具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例所使用的主要试剂盒和药品为:RNAplant Reagent(TIANGEN),RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN),SuperScriptTM First-Strand Synthesis System(Invitrogen),LR Clonase II enzyme Mix(Invitrogen),pCRTM8/GW/TOPOT M vector(Invitrogen),TaKaRa LA Taq(TaKaRa),TaKaRa Taq(TaKaRa),pMD-19T(TaKaRa),5’-Full RACE Kit(TaKaRa),3’-Full RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa),所有引物合成及测序工作均由Invitrogen(上海)完成。其他未作出说明的均为常规要求。
实施例1895杨cDNA模板的准备
可按常规方法准备895杨cDNA,也可以采用如下方法准备:
总RNA的粗提:吸取1mL RNAplant Reagent裂解液于2mL离心管中,将适量经液氮研磨精细的南林895杨根材料加入其中,涡旋并充分混匀;室温水平放置离心管5-10min,彻底裂解核蛋白;4℃12000rmp离心2-5min,转移上清液至新的离心管;加入0.2mL 5M NaCl,轻轻混匀;再加入0.3mL氯仿,上下颠倒混匀;4℃12000rmp离心10min,转移上清液至新的离心管;重复氯仿抽提;加与所得上清液等体积的异丙醇,混匀,室温静置10min;4℃12000rmp离心10min,弃上清液;加入0.5mL新鲜配置的RLT buffer(1mL RLT加10μL β-巯基乙醇),彻底涡旋;加入250μL无水乙醇,吹打混匀;将混合液转移至收集柱RNeasy mini column(Pink)中,12000rmp离心15s,弃滤液,离心管可重复使用;在收集柱RNeasy mini column中加入350μL RWI buffer,12000rmp离心15s,弃滤液和离心管;将新鲜配置的80μL DNase I incubation mix加入收集柱RNeasy mini colum膜中央,室温静置15min;在收集柱RNeasy minicolumn中加入350μL RWI buffer,12000rmp离心15s,弃滤液和离心管;将收集柱RNeasy mini column放入新的离心管,加500μL buffer RPE,12000rmp离心15s,弃滤液;重新加入500μL buffer RPE,12000rmp离心2min,弃滤液和离心管;将收集柱RNeasy mini column放入新的离心管,13000rmp离心1min;将收集柱RNeasy mini column放入新的RNA收集离心管,加入适量RNase-free water到膜中央,静置1min,12000rmp离心1min;将滤液重新加入收集柱RNeasy mini column,12000rmp离心1min,回收滤液,即得总RNA;用紫外分光光度计检测确定RNA浓度,琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,确认质量完好。
总RNA的纯化:将总RNA的体积用RNase-free水调整到100μL(确保RNA总量不超过100μg);加入350μL RLT工作液(1mL RLT加10μLβ-巯基乙醇),充分混匀;加入250μL无水乙醇,充分混匀(不要离心);将700μL混合液将到QIAGEN纯化柱中,12000rmp,离心15s;弃滤液,加入500μL工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成),12000rmp,离心15s;弃滤液,重新加入500μL工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成),12000rmp,离心2min;将纯化柱放入新的离心管,最大转速离心1min;将纯化柱重新放入新的RNA收集离心管,在纯化柱膜中央加适量RNase-free水,室温静置1min,最大转速离心1min;回收滤液即得纯化RNA样品;
第一链cDNA合成:采用SuperScriptTM First-Strand Synthesis System(Invitrogen),以Oligo DT-Adaptor Primer引物引发进行第一链cDNA的合成。具体操作如下:
准备RNA/Primer混合液:1μg南林895杨Total RNA,1μL Oligo DT-Adaptor Primer(50ng/μL),1μL 10mM dNTP mix,加DEPC-treated water到10μL;65℃温浴5min,而后迅速放置冰上至少1min;配制反转录混合液,依次加入试剂:2μL 10×RT buffer、4μL 250nnM MgCl2、2μL 0.1M DTT、1μL RNase OUTTM(40U/μL)、1μL SuperScriptTM RT(200U/μL);将10μL反转录混合液加入10μL RNA/Primer混合液中,轻轻混匀,短暂离心;进行反转录程序:25℃,10min,50℃,50min,85℃,5min(终止反应),然后置于冰上;加1μL RNase H,混匀,短暂离心,37℃温浴20min;冰上冷却后使用灭菌Milli-Q水1∶50稀释后(~10ng/μL)-20℃保存备用。
实施例2通过RACE技术克隆PeWOX11a基因
以实施例1制备的895杨cDNA为模板,使用特异性引物来扩增PeWOX11b基因短片段,其中,扩增PeWOX11b短片段正向引物为:5’AACGCCAGATGCAAGCTAGT 3
扩增PeWOX11b短片段反向引物为:5’TCTGTTGGAACCCCATTGAT 3
高保真PCR反应体系如下:10×LA PCR Buffer(Mg
2+ free)5.0μL;2.5mM dNTP Mixture 8.0μL;25mM Mg
2+ 5.0μL;LA Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL;正向引物(10μM)2μL;反向引物(10μM)2μL;模板(895杨cDNA)1μL;加无菌ddH
2O补足50μL。反应程序:预变性94℃,3min;94℃,40s,55℃,30s,72℃,30s,35个循环;72℃,10min。对产物测序,获得的PeWOX11a基因短片段序列如SEQ NO3所示。
依据上述PeWOX11a基因短片段序列设计3’末端的RACE引物,进行3’RACE,获得3’cDNA末端片段,克隆入T-载体,对插入片段进行PCR筛选后进行测序,在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中Blast确认上述片段与其它植物相关的基因同源。以相同的方法,根据获得的正确的3’cDNA末端片段序列设计5’末端的RACE引物,进行5’RACE,获得5’cDNA末端片段,克隆入T-载体,对插入片段进行PCR筛选后进行测序。主要引物和过程如下:
3’RACE 引物:3′RACE gene-specific outer primer:5′ATAATCAACGGGCATACGATAGC 3
3′RACE gene specific inner primer:5′CTTGTTTTCTTTCTCTAACCAGArGGGT 3
3′RACE Outer Primer:5′GCGAGCACAGAATTAATACGACT 3
3′RACE Inner Primer:5′CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG 3
3′RACE反应程序:
根据3’-Full RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa)Protocol进行。
反转录(Reverse Transcription):将表1成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中,轻轻混匀,短暂离心,42℃温育1h,72℃温育15min;进入PCR步骤,或-20℃保存反应物。
表1反转录反应体系
南林895杨Total RNA(实施例1制备) |
1μg |
dNTP Mix(10mM each) |
1μL |
3′RACE Adapter(5μM) |
1μL |
5×M-MLV Buffer |
2μL |
RNase Inhibitor(40U/μL) |
0.25μL |
Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(200U/μL) |
0.25μL |
Nuclease-free Water |
to 10μL |
3′RACE巢式PCR:反应体系如表2所示,反应程序为:94℃,3min;94℃,30s,60℃,30s,72℃,1min,35个循环;72℃,7min。
表23′RACE巢式PCR的反应体系
纯化片段与克隆载体的连接反应:采用TaKaRa公司的pMD19-T simple Vetor克隆目的DNA分子,参考说明书,连接反应体系与程序稍有改进,具体为:5μL反应体系:2.2μL纯化回收的PCR产物,0.3μL pMD-19 Simple Vector,2.5μL Solution I。反应条件:16℃30min;4℃过夜。
大肠杆菌转化:将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化;取5μL纯化片段与克隆载体的连接产物,加入到100μL感受态细胞中,并轻轻混匀,冰浴30min左右;42℃水浴中热击90s,迅速置于冰上3-5min;加入800μL LB液体培养基,37℃&100rmp摇菌1h;4000rmp离心3min,吸掉上层800μL培养基,混匀剩余菌液;将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上,37℃倒置培养过夜。
阳性克筛选及测序分析:从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中,37℃&250rmp摇菌过夜;直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。反应体系如表3所示。反应程序为:94℃,3min;94℃,30s,60℃,30s,72℃,1min,28个循环;72℃,7min。菌液PCR检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司(上海)测序鉴定,得3’cDNA末端片段序列,如SEQNO6所示。在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中,Blast确认上述3’cDNA末端片段序列片段与拟南芥/水稻AtWOX11/OsWOX11基因高度同源。
表3PCR检测反应体系
10×PCR Buffer(Mg2+ free) |
2.0μL |
MgCl2(25mM) |
1.5μL |
dNTP Mixture (each 2.5mM) |
1.3μL |
3′RACE gene specific inner primer(10μM) |
1.0μL |
3′RACE Inner Primer(10μM) |
1.0μL |
菌液 |
0.1μL |
TaKaRa Taq |
1.0μL |
Milli-Q Water |
12.1μL |
Total volume |
20.0μL |
5′RACE反应引物:5′RACE Outer Primer:5′CATGGCTACATGCTGACAGCCTA 3
5′RACE Inner Primer:5′CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG 3
5′RACE gene-specific outer primer:5′CCCATTGATGAAGATTGTGATGC 3
5′RACE gene specific inner primer:5′GCAAACCCATTAGAAGTGCCACC 3
5′RACE反应程序:
根据5’-Full RACE Kit(TaKaRa)Protocol进行。
RNA处理(RNA Processing):CIP反应,将表4成分加入到RNase-free的小离心管中,轻轻混匀,短暂离心;37℃温育1h;加入表5试剂到CIP反应离心管,充分涡旋,室温高速离心(≥10000g)5min;转移上层水相到一个新的离心管中,加入150μL氯仿,充分涡旋,室温高速离心(≥10000g)5min;转移上层水相到一个新的离心管中,加入150μL异丙醇,充分涡旋,冰浴10min;高速离心(≥10000g)20min,用0.5mL预冷的70%乙醇冲洗沉淀,最大转速离心5min,小心弃乙醇,气干沉淀;以11μLNuclease-free Water重悬沉淀,即得CIP’RNA,冰上放置进一步用于TAP反应,或者-20℃保存。
表4CIP反应体系
Total RNA |
10μg |
10×CIP buffer |
2μL |
Calf Intestine Alkaline Phosphatase(CIP) |
2μL |
Nuclease-free Water |
to 20μL |
表5CIP反应试剂
Ammonium Acetate Solution |
15μL |
Nuclease-free Water |
115μL |
acid phenol:chloroform |
150μL |
TAP反应:把表6成分加入到一个RNase-free的小离心管中,轻轻混匀,短暂离心,37℃温育1h,即得CIP/TAP-treated RNA;进入接头连接步骤,或-20℃保存反应物。
表6TAP反应体系
CIP’d RNA(from fabove) |
5μL |
10×TAP buffer |
1μL |
Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP) |
2μL |
Nuclease-free Water |
2μL |
Total volume |
10μL |
5′RACE接头连接:把表7成分加入到一个RNase-free的小离心管中,轻轻混匀,短暂离心,37℃温育1h,即得Ligated RNA;进入反转录步骤,或-20℃保存反应物。
表75′RACE接头连接体系
CIP/TAP-treated RNA |
2μL |
5′RACE Adapter |
1μL |
10×RNA Ligase Buffer |
1μL |
T4RNA Ligase(2.5U/μL) |
2μL |
Nuclease-free Water |
4μL |
反转录:将表8成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中,轻轻混匀,短暂离心;42℃温育1h,即得RT reaction;进入PCR步骤,或-20℃保存反应物。
表85′RACE反转录体系
Ligated RNA |
2μL |
dNTP Mix |
4μL |
Random Decamers |
2μL |
10×RT Buffer |
2μL |
RNase Inhibitor |
1μL |
M-MLV Reverse Transcfiptase |
1μL |
Nuclease-free Water |
to 20μL |
5′RACE巢式PCR,反应体系、反应条件与3′RACE的巢式PCR一致。
PCR产物克隆测序,与3′RACE克隆一致,得5’cDNA末端片段序列,如SEQ NO7所示。在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中,Blast确认上述片段与拟南芥/水稻AtWOX11/OsWOX11基因高度同源。
采用BioEdit软件对3′RACE和5′RACE序列进行比对拼接,并使用FGENESH(
http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic=fgen)预测其阅读框。根据基因全长序列设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子),再次进行PeWOX11b基因的全长扩增和测序验证。PeWOX11b全长cDNA序列为960bp,包含一个747bp的完整阅读框,序列如SEQ NO1所示。PeWOX11b基因的表达蛋白,氨基酸序列如SEQ NO2所示。其中,PeWOX11b ORF正向引物为:5′ATGGAAGATAATCAAGGCCAAGAC 3
PeWOX11b ORF反向引物为:5′TTAGGCTGTTCTTGAAACCAGGA 3′。高保真PCR反应体系如下:10×LA PCR Buffer(Mg
2+ free)5.0μL;2.5mM dNTP Mixture 8.0μL;25mM Mg
2+ 5.0μL;LATaq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL;正向引物(10μM)2μL;反向引物(10μM)2μL;模板(895杨cDNA)1μL;加无菌ddH
2O补足50μL。反应程序:预变性94℃,3min;94℃,40s,55℃,30s,72℃,30s,35个循环;72℃,10min。
实施例2WOX11a基因植物表达载体构建
利用通路克隆技术构建PeWOX11b基因的过量表达载体。使用特异PCR引物(实施例1的PeWOX11b ORF引物),以895杨cDNA为模板,进行PCR扩增,将PeWOX11b基因ORF构建到入门载体。入门载体为pCRTM8/GW/TOPOT M vector(Invitrogen)。反应体系为:Fresh PCR product(purified)10-20ng;Salt solution 1μL;pCRTM8/GW/TOPOTM vector 1μL;加无菌ddH2O补足6μL。反应程序为:室温静置30min。
大肠杆菌转化:将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化;将6μl连接产物,加入到100μl感受态细胞中,并轻轻混匀,冰浴30min左右;42℃水浴中热击90sec,迅速置于冰上3-5min;加入800μl LB液体培养基,37℃,100rmp摇菌1h;4000rmp离心3min,吸掉上层800μl培养基,混匀剩余菌液;将菌液涂抹于含有spc的LB筛选培养板上,37℃倒置培养过夜。
从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证,带PeWOX11b基因的入门载体与植物表达载体pH5GS进行LR反应。反应体系为:linearized entry clone 100ng;purified destination vector(100ng/μL)1.5μL;LR ClonaseII enzyme mix 2μL;加TE(pH 8.0)补足10μL;。反应条件:25℃1h。经LR反应后PeWOX11a基因交换至植物表达载体pH35GS中,载体质粒如图1所示,在PeWOX11b基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S,它能使PeWOX11b基因在杨树体内高效表达;在PeWOX11b基因的3’端组装了强终止子NOST,可有效终止PeWOX11b基因的转录;在载体质粒上组装HPT基因表达盒,作为转基因杨树的筛选标记,可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选;在载体质粒组装LB和RB序列,促使组装于其间的PeWOX11b基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。通过PCR检测及测序验证,确认过量表达载体构建成功,命名为pH35GS-PeWOX11b,该基因位于启动子P35S之后,在启动子P35S的驱动下,PeWOX11b可在杨树体内高效表达。
实施例3PeWOX11b基因的遗传转化
通过液氮冻融法将所构建的pH35GS-PeWOX11b过量表达载体转入农杆菌菌株EHA105(Invitrogen),通过农杆菌介导将PeWOX11b基因转入杨树。结果如图2~7所示,其中,图2为过量表达PeWOX11b基因的转基因杨半定量检测;图3为过量表达PeWOX11b基因的转基因杨与未转基因杨的整体形态比较,图中,左边为未转基因杨,右边为转基因杨;图4为过量表达PeWOX11b基因的转基因杨与未转基因杨的根形态比较,图中,左边未转基因杨,右边为转基因杨;图5为过量表达PeWOX11b基因的转基因杨继代培养苗10周后茎上产生异位根;图6为过量表达PeWOX11b基因的转基因杨继代培养苗10周后叶尖产生异位根;图7为过量表达PeWOX11b基因的转基因杨继代培养苗茎上异位根再生出新植株。从结果明显看出,过量表达PeWOX11b基因的转基因杨不定根数目增多,茎上有不定根产生,而且在异位根上还能再生出新植株,说明PeWOX11b基因是控制杨树不定根发生发育的关键调节因子,在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a及其应用
<130> 100
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'
<400> 1
gaaattattt tttatcgaca aacatttctt ttcttcattt caatacagta tggaagataa 60
tcaaggccaa gaccataaca gtcaaagcaa ccatggaact gaaagaagtg agccagtgag 120
gtcaaggtgg actccaaagc cagagcaaat actgatactt gagtccatct ttaacagtgg 180
aatggtaaat ccaccaaaaa atgagactgt gagaataagg aagcttcttg aaaaatttgg 240
ctctgttggt gatgcaaatg ttttctactg gttccaaaac cgacgatcaa gatcccgccg 300
ccggcaacgc cagatgcaag ctagtcttct tgcaggatat caaagaaata atcaacgggc 360
atacgatagc ggtggtgtaa ttcaatacga aggtggtggc acttctaatg ggtttgcaaa 420
ttctccatct tcttatcttg ttggttcctc ttcttcttgt ggcgttgttg gtgaagatca 480
tggtggagag agcttgtttt ctttctctaa ccagatgggt tttcaagaat tcgagcaaac 540
ctctggtgta acttcaattc tatgcccatc agagacttct agtttgcatt accaaactgc 600
tggatgcatc acaatcttca tcaatggggt tccaacagaa gttcctgggg tgccacttga 660
cgtgaaagca atgtttggtc aagatgtaat gttggtgcat tcctctggag tgcctgttcc 720
cactaatgaa tatgggctct tagtgcaaat cttgcatcat ggtgaaagct atttcctggt 780
ttcaagaaca gcctaaatcg ttattaaagc tgcatcaaga agtgggagct tcctctacat 840
gttggtgtgc aaagcagatg ttttaggacc aatattttac tatgagggac gattgaaaaa 900
cccaaaaaat tatctactaa ttagcattta attaattatg atgtctcgaa aaaaaaaaaa 960
<210> 2
<211> 248
<212> PRT
<213> Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'
<400> 2
Met Glu Asp Asn Gln Gly Gln Asp His Asn Ser Gln Ser Asn His Gly
1 5 10 15
Thr Glu Arg Ser Glu Pro Val Arg Ser Arg Trp Thr Pro Lys Pro Glu
20 25 30
Gln Ile Leu Ile Leu Glu Ser Ile Phe Asn Ser Gly Met Val Asn Pro
35 40 45
Pro Lys Asn Glu Thr Val Arg Ile Arg Lys Leu Leu Glu Lys Phe Gly
50 55 60
Ser Val Gly Asp Ala Asn Val Phe Tyr Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ser
65 70 75 80
Arg Ser Arg Arg Arg Gln Arg Gln Met Gln Ala Ser Leu Leu Ala Gly
85 90 95
Tyr Gln Arg Asn Asn Gln Arg Ala Tyr Asp Ser Gly Gly Val Ile Gln
100 105 110
Tyr Glu Gly Gly Gly Thr Ser Asn Gly Phe Ala Asn Ser Pro Ser Ser
115 120 125
Tyr Leu Val Gly Ser Ser Ser Ser Cys Gly Val Val Gly Glu Asp His
130 135 140
Gly Gly Glu Ser Leu Phe Ser Phe Ser Asn Gln Met Gly Phe Gln Glu
145 150 155 160
Phe Glu Gln Thr Ser Gly Val Thr Ser Ile Leu Cys Pro Ser Glu Thr
165 170 175
Ser Ser Leu His Tyr Gln Thr Ala Gly Cys Ile Thr Ile Phe Ile Asn
180 185 190
Gly Val Pro Thr Glu Val Pro Gly Val Pro Leu Asp Val Lys Ala Met
195 200 205
Phe Gly Gln Asp Val Met Leu Val His Ser Ser Gly Val Pro Val Pro
210 215 220
Thr Asn Glu Tyr Gly Leu Leu Val Gln Ile Leu His His Gly Glu Ser
225 230 235 240
Tyr Phe Leu Val Ser Arg Thr Ala
245
<210> 3
<211> 334
<212> DNA
<213> Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'
<400> 3
aacgccagat gcaagctagt cttcttgcag gatatcaaag aaataatcaa cgggcatacg 60
atagcggtgg tgtaattcaa tacgaaggtg gtggcacttc taatgggttt gcaaattctc 120
catcttctta tcttgttggt tcctcttctt cttgtggcgt tgttggtgaa gatcatggtg 180
gagagagctt gttttctttc tctaaccaga tgggttttca agaattcgag caaacctctg 240
gtgtaacttc aattctatgc ccatcagaga cttctagttt gcattaccaa actgctggat 300
gcatcacaat cttcatcaat ggggttccaa caga 334
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PeWOX11b短片段正向引物
<400> 4
aacgccagat gcaagctagt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> PeWOX11b短片段反向引物
<400> 5
tctgttggaa ccccattgat 20
<210> 6
<211> 468
<212> DNA
<213> Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'
<400> 6
cttgttttct ttctctaacc agatgggttt tcaagaattc gagcaaacct ctggtgtaac 60
ttcaattcta tgcccatcag agacttctag tttgcattac caaactgctg gatgcatcac 120
aatcttcatc aatggggttc caacagaagt tcctggggtg ccacttgacg tgaaagcaat 180
gtttggtcaa gatgtaatgt tggtgcattc ctctggagtg cctgttccca ctaatgaata 240
tgggctctta gtgcaaatct tgcatcatgg tgaaagctat ttcctggttt caagaacagc 300
ctaaatcgtt attaaagctg catcaagaag tgggagcttc ctctacatgt tggtgtgcaa 360
agcagatgtt ttaggaccaa tattttacta tgagggacga ttgaaaaacc caaaaaatta 420
tctactaatt agcatttaat taattatgat gtctcgaaaa aaaaaaaa 468
<210> 7
<211> 417
<212> DNA
<213> Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'
<400> 7
gaaattattt tttatcgaca aacatttctt ttcttcattt caatacagta tggaagataa 60
tcaaggccaa gaccataaca gtcaaagcaa ccatggaact gaaagaagtg agccagtgag 120
gtcaaggtgg actccaaagc cagagcaaat actgatactt gagtccatct ttaacagtgg 180
aatggtaaat ccaccaaaaa atgagactgt gagaataagg aagcttcttg aaaaatttgg 240
ctctgttggt gatgcaaatg ttttctactg gttccaaaac cgacgatcaa gatcccgccg 300
ccggcaacgc cagatgcaag ctagtcttct tgcaggatat caaagaaata atcaacgggc 360
atacgatagc ggtggtgtaa ttcaatacga aggtggtggc acttctaatg ggtttgc 417
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' RACE gene-specific outer primer
<400> 8
ataatcaacg ggcatacgat agc 23
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' RACE gene specific inner primer
<400> 9
cttgttttct ttctctaacc agatgggt 28
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' RACE Outer Primer
<400> 10
gcgagcacag aattaatacg act 23
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' RACE Inner Primer
<400> 11
cgcggatccg aattaatacg actcactata gg 32
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' RACE Outer Primer
<400> 12
catggctaca tgctgacagc cta 23
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' RACE Inner Primer
<400> 13
cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc gatg 34
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' RACE gene-specific outer primer
<400> 14
cccattgatg aagattgtga tgc 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' RACE gene specific inner primer
<400> 15
gcaaacccat tagaagtgcc acc 23
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PeWOX11b ORF正向引物
<400> 16
atggaagata atcaaggcca agac 24
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PeWOX11b ORF反向引物
<400> 17
ttaggctgtt cttgaaacca gga 23