CN103865952B

CN103865952B - 一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1及其应用

Info

Publication number: CN103865952B
Application number: CN201410067980.7A
Authority: CN
Inventors: 胥猛; 杨春霞; 黄敏仁
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2034-02-27
Also published as: CN103865952A

Abstract

本发明公开了一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1及其应用，所述基因PeARF17.1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过将PeARF17.1基因转入杨树，过量表达PeARF17.1的转基因杨无明显主干，丛生状态，根茎结合部扁平，不定根数显著增多，说明杨树生长素响应因子基因PeARF17.1是控制杨树生长发育的关键调节因子，在林木基因工程领域有重要应用价值。

Description

一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1及其应用。

背景技术

杨树是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种，加快杨树育种的应用基础研究具有紧迫性和必要性。据第七次全国森林资源清查统计，截止2008年底，我国杨树人工林总面积已超过700万公顷，居世界第一，杨树木材产量占全国木材总量的30%左右。目前国内外杨树育种的发展趋势主要表现在两个方面，一方面继续以常规育种为主，不断完善育种技术，由过去的单一追求产量为育种目标发展到与工业用材相结合的生长、材性、干形、资源利用等多性状联合改良为目标的定向育种；另一方面加快生物技术在杨树育种中的应用，发展分子育种技术体系。

生长素调节植物生长发育的各个阶段。生长素响应因子（Auxin responsefactor, ARF）在生长素信号转导中起着转录“开关”作用，调控生长素响应基因的表达，促进或抑制植物的生长发育和形态建成。ARF转录因子，通过识别并结合生长素响应基因启动子区域的TGTCTC生长素响应元件（AuxRE）来激活或抑制该基因的表达。同其它转录因子一样，ARF具有一些特定结构域，一般包括氨基端DNA结合域（DBD）、中间激活区（AD）或抑制区（RD）及羧基末端的二聚体功能域（CTD），其中CTD区域可与Auxin/IAA形成二聚体，抑制生长素响应基因表达。

ARF转录因子在植物体内以家族的形式存在, 并且物种之间的ARF基因存在一定的同源性。当前，有关ARF基因家族功能的阐释主要来自于对拟南芥、水稻和玉米等草本植物的研究，加之ARF基因家族成员之间存在功能冗余现象，因此并不是所有的ARF基因功能都能得到很好的解析，而且草本植物中的ARF基因家族分支不能完全代表高等植物中所有ARF的功能和特征，所以在多年生木本植物中对ARF家族进行研究将有助于人们深入认识和理解ARF基因家族及其生长素信号在植物生长发育过程中的调控模式。

目前，在杨树中尚未有ARF基因家族克隆和功能研究的相关报道。克隆和开发利用这些基因资源，不仅有助于阐明林木生长发育的分子调节机制，而且还能促进林木分子育种进程，对农、林与园艺业的发展具有不可估量的价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1。本发明的另一目的是提供一种杨树生长素响应因子基因PeARF17.1的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

含有所述的杨树生长素响应因子基因PeARF17.1的载体。所述载体在PeARF17.1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S。所述载体在PeARF17.1基因的3’端组装有强终止子NOS。所述载体组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选。所述载体组装有能促使组装于其间的PeARF17.1基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中的LB和RB序列。

含有所述的杨树生长素响应因子基因PeARF17.1的宿主细胞。

所述的杨树生长素响应因子基因PeARF17.1在调控杨树生长发育过程中的应用。

所述的杨树生长素响应因子基因PeARF17.1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明以南林895杨不定根为材料，通过RACE技术克隆了PeARF17.1基因。同时，采用通路克隆技术构建其杨树过量表达载体pH35GS-PeARF17.1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeARF17.1可在杨树体内高效表达，从而调控杨树的生长和发育。其中，PeARF17.1基因是调控杨树生长发育的关键基因。

有益效果：本发明通过将PeARF17.1基因转入杨树，过量表达PeARF17.1的转基因杨无明显主干，丛生状态，根茎结合部扁平，不定根数显著增多，说明PeARF17.1基因是控制杨树生长发育的关键调节因子，在林木基因工程领域有重要应用价值。

附图说明

图1是植物表达载体pH5GS的结构示意图；

图2是PeARF17.1基因在杨树不定根发生发育过程中的表达模式图；

图3是过量表达PeARF17.1的转基因杨的分子检测图；

图4是过量表达PeARF17.1的转基因杨与未转基因杨的整体形态对比图，图中，左边为转基因杨，右边为未转基因杨；

图5是过量表达PeARF17.1的转基因杨与未转基因杨根系比较图，图中，左边为转基因杨，右边为未转基因杨。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中未进行详尽说明的操作可参照生物学实验手册、相关试剂盒使用说明以及生物领域中的常规操作实现。

实施例1通过RACE技术克隆PeARF17.1基因

以南林895杨初生不定根为材料，采用常规方法提取符合使用要求的cDNA、RNA。使用Oligo 6设计特异性引物扩增PeARF17.1基因短片段，其中，PeARF17.1短片段正向引物为：5’-AGGGCAAAGTGAAGGTAGAG-3’，PeARF17.1短片段反向引物为：5’-GTAGGAGGAAGTCAGTGAAAGT-3’。高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer (Mg²⁺ free)5.0μl；2.5mM dNTP Mixture 8.0μl；25mM Mg²⁺ 5.0μl；LA Taq DNA Polymerase(5U/μl)0.5μl；正向引物(10μM) 2μl；反向引物 (10μM) 2μl；模板（895杨cDNA）1μl；加无菌ddH₂O补足 50μl。反应程序：预变性94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃10min。对产物测序，获得的PeARF17.1基因短片段序列如SEQ ID NO.3所示。

依据上述PeARF17.1基因短片段序列设计3’末端的RACE引物，进行3’RACE，获得3’cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序，Blast确认上述片段与其它植物相关的基因同源。以相同的方法，根据获得的正确的3’ cDNA末端片段序列设计5’末端的RACE引物，进行5’RACE，获得5’ cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序。

3’RACE正向引物：3' RACE gene-specific outer primer：5'-AGGGCAAAGTGAAGGTAGAGGAG-3’， 3' RACE gene specific inner primer：5'-GATCTAACTAATTCAACTATGGGGCACACG-3’； 3' RACE Outer Primer：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3’， 3' RACE Inner Primer：5'-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3’； 5' RACE Outer Primer：5'-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3’， 5' RACE Inner Primer：5'-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3’； 5' RACE gene-specific outer primer：5'-AGTAGGACATGCTTCAACAGGTG-3’， 5' RACE gene specific inner primer：5'-ACAGGTGAAGCTCTTTGGCATTGGGCAT-3’。

（1）3' RACE 反应

1）反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：1μgTotal RNA，4μL dNTP Mix，2μL 3' RACE Adapter，2μL 10X RT Buffer，1μL RNaseInhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water补齐20μL。轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1h；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物。

2）3' RACE巢式PCR

反应体系：Outer 3' RACE Component：5.0μL 10×LA PCR Buffer（Mg²⁺ Free），5.0μL MgCl₂（25mM），8.0μL dNTP Mixture（each 2.5mM），2.0μL 3' RACE gene-specificouter primer，2.0μL 3' RACE Outer Primer（10μM），1μL RT reaction product，0.5μLTakaRa LA Taq（5U/μL），26.5μL Nuclease-free Water，Total volume50μL。Inner 3'RACE Component：5.0μL 10×LA PCR Buffer（Mg²⁺ Free），5.0μL MgCl₂（25mM），8.0μL dNTPMixture（each 2.5mM），2.0μL 3' RACE gene specific inner primer，2.0μL 3' RACEInner Primer（10μM），1μL Outer 3' RACE PCR product，0.5μL TakaRa LA Taq（5U/μL），26.5μL Nuclease-free Water，Total volume50μL。

反应程序：94℃，3min；94℃，30sec，60℃，30sec，72℃，1.5min，35cycles；72℃，7min。

3）纯化片段与克隆载体的连接反应：采用TaKaRa公司的pMD19-T simple Vetor克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进。反应体系（5μL）：2.2μL纯化回收的PCR产物，0.3μL pMD-19 Simple Vector，2.5μL Solution I。反应条件：16℃ 2min；4℃过夜。

4）大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化；取5μL纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μL感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；加入800μL LB液体培养基，37℃&100rmp 摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层800μL培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。

5）阳性克隆筛选及测序分析：从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃&250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。反应体系（20.0μL）：2.0μL 10×PCR Buffer（Mg²⁺free），1.2μL MgCl₂（25mM），1.6μL dNTPMixture （each 2.5mM），1.0μL 3' RACE gene specific inner primer（10μM），1.0μL 3'RACE Inner Primer（10μM），1.0μL菌液，0.2μL rTaq，12.0μL Milli-Q Water。反应程序：94℃，3min；94℃，30sec，60℃，30sec，72℃，1min，28cycles；72℃，7min。菌液PCR检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司（上海）测序鉴定。

（2）5' RACE 反应

1）RNA处理（RNA Processing）

CIP反应，将如下成分加入到RNase-free的小离心管中：10μg Total RNA，2μL 10XCIP buffer，2μL Calf Intestine Alkaline Phosphatase （CIP），Nuclease-free Water补齐20μL。轻混匀，短暂离心；37℃温育1h。加入以下试剂到CIP反应离心管：15μL AmmoniumAcetate Solution，115 μL Nuclease-free Water，150 μL acid phenol:chloroform。充分涡旋，室温高速离心（≧10000 g）5min。转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL氯仿，充分涡旋，室温高速离心（≧10000 g）5min。转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL异丙醇，充分涡旋，冰浴10min。最大转速离心20min，用0.5ml预冷的70%乙醇冲洗沉淀，最大转速离心5min，小心弃乙醇，气干沉淀。以11μLNuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP’RNA，冰上放置进一步用于TAP反应，或者-20℃保存。TAP反应，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：5μL CIP’d RNA （from f above），1μL 10X TAP buffer，2μLTobacco Acid Pyrophosphatase（TAP），2μL Nuclease-free Water。轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得CIP/TAP-treated RNA ；进入接头连接步骤，或-20℃保存反应物。5'RACE接头连接，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：2μL CIP/TAP-treatedRNA，1μL 5' RACE Adapter，1μL 10X RNA Ligase Buffer，2μL T4 RNA Ligase（2.5U/μL），4μL Nuclease-free Water。轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得Ligated RNA；进入反转录步骤，或-20℃保存反应物。

2）反转录（Reverse Transcription）：将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中；2μL Ligated RNA，4μL dNTP Mix，2μL Random Decamers，2μL 10X RTBuffer，1μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-freeWater补齐20μL。轻轻混匀，短暂离心；42℃温育1h，即得RT reaction；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物。

3）5' RACE巢式PCR：反应体系、反应条件与3' RACE的巢式PCR一致。

4）PCR产物克隆测序，操作与3' RACE克隆一致，获得基因序列片段。Blast确认该片段与拟南芥AtARF17基因高度同源。

采用BioEdit软件对3' RACE和5' RACE序列进行比对拼接，并使用FGENESH(http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic =fgen)预测其阅读框。根据基因全长序列设计引物（扩增子包含起始密码子及终止密码子），再次进行PeARF17.1基因的全长扩增和测序验证。其中，PeARF17.1 ORF正向引物为：5'-ATGCCGCAACTGACGGAGCTCAGC-3’，PeARF17.1 ORF反向引物为：5'-TCAAGTAGGACATGCTTCAACAGGT-3'；高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer (Mg²⁺ free) 5.0μl；2.5mM dNTP Mixture 8.0μl；25mM Mg²⁺ 5.0μl；LA Taq DNA Polymerase(5U/μl) 0.5μl；正向引物(10μM) 2μl；反向引物 (10μM) 2μl；模板（895杨cDNA）1μl；加无菌ddH₂O 补足 50μl。反应程序：预变性94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 10min。

最终获得基因全长cDNA序列为2178bp，包含一个1779bp的完整阅读框，命名为PeARF17.1基因，序列如SEQ ID NO.1所示，其所编译表达蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2 PeARF17.1基因植物表达载体构建

利用通路克隆技术构建PeARF17.1基因的过量表达载体。使用特异PCR引物（实施例1的PeARF17.1 ORF引物），以cDNA为模板，进行PCR扩增，将PeARF17.1基因ORF构建到入门载体。入门载体为pCR^TM8/GW/TOPO^TM vector (Invitrogen)。反应体系为：Fresh PCRproduct (purified) 80ng；Salt solution 0.5μl；pCR^TM8/GW/TOPO^TM vector 0.5μl；加无菌ddH₂O补足3μl。反应程序为：22℃反应2h。

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，带PeARF17.1基因的入门载体与植物表达载体pH35GS进行LR反应。载体质粒如图1所示。反应体系为：linearizedentry clone 50ng；purified destination vector 75ng；LR Clonase enzyme mix0.5μl；加TE(pH 8.0)补足2.5μl；。反应条件：25℃ 2-3h。经LR反应后PeARF17.1基因导入植物表达载体pH35GS中，在PeARF17.1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，它能使PeARF17.1基因在杨树体内高效表达；在PeARF17.1基因的3’端组装了强终止子NOS，可有效终止PeARF17.1基因的转录；在载体质粒上组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选；在载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeARF17.1基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pH35GS- PeARF17.1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeARF17.1可在杨树体内高效表达。

实施例3 PeARF17.1基因的遗传转化

通过液氮冻融法将所构建的pH35GS-PeARF17.1过量表达载体转入农杆菌菌株EHA105（Invitrogen），通过农杆菌介导将PeARF17.1基因转入杨树。实验结果如图1~5所示，图1是植物表达载体pH35GS的结构示意图；图2为PeARF17.1基因在杨树不定根发生发育过程中的表达模式；图3为过量表达PeARF17.1的转基因杨的分子检测；图4为过量表达PeARF17.1的转基因杨与未转基因杨的整体形态比较，图中，左边为转基因杨，右边为未转基因杨；图5为过量表达PeARF17.1的转基因杨与未转基因杨根系比较，图中，左边为转基因杨，右边为未转基因杨。从结果可以明显得出，过量表达PeARF17.1的转基因杨无明显主干，丛生状态，根茎结合部扁平，不定根数显著增多，说明PeARF17.1基因是调控杨树生长发育的关键调节因子，在林木基因工程领域有重要应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种调控杨树生长发育的生长素响应因子基因PeARF17.1及其应用

<130> 100

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2178

<212> DNA

<213> 南林895杨

<400> 1

gaaaattttt ttccccgtac tcaacctcga gacggcactc tctcccctac aacactgcaa 60

cactctccct ctctgtagag tctggacagg cacacacgca gagctcatat gttaataaac 120

cgtttccatt tcactctttg tcactctctc tctctcggtt tcgaaaccca aactaactaa 180

caaatgccgc aactgacgga gctcagccgt gtggacccgc ggatctggcg agcctgtgct 240

ggatcctccg ttcaaatccc caccattaat tctagggttt actacttccc tcaggggcat 300

ctcgaacaat cctcatcgtc tacggcacct catcccccgt ttctctccaa tctcgctctc 360

tctaaaccct taatttcttg ccaaatctcc gccgttgatt tcctcgccga tccggtaacc 420

gatgaggtct tcattagact tctccttctt cctctcaata atcactcctg taacctccct 480

ctctcctttc tagaaccttc tagaagtgag ggtggaggtg ttaatgacgt cgatgacgat 540

gagaataaga ttttggcctt cgctaagatt ctaacgccgt cagatgcgaa taacggtggt 600

ggtttctccg tcccgaggtt ctgtgccgac tcgattttcc ctccgttaaa ctaccaggcg 660

gagcctccgg ttcagactct aacggtcacc gatattcacg gaattagttg ggatttcaga 720

cacatttatc gagggacgcc acgcaggcac ttgctaacta ctggatggag taagtttgtg 780

aacaataaga agttgattgc gggtgactcg gtggttttta tgaggaattt gaagggagag 840

atgtttattg gagtgaggag ggcagttagg cttaataaca gtgccaggtg gagggagcag 900

attgctggtg gcggtggaga aggcaaagtg aaggtagagg agggattttc gatgagtggg 960

agagggaggt tgtcccagga ggctgttgcg gaggctgtgg agatggcggc taaaggtttg 1020

ccgtttgacg ttgtgtatta tccgagggca ggttggtact cagattttgt ggtgagggct 1080

gaagcggtgg aggctgccct tggtgtgttt tggactgctg ggatgagagt gaagatggcc 1140

atggagactg aggattcttc tagaatgact tggtttcagg ggactgtttc gggtactggc 1200

ttaccagact ctggtgcatg gcgtggctct ccttggcgca tgcttcagat tacgtgggat 1260

gagcctgaag ttttgcagaa tgcaaagaga gtgagccctt ggcaagttga atttgttgca 1320

accactccac agcttcaagc tgcattcccc ccaatgaaga aattgagata tccaaatgat 1380

tctaggttcc tgacggatgg agaacttttt tttcccatgt cagatctaac taattcaact 1440

atggggcaca cgaatgcttc aatgttgaat tatagtactt ttcctgctgg catgcaggga 1500

gccaggcaag atcctttttc cacattcggt ttatccaact ttataagtga aaatgctcct 1560

caggtgttca gtgacagggc ctttggaaac aacttggtcc ctaagatgaa aagaatgccc 1620

agtgagatga acattggcag tttgcagtct gagaacttat cacctgagag ccagagtagt 1680

gcatattctt ttggcatagg ttttgttgga aacaggggct tcaaccccaa gaaagttgga 1740

attaactcta ttcagttatt tggtaagatc attcacatgg accagcctgt tgaaaatggt 1800

tttgatgatg ttggcttcat ggatgacagc agtaaatgtg gcaatgaaac tgaaggtgtt 1860

gatgcactgg aactttcact gacttcctcc tacacagaac tacttaacag gattgatgcc 1920

caatgccaaa gagcttcacc tgttgaagca tgtcctactt gaacaaatag ttctgtagcg 1980

catgcatata agtagctgtg caggttctat ctgcatgcag ggagctgact tctgaataga 2040

cccatgcagt agtaactggt ctctgttggt ttagtgtatg ctagtttgtt ctagttagtg 2100

atgttgagaa ctaaagaaaa ttgacttggc atatgtttaa aatttggtgc tggatattct 2160

tgtggcaaaa aaaaaaaa 2178

<210> 2

<211> 592

<212> PRT

<213> 南林895杨

<400> 2

Met Pro Gln Leu Thr Glu Leu Ser Arg Val Asp Pro Arg Ile Trp Arg

1 5 10 15

Ala Cys Ala Gly Ser Ser Val Gln Ile Pro Thr Ile Asn Ser Arg Val

20 25 30

Tyr Tyr Phe Pro Gln Gly His Leu Glu Gln Ser Ser Ser Ser Thr Ala

35 40 45

Pro His Pro Pro Phe Leu Ser Asn Leu Ala Leu Ser Lys Pro Leu Ile

50 55 60

Ser Cys Gln Ile Ser Ala Val Asp Phe Leu Ala Asp Pro Val Thr Asp

65 70 75 80

Glu Val Phe Ile Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Asn Asn His Ser Cys

85 90 95

Asn Leu Pro Leu Ser Phe Leu Glu Pro Ser Arg Ser Glu Gly Gly Gly

100 105 110

Val Asn Asp Val Asp Asp Asp Glu Asn Lys Ile Leu Ala Phe Ala Lys

115 120 125

Ile Leu Thr Pro Ser Asp Ala Asn Asn Gly Gly Gly Phe Ser Val Pro

130 135 140

Arg Phe Cys Ala Asp Ser Ile Phe Pro Pro Leu Asn Tyr Gln Ala Glu

145 150 155 160

Pro Pro Val Gln Thr Leu Thr Val Thr Asp Ile His Gly Ile Ser Trp

165 170 175

Asp Phe Arg His Ile Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Arg His Leu Leu Thr

180 185 190

Thr Gly Trp Ser Lys Phe Val Asn Asn Lys Lys Leu Ile Ala Gly Asp

195 200 205

Ser Val Val Phe Met Arg Asn Leu Lys Gly Glu Met Phe Ile Gly Val

210 215 220

Arg Arg Ala Val Arg Leu Asn Asn Ser Ala Arg Trp Arg Glu Gln Ile

225 230 235 240

Ala Gly Gly Gly Gly Glu Gly Lys Val Lys Val Glu Glu Gly Phe Ser

245 250 255

Met Ser Gly Arg Gly Arg Leu Ser Gln Glu Ala Val Ala Glu Ala Val

260 265 270

Glu Met Ala Ala Lys Gly Leu Pro Phe Asp Val Val Tyr Tyr Pro Arg

275 280 285

Ala Gly Trp Tyr Ser Asp Phe Val Val Arg Ala Glu Ala Val Glu Ala

290 295 300

Ala Leu Gly Val Phe Trp Thr Ala Gly Met Arg Val Lys Met Ala Met

305 310 315 320

Glu Thr Glu Asp Ser Ser Arg Met Thr Trp Phe Gln Gly Thr Val Ser

325 330 335

Gly Thr Gly Leu Pro Asp Ser Gly Ala Trp Arg Gly Ser Pro Trp Arg

340 345 350

Met Leu Gln Ile Thr Trp Asp Glu Pro Glu Val Leu Gln Asn Ala Lys

355 360 365

Arg Val Ser Pro Trp Gln Val Glu Phe Val Ala Thr Thr Pro Gln Leu

370 375 380

Gln Ala Ala Phe Pro Pro Met Lys Lys Leu Arg Tyr Pro Asn Asp Ser

385 390 395 400

Arg Phe Leu Thr Asp Gly Glu Leu Phe Phe Pro Met Ser Asp Leu Thr

405 410 415

Asn Ser Thr Met Gly His Thr Asn Ala Ser Met Leu Asn Tyr Ser Thr

420 425 430

Phe Pro Ala Gly Met Gln Gly Ala Arg Gln Asp Pro Phe Ser Thr Phe

435 440 445

Gly Leu Ser Asn Phe Ile Ser Glu Asn Ala Pro Gln Val Phe Ser Asp

450 455 460

Arg Ala Phe Gly Asn Asn Leu Val Pro Lys Met Lys Arg Met Pro Ser

465 470 475 480

Glu Met Asn Ile Gly Ser Leu Gln Ser Glu Asn Leu Ser Pro Glu Ser

485 490 495

Gln Ser Ser Ala Tyr Ser Phe Gly Ile Gly Phe Val Gly Asn Arg Gly

500 505 510

Phe Asn Pro Lys Lys Val Gly Ile Asn Ser Ile Gln Leu Phe Gly Lys

515 520 525

Ile Ile His Met Asp Gln Pro Val Glu Asn Gly Phe Asp Asp Val Gly

530 535 540

Phe Met Asp Asp Ser Ser Lys Cys Gly Asn Glu Thr Glu Gly Val Asp

545 550 555 560

Ala Leu Glu Leu Ser Leu Thr Ser Ser Tyr Thr Glu Leu Leu Asn Arg

565 570 575

Ile Asp Ala Gln Cys Gln Arg Ala Ser Pro Val Glu Ala Cys Pro Thr

580 585 590

<210> 3

<211> 974

<212> DNA

<213> 南林895杨

<400> 3

agggcaaagt gaaggtagag gagggatttt cgatgagtgg gagagggagg ttgtcccagg 60

aggctgtggc ggaggctgtg gagatggcgg ctaaaggttt gccgtttgac gttgtgtatt 120

atccgagggc aggttggtac tcagattttg tggtgagggc tgaagcggtg gaggctgccc 180

ttggtgtgtt ttggactgcc gggatgagag tgaagatggc catggagact gaggattctt 240

ctagaatgac ttggtttcag gggactgttt cgggtactgg cttaccagac tctggtgcat 300

ggcgtggctc tccttggcgc atgcttcaga ttacgtggga tgagcctgaa gttttgcaga 360

atgcaaagag agtgagccct tggcaagttg aatttgttgc aaccactcca cagcttcaag 420

ctgcattccc cccaatgaag aaattgagat atccaaatga ttctaggttc ctgacagatg 480

gagaactttt ttttcccatg tcagatctaa ctaattcaac tatggggcac acgaatgctt 540

caatgttgaa ttatagtact tttcctgctg gcatgcaggg agccaggcaa gatccttttt 600

ccacattcgg tttatccaac tttataagtg aaaatgctcc tcaggtgttc agtgacaggg 660

cctttggaaa caacttggtc cctaagatga aaagaatgcc cagtgagatg aacattggca 720

gtttgcagtc tgagaactta tcacctgaga gccagagtag tgcatattct tttggcatag 780

gttttgttgg aaacaggggc ttcaacccca agaaagttgg aattaactct attcagttat 840

ttggtaagat cattcacatg gaccagcctg ttgaaaatgg ttttgatggt gttggcttca 900

tggatgacag cagtaaatgt tgcactgaaa ctgaaggtgt tgatgcactg gaactttcac 960

tgacttcctc ctac 974

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PeARF17.1短片段正向引物

<400> 4

agggcaaagt gaaggtagag 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PeARF17.1短片段反向引物

<400> 5

gtaggaggaa gtcagtgaaa gt 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE gene-specific outer primer

<400> 6

agggcaaagt gaaggtagag gag 23

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE gene specific inner primer

<400> 7

gatctaacta attcaactat ggggcacacg 30

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE Outer Primer

<400> 8

gcgagcacag aattaatacg act 23

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE Inner Primer

<400> 9

cgcggatccg aattaatacg actcactata gg 32

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE Outer Primer

<400> 10

catggctaca tgctgacagc cta 23

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE Inner Primer

<400> 11

cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc gatg 34

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE gene-specific outer primer

<400> 12

agtaggacat gcttcaacag gtg 23

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE gene specific inner primer

<400> 13

acaggtgaag ctctttggca ttgggcat 28

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PeARF17.1 ORF正向引物

<400> 14

atgccgcaac tgacggagct cagc 24

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PeARF17.1 ORF反向引物

<400> 15

tcaagtagga catgcttcaa caggt 25

Claims

1.含有杨树生长素响应因子基因PeARF17.1的载体，其特征在于：所述载体在PeARF17.1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，在PeARF17.1基因的3’端组装有强终止子NOS；所述PeARF17.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的含有杨树生长素响应因子基因PeARF17.1的载体，其特征在于：所述载体组装HPT基因表达盒，所述HPT基因表达盒作为转基因杨树的筛选标记，用潮霉素进行转基因杨树的筛选。

3.根据权利要求1所述的含有杨树生长素响应因子基因PeARF17.1的载体，其特征在于：所述载体组装有能促使组装于其间的PeARF17.1基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中的LB和RB序列。

4.含有杨树生长素响应因子基因PeARF17.1的宿主细胞；所述PeARF17.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.杨树生长素响应因子基因PeARF17.1在调控杨树不定根形成中的应用；所述PeARF17.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.杨树生长素响应因子基因PeARF17.1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述PeARF17.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。