CN105985421B - 促进木本植物茎生长基因TcSG及其编码蛋白和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种促进木本植物茎生长(纵向和横向生长)基因TcSG及其编码蛋白，本发明还公开了这种促进木本植物茎生长(纵向和横向生长)基因的用途，尤其在木本植物改良中用于增加木本植物植株的高度、节间的长度和茎的粗度。本发明的基因是一个在木本植物木材产量和质量方面上有重要应用价值的基因，前景广阔。

Description

促进木本植物茎生长基因TcSG及其编码蛋白和用途

技术领域

本发明属于基因技术和植物学领域。具体地说，本发明涉及新的促进木本植物茎生长(纵向和横向生长)的基因及其编码蛋白。尤其是涉及促进木本植物茎生长基因TcSG及其编码蛋白和用途。

背景技术

当前，对于木本植物木材产量和品质的遗传改良的研究主要集中在以下几个方面：1.增加木本植物叶片的大小；2.增强木本植物叶片的光合作用；3.提高木本植物光合产物由叶片向茎运输的能力。其中，增强木本植物叶片的光合作用和提高光合产物向茎运输的能力是有效的育种途径。

尽管人们采取了许多方法来提高木本植物木材的产量和品质进行改良，然而，目前还缺乏有效的技术手段。例如，我国主要人工造林的阔叶树种杨柳科的杨树，当前的许多杨树高产栽培品种尤其杂交杨树品种还存在生长速度及木材胸径不能达到理想的情况，这在很大程度上影响了杨树木材产量和品质的进一步提高。

因此，本领域迫切需要找到有效的手段，解决木本植物茎(纵向和横向)快速生长的问题，从而进一步改良木本植物，实现木本植物木材产量和品质的提高，以满足社会和经济发展的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的来自中国红豆杉(Taxus chinensis(Pilger)Rehd.)能促进木本植物茎生长的基因及其编码蛋白和用途。

在本发明的第一方面，提供一种分离的促进木本植物茎生长的蛋白，所述蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；或

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进木本植物茎生长功能的由(a)衍生的多肽。

在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自编码所述的促进木本植物茎生长的蛋白的多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在本发明的另一优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列

在本发明的第三方面，提供一种载体，其含有所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，其含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供所述的促进木本植物茎生长的基因或其编码蛋白的用途，用于：

促进木本植物茎生长(纵向和横向生长)，提高木本植物木材的产量和品质。

在本发明的第六方面，提供一种改良木本植物的方法，该方法包括：

增加所述木本植物中促进木本植物茎生长的基因的表达。

在本发明的第七方面，提供一种制备转基因植物的方法，它包括步骤：

将所述的多核苷酸导入植物细胞或组织中，培养所述的植物细胞或组织，再生成植物。

在本发明的另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的木本植物茎生长蛋白的编码基因；

(b)将木本植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使该木本植物地上部分营养器官大小调节蛋白DNA编码序列转入到木本植物细胞，并且整合到木本植物细胞的染色体上；

(c)将转入了所述促进木本植物地上部分营养器官生长的蛋白DNA编码序列的木本植物细胞或组织或器官再生成木本植物植株。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了中国红豆杉剥皮再生不同时期TcSG基因表达水平的变化状况。其中，CK、6D、12D、18D、24D、30D和36D分别表示红豆杉剥皮当天(0D)的组织、剥皮后第6天、12天、18天、24天、30天和36天再生的组织。横坐标为时间(天)，纵坐标为基因的相对表达量。

图2显示了TcSG基因对于杨树株高的影响，含有额外TcSG基因的转基因杨树植株变高(图2右侧植株所示)。其中，图2左侧植株为未转TcSG基因的杨树的植株，图2右侧植株为转TcSG基因的杨树的植株。

图3显示了TcSG基因对于杨树茎段节间的影响，转化外源TcSG基因的转基因杨树茎段节间变长(图3右侧茎段所示)。其中，图3左侧茎段为未转TcSG基因的杨树(对照)的茎段，图3右侧茎段为转TcSG基因的杨树的茎段。

图4显示了TcSG基因对于杨树茎粗度的影响，转化外源TcSG基因的转基因杨树植株的茎段变粗(图4右侧茎的横切面所示)。其中，图4左侧茎的横切面为未转TcSG基因的杨树的茎的横切面，图4右侧茎的横切面为转TcSG基因的杨树的茎的横切面。

图5显示含有额外TcSG的转基因杨树其TcSG基因表达水平比较高(图5所示)。用实时定量PCR技术(real-time quantitativepolymerase chain reaction，real-time qPCR)检测并比较过量表达TcSG的转基因杨树与未转TcSG基因的杨树对照中的TcSG基因表达水平。过量表达TcSG基因的转基因杨树的根(图5中H所示)、次生茎(图5中I所示)、初生茎(图5中J所示)、老叶(图5中K所示)、幼叶(图5中L所示)、韧皮部(图5中M所示)、木质部(图5中N所示)中TcSG基因的相对表达量分别为1.09，0.94，1.57，2.94，3.22，3.31，2.24，而未转TcSG基因杨树的根(图5中A所示)、次生茎(图5中B所示)、初生茎(图5中C所示)、老叶(图5中D所示)、幼叶(图5中E所示)、韧皮部(图5中F所示)、木质部(图5中G所示)中的TcSG基因相对表达量均为0，有额外TcSG基因的转基因杨树其TcSG基因表达水平比较高。

具体实施方式

本发明人经过深入地研究，首次发现了一个控制木本植物茎生长的基因，该基因的表达提高可以增进木本植物茎纵向和横向的生长，提高木材的产量和品质。通过分子生物学中的转录组测序、基因表达水平的实时定量PCR技术(real-time quantitativepolymerase chain reaction，real-time qPCR)结合逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，本发明人克隆了该基因的开放阅读框(ORF，open reading frame)并将它命名为中国红豆杉促进木本植物茎生长基因(TcSG，Taxus chinensis Stem Growth Gene)。试验证实，转化TcSG基因的木本植物的转基因植株茎的生长加快，植株变高，节间变长，茎变粗。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，所述的“木本植物”包括但不限于：杨柳科植物。更优选的，所述的杨柳科植物包括但不限于：杨树、柳树等。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始的环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物的细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括TcSG蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的TcSG蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。根据本发明下列的说明和实例，具有本领域一般技术的人员可以很容易地测定一个多肽是否具有和TcSG蛋白相同的生物学功能或活性。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“TcSG蛋白”指具有TcSG蛋白活性的SEQ ID NO：2序列所示的多肽。该术语还包括具有与TcSG蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括TcSG蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能够与TcSG蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗TcSG蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含TcSG蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了TcSG蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有TcSG蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供TcSG蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然TcSG蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过高能射线的辐射或暴露于化学诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常是不改变一级结构)的形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解的性能或优化了溶解的性能的多肽。

在本发明中，“TcSG蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gin；Asn	Lys
			Asn(N)	Gin；His；Lys；Arg	Gin
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Set
Gin(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明TcSG蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

应理解，虽然本发明的TcSG基因优选获自中国红豆杉，但是获白其它植物的与中国红豆杉TcSG基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。

本发明的TcSG蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法或人工基因合成的方法获得。对于PCR扩增法，可以根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框(ORF，open reading frame)的序列来设计引物，并利用市场上出售的cDNA文库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA文库作为模板，扩增而得有关的序列。当序列较长时，通常需要进行两次或多次的PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按照正确的次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将它克隆入适当的载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行各小片段的连接即可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可以将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或TcSG蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的TcSG蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码TcSG蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，TcSG蛋白多核苷酸序列可以插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含TcSG蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可以有效地连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性、绿色荧光蛋白(GFP)以及黄色荧光蛋白(YFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对(bp)，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域的一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可以用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的具体步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2处理。如果需要，重组DNA转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物时，可以选用如下的DNA转化方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌介导转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等。对于转化的植物细胞或组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得茎生长发生改变的植物。

获得的转化子可以用常规的方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养时所用的培养基可以选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度变换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超速离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相色谱(HPLC)和其它各种层析技术及这些方法的组合。

本发明还涉及一种改良木本植物的方法，该方法包括增加所述植物中TcSG基因或其同源基因的表达。

增加TcSG基因或其同源基因表达的方法是本领域所周知的。例如，可以通过用强启动子驱动从而增强TcSG基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如Actin基因第一内含子等)来增强该TcSG基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、拟南芥色氨酸合酶β亚基基因启动子等。

作为本发明的一种优选方式，所述的改良木本植物的方法包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有TcSG蛋白DNA编码序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该TcSG蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述TcSG蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。

其中，可以采用任何适当的常规手段，包括温度、试剂、压力条件等来实施此方法。

在本发明的一个实例中，提供了一种TcSG基因，其全长cDNA(SEQ ID NO：1)为540bp，编码一个含有179个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)。所述的TcSG基因可为木本植物品种改良提供新的途径，因而具有巨大的应用前景。

本发明的主要优点在于：

(1)首次分离得到一种新的促进木本植物茎生长的基因TcSG，该基因具有促进木本植物植株变高、节间变长、茎变粗的功能。

(2)促进木本植物茎生长的基因TcSG可以作为控制促进茎生长(纵向和横向生长)，提高木本植物木材产量和品质的一个基因，应用于木本植物的遗传改良。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列的实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Joseph Sambrook和David W.Russell，分子克隆：实验室指南》第三版(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照以下文献中公布的方法：Carl W.Dieffenbach和Gabriela S.Devksler eds.PCR Primer：A LaboratoryManual.Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2003。或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

红豆杉剥皮处理和再生材料的采集

本发明的植物材料为中湖北省襄阳市林业科学研究所襄阳实验基地的十年生的中国红豆杉(Taxus chinensis(Pilger)Rehd.)实生苗。2013年6月初在形成层活动旺盛期进行剥皮处理，取生长良好、干形均匀的红豆杉。对选取的红豆杉从其基部距地面约40cm处开始，一直向上环剥约25cm，分别用无菌处理的刀片轻轻刮取剥皮后暴露在外树干的材料，做好标记，迅速投入液氮中，为剥皮当天的材料，即第0天(day，D)。剥皮后将树用消毒的塑料薄膜包裹好。剥皮后第6D，选择第0D未取过样的树，揭开塑料薄膜，刮取树干上的材料做好标记立即投入液氮中，重新包裹好树干。剥皮后第12D、18D、24D、30D和36D参照第6D的方法分别取样。

实施例2

红豆杉剥皮再生材料的转录组测序

根据CTAB法提取第0D、6D、12D、18D、24D、30D和36D组织的总RNA，分别用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，加入破碎缓冲液(fragmentation buffer)打断mRNA为200-700的短片段，以它们为模板，分别用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，再加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成其第二条cDNA链。cDNA用QIAquick PCRPurification Kit(QIAGEN试剂公司)纯化，经EB缓冲液洗脱后进行末端修复、加polyA及连接测序接头。采用琼脂糖凝胶电泳筛选不同大小的片段，之后PCR扩增，建好上述7个文库。最后用Illumina GAIIx仪器进行双末端测序。原始的测序结果去除制备文库时产生的接头序列、两端低质量序列、低复杂度序列、长度小于75bp的序列，再利用SOAPdenovo软件进行7个文库转录组测序序列的从头混合组装，最后对各个序列作注释与分类。

实施例3

中国红豆杉剥皮再生不同时期TcSG基因表达水平的变化分析

搜索测序获得的中国红豆杉剥皮再生组织的转录组数据，本发明人筛选得到一个基因序列，并将它命名中国红豆杉促进木本植物茎生长基因(TcSG，Taxus chinensis StemGrowth Gene)。经NCBI的BLASTx比对及开放阅读框发现者(Open Reading Frame Finder)分析显示，它具有完整的开放阅读框。根据其开放阅读框的序列设计如下正向和反向引物：

正向引物5’-3’：CCTCCACTTGCAATCCCTAGA(SEQ ID NO：3)

反向引物5’-3’：CTTGGCTTGAGACAACCAGC(SEQ ID NO：4)

接着，用实时定量PCR技术对该基因在中国红豆杉剥皮再生不同时期表达水平的变化进行分析。将不同时期红豆杉剥皮再生的组织提取的600ng RNA用天根生化科技有限公司反转录试剂盒TIANScript RT Kit合成eDNA。实时定量PCR反应体系：模板cDNA 1μl，每对特异性正向和反向引物均为0.4μl(10μM)，SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)10μl，0.4μl ROX，用灭菌双蒸水补足20μl，具体操作步骤按SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal(KAPA，美国)说明书进行。内参基因Actin为看家基因，以灭菌双蒸水为模板作为空白对照。实时定量PCR反应条件为95℃30秒，随后95℃5秒、56℃34秒进行40个循环，反应在ABI7500仪器(ABI，美国)上进行。目的基因相对表达水平采用2^-△△ct方法(Methods，2001；25(4)：402-408)，所有反应均为两次生物学重复，三次技术性重复。结果见图1。由结果可见TcSG在中国红豆杉剥皮再生不同时期的表达水平都显著增加，以18D、30D和36D最为明显。

实施例4

RT-PGR法获得中国红豆杉TcSG蛋白的编码序列

本发明人在TcSG基因开放阅读框上下游设计如下正向和反向引物：

正向引物5’-3’：AGCCAGGGAAAGAGGCATGGTT(SEQ ID NO：5)

反向引物5’-3’：CTTGGCTTGAGACAACCAGC(SEQ ID NO：4)

利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增TcSG基因开放阅读框序列，具体步骤：

采用TakaRa的Max DNA Polymerase mix 12.5μl，引物0.6μl，cDNA模板1μl，用灭菌双蒸水补足25μl。PCR反应条件为94℃预变性1分钟，随后94℃变性15秒、52℃退火5秒、72℃延伸15秒进行35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR产物经过1.0％的琼脂糖电泳检测，回收连接到pEASY-T1载体上。将获得的PCR产物通过ABI 3730测序仪(中美泰和生物技术北京有限公司，北京)上进行测序。测序结果验证了中国红豆杉TcSG蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO：1)的正确性。

实施例5

pBI 121-TcSG载体的构建

TcSG用XbaI、SacI酶切后，连接到用XbaI和SacI酶切的pBI121中(参见http：//www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pBI121/)中，得到pBI121-TcSG表达载体。

实施例6

pBI 121-TcSG载体转化农杆菌

pBI 121-TcSG载体对农杆菌的转化包括如下步骤：

1.取出农杆菌GV3101感受态细胞在冰上溶解，取1μg的pBI121-TcSG的载体加入到100μl的农杆菌GV3101感受态细胞中，均匀混合。

2.放入电击转化槽中，按照仪器说明进行转化，选择bacteria程序EC2，电击后立刻取出，检查measurement，电压应该为2.5kv。

3.立即将1ml LB培养基加入到转化杯中，转移到1.5ml离心管中，28℃振荡培养4小时。

4.略微离心去除适量培养基后取50μl涂铺在含有适当抗生素的YEP平板上，28℃培养培养2-3天直至阳性克隆出现。

5.挑取适量的克隆在新的平板上划线，28℃培养。提取质粒或菌落PCR法筛选阳性克隆，即携带目标基因的农杆菌。

实施例7

含pBI 121-TcSG载体的农杆菌转化杨树

利用农杆菌介导的叶盘法转化84K杨树(Populus alba×Populus glandulosa)，同以未做侵染的84K杨树叶片外植体作为空白对照。农杆菌转化杨树包括如下操作步骤：

(1)农杆菌侵染液的制备：从平板上挑取含pBI 121-TcSG载体的农杆菌单菌落，接种到20mL附加相应抗生素(50mg/L卡那霉素，34mg/L利福平)的液体培养基(pH5.8)中，置于摇床上于27℃，180r/min培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时即可用于转化。

(2)侵染：于超净工作台上，从培养瓶中选取无菌苗从顶端数第4～5片生长旺盛的幼叶，用灭菌刀片在叶片上横向划取伤口(主要于叶脉处)后放入菌液中浸泡10-15分钟，期间轻轻摇动2～3次，以便叶片充分浸泡，取出外植体置于无菌滤纸上吸去多余菌液。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

(3)共培养：将侵染过的外植体接种在分化培养基上(MS+NAA 0.05mg/L+6-BA0.05mg/L)，在28℃暗培养条件下共培养2-4天，可见到外植体周围有农杆菌菌群。

(4)选择培养：将经过共培养的外植体转移到加有选择压(30mg/L卡那霉素)的脱菌(附加200mg/L的特美汀)分化培养基上，在光照周期16小时/8小时，25℃条件下进行选择培养。选择培养1-2周，直到叶盘边缘愈伤组织开始产生。

(5)继代选择培养：2-3周后，选择有生长淡绿色的、致密的愈伤组织的叶盘，更换一次选择培养基使愈伤组织更好的诱导分化。

(6)生根培养：待不定芽长到1厘米以上时，将其切下并插入含有选择压的生根培养基(MS+NAA 0.02mg/L+IBA 0.05mg/L)上进行生根培养，两周后长出不定根。

(7)温室培养：转化的组培苗不定根长至2-3厘米时，开瓶炼苗，移栽入营养土中，置于温室培养，作为分子鉴定和形态测定的材料。

实施例8

TcSG基因对杨树植株高度的影响

本发明人将转化的组培苗和未转化的组培苗(对照)移栽入营养土中并置于温室中培养。在温室中培养到3个月时，本发明人对比了含有额外TcSG基因的转基因杨树的植株和未转TcSG基因的杨树的植株的株高，结果见图2。由结果可见含有额外TcSG基因的转基因杨树植株显著变高。

实施例9

TcSG基因对杨树茎节间长度的影响

本发明人将转化的组培苗和未转化的组培苗(对照)移栽入营养土中并置于温室中培养。在温室中培养到3个月时，本发明人对比了含有额外TcSG基因的转基因杨树茎节间长度和未转TcSG基因的杨树茎节间长度，结果见图3。由结果可见含有额外TcSG基因的转基因杨树茎段节间显著变长。

实施例10

TcSG基因对杨树茎粗度的影响

本发明人将转化的组培苗和未转化的组培苗(对照)移栽入营养土中并置于温室中培养。在温室中培养到3个月时，本发明人对比了含有额外TcSG基因的转基因杨树茎粗度和未转TcSG基因的杨树茎粗度，结果见图3。由结果可见含有额外TcSG基因的转基因杨树茎粗度显著变大。

实施例11

转基因杨树中的TcSG基因表达水平分析

从含有额外TcSG的转基因杨树以及未转TcSG基因杨树(对照)的根、次生茎、初生茎、老叶、幼叶、韧皮部、木质部这些不同组织中分别提取600ng RNA，之后分别用天根生化科技北京有限公司反转录试剂盒TIANScript RT Kit合成cDNA。设计如下用于TcSG基因实时定量PCR分析的正向和反向引物：

正向引物5’-3’：CCTCCACTTGCAATCCCTAGA(SEQ ID NO：3)

反向引物5’-3’：TTCCATGGTCGTAAAGTTCCC(SEQ ID NO：6)

实时定量PCR反应体系：稀释四倍的cDNA模板2μl，每对特异性引物均为0.4μl(10μM)，SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)10μl，用灭菌双蒸水补足20μl，具体操作步骤按SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal(KAPA，美国)说明书进行。内参基因Actin为看家基因，以灭菌双蒸水为模板作为空白对照。PCR反应条件为：95℃5分钟，随后95℃5秒、56℃20秒、72℃10秒进行40个循环，反应在Roche lightcycler 480仪器(Roche，德国)上进行。目的基因相对表达水平采用2^-△△ct方法(Methods，2001；25(4)：402-408)，所有反应均为三次生物学重复，三次技术性重复。

结果显示，过量表达TcSG基因的转基因杨树的根(图5中H所示)、次生茎(图5中I所示)、初生茎(图5中J所示)、老叶(图5中K所示)、幼叶(图5中L所示)、韧皮部(图5中M所示)、木质部(图5中N所示)中TcSG基因的相对表达量分别为1.09，0.94，1.57，2.94，3.22，3.31，2.24，而未转TcSG基因杨树的根(图5中A所示)、次生茎(图5中B所示)、初生茎(图5中C所示)、老叶(图5中D所示)、幼叶(图5中E所示)、韧皮部(图5中F所示)、木质部(图5中G所示)中的TcSG基因相对表达量均为0，有额外TcSG基因的转基因杨树其TcSG基因表达水平比较高。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种分离的蛋白质的用途，所述的蛋白质是来自中国红豆杉(Taxus chinensis(Pilger)Rehd.)，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其特征在于，用于：促进木本植物茎的纵向和横向生长，增加木本植物植株的高度、节间的长度和茎的粗度，其中，所述木本植物是杨柳科植物杨树。

2.一种分离的蛋白质，所述的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码权利要求2所述的蛋白质。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3-4所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程的宿主细胞，其特征在于它含有权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利要求3-4所述的多核苷酸。

7.一种改良木本植物的方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有来自中国红豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)促进木本植物茎的纵向和横向生长蛋白质的DNA编码序列，所述的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)将木本植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述的来自中国红豆杉(Taxus chinensis(Pilger)Rehd.)促进木本植物茎的纵向和横向生长蛋白质的DNA编码序列导入木本植物细胞，并整合到木本植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入来自中国红豆杉(Taxus chinensis(Pilger)Rehd.)可促进木本植物茎的纵向和横向生长蛋白质的DNA编码序列的木本植物细胞或组织或器官；

(4)培养步骤(3)所述的木本植物细胞或组织或器官，将它们再生成植株，其中，所述木本植物是杨柳科植物杨树。