CN103130885A

CN103130885A - 来源于新疆野苹果的与植物生长相关的蛋白质及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103130885A
Application number: CN2013100840404A
Authority: CN
Inventors: 李天红; 袁华招; 刘芸; 沈欣杰; 廖雄; 王琪; 刘琳琳
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: CN103130885B

Abstract

本发明公开了来源于新疆野苹果的与植物生长相关的蛋白质及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质是如下a）或b）的蛋白质：a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；b）将SEQ ID No.2经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物生长相关的由a）衍生的蛋白质。该蛋白质及其编码基因可用于调控植物生长。

Description

来源于新疆野苹果的与植物生长相关的蛋白质及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及来源于新疆野苹果的与植物生长相关的蛋白质及其编码基因与应用。

背景技术

苹果是我国第一大果树树种，上世纪90年代中期以来，栽培面积、产量一直保持世界第一。至2011年，栽培面积3280万亩、产量3150万吨，分别占世界栽培面积的52%、产量的48%，出口量占全球苹果贸易量的12%。我国传统的苹果栽培方式是大冠稀植和乔砧栽培。土地利用率低，早果丰产性差，果实品质不易提高。自英国1917年选育出M系苹果矮化砧木后，生产实践证明，与乔砧密植比，矮砧密植结果早、产量高、品质好，节约劳动力，便于机械化作业和标准化生产，生产效率高。我国苹果矮化密植栽培的关键是培育出具有自主知识产权的优良矮化品种。从苹果中克隆与调控株高相关的基因将为苹果矮化品种的培育奠定物质基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一个与植物生长相关的蛋白质及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为MdGH3-1，来源于新疆野苹果（Malus sieversii (Ledeb.)Roem.），是如下a）或b）的蛋白质：

a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

b）将SEQ ID No.2经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物生长相关的由a）衍生的蛋白质。

其中，SEQ ID No.2由607个氨基酸残基组成。

为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的MdGH3-1可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的MdGH3-1的编码基因可通过将SEQ ID No.1的第75-1898位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码MdGH3-1的核酸分子也属于本发明的保护范围。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述核酸分子具体可为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：

1）编码MdGH3-1的DNA分子；

2）其编码序列是SEQ ID No.1的第75-1898位核苷酸的DNA分子；

3）核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

4）核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子；

5）在严格条件下与2）限定的DNA分子杂交且编码MdGH3-1的DNA分子；

6）与2）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码MdGH3-1的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，SEQ ID No.1由2095个核苷酸组成，是MdGH3-1的cDNA基因，其编码序列是第75-1898位，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。SEQ ID No.3由2643个核苷酸组成，是MdGH3-1的基因组基因，第1-364位为第一外显子，第365-442位为第一内含子，第443-546位为第二外显子，第547-665位为第二内含子，第667-1510位为第三外显子，第1511-1860位为第三内含子，第1861-2643位为第四外显子，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。

下述1）-4）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

1）含有编码MdGH3-1的核酸分子的表达盒；

2）含有编码MdGH3-1的核酸分子的重组载体；

3）含有编码MdGH3-1的核酸分子的重组微生物；

4）含有编码MdGH3-1的核酸分子的转基因细胞系。

上述生物材料中，1）所述的含有编码MdGH3-1的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达MdGH3-1的DNA，该DNA不但可包括启动MdGH3-1基因转录的启动子，还可包括终止MdGH3-1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。2）所述的含有编码MdGH3-1的核酸分子的重组载体具体可为在载体pCB302-3的多克隆位点插入MdGH3-1编码基因得到的表达MdGH3-1的重组表达载体。3）所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）,欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）,产碱菌属（Alcaligenes）,假单胞菌属（Pseudomonas）,芽胞杆菌属（Bacillus）等。4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

本发明还保护编码MdGH3-1的核酸分子、编码MdGH3-1的核酸分子或上述任一种生物材料在调控植物生长中的应用。

其中，所述生长为营养生长和/或生殖生长，所述营养生长可为根系的生长、茎的生长和/或叶的生长。

当所述植物为十字花科植物时，所述生殖生长为花薹的生长和/或角果的生长。

本发明还提供了一种培育具有下述A-C中至少一种性状的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育具有A-C中至少一种性状的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入编码MdGH3-1的核酸分子得到所述转基因植物的步骤；

A、所述转基因植物与所述受体植物相比，侧根数目减少；

B、所述转基因植物与所述受体植物相比，叶片变小；

C、所述转基因植物与所述受体植物相比，株高变小。

上述应用和方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

当所述植物为十字花科植物，所述转基因植物还具有D-F中的至少一种性状：

D、所述转基因植物与所述受体植物相比，花薹高度降低；

E、所述转基因植物与所述受体植物相比，花薹数量增多；

F、所述转基因植物与所述受体植物相比，角果变小。

在本发明的一个实施例中，所述调控植物生长为调控拟南芥生长。所述转基因植物为转基因拟南芥。

其中，所述MdGH3-1基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1）根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述MdGH3-1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。

所述MdGH3-1基因可通过MdGH3-1基因表达盒或含有所述MdGH3-1基因表达盒的MdGH3-1基因表达载体导入目的植物。

本发明中所述MdGH3-1基因表达盒均可含有所述MdGH3-1基因和启动所述MdGH3-1基因转录的启动子。本发明中所述MdGH3-1基因表达盒均指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.2所示的MdGH3-1的DNA，该DNA不但可包括启动所述MdGH3-1基因转录的启动子，还可包括终止所述MdGH3-1基因转录的终止子。进一步，所述MdGH3-1基因表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人（1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利200710099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev.,5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。在本发明的实施例中，所述MdGH3-1基因表达盒中启动所述MdGH3-1基因转录的启动子为花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S，终止所述MdGH3-1基因转录的终止子为NOS终止子。

可用现有的植物表达载体构建含有所述MdGH3-1基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

在本发明的实施例中，所述选择标记基因为赋予对抗生素潮霉素抗性的潮霉素B磷酸转移酶（hph）基因hyg。在本发明的实施例中，所述MdGH3-1基因通过含有所述MdGH3-1基因表达盒的MdGH3-1基因表达载体导入目的植物。所述MdGH3-1基因表达载体是载体pCB302-3的多克隆位点插入MdGH3-1编码基因得到的表达MdGH3-1的重组表达载体pCB302-3-MdGH3-1。

所述MdGH3-1基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998，Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

所述方法还包括从导入MdGH3-1的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因植物的步骤。

所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

实验证明，导入SEQ ID No.2所示的MdGH3-1的编码基因的转基因拟南芥与受体拟南芥相比，具有下述A至E的性状：A、所述转基因植物与所述受体植物相比，侧根数目减少；B、所述转基因植物与所述受体植物相比，叶片变小；C、所述转基因植物与所述受体植物相比，株高变小；D、所述转基因植物与所述受体植物相比，花薹高度降低；E、所述转基因植物与所述受体植物相比，花薹数量增多。说明MdGH3-1及其编码基因可用于调控植物生长。

附图说明

图1为pCB302-3-MdGH3-1重组质粒酶切验证电泳图谱。

M为DNA MarkerⅢ，1,2为重组质粒pCB302-3-MdGH3-1酶切结果。

图2为转基因拟南芥的PCR鉴定图谱。

M为DNA MarkerⅢ；WT：哥伦比亚生态型拟南芥；1-7为拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系。

图3为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2和L-3中MdGH3-1基因表达检测。

WT：哥伦比亚生态型拟南芥。

图4为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2和L-3以及受体拟南芥——哥伦比亚生态型拟南芥（WT）在1/2MS培养基中培养11天的根系照片。

图5为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2和L-3以及受体拟南芥——哥伦比亚生态型拟南芥（WT）在1/2MS培养基中培养11天的主根长度。

图6为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2和L-3以及受体拟南芥——哥伦比亚生态型拟南芥（WT）在1/2MS培养基中培养11天的侧根数目。

图7为受体拟南芥——哥伦比亚生态型拟南芥（WT）在含有不同浓度的生长素的1/2MS培养基中培养11天的根系照片。

图8为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1在含有不同浓度的生长素的1/2MS培养基中培养11天的根系照片。

图9为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-2在含有不同浓度的生长素的1/2MS培养基中培养11天的根系照片。

图10为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2和L-3以及受体拟南芥——哥伦比亚生态型拟南芥（WT）的种子接入1/2MS培养基中生长11天后转移至土中生长8周的植株照片。

图11为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2和L-3以及受体拟南芥——哥伦比亚生态型拟南芥（WT）的种子接入1/2MS培养基中生长11天后转移至土中生长8周的花薹高度。

图12为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2和L-3以及受体拟南芥——哥伦比亚生态型拟南芥（WT）的种子接入1/2MS培养基中生长11天后转移至土中生长8周的花薹数量。

图13为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2以及受体拟南芥——哥伦比亚生态型拟南芥（WT）的种子接入1/2MS培养基中生长11天后转移至土中生长8周的莲座叶形态学观察。

图14为T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2以及受体拟南芥——哥伦比亚生态型拟南芥（WT）的种子接入1/2MS培养基中生长11天后转移至土中生长8周的果实形态学观察。

上述图5、6、11和12中，转基因株系及受体拟南芥平均值及标准差取自20棵植株（D,E,F,G）;平均值及标准差来自三次重复（Student’s t-test,**P<0.01,*P<0.05）；WT：哥伦比亚生态型拟南芥。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RNase-Free DNase Ⅰ、限制性内切酶BamH Ⅰ与Xba Ⅰ，T4DNA连接酶，购自TAKARA公司，KOD plus DNA聚合酶购自东洋纺公司，M-MLV反转录酶购自Promega公司，DNA Marker购自中科瑞泰北京生物技术有限公司。氨苄青霉素、硫酸卡钠酶素、利福平购自北京新经科生物技术有限公司。离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京汇天东方科技有限公司，离心柱型质粒小量提取试剂盒购自北京博大泰恒生物技术有限公司。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105购自北京博大泰恒生物技术有限公司。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105购自北京博大泰恒生物技术有限公司。哥伦比亚生态型拟南芥（Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.NATURE.VOL408.14DECEMBER2000.www.nature.com）、双元植物转化载体pCB302-3（Chengbin Xiang.etal.A mini binary vector series for plant transformation.Plant Molecular Biology40:711–717,1999）公众可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。

实施例1、MdGH3-1基因的克隆及转基因载体的构建

一、MdGH3-1基因的克隆

以新疆野苹果（Malus sieversii (Ledeb.)Roem.）水培苗为材料，CTAB法提取其叶片总RNA，以RNA为模板，反转录成cDNA。再以cDNA为模板，利用RT-PCR方法扩增MdGH3-1全长cDNA,PCR产物回收后进行末端加A反应，加A产物进行纯化后连接到pMD18-T克隆载体上获得质粒pMD18-T/MdGH3-1,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中送公司进行测序。其中，RT-PCR引物如表2所示。

表2、RT-PCR引物

引物名称	引物序列
		MdGH3-1-L	5′-CAGTGAGTGACGTCCTAGAATCG-3′
MdGH3-1I-R	5′-CCAAATCCAACATACACAATGAGAG-3′

其中，PCR程序为：94℃3min；94℃15sec，58℃30sec，68℃2min40sec，35Cycles；68℃10min。

将测序结果表明含有SEQ ID No.1的DNA分子的重组载体命名为pMD18-T-MdGH3-1。MdGH3-1的cDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码序列是第75-1898位核苷酸，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质MdGH3-1。

二、MdGH3-1基因表达载体的构建

根据MdGH3-1全长的ORF序列设计引物GH3-1F1、GH3-1R1，并引入pCB302-3真核表达载体的酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ。其中，PCR引物如表3所示。

表3、PCR引物

引物名称	引物序列
		GH3-1F1	CGGGATCCATGATTCCCAGATATAATCCA（划线部分为BamHⅠ酶切位点）
GH3-1R1	GCTCTAGATTATTGAGTCTCTATTCTAAATGGC（划线部分为XbaⅠ酶切位点）

以质粒pMD18-T/MdGH3-1为模板，以GH3-1F1、GH3-1R1为引物进行PCR反应扩增MdGH3-1基因全长。其中，PCR程序为：94℃3min；94℃15sec，65℃30sec，68℃2min40sec，35Cycles；68℃10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，回收并纯化目的片段，BamHⅠ与XbaⅠ双酶切后与BamHⅠ与XbaⅠ双酶切的pCB302-3植物表达载体连接，得到MdGH3-1基因表达载体pCB302-3-MdGH3-1。pCB302-3-MdGH3-1的BamHⅠ与XbaⅠ双酶切鉴定结果如图1所示，pCB302-3-MdGH3-1经BamHⅠ与XbaⅠ酶切后得到1800bp左右的片段。pCB302-3-MdGH3-1含有序列表中序列1的第75-1898位的MdGH3-1基因的编码序列。

实施例2、培育转MdGH3-1基因拟南芥

本实施例的实验证明，导入SEQ ID No.2第75-1898位核苷酸所示的MdGH3-1的编码基因的转基因拟南芥与受体拟南芥相比，具有下述A至E的性状：A、所述转基因植物与所述受体植物相比，侧根数目减少；B、所述转基因植物与所述受体植物相比，叶片变小；C、所述转基因植物与所述受体植物相比，株高变小；D、所述转基因植物与所述受体植物相比，花薹高度降低；E、所述转基因植物与所述受体植物相比，花薹数量增多。说明MdGH3-1及其编码基因可用于调控植物生长。具体的实验方法和实验结果如下：

一、转基因拟南芥的获得

将pCB302-3-MdGH3-1重组质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，接种于10mlYEB液体培养基中（含100ug/ml Kan卡那霉素，100ug/ml利福霉素)，28℃200rpm振荡培养过夜。转化前一天按1:50比例接种于200ml YEB液体培养基(含100ug/ml卡那霉素Kan，100ug/ml利福霉素)中继续培养至OD₆₀₀为1.2-1.6,5000rpm离心15min，重悬于渗入缓冲液使OD₆₀₀为0.8-1.0。哥伦比亚生态型拟南芥抽薹4-5cm时剪去顶端花序，使腋生花序生长，剪时伤口应位于最高的茎生叶上方，约4-5天后进行转化，转化前充分浇水且将大的花蕾去掉。转化的时候，把整株拟南芥与花盆一起倒扣在盛有200ml菌液的容器中浸泡3min，浸泡结束后取出花盆，侧着放在托盘中，在黑暗条件下放置24h，在这之后，花盆直立放置，在正常的光照下培养，待果荚成熟时收获T₀代种子。将T0代种子播于土钵中，有两片真叶长出时，喷施0.1%的除草剂Basta筛选，提取阳性苗用GH3-5F1和GH3-5R1进行PCR鉴定。将鉴别出的PCR阳性苗继续培养收获T1代种子，播种、喷施除草剂筛选，选取经卡方检验符合孟德尔遗传定律3:1分离比的植株，单株收获T2代种子，播种、喷施除草剂，选取未分离的植株收种，即为T3代单拷贝纯合转基因种子，将其命名为拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1作为后期表型分析及功能验证的材料。

T0代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1的PCR鉴定结果如图2所示，哥伦比亚生态型拟南芥（受体植物）没有MdGH3-1基因的PCR产物，7个拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系中均得到MdGH3-1基因的PCR产物。

分别提取其中的3个T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2和L-3植株的总RNA，在oligo(dT)引导下反转录成第一链cDNA，以上述GH3-1F1和GH3-1R1为引物进行PCR检测在转基因拟南芥中MdGH3-1基因的表达水平，同时将AtACTIN2作为内参照基因，其扩增引物为：Forward5'-TTGACTACGAGCAGGAGATGG-3'；Reverse5'-CAAACGAGGGCTGGAACAAG-3'。结果如图3所示，2个T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1和L-2中均表达MdGH3-1基因，T3代拟南芥col/ pCB302-3-MdGH3-1株系L-3中几乎没有检测到MdGH3-1基因的表达。

二、MdGH3-1转基因拟南芥表型分析及功能鉴定

将3个T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2和L-3、哥伦比亚生态型拟南芥的种子接入1/2MS培养基中，在22℃中培养，11天时测量主根长度、侧根数量。

将在上述条件下在1/2MS培养基培养11天的拟南芥植株转移至土壤中培养8周天至种子成熟，测量花薹数量和花薹高度，取相同部位的叶片和角果进行拍照。

结果表明3个T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2和L-3转基因植株主根长度与哥伦比亚生态型拟南芥（野生型，以WT表示）（图4和图5）无显著差异，T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1和L-2的侧根数目显著低于哥伦比亚生态型拟南芥（野生型，以WT表示）（图4和图6），T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-3的侧根数目与哥伦比亚生态型拟南芥（野生型，以WT表示）（图4和图6）无显著差异。T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1和L-2的花薹高度显著低于哥伦比亚生态型拟南芥（野生型，以WT表示）（图10和图11），T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-3的花薹高度与哥伦比亚生态型拟南芥（野生型，以WT表示）（图10和图11）无显著差异。T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1和L-2的花薹数显著高于哥伦比亚生态型拟南芥（野生型，以WT表示）（图10和图12），T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-3的花薹数与哥伦比亚生态型拟南芥（野生型，以WT表示）（图10和图12）无显著差异。T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1和L-2的叶片和角果大小显著低于哥伦比亚生态型拟南芥（野生型，以WT表示）（图13和图14）。

说明MdGH3-1蛋白及其基因具有调控植物营养生长（根的生长、茎的生长和叶的生长）和生殖生长（花薹的生长和角果的生长）的功能。

将2个T3代拟南芥col/pCB302-3-MdGH3-1株系L-1、L-2、哥伦比亚生态型拟南芥的种子分别接入含有不同生长素浓度的1/2MS培养基中，在22℃中培养，11天时移出拍照观察。结果如图7，8和9所示，表明拟南芥WT,L-1，L-2在生长素浓度梯度下侧根恢复，主根变短。表明转基因拟南芥侧根变少的原因可能是MdGH3-1表达降低了拟南芥体内生长素浓度，影响侧根发育。