nucl.AcidRes.(1988)16,9877中描述，或尤其在F.F.White,Vectors for GeneTransfer in Higher Plants;Transgenic Plants,第1卷,Engineering andUtilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press,1993,第15-38页中已知。

除了转化体细胞（其然后再生成完整植株），还可以转化植物分生组织的细胞，尤其是发育成配子的那些细胞。在该情况下，转化的配子遵循天然植物发育，产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从特定部分被转化因此是转基因的发育植物中获得种子[Feldman,KA和Marks MD(1987).Mol Gen Genet 208:274-289;Feldmann K(1992).C Koncz,N-H Chua和J Shell,eds,Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific,Singapore,第274-289页]。备选方法基于反复去除花序并将莲座叶中间的切除部位与转化的农杆菌温育，由此在稍晚时间点上获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5:551-558;Katavic(1994).Mol GenGenet,245:363-370)。然而，尤其有效的方法是具有修饰的真空渗入方法，如“花浸”法。在真空渗入拟南芥的情况下，用农杆菌悬浮液处理减压下的完整植株[Bechthold,N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci,316:1194-1199]，而在“花浸”法的情况下，发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬浮液短暂地温育[Clough,SJ和Bent AF(1998)The Plant J.16,735-743]。在两种情况下收获特定比例的转基因种子，并且这些种子与非转基因种子通过上述选择条件下生长区分开。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体为母系遗传的，大多数农作物降低或消除了转基因随花粉流动的风险。一般通过Klaus等,2004[Nature Biotechnology 22(2),225-229]中概要展示的方法完成叶绿体基因组的转化。简言之，待转化的序列与选择标记基因一起克隆到与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导向原质体系中的位点特异性整合。已经对许多不同植物物种描述了质体转化，并在Bock(2001)Transgenic plastids in basicresearch and plant biotechnology.J Mol Biol.2001Sep 21;312(3):425-38或Maliga,P(2003)Progress towards commercialization of plastidtransformation technology.Trends Biotechnol.21，20-28中给出了综述。目前已经以无标记转化体的形式报道了其他生物技术进展，所述转化体可通过瞬时共整合标记基因产生(Klaus等,2004,Nature Biotechnology 22(2),225-229)。

可通过技术人员熟悉的所有方法再生遗传修饰的植物细胞。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu,Potrykus或

和Willmitzer的上述出版物。

一般在转化后，选择植物细胞或细胞群体中一种或多种标记的存在，所述标记由与目的基因共转染的植物表达基因编码，然后转化材料再生成整株植物。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料通常经受选择条件，以便转化的植物可与未转化植物区分开。例如，可种植以上述方式获得的种子，并且在初始生长期后通过喷雾进行适当选择。其他可能性在于灭菌后适当时使用合适的选择剂在琼脂平板上播种种子，使得仅转化的种子可生长成植物。或者，筛选转化植物中选择标记（如上文所述标记）的存在。

DNA转移和再生后，例如还使用Southern分析评估推测的转化植物中目的基因的存在、拷贝数目和/或基因组组成。备选或额外地，可使用Northern和/或Western分析监测新引入DNA的表达水平，所述两种技术为本领域技术人员所熟知。

可通过多种手段，如通过克隆繁殖或经典的育种技术繁殖所产生的转化植物。例如，第一代（或T1）转化植物可自交，并选择纯合的第二代（或T2）转化体，并且T2代植物然后可进一步通过经典的育种技术进行繁殖。产生的转化生物体可采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体（例如，转化以含有表达盒的所有细胞）；转化和非转化组织的嫁接物（例如，在植物中，转化的根状茎嫁接到非转化的接穗）。

在该申请中，转化有构建体－或可互换转化有构建体或转化有核酸的植物、植物部分、种子或植物细胞将理解为通过生物技术手段引入所述构建体或所述核酸而携带所述构建体或所述核酸作为转基因的植物、植物部分、种子或植物细胞。所述植物、植物部分、种子或植物细胞因此包含所述重组构建体或所述重组核酸。过去在引入后不再含有所述重组构建体或所述重组核酸的任何植物、植物部分、种子或植物细胞称为失效分离子、失效合子或失效对照，但并不认为转化有所述构建体或所述核酸的植物、植物部分、种子或植物细胞不在该申请意义内。

T-DNA激活标签

T-DNA激活标签(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括插入T-DNA，其一般在目的基因基因组区域或基因编码区上游或下游10kb处含有启动子（也可以是翻译增强子或内含子），处于使得启动子指导靶基因表达的构型。通常，其天然启动子对靶基因表达的调节被破坏，并且所述基因落入新引入的启动子的控制之下。启动子通常嵌入T-DNA中。该T-DNA例如通过农杆菌感染随机插入植物基因组内，并导致插入T-DNA附近的基因的修饰表达。所得转基因植物由于引入的启动子附近的基因修饰表达而显示显性表型。

TILLING

术语“TILLING”是“基因组中定向诱导局部损伤”的缩写，并指用于产生和/或鉴定编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质的核酸的诱变技术。TILLING也允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体在强度或定位或时间选择（例如如果突变影响了启动子）上显示修饰的表达。这些突变体变体可以比天然形式的基因显示更高的活性。TILLING组合了高密度诱变与高通量筛选方法。TILLING中通常遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)Methods in Arabidopsis Research,Koncz C,Chua NH,Schell J,编辑Singapore,World Scientific PublishingCo,第16–82页;Feldmann等,(1994)Meyerowitz EM,Somerville CR,编辑,Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,第137-172页;Lightner J和Caspar T(1998)JMartinez-Zapater,J Salinas,编辑,Methods on Molecular Biology,第82卷.Humana Press,Totowa,NJ,第91-104页)；(b)个体DNA的制备和合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性并退火以允许异源双链体的形成；(e)DHPLC，其中在层析图中检测混合物中异源双链体的存在为额外峰；(f)鉴定突变体个体；和(g)对突变体PCR产物测序。用于TILLING的方法为本领域所熟知(McCallum等,(2000)Nat Biotechnol 18:455-457;Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2):145-50中进行了综述)。

同源重组

同源重组允许在基因组明确选定的位置上引入所选的核酸。同源重组是生物科学中对低等生物如酵母或苔藓（Physcomitrella）常规使用的标准技术。不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10):3077-84)，还对农作物，例如稻(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10):1030-4;Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2):132-8)描述了用于在植物中进行同源重组的方法，并且存在不管靶生物体如何一般均可应用的方法(Miller等,Nature Biotechnol.25,778-785,2007)。

产量相关性状

产量相关性状包含一种或多种产量、生物量、种子产量、早期萌发势、绿色指数、增加的生长速率、改善的农艺性状（如改善的水分利用效率(WUE)、氮利用效率(NUE)等）。

产量

术语”产量”通常表示经济价值的可测量生产，一般与指定农作物、面积和时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接对产量有贡献，或实际产量是对于农作物和一年的每平方米产量，这通过总产量（包括收获的和评估的产量）除以种植的平方米数而确定。术语植物的“产量”可指营养组织生物量（根和/或苗生物量）、生殖器官、和/或植物的繁殖体（如种子）。

以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每平方米生长的（establish）植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、穗长度/直径、种子饱满率的增加（其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100）等等。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每平方米植物数、每株植物圆锥花序数、圆锥花序长度、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花（小花）数、种子饱满率的增加（其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100）、千粒重的增加等等。在稻中，水下耐受性也可导致产量增加。

早期萌发势

“早期萌发势”指尤其在植物生长早期期间活跃、健康、良好平衡的生长，并可以因植物适应性增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境（即优化能源的使用和苗与根之间的分配）。具有早期萌发势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的农作物建立，这往往导致高度均匀的田块（农作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的多个阶段）和往往更好及更高的产量。因而，早期萌发势可以通过多种因子如千粒重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及苗生物量和众多其他因素而确定。

增加的生长速率

增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分（包括种子）是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如萌发速率、早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能（相似的作用可以用较早的开花时间获得）。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子（例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部过程均在一个常规生长时段内）。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子（例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物）。从相同的根茎中收获额外次数在一些农作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米的年生物量产量的增加（因任何特定植物可以生长并收获的次数（如在一年中）增加）。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育农作物的区域限制往往由栽种时间（早季）或在收获时期（晚季）的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid（植物达到其50％最大尺寸所花费的时间）和T-90（植物达到其90％最大尺寸所花费的时间）等。

胁迫耐受性

发生产量和/或生长速率的增加，不管与对照植物相比，植物处于非胁迫条件还是植物暴露于多种胁迫。植物通常通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40%、35%、30%或25%，优选小于20%或15%。由于农业实践（灌溉、施肥、杀虫剂处理）上的进步，在栽培农作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。轻微胁迫是植物暴露的常见生物和/或非生物（环境）胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过多的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、冷或冰冷温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫（尤其因为干旱）、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫通常是病原体，如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。

具体而言，本发明的方法可以在非胁迫条件或在轻微干旱条件下进行以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。如在Wang等（Planta（2003）218：1-14）中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等（Plant Physiol（2003）133：1755-1767）描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、上调抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。具有最佳生长条件的植物（在非胁迫条件下生长）通常产生该植物在给定环境中平均产量的以递增优选顺序至少97%、95%、92%、90%、87%、85%、83%、80%、77%或75%。可在收获和/或季节基础上计算平均产量。本领域的技术人员清楚农作物的平均产量生产。

营养缺乏可以由营养物的缺乏引起，所述营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼，等等。

术语盐胁迫不限于普通盐(NaCl)，也指任何一种或多种的：NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂、CaCl₂等等。

增加/提高/增强

术语“增加”、“提高”或“增强”可互换，并在应用意义上表示与本文定义的对照植物相比至少3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%，优选至少15%或20%，更优选25%、30%、35%或40%的更高产量和/或生长。

根

本文所用的术语根包括植物的所有“地下”或“地下”部分，其作为支撑，从周围土壤提取矿物质和水，和/或储存营养储备物。这些包括球茎、球茎、块根、块状根、根茎和肉质根。增加的根产量本身表现为下列一种或多种指标：根生物量（总重量）的增加，其基于个体和/或每株植物和/或每平方米；增加的收获指数，其表示为可收获部分，如根的产量除以总生物量的比值。

根产量的增加也可表现为根大小和/或根体积的增加。此外，根产量的增加自身也可表现为根面积和/或根长和/或根宽和/或根周长的增加。增加的产量也可以产生改良的结构，或可以因改良的结构而出现。

种子产量

增加的种子产量本身可以表现为下列一种或多种指标：a）种子生物量（种子总重量）增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米；b）每株植物增加的花数；c）增加的（饱满）种子数；d）增加的种子饱满率（其表述为饱满种子数与种子总数之间的比率）；e）增加的收获指数，其表述为可收获部分（如种子）产量与总生物量的比率；和f）增加的千粒重（TKW），这从计数的饱满种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。

种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加本身也可以自我表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的产量也可以产生改良的结构，或可以因改良的结构而出现。

绿色指数

本文所用的“绿色指数”从植物的数字图像计算而来。对于属于图像上植物物体的每个像素，计算绿色值与红色值的比值（用于编码颜色的RGB模式）。将绿色指数表示为绿色与红色比值超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下，和在降低的养分有效性生长条件下，在开花之前测量最后成像中植物的绿色指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，测量干旱后第一次成像中植物的绿色指数。

生物量

如本文所用的术语“生物量”指植物的总重量。在生物量的定义中，可在植物一个或多个部分的生物量之间进行区分，其可包括下列一种或多种：

-地上部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地上可收获部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地下部分，如但不限于根生物量、块茎、球茎等；

-地下可收获部分，如但不限于根生物量、块茎、球茎等；

-部分插入下地或与地下接触的可收获部分，如但不限于甜菜和植物的其他下胚轴区域、根茎、匍匐茎或匍匐根茎；

-营养组织生物量，如根生物量、苗生物量等；

-生殖器官；和

-繁殖体，如种子。

标记辅助育种

此类育种程序有时候需要通过使用例如EMS诱变来诱变处理植物以引入等位变异；或者，程序可以以无意引起的所谓“天然”起源的一组等位变体开始。然后例如通过PCR进行等位变体的鉴定。这之后是选择正在讨论的序列的高级等位变体的步骤，并且其产生增加的产量。通过监测含有正在讨论的序列的不同等位变体的植物的生长性能进行选择。可在温室或田间监测生长性能。其他任选的步骤包括将其中鉴定了高级等位变体的植物与另一植物杂交。这可用于例如制备感兴趣表型特征的组合。

在（基因作图）中用作探针

编码目的蛋白质的核酸用于遗传和物理作图基因的用途需要长度仅至少15个核苷酸的核酸序列。这些核酸可用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用编码目的蛋白质的核酸探测限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J,Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual)。然后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1:174-181)对所得带型进行遗传分析以构建遗传图。此外，核酸可用于探测含有代表确定遗传杂交的亲本和后代的一组个体的限制性内切核酸酶处理的基因组DNA的Southern印迹。指出了DNA多态性的分离，并用于计算之前使用该群体获得的遗传图中编码目的蛋白质的核酸的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。

在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4:37-41中描述了植物基因来源探针的制备及用于遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用上述方法或其变型进行的特异性cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系和其他个体组可用于作图。此类方法为本领域技术人员所熟知。

核酸探针还可用于物理作图（即，序列在物理图谱上的布局；参阅Hoheisel等Non-mammalian Genomic Analysis:A Practical Guide,Academic press 1996,第319-346页，及其中引用的参考文献）。

在另一实施方案中，核酸探针可用于在原位杂交(FISH)作图中直接萦光(Trask(1991)Trends Genet.7:149-154)。尽管目前的FISH作图方法倾向于使用大克隆(几kb到几百kb;参阅Laan等(1995)Genome Res.5:13-20)，灵敏性上的提高可允许使用更短的探针进行FISH作图。

可使用核酸进行多种基于核酸扩增的方法用于遗传和物理作图。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics 16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241:1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18:3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17:6795-6807)。对于这些方法，核酸序列用于设计并产生在扩增反应或引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计为本领域技术人员所熟知。在使用基于PCR的遗传作图方法中，鉴定对应于本发明核酸序列的区域中的作图杂交的亲本之间DNA序列差异是必要的。然而，这对作图方法一般不是必须的。

植物

如本发明所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先和后代、和植物部分，包括种子、芽、茎、叶、根（包括块茎）、花、组织和器官，其中各上述部分包含目的基因/核酸。术语“植物”还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，其中各上述部分也包含目的基因/核酸。

特别用于本发明方法的植物包括所有植物，其属于绿色植物（Viridiplanta）超家族，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，其选自包含以下的列表：槭属（Acerspp.）,猕猴桃属（Actinidia spp.）,黄葵属(Abelmoschus spp.）,剑麻(Agavesisalana）,冰草属(Agropyron spp.）,匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera）,葱属(Allium spp.）,苋属(Amaranthus spp.）,Ammophila arenaria，菠萝(Ananas comosus)，番荔枝属(Annona spp.）,芹菜（Apium graveolens)，落花生属(Arachis spp)，木菠萝属（Artocarpus spp.）,石刁柏(Asparagusofficinalis)，燕麦属（Avena spp.）(例如燕麦（Avena sativa)，野燕麦（Avenafatua）,比赞燕麦(Avena byzantina ）,Avena fatua var.sativa，杂种燕麦(Avena hybrida)),阳桃(Averrhoa carambola）,山白竹(Bambusa sp.）,冬瓜(Benincasa hispida）,Bertholletia excelsea，甜菜(Beta vulgaris）,芸苔属(Brassica spp.）(例如欧洲油菜,芜青（Brassica rapa ssp.）[芸苔,油菜,萝卜]),Cadaba farinosa，野茶树（Camellia sinensis）,美人蕉（Cannaindica）,大麻（Cannabis sativa ）,辣椒属（Capsicum spp.）,Carex elata，番木瓜（Carica papaya）,大花假虎刺（Carissa macrocarpa）,山核桃属（Carya spp.）,红花（Carthamus tinctorius ）,栗属（Castanea spp.）,爪哇木棉（Ceiba pentandra）,缩叶菊苣（Cichorium endivia ）,樟属（Cinnamomum spp.）,西瓜（Citrullus lanatus ）,柑桔属（Citrus spp.）,椰子属（Cocos spp.）,咖啡属（Coffea spp.）,芋头（Colocasia esculenta)，可乐属（Cola spp.）,黄麻属（Corchorus sp.)，芫荽（Coriandrum sativum)，榛属（Corylus spp.）,山楂属（Crataegus spp.）,番红花（Crocus sativus）,南瓜属（Cucurbita spp.）,香瓜属（Cucumis spp.）,Cynara spp.,胡萝卜,山马蝗属（Desmodium spp.）,龙眼（Dimocarpus longan）,薯蓣属(Dioscorea spp.）,柿属(Diospyros spp.）,稗属（Echinochloa spp.）,油棕属（Elae）(例如油椰（Elaeis guineensis)，美洲油棕（Elaeis oleifera)),龙爪稷（Eleusine coracana）,Eragrostis tef，蔗茅属（Erianthus sp.）,枇杷（Eriobotrya japonica）,桉树属（Eucalyptus sp.）,红仔果（Eugeniauniflora）,荞麦属（Fagopyrum spp.）,山毛榉属（Fagus spp.）,苇状羊茅（Festuca arundinacea ）,无花果（Ficus carica）,金柑属（Fortunellaspp.）,草莓属（Fragaria spp.）,银杏（Ginkgo biloba ）,大豆属（Glycinepp.）(例如大豆（Glycine max）,黄豆（Soja hispida）或Soja max),陆地棉（Gossypium hirsutum）,向日葵属(Helianthus spp.）(例如向日葵（Helianthus annuus)),萱草(Hemerocallis fulva)，木槿属(Hibiscus spp.）,大麦属(Hordeum spp.）(例如大麦（Hordeum vulgare)),甘薯(Ipomoeabatatas)，核桃属（Juglans spp.）,莴苣（Lactuca sativa)，山黧豆属(Lathyrusspp.）,兵豆（Lens culinaris）,亚麻(Linum usitatissimum）,荔枝(Litchichinensis）,莲属(Lotus spp.）,丝瓜(Luffa acutangula）,羽扇豆属(Lupinus spp.）,Luzula sylvatica，番茄属(Lycopersicon spp.）(例如番茄（Lycopersicon esculentum）,番茄（Lycopersicon lycopersicum）,Lycopersicon pyriforme),硬皮豆属(Macrotyloma spp.）,苹果属(Malusspp.）,凹缘金虎尾（Malpighia emarginata）,曼密苹果（Mammeaamericana）,芒果(Mangifera indica）,木薯属(Manihot spp.）,人心果（Manilkara zapota）,紫花苜蓿（Medicago sativa）,草木犀属(Melilotusspp.）,薄荷属（Mentha spp.）,芒草（Miscanthus sinensis ）,苦瓜属(Momordica spp.）,黑桑（Morusn nigra ）,芭蕉属(Musa spp.）,烟草属(Nicotiana spp.）,齐墩果属（Olea spp.）,仙人掌属（Opuntia spp.）,料豆属（Ornithopus spp.）,稻属（Oryza spp.）(例如稻（Oryza sativa）,阔叶稻（Oryza latifolia）),稷（Panicum miliaceum）,柳枝稷（Panicumvirgatum）,鸡蛋果（Passiflora edulis）,欧洲防风（Pastinaca sativa）,狼尾草属（Pennisetum sp.）,鳄梨属（Persea spp.）,欧芹（Petroselinumcrispum）,虉草（Phalaris arundinacea）,菜豆属(Phaseolus spp.）,梯牧草（Phleum pratense）,刺葵属(Phoenix spp.）,南方芦苇（Phragmitesaustralis）,酸浆属(Physalis spp.）,松属（Pinus spp.）,阿月浑子（Pistaciavera）,豌豆属(Pisum spp.）,早熟禾属(Poa spp.）,杨属(Populus spp.）,牧豆树属(Prosopis spp.）,李属(Prunus spp.）,番石榴属(Psidium spp.）,石榴(Punica granatum)，西洋梨（Pyrus communis)，栎属（Quercus spp.）,萝卜(Raphanus sativus)，Rheum rhabarbarum，茶藨子属(Ribes spp.）,蓖麻(Ricinus communis)，悬钩子属(Rubus spp.）,甘蔗属（Saccharum spp.）,柳属（Salix sp.）,接骨木属（Sambucus spp.）,黑麦（Secale cereale ）,胡麻属（Sesamum spp.）,白芥属(Sinapis sp.）,茄属（Solanum spp.）(例如马铃薯（Solanum tuberosum）,红茄（Solanum integrifolium）或番茄（Solanum lycopersicum)，两色蜀黍（Sorghum bicolor)，菠菜属（Spinaciaspp.）,蒲桃属（Syzygium spp.）,万寿菊属（Tagetes spp.）,酸豆（Tamarindus indica）,可可（Theobroma cacao）,三叶草属（Trifoliumspp.）,Tripsacum dactyloides，Triticosecale rimpaui，小麦属（Triticum spp.）(例如普通小麦（Triticum aestivum）,硬粒小麦（Triticum durum）,圆柱小麦（Triticum turgidum)，Triticum hybernum，马卡小麦（Triticum macha)，普通小麦（Triticum sativum）,单粒小麦（Triticum monococcum）或普通小麦（Triticum vulgare)),Tropaeolum minus，金莲花（Tropaeolum majus)，越桔属（Vaccinium spp.）,野豌豆属（Vicia spp.）,豇豆属（Vigna spp.）,香堇（Viola odorata）,葡萄属（Vitis spp.）,玉米(Zea mays）,Zizaniapalustris，枣属(Ziziphus spp.）,等等。

对于本发明的序列，植物来源的核酸或多肽序列具有优化用于在植物中表达的密码子选择，和分别在植物中使用常见氨基酸和调节性位点的特征。起始植物可以是任何植物，但优选在前面段落中描述的那些植物。

对照植物

合适对照植物的选择是实验方案的例行部分，并可包括相应的野生型植物或没有目的基因的相应植物。对照植物通常是与待评估植物相同的植物种类或甚至是与其相同的品种。对照植物还可以是待评估植物的失效合子。失效合子（也称为失效对照植物）是通过分离而丢失转基因的个体。此外，对照植物已经在与本发明植物生长条件等同的生长条件下生长。典型地，对照植物在等同的生长条件下生长，因此处于本发明植物附近并与其处于相同的时间。如本文所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子和种子部分。在允许比较根据本发明产生的植物的条件下评估对照植物的表型或性状，例如对照植物和根据本发明的方法产生的植物在相似，优选相同的条件下生长。

发明详述

目前已经发现调节植物中编码富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增加的产量和/或增强的产量相关性状的植物。根据第一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物增强植物中产量和/或产量相关性状的方法，其中所述方法包括用重组构建体转化植物，以增强植物中富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）的活性或表达，并任选选择具有增加的产量和/或增强的产量相关性状的植物。

调节植物中富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）的表达和活性的优选方法是通过引入并表达编码该富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）的核酸分子。

下文中对“用于本发明方法的蛋白质”的任何参考指如本文定义的富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）。下文中对“用于本发明方法的核酸”的任何参考指能够编码此类富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）的核酸。待引入植物（因此可用于实施本发明方法）的核酸是编码现在将描述的类型蛋白质的任何核酸，其在下文中也称作“POI核酸”或“POI基因”。

优选地，本文定义的本发明的“富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）”（即，POI多肽）指任何多肽，其包含含有至少一个短基序，如SP、SPP、AP或PA的氨基酸序列。在优选的实施方案中，氨基酸序列含有至少3个，更优选至少所有基序SP、SPP、AP和PA。

在植物中细胞壁蛋白质和与细胞壁结合的蛋白质中发现了这些基序SP、SPP、AP和PA。

此外，本文定义的本发明富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）（即，POI多肽）指包含这样氨基酸序列的任何多肽，所述氨基酸序列含有SEQ ID NO.:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到37中显示的任何一个多肽序列，或在一个实施方案中在SEQ ID NO:2、4、6、9、12、16、18、22、24、25到33或35到37中显示的任何一个序列，及其同源物（如本文所述），或指包含SEQ ID NO.:1、3、5、7、8、10、11、13、15、17、19、21或23中显示的核酸分子的多核苷酸编码的多肽，及其同源物（如本文所述）和/或包含基序1到4任何一个中的至少一个。

优选地，富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）包含含有短基序，如SP、SPP、AP和/或PA的氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、16、18、22、24、25到33或35到37中显示的任何一个多肽序列，或包含SEQID NO.:1、3、5、7、8、10、11、15、17、21或23中显示的核酸分子的多核苷酸编码的多肽具有35%或更高同一性的氨基酸序列，并且甚至更优选地也包含基序2到4任何一个中的至少一个。

在一个实施方案中，富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）是植物细胞分泌的细胞壁结合蛋白质。

在一个实施方案中，富羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）特征为包含一个或多个下列MEME基序：

基序1(SEQ ID NO:41)

G[VA]IAA[AV][CAG]V[VL]G[LF][GA][AG][LFM]V[YW][KR]KR[QR][QADE]NI[RQ]R[SA][RQ]YGY

基序2(SEQ ID NO:42)

M[SN][GS]GKKAG[IV][AV][VL]

基序3(SEQ ID NO:43)

AR[RL]E[LI]L

基序4(SEQ ID NO:44)

G[VA]I[VA]A[AV][CAG][MV][VL]G[LF][GA][AG][LFM]V[YW][KR]KR[QR][QADE]NI[RQ]R[SA][RDQ]YGY

在一个实施方案中，基序4在基序的4号位置上具有缬氨酸，在8号位置上具有甲硫氨酸，并在27号位置上具有天冬氨酸。

使用MEME算法(Bailey和Elkan,Proceedings of the SecondInternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology,第28-36页,AAAI Press,Menlo Park,California,1994)得到基序1到4。在MEME基序的每个位置上，显示了频率高于0.2的查询组序列中存在的残基。方括号内的残基代表了可选项。

更优选地，POI多肽包含这四个基序中的至少一个。在另一实施方案中，所述POI多肽包含基序2、3或4中的至少一个。

此外，本发明涉及POI多肽的同源物及其在本发明方法中的用途。POI多肽的同源物与SEQ ID NO:2代表的和/或SEQ ID NO.:4、6、9、12、16、18、22、24、25到33或35到37中显示的其直向同源物和旁系同源物（优选地，条件是同源蛋白质包含上文描述的任何一个或多个基序）代表的氨基酸具有递增优选顺序为至少25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的总体序列同一性。使用整体比对算法，如程序GAP中的Needleman Wunsch算法(GC G Wisconsin Package,Accelrys)，优选默认参数并优选利用成熟蛋白质（即不考虑分泌信号或转运肽）的序列来确定总的序列同一性。在一个实施方案中，通过比较SEQ ID NO:2全长序列上的多肽序列来确定序列同一性水平。

与总的序列同一性相比，序列同一性通常比仅考虑保守结构域或基序时更高。优选地，POI多肽中的基序与基序1到4中的任何一个或多个具有递增优选顺序为至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在本文“定义”部分中定义了术语“结构域”、“标记”和“基序”。

在一个实施方案中，用于本发明方法、构建体、植物、可收获部分和产品中的HRGP多肽是这样的HRGP，其不包括在专利申请EP1586645（如SEQ ID NO:38569）或专利申请US2004/031072（如SEQ IDNO:194788），或专利申请US2006/123505（如SEQ ID NO:31740）中公开的序列的HRGP。

优选地，用于构建如图1中描述的系统树时使用的多肽序列与包含SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)组聚类，而不与任何其他组聚类。

此外，POI多肽（至少是其天然形式）通常描述为富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)。SEQ ID NO.:1编码毛果杨（Populus trichocarpa）的HRGP。该蛋白质属于已知参与植物生长和发育的多方面，包括细胞壁结构、细胞壁装配、细胞增殖、细胞与细胞识别、细胞扩展、胁迫应答、氧化胁迫和疾病的富羟脯氨酸糖蛋白组。富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)是在所有植物，还有藻类、苔藓植物中存在的糖蛋白，分泌到细胞壁中或附着到质膜上。HRGPs家族包括伸展蛋白、阿拉伯半乳聚糖蛋白质、脯氨酸/富羟脯氨酸糖蛋白和一些凝集素(Deepak等,2007;Estevez等,2006;Cassab,1998)。已知HRGPs参与生长和发育，以及胁迫应答，如氧化胁迫和疾病。

例如根据实施例7和8中描述的本发明方法在植物中表达时，POI多肽的表达或活性的增加产生了这样的植物，其相对于对照植物具有增加的产量，特别是通过种子总重量和数目测定的种子产量，和改善的产量相关性状（特别是种子饱满率、饱满种子数、苗和根生物量）。此外，植物或植物细胞中POI多肽活性或量的增加对根生物量和种子饱满率的正面影响提示了，活性或量的这种增加也可赋予在非生物胁迫，特别是干旱胁迫下产量的正面影响。

通过利用SEQ ID NO:1代表的核酸序列转化植物来阐明本发明，所述核酸序列编码SEQ ID NO:2的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；可使用本文定义的任何POI编码核酸或POI多肽，例如表A和序列表中列出的，如SEQ ID No.:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或25到37中显示的多肽及其同源物、直向同源物或旁系同源物有利地进行本发明的方法。

在本文实施例部分的表A中给出了编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)的核酸的实例。此类核酸可用于进行本发明的方法。实施例部分的表A中给出的氨基酸序列是SEQ ID NO:2代表的POI多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。可通过进行定义部分中描述的所谓交互式blsat搜索容易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物；其中查询序列是例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，第二次BLAST(反向-BLAST)将针对原始序列数据库，例如杨数据库。

本发明也提供了迄今未知的POI编码核酸分子和POI多肽，其用于赋予植物相对于对照植物增强的产量相关性状。

根据本发明的其他实施方案，因此需要提供选自以下的分离的核酸分子：

(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、11、13、15、17、19、21或23（任何一项）代表的核酸；

(ii)SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、11、13、15、17、19、21或23（任何一项）代表的核酸的互补序列；

(iii)编码SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到37（任何一项）代表的多肽的核酸，优选因遗传密码的简并性，所述分离的核酸可来自SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到37（任何一项）代表的多肽序列，并且进一步优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(iv)核酸，其与SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、11、13、15、17、19、21或23的任一核酸序列以递增优选顺序有至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并进一步优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(iv)核酸分子，其与(i)到(iv)的核酸分子在严格杂交条件下杂交，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(vi)编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)的核酸，其与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到37（任何一项）代表的氨基酸序列和表A中的任何其他氨基酸序列以递增优选顺序有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。

根据本发明的其他实施方案，还提供选自以下的分离多肽：

(i)SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到37（任何一项）代表的氨基酸序列；

(ii)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到37（任何一项）代表的氨基酸序列和表A中的任何其他氨基酸序列以递增优选顺序有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(iii)上文(i)或(ii)中给出的任何氨基酸序列的衍生物；或

(iv)本发明的核酸编码的氨基酸序列。

优选地，本发明的核酸分子或本发明的多肽分别不包含序列SEQ IDNO.:1、13、19或2、14、20、34。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明核酸分子或赋予本发明POI多肽的表达的表达构建体。

核酸变体也可用于实施本发明的方法。此类变体的实例包括这样的核酸，其编码实施例部分的表A中给出的任何一个氨基酸序列的同源物和衍生物，术语“同源物”和“衍生物”如本文所定义。也用于本发明方法的是编码实施例部分的表A中给出的任何一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。可用于本发明方法的同源物和衍生物与它们来源的未修饰蛋白质具有基本相同的生物学和功能活性。用于实施本发明方法的其他变体是这样的变体，其中优化了密码子选择或其中去除了miRNA靶位点。

可用于实施本发明方法的其他核酸变体包括这样的核酸部分，所述核酸编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)、与编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)的核酸杂交的核酸、编码POI的核酸的剪接变体、编码POI多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码POI多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。

在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸序列的功能是当在活的植物细胞中转录和翻译本发明的核酸序列时赋予增加产量或产量相关性状的蛋白质的信息。

编码POI多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例部分的表A中给出的任何一个核酸序列的部分，或编码实施例部分的表A中给出的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。

例如，通过产生一个或多个核酸缺失来制备核酸的部分。可以分离的形式使用所述部分或它们可与其他编码（或非编码）序列融合，以例如产生组合若干活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，翻译后产生的所得多肽可以比为蛋白质部分预测的更大。

用于本发明方法的部分编码如本文定义的POI多肽，并与实施例部分的表A中给出的氨基酸序列具有基本相同的生物学活性。优选地，所述部分是在实施例部分的表A中给出的任何一个核酸的部分，或是编码实施例部分的表A中给出的任何一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，所述部分长度为至少100、200、300、400、500、550、600、700、800或900个连续核苷酸，所述连续核苷酸是实施例部分的表A中给出的任何一个核酸序列，或编码实施例部分的表A中给出的任何一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的核酸序列。优选地，所述部分是SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、11、15、17、21或23的核酸的部分。最优选地，所述部分是SEQ ID NO:1的核酸的部分。优选地，所述部分编码氨基酸序列的片段，当用于构建如图1中描述的系统树时，其与包含SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的POI多肽组聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含基序1到4中的任何一个或多个和/或具有HRGP的生物活性和/或包含本发明的核酸分子，例如与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、16、18、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、36或37具有至少50%的序列同一性，或是其直向同源物或旁系同源物。例如，所述部分编码氨基酸序列的片段，当用于构建如图1中描述的系统树时，其与包含SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的POI多肽组聚类，而不与任何其他组聚类，并包含基序1或2中的任何一个或多个，具有HRGP的生物活性，与SEQ ID NO:2具有至少50%的序列同一性。

在一个实施方案中，杂交序列能够与SEQ ID NO:1代表的核酸的互补序列或其部分在中等或高度严格性，优选上文定义的高度严格性条件下杂交。在另一实施方案中，所述杂交序列能够与SEQ ID NO:1代表的核酸的互补序列在严格条件下杂交。

可用于本发明方法的另一核酸变体是能够在降低的严格条件下，优选在严格条件下与编码如本文定义的POI多肽，或与如本文定义的部分杂交的核酸。

根据本发明，提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达能够与实施例部分的表A中给出的任何一个核酸杂交的核酸，或包括在植物中引入并表达能够与编码实施例部分的表A中给出的任何核酸序列的直向同源物或旁系同源物或同源物的核酸杂交的核酸。

可用于本发明方法的杂交序列编码如本文定义的POI多肽，其与实施例部分的表A中给出的氨基酸序列具有基本相同的生物活性。优选地，杂交序列能够与实施例部分的表A中给出的任何一个核酸，或任何这些序列的部分（上文定义的部分）杂交，或杂交序列能够与编码实施例部分的表A中给出的任何一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。最优选地，杂交序列能够与SEQ ID NOs 1代表的核酸的互补序列或其部分杂交。

优选地，杂交序列编码具有氨基酸序列的多肽，当全长序列用于构建如图1中描述的系统树时，其与包含SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的POI多肽组聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含基序1到4中的任何一个和/或具有HRGP的生物活性和/或与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到37，或在一个实施方案中与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、16、18、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、36或37具有至少50%的序列同一性，或是其直向同源物或旁系同源物。例如，所述部分编码氨基酸序列的片段，当用于构建如图1中描述的系统树时，其与包含SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的POI多肽组聚类，而不与任何其他组聚类，并包含基序1到4中的任何一个或多个，具有HRGP的生物活性，与SEQ ID NO:2具有至少50%的序列同一性。

用于本发明方法的另一核酸变体是编码如上文定义的POI多肽的剪接变体，剪接变体如本文定义。

根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例部分的表A中给出的任何一个核酸序列的剪接变体，或编码实施例部分的表A中给出的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。

优选的剪接变体是SEQ ID NO:1代表的核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO:2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，剪接变体编码的氨基酸序列，当用于构建如图1中描述的系统树时，其与包含SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的POI多肽组聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含基序1到4中的任何一个和/或具有HRGP的生物活性和/或与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到37，或在一个实施方案中与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、16、18、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、36或37或其直向同源物或旁系同源物具有至少50%的序列同一性。例如，所述部分编码氨基酸序列的片段，当用于构建如图1中描述的系统树时，其与包含SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的POI多肽组聚类，而不与任何其他组聚类，并包含基序1到4中的任何一个或多个，具有HRGP的生物活性，与SEQ ID NO:2具有至少50%的序列同一性。

用于实施本发明方法的另一核酸变体是编码如上文定义的POI多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文定义。

根据本发明，提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例部分的表A中给出的任何一个核酸的等位变体，或包括在植物中引入并表达编码实施例部分的表A中给出的任何一个氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位变体。

可用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQ ID NO:2的POI多肽和实施例部分的表A中描述的任何氨基酸具有基本相同的生物活性。等位变体在自然界中存在，并且在本发明方法中包括使用这些天然等位基因。优选地，等位变体是SEQ ID NO:1的等位变体，或编码SEQ ID NO:2的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，等位变体编码的氨基酸序列，当用于构建如图1中描述的系统树时，其与包含SEQ IDNO:2代表的氨基酸序列的POI多肽组聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含基序1到4中的任何一个和/或具有HRGP的生物活性和/或与SEQID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到37，或在一个实施方案中与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、16、18、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、36或37或其直向同源物或旁系同源物具有至少50%的序列同一性。例如，所述部分编码氨基酸序列的片段，当用于构建如图1中描述的系统树时，其与包含SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的POI多肽组聚类，而不与任何其他组聚类，并包含基序1到4中的任何一个或多个，具有HRGP的生物活性，与SEQ ID NO:2具有至少50%的序列同一性。

基因改组或定向进化也可用于产生编码如上文定义的POI多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文定义。

根据本发明，提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例部分的表A中给出的任何一个核酸序列的变体，或包括在植物中引入并表达编码实施例部分的表A中给出的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，通过基因改组获得所述变体核酸。

优选地，通过基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列，当用于构建如图1中描述的系统树时，其与包含SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的POI多肽组聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含基序1到4中的任何一个和/或具有HRGP的生物活性和/或与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到37，或在一个实施方案中与SEQ IDNO:2、4、6、9、12、16、18、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、36或37或其直向同源物或旁系同源物具有至少50%的序列同一性。例如，所述部分编码氨基酸序列的片段，当用于构建如图1中描述的系统树时，其与包含SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的POI多肽组聚类，而不与任何其他组聚类，并包含基序1到4中的任何一个或多个，具有HRGP的生物活性，与SEQ ID NO:2具有至少50%的序列同一性。

此外，还可通过位点定向诱变获得核酸变体。可利用几种方法来完成位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编辑)。

编码POI多肽的核酸可来自任何天然或人工来源。可通过刻意的人为操作从组合物和/或基因组环境中其天然形式修饰核酸。优选地，编码POI多肽的核酸来自表A中显示的生物，例如来自植物。

本发明方法的实施产生具有增强的产量相关性状的植物。具体而言，本发明方法的实施产生相对于对照植物具有增加的产量，尤其是增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文“定义”部分中进行了更详细的描述。

在一个实施方案中，术语“增强植物相对于对照植物的产量”可被术语“增加植物相对于对照植物的产量”或术语“增加植物相对于对照植物的至少一种产量相关性状”所替换，因为可以多种方式，通过增加产量或通过增强植物性能，例如通过增加产量相关性状或增加胁迫耐受性来增加植物的产量。

本文参考的增强的产量相关性状指植物一个或多个部分的早期萌发势和/或生物量（重量）增加，所述植物部分包括地上（可收获）部分和/或地下（可收获）部分。具体而言，此类可收获部分是种子和/或根，并且本发明方法的实施导致相对于对照植物具有增加的种子饱满率、根和苗生物量的植物。

本发明提供与失效对照植物相比增加产量，特别是如通过总重量和种子数测定的种子和/或根产量，和相对于对照植物改善的产量相关性状（特别是种子饱满率、饱满种子数、苗和根生物量）的方法，所述方法包括调节，优选增加植物中POI多肽的表达或活性，例如调节或增加植物中编码本文定义的POI多肽的核酸的表达。此外，植物或植物细胞中POI多肽的活性或表达的增加对根生物量和种子饱满率的正面影响提示，这也可能赋予非生物胁迫，特别是干旱胁迫下对产量的正面影响。

因为本发明的转基因植物具有增加的产量，例如产量相关性状，如增加的种子饱满率、根和苗生物量，相对于在其生命周期相应阶段的对照植物的生长速率，这些植物可能显示出增加的生长速率（在其生命周期的至少一个阶段内）。

根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的生长率的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长率的方法，所述方法包括调节植物中编码本文定义的POI多肽的核酸的表达。

本发明方法的实施赋予了非胁迫条件或轻微干旱条件下生长的植物相对于可比较的条件下生长的对照植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加非胁迫条件或轻微干旱条件下生长的植物的产量的方法，所述方法包括调节植物中编码POI多肽的核酸的表达。

在另一实施方案中，本发明延伸至包含用于本发明方法的核酸序列的重组染色体DNA，其中所述核酸因重组方法存在于染色体DNA中，即所述核酸不位于其天然环境的染色体DNA中。所述重组染色体DNA可以是天然来源的染色体，所述核酸通过重组手段插入到其中，或者其可以是小染色体或非天然染色体结构，例如，是人工染色体。染色体DNA的性质可发生变化，只要其允许稳定传递到用于本发明方法的重组核酸的连续世代中，并允许在活的植物细胞中表达所述核酸，导致植物细胞或包含植物细胞的植物产量增加或产量相关性状增强。

在其他实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含在植物细胞中。

本发明方法的实施赋予了营养缺失条件，特别是氮缺失条件下生长的植物相对于可比较条件下生长的对照植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加营养缺失条件下生长的植物产量的方法，所述方法包括调节植物中编码POI多肽的核酸的表达。

本发明方法的实施赋予了盐胁迫条件下生长的植物相对于可比较条件下生长的对照植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加盐胁迫条件下生长的植物产量的方法，所述方法包括调节植物中编码POI多肽的核酸的表达。

本发明还提供了遗传构建体和载体，以利于在植物中引入和/或表达编码POI多肽的核酸。所述基因构建体可插入到载体中，所述载体可通过商业途径获得，适合于转化到植物中并适合于在所转化的细胞中表达目的基因。本发明还提供了本文定义的基因构建体用于本发明方法中的用途。

具体而言，本发明提供了构建体，其包含：

(a)编码如上文定义的POI多肽的核酸；

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(c)转录终止序列。

优选地，编码POI多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文定义。

本发明还提供了转化有如上描述的构建体的植物。具体而言，本发明提供了转化有如上描述的构建体的植物，所述植物具有如本文描述的增强的产量相关性状。

用包含如上述任一核酸的载体转化植物。技术人员熟知必须在载体上存在的遗传元件，以成功转化、选择并繁殖含有目的序列的宿主细胞。目的序列有效连接本发明载体中的一个或多个控制序列（至少连接启动子）。

在一个实施方案中，用包含如上述任一核酸的表达盒转化植物。技术人员熟知必须在表达盒上存在的遗传元件，以成功转化、选择并繁殖含有目的序列的宿主细胞。在本发明的表达盒中，目的序列有效连接一个或多个控制序列（至少连接启动子）。在该表达盒中的启动子可以是如上描述的核酸的非天然启动子，即启动子不调节所述核酸在其天然环境中的表达。

在其他实施方案中，当本发明的表达盒已经引入到所述植物细胞时，它们赋予活的植物细胞增加的产量或产量相关性状，并导致包含在表达盒中的如上定义的核酸的表达。本发明的表达盒可包含在宿主细胞、植物细胞、种子、农产品或植物中。

有利地，任何类型的启动子，无论天然的或合成的，均可用于驱动核酸序列的表达，但优选地所述启动子是植物来源。组成型启动子特别用于本发明方法。优选地，组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。对于多种启动子类型的定义可参阅本文的“定义”部分。也用于本发明方法的是根特异性启动子。一般地，“中等强度启动子”指驱动编码序列以比强启动子低的水平，尤其是以在所有情况下低于35S CaMV启动子控制下获得的水平表达的启动子。

应该清楚的是，本发明的适用性不限于SEQ ID NO:1代表的POI多肽编码核酸，或者本发明的适用性不限于当由组成型启动子驱动，或根特异性启动子驱动时POI多肽编码核酸的表达。

组成型启动子优选为中等强度启动子，更优选选自植物来源的启动子，如GOS2启动子，更优选是来自稻的PRO0129启动子。所述GOS2启动子有时候称为PRO129或PRO0129。进一步优选地，组成型启动子由与SEQ ID NO:38基本相似的核酸序列代表，最优选地，组成型启动子由SEQ ID NO:38代表。对于组成型启动子的其他实例参阅本文的“定义”部分。

任选地，一个或多个终止子序列可用于引入植物中的构建体。优选地，所述构建体包含这样的表达盒，其包含GOS2启动子和编码POI多肽的核酸。此外，编码选择标记的一个或多个序列可存在于引入到植物中的构建体上。

根据本发明的优选特征，受调节的表达是增强的表达或活性，例如POI多肽编码核酸分子的过表达，例如编码例如表A中显示的SEQ ID NO.:1、3、5、7、8、10、11、15、17、21或23或其旁系同源物或直向同源物的核酸分子的过表达。用于增强核酸或基因或基因产物表达的方法在本领域中得到了很好地记载，并且在定义部分中提供了实例。

如上提及，用于调节编码POI多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码POI多肽的核酸；然而，实施本方法的效果，即增强产量相关性状也可使用其他众所周知的技术，包括但不限于T-DNA激活标签、TILLING、同源重组来完成。在定义部分中提供了这些技术的描述。

本发明还提供用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括在植物中引入并表达编码如上文定义的POI多肽的任何核酸。

具体而言，本发明提供用于产生与失效对照植物相比具有增强的产量相关性状，特别是增加的种子产量、种子饱满率、根和苗生物量的转基因植物的方法，所述方法包括：

(i)在植物或植物细胞中引入并表达POI多肽编码核酸或包含POI多肽编码核酸的遗传构建体；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。

此外，该构建体对根生物量和种子饱满率的正面影响提示，该构建体也可赋予非生物胁迫，特别是干旱胁迫下对产量的正面影响。(i)的核酸是能够编码如本文定义的POI多肽的任何核酸。

核酸可直接引入植物细胞或植物本身中（包括引入植物的组织、器官或任何其他部分中）。根据本发明的优选特征，核酸优选通过转化引入植物中。在本文“定义”部分更详细地描述了术语“转化”。

在一个实施方案中，本发明清晰地延伸到本文所述任何方法产生的任何植物细胞或植物，及所有植物部分和其繁殖体。本发明包括通过本发明方法获得的植物或其部分（包括种子）。所述植物或其部分包含编码如上定义的POI多肽的核酸转基因。本发明还延伸到包括通过任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求是该后代显示与在本发明方法中亲本产生的那些相同的基因型和/或表型特征。

在另一实施方案中，本发明还延伸到在植物表达盒或植物表达构建体中包含本发明核酸分子的转基因植物细胞和种子。

在其他实施方案中，本发明的种子重组地包含本发明的表达盒、本发明的（表达）构建体、上述核酸和/或上述核酸编码的蛋白质。

本发明的其他实施方案延伸到植物细胞，其在重组植物表达盒中包含上述核酸。

在又一实施方案中，本发明的植物细胞是非繁殖细胞，例如使用标准细胞培养技术，所述细胞不能用于从该细胞再生为作为整体的整株植物，这些技术意味着细胞方法，不包括体外细胞核、器官或染色体转移方法。虽然植物细胞一般具有全能性特征，但是一些植物细胞不能用于从所述细胞再生或繁殖完整植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞就是这样的细胞。

在另一实施方案中，本发明的植物细胞是不能通过光合作用从无机物，如水、二氧化碳和无机盐合成碳水化合物和蛋白质而维持自身的植物细胞，即认为它们是非植物品种。在其他实施方案中，本发明的植物细胞是非植物品种和非繁殖性的。

本发明还包括含有编码如上文定义的POI多肽的分离核酸的宿主细胞。本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞，如大肠杆菌（E.coli）或农杆菌属种细胞、酵母细胞、真菌、藻类、或蓝细菌细胞或植物细胞的任何细胞。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞。用于本发明方法的核酸或载体、表达盒或构建体或载体的宿主植物原则上有利地是所有植物，其能够合成用于本发明方法的多肽。

在一个实施方案中，本发明的植物细胞过表达本发明的核酸分子。

本发明还包括用于生产产品的方法，其包括a)培养本发明的植物和b)从或通过本发明的植物或这些植物的部分，包括种子生产所述产品。在其他实施方案中，所述方法包括步骤a)培养本发明的植物，b)从所述植物中取出如上定义的可收获部分和c)从或通过本发明的可收获部分生产所述产品。

此类方法的实例可以是培养本发明的玉米植物，收获玉米穗轴，并取出玉米仁。这些可用作饲料或加工成作为农产品的淀粉和油。

可在已经培养植物的地点上生产产品，或可从已经培养植物的地点取出所述植物或其部分，以生产所述产品。通常，培养植物，从所述植物取出想要的可收获部分，如果可循环操作，从植物的可收获部分制备产品。培养植物的步骤可以仅在每次实施本发明方法时进行一次，同时允许重复产品生产步骤，例如通过重复取出本发明植物的可收获部分，并且需要时进一步加工这些部分以获得所述产品。也可以重复培养本发明植物的步骤，并且储存植物或可收获部分，直至后来为累积的植物或植物部分进行一次产品生产。同样，培养植物和生产产品的步骤可在时间上重叠、甚至在很大程度上同时或顺序地进行。一般地，在生产产品前培养所述植物一段时间。

有利地，本发明的方法比已知方法更有效，因为本发明的植物相比于可比较的方法中使用的对照植物具有增加的产量和/或对环境胁迫的增强胁迫耐受性。

在一个实施方案中，本发明所述方法生产的产品是植物产品，如但不限于粮食、饲料、食品补充剂、饲料添加剂、纤维、化妆品或药物。粮食被视为用于营养或补充营养的组合物。特别地，动物饲料和动物饲料添加剂被视为粮食。

在另一实施方案中，用于生产的本发明方法用于制备农产品，如但不限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂肪、油、聚合物、维生素等。

植物产品可能在很大程度上由一种或多种农产品组成。

在又一实施方案中，本发明的多核苷酸序列或多肽序列包含在农产品中。

在其他实施方案中，本发明的核酸序列和蛋白质序列可用作例如本发明方法产生的农产品的产品标记。该标记可用作鉴定有利方法生产的产品，因用于所述方法的植物材料和可收获部分的质量提高，不仅导致方法的更高效率，还导致产品的提高的质量。可通过本领域已知的多种方法，例如但不限于基于PCR的方法（对于核酸检测）或基于抗体的方法（对于蛋白质检测）检测此类标记。

本发明方法有利地可应用于任何植物。特别用于本发明方法的植物包括属于绿色植物超家族的所有植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或草料豆类、观赏植物、粮食作物、树木或灌木。根据本发明的优选实施方案，植物是农作物植物。农作物植物的实例包括大豆、甜菜、甜菜、向日葵、芸苔、菊苣、胡萝卜、木薯、苜蓿、三叶草、油菜、亚麻、棉花、番茄、马铃薯和烟草。进一步优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、黑麦、单粒小麦、画眉草、蜀黍和燕麦。

在一个实施方案中，用于本发明方法的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油菜，包括芸苔、甘蔗、甜菜和苜蓿。

在本发明的另一实施方案中，本发明的植物和用于本发明方法的植物是甜菜植物，其具有增加的生物量和/或甜菜的糖含量。

本发明还延伸到植物的可收获部分，如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码POI多肽的重组核酸。本发明还涉及来自，优选直接来自此类植物的可收获部分的产品，如干沉淀物或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明还包括编码如本文所述的POI多肽的核酸的用途，以及这些POI多肽在增强植物中任何上述产量相关性状中的用途。例如，编码本文所述POI多肽的核酸或POI多肽本身可用于育种程序，其中鉴定可遗传连接POI多肽编码基因的DNA标记。核酸/基因，或POI多肽本身可用于定义分子标记。该DNA或蛋白质标记然后可用于育种程序来选择在本发明方法中具有如上文定义的增强产量相关性状的植物。此外，POI多肽编码核酸/基因的等位变体可用于标记辅助育种程序。编码POI多肽的核酸也可用作遗传和物理作图基因的探针，所述基因是这些基因的部分，并作为连接这些基因的性状的标记。该信息可用于植物育种中，以培育具有想要的表型的株系。

在一个实施方案中，在

-比较SEQ ID NO:1的完整编码区域中的核酸的情况下，或

-比较SEQ ID NO:2全长中的多肽序列的情况下

进行任何比较，以确定序列同一性百分比。

例如，该实施方案中50%的序列同一性表示在SEQ ID NO:1的完整编码区中，在SEQ ID NO:1的序列与相关序列之间50%的所有碱基相同。类似地，在该实施方案中，当比较从起始甲硫氨酸到SEQ ID NO:2的序列结束时检测的多肽中发现了SEQ ID NO:2代表的序列50%的氨基酸残基时，多肽序列与SEQ ID NO:2的多肽序列具有50%的同一性。

在一个实施方案中，用于本发明方法、构建体、植物、可收获部分和产品中的核酸序列是编码POI的序列，但不包括编码在

1.表X1；或

2.表X2或

3.WO XXXXXXX,SEQ ID NO:AAA任何一项中公开的多肽序列的那些核酸。

在其他实施方案中，用于本发明的核酸序列是那些序列，其

●不是编码选自表A中列出的蛋白质，但不包括SEQ ID NO:8和24的那些蛋白质的多核苷酸和

●当与编码表A中列出的蛋白质的序列进行最佳比对时具有至少60、70、75、80、85、90、93、95、98或99%核苷酸同一性的那些多核苷酸。

项目：

1.用于增强植物相对于对照植物的产量的方法，其包括调节植物中多肽的活性，其中所述多肽包含至少一个SP、SPP、AP或PA基序。

2.项目1的方法，其包括调节植物中编码多肽的核酸的表达，其中所述多肽包含至少一个SP、SPP、AP或PA基序。

3.项目1或2的方法，其中所述多肽包含一个或多个以下基序：

(i)基序1:

G[VA]IAA[AV][CAG]V[VL]G[LF][GA][AG][LFM]V[YW][KR]KR[QR][QADE]NI[RQ]R[SA][RQ]YGY

(ii)基序2:M[SN][GS]GKKAG[IV][AV][VL,

(iii)基序3:

AR[RL]E[LI]L

4.项目2到3的方法，其中通过在植物中引入并表达编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)的核酸实现所述受调节的表达。

5.项目1到3任何一项的方法，其中所述多肽由包含选自以下的核酸分子的核酸分子编码：

(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23（任何一项）代表的核酸；

(ii)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23（任何一项）代表的核酸的互补序列；

(iii)优选地因遗传密码的简并性，编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或25到37（任何一项）代表的多肽的核酸，所述分离的核酸可来自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或25到37（任何一项）代表的多肽序列，并进一步优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(iv)核酸，其与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23的任何核酸序列以递增优选顺序有至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并进一步优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(v)核酸分子，其与(i)到(iv)的核酸分子在严格杂交条件下杂交，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(vi)编码所述多肽的核酸，所述多肽与任一SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、或25到37代表的氨基酸序列以递增优选顺序有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。

6.任何前述项目的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，优选种子饱满率、饱满种子数，苗和/或根生物量。

7.项目1到6任何一项的方法，其中在非胁迫条件下获得所述增强的产量相关性状。

8.项目1到6任何一项的方法，其中在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏条件下获得所述增强的产量相关性状。

9.项目2到8任何一项的方法，其中所述核酸有效连接组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。

10.项目1到9任何一项的方法，其中所述核酸分子或所述多肽分别是植物来源，优选来自双子叶植物，进一步优选来自杨柳科，更优选来自杨属，最优选来自毛果杨。

11.项目1到10任何一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码项目1到10任何一项中定义的所述多肽的重组核酸。

12.构建体，其包含

(i)编码项目1到10任何一项中定义的所述多肽的核酸；

(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

13.项目12的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。

14.项目12或13的构建体在产生这样的植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，优选种子饱满率、饱满种子数，苗和/或根生物量。

15.植物、植物部分或植物细胞，其转化有项目12或13的构建体。

16.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量，所述方法包括：

(i)在植物中引入并表达编码项目1到10任何一项中定义的所述多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

17.因编码所述多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物，或来自所述转基因植物的转基因植物细胞。

18.项目11、15或17的植物，或其来源的转基因植物细胞，其中所述植物是农作物植物，如甜菜、苜蓿、车轴草、菊苣、胡萝卜、木薯，或单子叶植物，如甘蔗，或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、黑麦、单粒小麦、画眉草、蜀黍和燕麦。

19.项目18的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为苗和/或根生物量和/或种子。

20.产品，其来自项目18的植物或来自项目19的植物的可收获部分。

21.编码项目1到10任何一项中定义的多肽的核酸在相对于对照植物增加产量，特别是种子饱满率、饱满种子数、苗和/或根生物量中的用途。

其他项目：

A.用于增强植物中相对于对照植物的产量的方法，其包括调节植物中多肽的活性，其中所述多肽包含至少一个SP、SPP、AP或PA基序并且其中所述多肽包含一个或多个以下基序：

(i)基序4(SEQ ID NO:44):

G[VA]I[VA]A[AV][CAG][MV][VL]G[LF][GA][AG][LFM]V[YW][KR]KR[QR][QADE]NI[RQ]R[SA][RDQ]YGY

(ii)基序2(SEQ ID NO:42):M[SN][GS]GKKAG[IV][AV][VL],

(iii)基序3(SEQ ID NO:43):

AR[RL]E[LI]L

(iv)基序1(SEQ ID NO:41):

G[VA]IAA[AV][CAG]V[VL]G[LF][GA][AG][LFM]V[YW][KR]KR[QR][QADE]NI[RQ]R[SA][RQ]YGY

B．项目A的方法，其包括调节植物中编码多肽的核酸的表达，其中所述多肽包含至少一个SP、SPP、AP或PA基序和项目A中定义的基序1到4中的至少一个或多个。

C．项目A或B的方法，其中所述多肽包含项目A中定义的所有基序2、3和4。

D．项目B到C的方法，其中通过在植物中引入并表达编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)的核酸实现所述受调节的表达。

E.项目A到C任何一项的方法，其中所述多肽由包含选自以下的核酸分子的核酸分子编码：

(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、11、15、17、21或23（任何一项）代表的核酸；

(ii)SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、11、15、17、21或23（任何一项）代表的核酸的互补序列；

(iii)优选地因遗传密码的简并性，编码SEQ ID NO:2、4、6、9、12、16、18、22、24或25到33或35到37（任何一项）代表的多肽的核酸，所述分离的核酸可来自SEQ ID NO:2、4、6、9、12、16、18、22、24或25到33或35到37（任何一项）代表的多肽序列，并进一步优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(iv)核酸，其与SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、11、15、17、21或23的任何核酸序列以递增优选顺序有至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并进一步优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(v)核酸分子，其与(i)到(iv)的核酸分子在严格杂交条件下杂交，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(vi)编码所述多肽的核酸，所述多肽与任一SEQ ID NO:2、4、6、9、12、16、18、22、24或25到33或35到37代表的氨基酸序列以递增优选顺序有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。

F.任何前述项目的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，优选种子饱满率、饱满种子数，苗和/或根生物量。

G.项目A到F任何一项的方法，其中在非胁迫条件下获得所述增强的产量相关性状。

H.项目A到F任何一项的方法，其中在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏条件下获得所述增强的产量相关性状。

I.项目B到H任何一项的方法，其中所述核酸有效连接组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。

J.项目A到I任何一项的方法，其中所述核酸分子或所述多肽分别是植物来源，优选来自双子叶植物，进一步优选来自杨柳科，更优选来自杨属，最优选来自毛果杨。

K.项目A到10任何一项的方法的获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码项目A到J任何一项中定义的所述多肽的重组核酸。

L.构建体，其包含

(i)编码项目A到J任何一项中定义的所述多肽的核酸；

(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

M.项目L的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。

N.项目L或M的构建体在制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，优选种子饱满率、饱满种子数，苗和/或根生物量。

O.植物、植物部分或植物细胞，其转化有项目L或M的构建体。

P.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量，所述方法包括：

(i)在植物中引入并表达编码项目A到J任何一项中定义的所述多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

Q.因编码所述多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物，或来自所述转基因植物的转基因植物细胞。

R.项目K、O或Q的植物，或其来源的转基因植物细胞，其中所述植物是农作物植物，如甜菜、苜蓿、车轴草、菊苣、胡萝卜、木薯，或单子叶植物，如甘蔗，或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、黑麦、单粒小麦、画眉草、蜀黍和燕麦。

S.项目R的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为苗和/或根生物量和/或种子。

T.产品，其产自项目R的植物或来自项目S的植物的可收获部分。

U.编码项目A到J任何一项中定义的多肽的核酸在相对于对照植物增加产量，特别是种子饱满率、饱满种子数、苗和/或根生物量中的用途。

V．生产产品的方法，其包括培养项目K、O的植物；和从或通过以下生产所述产品的步骤：

(i)所述植物；或

(ii)所述植物的部分，包括种子。

W．项目L或M的构建体，其包含在植物细胞中。

附图描述

现在将参考以下图描述本发明，其中：

图1显示了POI多肽的进化树。使用程序ClustalW(版本2.0.11)比对蛋白质。使用Dendroscope2.0.1(Hudson等;2007)绘制进化树。

图2代表了用于在稻（Oryza satva）中增强表达稻GOS2启动子(pGOS2)控制下的POI编码核酸的表达的二元载体。

实施例

本发明现将参考仅作为说明的下列实施例加以描述。下列实施例不意图彻底定义或限制本发明范围。

DNA操作：除非另外指出，根据（Sambrook（2001）MolecularCloning:a laboratory manual,3rd Edition Cold Spring HarborLaboratory Press,CSH,New York）或Ausubel等（1994）,CurrentProtocols in Molecular Biology,Current Protocols的卷1和卷2中所述的标准方案进行重组DNA技术。用于植物分子工作的标准材料和方法在BIOS Scientific Publications Ltd  （UK）和Blackwell ScientificPublications（UK）出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax（1993）中描述。

实施例1：鉴定SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关序列

使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具（BLAST）（Altschul等（1990）J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等（1997）Nucleic AcidsRes.25：3389-3402）在国家生物技术信息中心（NCBI）的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的相关序列（全长cDNA、EST或基因组的）。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。例如，用于SEQ ID NO:1的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分（E-值）排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率（E-值越低，命中的显著性越高）。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸（或多肽）序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸（或氨基酸）数目。在一些情况下，调整默认参数以调节搜索法的严格性。例如，E值可以增加以显示较低的严格性匹配。从而，可以鉴定短的几乎精确的匹配。

序列表提供了与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的核酸序列的列表；例如，选自表A：

表A：POI核酸和多肽的实例：

>P.trichocarpa_scaff_IX.1506            SEQ ID NO.:3和4

>P.trichocarpa_scaff_66.247        SEQ ID NO.:5和6

>G.max_GM06MC29142_sd54e1028469     SEQ ID NO.:7和8

>M.truncatula_TC137601     SEQ ID NO.:9和10

>S.lycopersicum_TC201936   SEQ ID NO.:11和12

>M.truncatula_TC134910     SEQ ID NO.:13和14

>A.thaliana_AT2G28440.1    SEQ ID NO.:15和16

>A.thaliana_AT3G45230.1        SEQ ID NO.:17和18

>O.sativa_TC296462             SEQ ID NO.:19和20

>Z.mays                        SEQ ID NO.:

>S.bicolor_Sb01g000890.1       SEQ ID NO.:21和22

>L.usitatissimum_LU04MC10504_6232693810500

                    SEQ ID NO.:23和24

以及SEQ ID NOs.:25至37中分别显示的多肽。

序列已经被试验性装配并被研究机构如基因组研究研究所（TIGR；以TA开始）公开。Eukaryotic Gene Orthologs（EGO）数据库可用于鉴定此类相关序列，通过关键词检索或者通过使用BLAST算法用目的核酸或多肽序列进行鉴定。如Joint Genome Institute已对特定生物建立了专门的核酸序列数据库。此外，进入专有数据库允许鉴定新的核酸和多肽序列。

实施例2：POI多肽序列的比对

使用MAFT(Katoh和Toh(2008).Briefings in Bioinformatics9:286-298.)进行多肽序列的比对。

使用渐进比对的ClustalW(2.0)算法(Thompson等(1997)NucleicAcids Res 25:4876-4882;Chenna等(2003).Nucleic Acids Res31:3497-3500)，以标准设置（慢比对，相似性矩阵：Gonnet(或Blosum 62(如果比对多肽)，空位开放罚分10，空位延伸罚分：0.2）进行多肽序列的比对。进行小的手工编辑以进一步优化比对。

可使用Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序提供的邻接聚类算法来构建POI多肽的系统树（图1）。

使用渐进比对的ClustalW(1.83/2.0)算法(Thompson等(1997)NucleicAcids Res 25:4876-4882;Chenna等(2003).Nucleic Acids Res31:3497-3500)，以标准设置（慢比对，相似性矩阵：Gonnet，空位开放罚分10，空位延伸罚分：0.2）进行多肽序列的比对。进行了小的手工编辑以进一步优化比对。

实施例3：多肽序列之间全局同一性百分比的计算

使用渐进比对的ClustalW 2.0算法(Thompson等(1997)Nucleic AcidsRes 25:4876-4882;Chenna等(2003).Nucleic Acids Res 31:3497-3500)，以默认设置来计算全长多肽序列之间全局相似性和同一性百分比。

用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利用本领域可用的方法之一MatGAT（矩阵全局比对工具）软件（（Campanella et al.,BMC Bioinformatics.20034:29.MatGAT:anapplication that generates similarity/identity matrices using protein orDNA sequences..Campanella JJ,Bitincka L,Smalley J;software hostedby Ledion Bitincka）来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法（空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2）进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62（对于多肽而言）计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。

实施例4：鉴定用于实施本发明的方法中的多肽序列中包含的结构域

使用MEME算法(Bailey和Elkan,Proceedings of the SecondInternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology,第28-36页,AAAI Press,Menlo Park,California,1994)鉴定基序。在MEME基序内的每一位置上，显示了存在于查询组序列中频率高于0.2的残基。在方括号内的残基代表备选项。

使用Pfam数据库鉴定结构域。

蛋白质家族、结构域和位点集成资源（Integrated Resouce of ProteinFamilies，Domain and Site，InterPro）数据库是基于文本和序列的搜索的通常所用标签数据库的集成界面。InterPro数据库组合了这些数据库，所述的数据库使用不同方法学和不同程度的有关已充分表征蛋白质的生物学信息以得到蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是一组多序列比对和覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的隐蔽马尔可夫模型。Pfam驻留于英国Sanger Institute的服务器。Interpro驻留于英国的欧洲生物信息研究所。

实施例5：POI多肽序列的拓扑学预测

TargetP 1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。位置分配是基于任何氨基端前序列的预测的存在：叶绿体转运肽（cTP）、线粒体靶向肽（mTP）或分泌途径信号肽（SP）。作为最终预测基础的记分并不实际是概率，并且它们未必合为一体。然而，具有最高记分的位置根据TargetP是最有可能的，并且记分之间的关系（可靠性类别）可以是预测的肯定性的一个指标。可靠性类别（RC）是1-5，其中1表示最强预测。TargetP在丹麦技术大学的服务器上维护。

对于预测含有氨基端前序列的序列，也可以预测潜在的切割位点。

选择了许多参数，如生物组（非植物或植物）、截断集合（无、预定的截断集合、或者用户定义的截断集合），和切割位点预测计算（是或否）。

众多其他算法可以用来执行此类分析，包括：

·在丹麦技术大学（Technical University of Denmar）服务器上驻留的ChloroP 1.1；

·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所（Institute forMolecular Bioscience,University of Queensland,Brisbane,Australia）的服务器上驻留的蛋白质Prowler亚细胞定位预测程序（Protein ProwlerSubcellular Localisation Predictor）第1.2版；

·在加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学（University ofAlberta,Edmonton,Alberta,Canada）的服务器上驻留的PENCE ProtemeAnalyst PA-GOSUB 2.5；

·在丹麦技术大学服务器上驻留的TMHMM。

·PSORT(URL:psort.org)

·PLOC(Park和Kanehisa,Bioinformatics,19,1656-1663,2003).

实施例6：克隆POI编码核酸序列

用定制的毛果杨幼苗cDNA文库(在pDONR222.1中;Invitrogen,Paisley,UK)作为模板通过PCR扩增核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件下，在50μl PCR混合物中使用200ng模板进行PCR。所用引物为prm17999(SEQ ID NO:39;正向,起始密码子用粗体表示):

5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgggtagcatcactggatt 3’

和prm17998(SEQ ID NO:40;反向，互补):

5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaataataattcagattcagagaatctc 3’,其包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。然后进行Gateway程序的第一步：BP反应，在该反应期间，PCR片段与pDONR201质粒在体内重组产生“进入克隆”（根据Gateway命名法）pPOI。质粒pDONR201购自Invitrogen作为

技术的一部分。

包含SEQ ID NO:1的进入克隆然后用于LR反应中，使用用于稻转化的目的载体。该载体在T-DNA边界内含有作为功能元件的：植物选择标记；筛选标记表达盒；和预期用于与已经克隆在进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的GOS2启动子位于该Gateway盒的上游。

LR重组步骤后，根据本领域公知的方法将所得的表达载体GOS2::POI转化到农杆菌菌株LBA4044中。

实施例7：植物转化

稻转化

含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70%乙醇中温育一分钟，随后在2%HgCl₂中30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2,4-D的培养基（愈伤组织诱导培养基）上萌发。在黑暗中温育4周后，将盾片衍生的胚发生性愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周而繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育（以增强细胞分裂活性）。

含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度（OD600）约1。将混悬液随后转移至培养皿并将愈伤组织在该混悬液内浸泡15分钟。愈伤组织组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃温育3日。共培育的愈伤组织在黑暗中于28℃在选择剂存在下于含有2,4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光线下温育后，胚发生潜力释放并且苗在随后4-5周发育。将苗从愈伤组织中切下并且在含有植物生长素的培养基上温育2-3周，其中将苗从所述的培养基上转移至土壤。硬化的苗在高湿度和短日照下于温室中培育。

一个构建体产生大约35个独立T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3-5月收获。该方法以高于50%的比率产生单一位点转化体（Aldemita和Hodges 1996，Chan等1993，Hiei等1994）。

实施例8：其他作物的转化

玉米转化

玉米的转化根据对Ishida等（1996.Nature Biotech 14745-50）描述方法的改良方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可操作用于转化和再生。近交系A188（明尼苏达大学）或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其他基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日（DAP）收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂（例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记）。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

小麦转化

小麦的转化用Ishida等Ishida等（1996）Nature Biotech 14（6）:745-50描述的方法进行。通常在转化中使用（可从墨西哥CIMMYT获得的）栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。在与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂（例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记）。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

大豆转化

根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack（从Illinois种子基金会可获得）通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌温育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

油菜/卡诺拉油菜转化

使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等（1998，Plant Cell Rep 17:183-188）转化。商业栽培品种Westar（Agriculture Canada）是用于转化的标准品种，但是也可以使用其他品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以（含有表达载体的）农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在含有3mg/l BAP、3%蔗糖、0.7%植物琼脂（Phytagar）的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀（300mg/l）的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5–10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培养基（含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5）。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基（MS0）。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

苜蓿转化

苜蓿的再生性克隆使用（McKersie等，1999 Plant Physiol119:839–847）的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander（Agriculture Canada）或如BrownDCW与A Atanassov（1985.Plant Cell Tissue Culture 4:111-112）描述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，RA3品种（威斯康星大学）已经被选择用于组织培养中（Walker等，1978Am J Bot 65:654-659）。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90（McKersie等，1999 PlantPhysiol 119:839–847）或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K₂SO₄和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天.外植体在半浓缩Murashige-Skoog培养基（Murashige和Skoog，1962）中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓缩Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

棉花转化

根据US 5,159,135中描述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。将棉花种子在20分钟内在3％次氯酸钠溶液中表面消毒并在含有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。然后将种子转移到含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中用于发芽。去除4到6天龄幼苗的下胚轴，切成0.5cm小块并置于0.8%琼脂上。农杆菌悬浮液（约108个细胞/ml，从用目的基因和合适的选择标记转化的过夜培养物稀释得到）用于接种下胚轴外植体。室温并光照下3天后，将组织转移到具有Murashige和Skoog盐与B5维生素（Gamborget al.,Exp.Cell Res.50:151-158（1968）），0.1mg/l 2,4-D,0.1mgl 6-糠胺嘌呤和750μg/ml MgCl₂,并具有用于杀死残留细菌的50到100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄西林的固体培养基（1.6g/l Gelrite）中。2到3个月（每4到6周传代培养）后分离各细胞系并进一步在选择培养基上培养用于组织扩增（30°C,16小时光周期）。转化的组织随后在2到3个月内在非选择培养基上进一步培养以产生体细胞胚。将具有至少4mm长度的看起来健康的胚转移到具有细小蛭石中SH培养基的管中，补充0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠胺嘌呤和赤霉酸。然后在30°C以16小时光周期培养胚，并将2到3片叶阶段的小植株转移到具有蛭石和营养物的盆中。植物变硬并随后移入温室中用于进一步培养。

甜菜转化

在70%乙醇中一分钟随后在20%次氯酸盐漂白剂例如

常规漂白剂（可商业购于Clorox,1221 Broadway,Oakland,CA 94612,USA）中振荡20分钟对甜菜（甜菜）种子进行灭菌。用无菌水冲洗种子并空气干燥，随后置于萌发培养基（Murashige和Skoog(MS)基础培养基（见Murashige,T.,和Skoog,.,1962.A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant,卷15,473-497），其包括B5维生素（Gamborg等;Nutrient requirements of suspension culturesof soy-bean root cells.Exp.Cell Res.,vol.50,151-8.）并添加有10g/l蔗糖和0.8%琼脂）上。根据Hussey和Hepher(Hussey,G.,和Hepher,A.,1978.Clonal propagation of sugarbeet plants and the formation of polylpoids bytissue culture.Annals of Botany,42,477-9)，基本上将下胚轴组织用于开始苗培养，并维持在添加有30g/l蔗糖加0.25mg/l苯甲基氨基嘌呤和0.75%琼脂的pH值为5.8的MS基础培养基上，23-25°C及16小时光周期下。

携带选择性标记基因，例如nptII的双元质粒的根癌农杆菌菌株用于转化实验。转化前一天，含抗生素的液体LB培养物在摇床(28°C,150rpm)中生长至600nm处光密度(O.D.)达到~1。将过夜生长的细菌培养物离心并在含乙酰丁香酮，pH值为5.5的接种培养基中重悬浮(O.D.~1)。

将苗底部组织切成小块（约1.0cm x 1.0cm x 2.0mm）。将组织浸泡在液体细菌接种培养基中30秒。通过滤纸印迹除去多余的液体。在含30g/l蔗糖的MS基础培养基上进行共培养24-72小时，随后是含MS基础培养基、30g/l蔗糖及含有用于诱导苗发育的1mg/l BAP和用于消灭农杆菌的头孢噻肟的非选择性周期。3-10天后，将外植体转移至含有例如卡那霉素或G418（50-100mg/l基因型依赖性的）的相似的选择性培养基上。

每2-3周将组织转移至新鲜培养基上以维持选择压力。苗的非常快速的出现（3-4天后）表明现有分生组织的再生，而非新发育出的转基因分生组织的器官发生。继代培养几轮后，将小苗转移至含5mg/l NAA和卡那霉素或G418的根诱导培养基上。进行额外步骤以减小产生嵌合的转化植株（部分转基因的）的可能性。来自再生苗的组织样本用于进行DNA分析。

用于甜菜的其他转化方法为本领域内所知，例如Linsey和Gallois(Linsey,K.,和Gallois,P.,1990.Transformation of sugarbeet(Betavul-garis)by Agrobacterium tumefaciens.Journal of ExperimentalBotany;卷41,No.226;529-36)的那些方法或在如以WO9623891A公开的国际申请中公开的方法。

甘蔗转化

从六月龄的田间生长的甘蔗植株上分离纺锤体（参阅Arencibia A.,等,1998.An efficient protocol for sugarcane(Saccharum spp.L.)transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens.TransgenicResearch,卷7,213-22;Enriquez-Obregon  G.,等,1998.Herbicide-resistant sugarcane(Saccharum officinarum L.)plants byAgrabac-terium-mediated transformation.Planta,卷206,20-27）。通过在20%次氯酸盐漂白剂例如

常规漂白剂（可商购于Clorox,1221Broadway,Oakland,CA 94612,USA）中浸泡20分钟对材料进行灭菌。将约0.5cm的横切片顶部朝上置于培养基上。植物材料在含有B5维生素（Gamborg等;Nutrient requirements of suspension cultures of soy-beanroot cells.Exp.Cell Res.,卷50,151-8.）并添加有20g/l蔗糖、500mg/l酪蛋白水解物、0.8%琼脂和5mg/l 2,4-D的MS基础培养基（Murashige,T.,和Skoog,.,1962.A revised medium for rapid growth and bioassays withtobacco tissue cultures.Physiol.Plant,卷15,473-497）上23°C黑暗中培养4周。4周后将培养物转移至相同的新鲜培养基上。

携带含有选择性标记基因例如hpt的双元质粒的根癌农杆菌菌株用于转化实验。转化前一天，含抗生素的液体LB培养物在摇床(28°C,150rpm)中生长至600nm处光密度(O.D.)达到～0.6。将过夜生长的细菌培养物离心并在含乙酰丁香酮pH值为5.5的MS基础培养基中重悬浮(O.D.~0.4)。

根据致密结构且为黄色的形态特征分离甜菜胚胎发生的愈伤组织块(2-4mm)，并在通风橱中干燥20分钟，随后在液体细菌接种培养基中浸泡10-20分钟。通过滤纸印迹除去多余的液体。共培养在暗中滤纸上进行3-5天，所述滤纸置于含B5维生素和1mg/l 2,4-D的MS基础培养基上。共培养后，用无菌水洗涤愈伤组织，随后在含500mg/l头孢噻肟的相似培养基上进行非选择性周期用于消除农杆菌。3-10天后，将外植体转移至含B5维生素、1mg/l 2,4-D和25mg/l潮霉素（基因型依赖性的）的MS基础选择培养基上再培养3周。所有处理在23°C黑暗条件下进行。

抗性愈伤组织在16小时光周期下缺少2,4-D但是包括1mg/l BA和25mg/l潮霉素的培养基上进一步培养，导致苗结构的发育。分离出苗并在选择性生根培养基（含20g/l蔗糖、20mg/l潮霉素和500mg/l头孢噻肟的MS基础培养基）上培养。

来自再生苗的组织样品用于进行DNA分析。

用于甘蔗的其他转化方法为本领域所知，例如来自以WO2010/151634A公布的国际申请和授权欧洲专利EP1831378中的方法。

实施例9:表型评估步骤

9.1评估设置

产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室中用于生长和收获T1种子。保留6个事件，其中T1后代对于转基因的存在/缺失以3:1分离。对于每个这些事件，通过监测可见标记表达选择约10个含有转基因的T1幼苗（杂合子和纯合子）和约10个缺少该转基因的T1幼苗（失效合子）。转基因植物和对应的失效合子在随机的位置上并排生长。温室条件是短日照（12小时光照），光照中28°C，黑暗中22°C，和70％的相对湿度。以固定时间间隔对在非胁迫条件下生长的植物浇水，以确保水份和营养物不受限并满足植物完成生长和发育所需。

从播种阶段到成熟阶段，植物通过数字成像箱几次。在每个时间点，从至少6个不同角度对每株植物拍下数字图像（2048x1536像素，1600万色彩数）。

干旱筛选

在正常条件下在花盆土中培养来自T2种子的植物，直到其接近抽穗期。然后将其转移到“干燥”区域，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量（SWC）。当SWC低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培（植物成熟、种子收获）与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。详细记录正常条件下培养的生长和产量参数。

氮使用效率筛选

来自T2种子的稻植物在除了营养溶液之外的正常条件下生长与盆栽土壤中。花盆从移植到成熟用特定营养溶液浇灌，该溶液含有减少的氮（N）含量，通常低7到8倍。培养的剩余部分（植物成熟，种子收获）与不在非生物胁迫条件下生长的植物相同。如对正常条件下生长详述的记录生长和产量参数。

盐胁迫筛选

植物生长在由椰子纤维和argex（3:1比例）组成的基质上。将小植株移植到温室后前两周内使用正常的营养物溶液。前两周后，向营养物溶液加入25mM盐（NaCl），直到收获植物。然后测量种子相关的参数。

9.2统计学分析：F-检验

将双因子ANOVA（方差分析）用作植物表型特征的总体评估的统计学模型。对用本发明的基因转化的所有事件的所有植物测量的所有参数进行F-检验。进行F-检验以检查基因在所有转化事件中的效果并验证该基因的总体效果，也称作总体基因效果。F检验的真实总体基因效果的显著性阈值设为5％概率水平。显著F－检验值指向基因效果，表示并不仅仅是该基因的存在或其位置引起表型差异。

9.3测量的参数

生物量相关的参数测量

从播种阶段到成熟阶段，植物通过数字成像箱几次。在每个时间点，从至少6个不同角度对每株植物拍下数字图像（2048x1536像素，1600万色彩数）。

通过对来自地上植物部分的数字图像上区别于背景的像素总数计数来确定植物地上部分面积（或者叶子生物量）。该值对在相同时间点从不同角度拍摄的图像平均并通过校正转化为物理表面值，其以平方mm表示。实验表明以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是植物达到其最大叶子生物量的时间点时测量的面积。早期萌发势是萌发后三周的植物（幼苗）地上部分面积。根生物量的增加表示为总根生物量的增加（测量为在植物寿命中观察到的根的最大生物量）；或者表示为根/苗指数的增加（测量为在根和苗的活跃生长期中根质量和苗质量之间的比值）。

植物高度的有力指示是测定重力，即测定多叶生物量重力中心的高度（mm表示）。这基于曲线拟合的渐近线，避免了单一直立叶片的影响，或者如果该拟合不符合要求，可基于绝对最大值。

通过对来自地上植物部分的区别于背景的像素总数计数确定早期萌发势。该值对在相同时间点从不同角度拍摄的图像平均并通过校正转化为物理表面值，以平方mm表示。下文描述的结果是萌发后三周的植物的结果。

种子相关的参数测量

将成熟的总圆锥花序收获，计数，装袋，用条形码标记，然后在烘箱中37°C下干燥3天。然后将圆锥花序脱粒并收集和计数所有种子。用鼓风装置分离饱满的外壳与空壳。丢弃空壳并再次计数剩余的部分。在分析天平上对饱满外壳称重。通过计数分离步骤后剩余的饱满外壳数来确定饱满种子数。通过对从植物收获的所有饱满外壳称重来测量总种子产量。通过对从植物收获的外壳数目计数测量每株植物的总种子数。从计数的饱满种子数和它们的总重量外推千粒重（TKW）。本发明中的收获指数（HI）定义为总种子产量和地上部分面积（mm²）之间的比值，再乘以因数10⁶。每个圆锥花序的总花数在本发明中定义为种子总数和成熟总圆锥花序数目的比值。如本文定义的种子饱满率是饱满种子数在种子（或小花）总数中占的比例（表示为％）。

实施例10：转基因植物表型评估结果

在下文中呈现了在非胁迫条件下T1代转基因稻植物的评估和含SEQID NO:1中最长可读框的核酸的表达的评估结果。对于转基因植物产生的详细信息参阅上述实施例。

在下文中呈现了转基因水稻植物在非胁迫条件下的评估结果。观察到地上生物量(AreaMax)、萌发势（早期萌发势）、总种子产量、饱满种子数、饱满率、每圆锥花序的花数、收获指数（至少高于）5%的增加和千粒重至少(2.5-3)%的增加。

在组成型启动子GOS2下过表达POI的转基因植物相比于失效对照植物显示增加的产量。具体而言，转基因植物显示具有整体正面影响的增加的根和苗生物量。在YIELD筛选下在稻中过表达POI的影响是增加地上部分生物量（总面积最大值，总体影响为9.1%(0.0008)）、萌发势的总体影响为16.2%(0.0172)、根生物量（根最大值，总体影响为5.9%(0.0269)）、植物高度最大值，总体影响为6.6%(0.0000)、每个圆锥花序的花数，总体增加影响为15.2%(0.0124)、种子饱满率，总体增加影响为10.6%(0.0017)、增加的总种子产量重量，总体增加影响为11.5%(0.0336)。

因为该蛋白质在胁迫下的预期功能和对根生物量的正面影响，预期过表达该蛋白质可以导致更强的干旱耐受性。

Claims (24)

1.用于相对于对照植物增强植物中产量的方法，其包括调节植物中多肽的活性，其中所述多肽包含至少一个SP、SPP、AP或PA基序并且其中所述多肽包含一个或多个以下基序：

(i)基序4(SEQ ID NO:44):G[VA]I[VA]A[AV][CAG][MV][VL]G[LF][GA][AG][LFM]V[YW][KR]KR[QR][QADE]NI[RQ]R[SA][RDQ]YGY，

(ii)基序2(SEQ ID NO:42):M[SN][GS]GKKAG[IV][AV][VL]，

(iii)基序3(SEQ ID NO:43):

AR[RL]E[LI]L，

(iv)基序1(SEQ ID NO:41):G[VA]IAA[AV][CAG]V[VL]G[LF][GA][AG][LFM]V[YW][KR]KR[QR][QADE]NI[RQ]R[SA][RQ]YGY。

2.权利要求1的方法，其包括调节植物中编码多肽的核酸的表达，其中所述多肽包含至少一个SP、SPP、AP或PA基序和权利要求1中定义的基序1到4中的至少一个或多个。

3.权利要求1或2的方法，其中所述多肽包含权利要求1中定义的所有基序2、3和4。

4.权利要求2到3的方法，其中通过在植物中引入并表达编码富羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)的核酸实现所述受调节的表达。

5.权利要求1到3任何一项的方法，其中所述多肽由包含选自以下的核酸分子的核酸分子编码：

(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、11、13、15、17、19、21或23（任何一项）代表的核酸；

(ii)SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、11、13、15、17、19、21或23（任何一项）代表的核酸的互补序列；

(iii)优选地由于遗传密码的简并性，编码SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到33或35到37（任何一项）代表的多肽的核酸，所述分离的核酸可来自SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到33或35到37（任何一项）代表的多肽序列，并进一步优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(iv)核酸，其与SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、11、13、15、17、19、21或23的任何核酸序列具有以递增优选顺序至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并进一步优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(v)核酸分子，其与(i)到(iv)的核酸分子在严格杂交条件下杂交，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；

(vi)编码所述多肽的核酸，所述多肽与SEQ ID NO:2、4、6、9、12、14、16、18、20、22、24或25到33或35到37（任何一项）代表的氨基酸序列具有以递增优选顺序至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。

6.任一前述权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，优选种子饱满率、饱满种子数，苗和/或根生物量。

7.权利要求1到6任何一项的方法，其中在非胁迫条件下获得所述增强的产量相关性状。

8.权利要求1到6任何一项的方法，其中在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏条件下获得所述增强的产量相关性状。

9.权利要求2到8任何一项的方法，其中所述核酸有效连接组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。

10.权利要求1到9任何一项的方法，其中所述核酸分子或所述多肽分别是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自杨柳科，更优选来自杨属，最优选来自毛果杨。

11.通过权利要求1到10任何一项的方法获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码权利要求1到10任何一项中定义的所述多肽的重组核酸。

12.构建体，其包含：

(i)编码权利要求1到10任何一项中定义的所述多肽的核酸；

(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

13.权利要求12的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。

14.权利要求12或13的构建体在制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，优选种子饱满率、饱满种子数，苗和/或根生物量。

15.用权利要求12或13的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

16.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量，所述方法包括：

(i)在植物中引入并表达编码如权利要求1到10任何一项中定义的所述多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

17.植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述植物由于编码所述多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量。

18.权利要求11、15或17的植物，或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是农作物植物，如甜菜、苜蓿、车轴草、菊苣、胡萝卜、木薯，或单子叶植物，如甘蔗，或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、黑麦、单粒小麦、画眉草、蜀黍和燕麦。

19.权利要求18的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为苗和/或根生物量和/或种子。

20.产品，其来自权利要求18的植物或来自权利要求19的植物的可收获部分。

21.编码权利要求1到10任何一项中定义的多肽的核酸在相对于对照植物增加产量，特别是种子饱满率、饱满种子数、苗和/或根生物量中的用途。

22.生产产品的方法，其包括培养权利要求11、15、17或18的植物并从或通过：

(i)所述植物；或

(ii)所述植物的部分，包括种子

生产所述产品的步骤。

23.权利要求12或13的构建体，其包含在植物细胞中。

24.任一前述权利要求，其中所述核酸编码这样的多肽，其不是选自SEQ ID NOs:14、20和34代表的序列的多肽。

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