CN104946664B

CN104946664B - 一种杨树耐盐有关基因PeHKT1及其表达蛋白和应用

Info

Publication number: CN104946664B
Application number: CN201510360679.XA
Authority: CN
Inventors: 胥猛; 陈彩慧; 徐立安; 黄敏仁
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: CN104946664A

Abstract

本发明公开了一种杨树耐盐有关基因PeHKT1及其表达蛋白和应用，该杨树耐盐重要基因PeHKT1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该杨树耐盐重要基因PeHKT1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明以南林895杨初生不定根为材料，通过RACE技术克隆了PeHKT1基因。同时，采用通路克隆技术构建其杨树过量表达载体pH35GS‑PeHKT1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeHKT1可在杨树体内高效表达，从而可提高杨树的抗盐性，所以PeHKT1基因是杨树响应盐胁迫的重要基因，在林木基因工程领域有重要应用价值。

Description

一种杨树耐盐有关基因PeHKT1及其表达蛋白和应用

技术领域

本发明属于杨树基因技术领域，具体涉及一种杨树耐盐有关基因PeHKT1及其表达蛋白和应用。

背景技术

杨树是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种，加快杨树育种的应用基础研究具有紧迫性和必要性。据第七次全国森林资源清查统计，截止2008年底，我国杨树人工林总面积已超过700万公顷，居世界第一，杨树木材产量占全国木材总量的30%左右。土壤盐渍化是严重制约农业生产的一个全球性问题。选育和创制耐盐新种质，提高植物对盐渍化环境的适应能力，是减轻土壤盐渍化危害以及开发利用沿海滩涂等极端生境资源的重要途径。

HKT (High-Affinity K⁺Transporter)是一类存在于真核和原核生物中的阳离子转运载体蛋白家族，具有Na⁺转运以及K⁺-Na⁺同向转运的双重功能，它们在植物响应盐胁迫过程中起着重要的作用。不同植物种甚至同种植物的不同HKT成员之间存在功能差异，研究认为，拟南芥AtHKT1;1作用机制主要为韧皮部装载-循环模式(Na⁺ loading into phloem)(Berthomieu et al. 2003)和木质部外排-卸载(Na⁺ exclusion from xylem) (Sunarpiet al. 2005; Horie et al. 2006; Davenport et al. 2007 )。

目前，在杨树中尚未有HKT基因家族克隆和功能研究的相关报道。在杨树中克隆和开发利用这些基因资源，不仅有助于阐明杨树抗逆的分子调控机制，为杨树抗性育种提供理论依据，而且可以培育新的转基因耐盐品种，对开发利用沿海滩涂等极端生境资源具有不可估量的价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杨树耐盐重要基因PeHKT1。本发明的另一目的是提供一种杨树不定根发育关键基因PePeHKT1的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种杨树耐盐重要基因PeHKT1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

含有所述的杨树耐盐重要基因PeHKT1的载体。所述载体在PeHKT1:1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S。所述载体在PeHKT1基因的3’端组装有强终止子NOS。所述载体组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选。所述载体组装有能促使组装于其间的PeHKT1基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中的LB和RB序列。

含有所述的杨树耐盐重要基因PeHKT1的宿主细胞。

所述的杨树耐盐重要基因PeHKT1在杨树抗盐胁迫中的应用。

所述的杨树耐盐重要基因PeHKT1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

有益效果：本发明以南林895杨初生不定根为材料，通过RACE技术克隆了PeHKT1基因。同时，采用通路克隆技术构建其杨树过量表达载体pH35GS-PeHKT1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeHKT1可在杨树体内高效表达，从而可提高杨树的抗盐性，所以PeHKT1基因是杨树响应盐胁迫的重要基因，在林木基因工程领域有重要应用价值。

附图说明

图1是植物表达载体pH5GS的结构示意图；

图2是PeHKT1基因在不同浓度NaCl胁迫下杨树不定根发中的表达模式图；

图3是过量表达PeHKT1的转基因杨的分子检测图；

图4是过量表达PeHKT1的转基因杨与未转基因杨的整体形态对比图，图中，左边为转基因杨，右边为未转基因杨；

图5是过量表达PeHKT1的转基因杨与未转基因在4%NaCl胁迫下比较图，图中，左边到右依次为未转基因杨正对照，未转基因杨负对照，转基因杨。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中未进行详尽说明的操作可参照生物学实验手册、相关试剂盒使用说明以及生物领域中的常规操作实现。

实施例1通过RACE技术克隆PeHKT1基因

以895杨cDNA为模板，使用Oligo 6设计特异性引物，扩增PeHKT1基因短片段，其中，PeHKT1短片段正向引物为：5’-TGGACTCCAAAGCCAGAGCAA-3’，PeHKT1短片段反向引物为：5’-CCAAACCATGCATCCTTGCA-3’。

高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer (Mg²⁺ free) 5.0μl；2.5mM dNTPMixture 8.0μl；25mM Mg²⁺ 5.0μl；LA Taq DNA Polymerase(5U/μl) 0.5μl；正向引物(10μM) 2μl；反向引物 (10μM) 2μl；模板（895杨cDNA）1μl；加无菌ddH₂O 补足 50μl。

反应程序：预变性94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃10min。对产物测序，获得的PeARF17.1基因短片段序列如SEQ ID NO.3所示。

依据上述PeHKT1基因短片段序列设计3’末端的RACE引物，进行3’RACE，获得3’cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序，Blast确认上述片段与其它植物相关的基因同源。以相同的方法，根据获得的正确的3’ cDNA末端片段序列设计5’末端的RACE引物，进行5’RACE，获得5’ cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序。

3’RACE正向引物：3' RACE gene-specific outer primer：5'-ATCTATTGTCGATCTCTCCATC-3’，3' RACE gene specific inner primer：5'-TGCCGAAAAAGCAACAGGAAGAGGTTGA-3’；3' RACE Outer Primer：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3’，3' RACE Inner Primer：5'-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3’；5' RACE Outer Primer：5'-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3’，5' RACE Inner Primer：5'-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3’；5' RACE gene-specific outer primer：5'-AGAACCCGACATTTCCGTATGC-3’，5' RACE gene specific inner primer：5'-GGTGAGAACAACAGGCACTGAACCAAAGAC-3’。

（1）3' RACE 反应

1）反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：1μgTotal RNA，4μL dNTP Mix，2μL 3' RACE Adapter，2μL 10X RT Buffer，1μL RNaseInhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water补齐20μL。轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1h；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物。

2）3' RACE巢式PCR

反应体系：Outer 3' RACE Component：5.0μL 10×LA PCR Buffer（Mg²⁺ Free），5.0μL MgCl₂（25mM），8.0μL dNTP Mixture（each 2.5mM），2.0μL 3' RACE gene-specificouter primer，2.0μL 3' RACE Outer Primer（10μM），1μL RT reaction product，0.5μLTakaRa LA Taq（5U/μL），26.5μL Nuclease-free Water，Total volume50μL。Inner 3'RACE Component：5.0μL 10×LA PCR Buffer（Mg²⁺ Free），5.0μL MgCl₂（25mM），8.0μL dNTPMixture（each 2.5mM），2.0μL 3' RACE gene specific inner primer，2.0μL 3' RACEInner Primer（10μM），1μL Outer 3' RACE PCR product，0.5μL TakaRa LA Taq（5U/μL），26.5μL Nuclease-free Water，Total volume50μL。

反应程序：94℃，3min；94℃，30sec，60℃，30sec，72℃，2min，35cycles；72℃，7min。

3）纯化片段与克隆载体的连接反应：采用TaKaRa公司的pMD19-T simple Vetor克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进。反应体系（5μL）：2.2μL纯化回收的PCR产物，0.3μL pMD-19 Simple Vector，2.5μL Solution I。反应条件：16℃ 2min；4℃过夜。

4）大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化；取5μL纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μL感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；加入800μL LB液体培养基，37℃&100rmp 摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层800μL培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。

5）阳性克隆筛选及测序分析：从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃&250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。反应体系（20.0μL）：2.0μL 10×PCR Buffer（Mg²⁺free），1.2μL MgCl₂（25mM），1.6μL dNTPMixture （each 2.5mM），1.0μL 3' RACE gene specific inner primer（10μM），1.0μL 3'RACE Inner Primer（10μM），1.0μL菌液，0.2μL rTaq，12.0μL Milli-Q Water。反应程序：94℃，3min；94℃，30sec，60℃，30sec，72℃，1min，30cycles；72℃，7min。菌液PCR检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司（上海）测序鉴定。

（2）5' RACE 反应

1）RNA处理（RNA Processing）

CIP反应，将如下成分加入到RNase-free的小离心管中：10μg Total RNA，2μL 10XCIP buffer，2μL Calf Intestine Alkaline Phosphatase （CIP），Nuclease-free Water补齐20μL。轻混匀，短暂离心；37℃温育1h。加入以下试剂到CIP反应离心管：15μL AmmoniumAcetate Solution，115 μL Nuclease-free Water，150 μL acid phenol:chloroform。充分涡旋，室温高速离心（≧10000 g）5min。转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL氯仿，充分涡旋，室温高速离心（≧10000 g）5min。转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL异丙醇，充分涡旋，冰浴10min。最大转速离心20min，用0.5ml预冷的70%乙醇冲洗沉淀，最大转速离心5min，小心弃乙醇，气干沉淀。以11μLNuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP’RNA，冰上放置进一步用于TAP反应，或者-20℃保存。TAP反应，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：5μL CIP’d RNA （from f above），1μL 10X TAP buffer，2μLTobacco Acid Pyrophosphatase（TAP），2μL Nuclease-free Water。轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得CIP/TAP-treated RNA ；进入接头连接步骤，或-20℃保存反应物。5'RACE接头连接，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：2μL CIP/TAP-treatedRNA，1μL 5' RACE Adapter，1μL 10X RNA Ligase Buffer，2μL T4 RNA Ligase（2.5U/μL），4μL Nuclease-free Water。轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得Ligated RNA；进入反转录步骤，或-20℃保存反应物。

2）反转录（Reverse Transcription）：将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中；2μL Ligated RNA，4μL dNTP Mix，2μL Random Decamers，2μL 10X RTBuffer，1μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-freeWater补齐20μL。轻轻混匀，短暂离心；42℃温育1h，即得RT reaction；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物。

3）5' RACE巢式PCR：反应体系、反应条件与3' RACE的巢式PCR一致。

4）PCR产物克隆测序，操作与3' RACE克隆一致，获得基因序列片段。Blast确认该片段与毛果杨PtHKT1基因高度相似。

采用BioEdit软件对3' RACE和5' RACE序列进行比对拼接，并使用FGENESH(http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic =fgen)预测其阅读框。根据基因全长序列设计引物（扩增子包含起始密码子及终止密码子），再次进行PeHKT1基因的全长扩增和测序验证。其中，PeHKT1 ORF正向引物为：5'-ATGAAGAGCTTTGCTAGT-3’，PeHKT1 ORF反向引物为：5'-CTAGGATAGCTTCCAAGCTTTACCA-3'；高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺ free) 5.0μl；2.5mM dNTP Mixture 8.0μl；25mM Mg²⁺ 5.0μl；LA Taq DNAPolymerase(5U/μl) 0.5μl；正向引物(10μM) 2μl；反向引物 (10μM) 2μl；模板（895杨cDNA）1μL；加无菌ddH₂O 补足 50μL。反应程序：预变性94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 10min。

最终获得基因全长cDNA序列为2173bp，包含一个1608bp的完整阅读框，命名为PeHKT1基因，序列如SEQ ID NO.1所示，其所编译表达蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2 PeHKT1基因植物表达载体构建

利用通路克隆技术构建PeHKT1基因的过量表达载体。使用特异PCR引物（实施例1的PeHKT1 ORF引物），以cDNA为模板，进行PCR扩增，将PeHKT1基因ORF构建到入门载体。入门载体为pCR^TM8/GW/TOPO^TM vector (Invitrogen)。反应体系为：Fresh PCR product(purified) 80ng；Salt solution 0.5μl；pCR^TM8/GW/TOPO^TM vector 0.5μl；加无菌ddH₂O补足3μl。反应程序为：22℃反应2h。

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，带PeHKT1基因的入门载体与植物表达载体pH35GS进行LR反应。载体质粒如图1所示。反应体系为：linearizedentry clone 50ng；purified destination vector 75ng；LR Clonase enzyme mix0.5μl；加TE(pH 8.0)补足2.5μl；。反应条件：25℃ 2-3h。经LR反应后PeARF17.1基因导入植物表达载体pH35GS中，在PeHKT1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，它能使PeHKT1基因在杨树体内高效表达；在PeHKT1基因的3’端组装了强终止子NOS，可有效终止PeHKT1基因的转录；在载体质粒上组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选；在载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeHKT1基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pH35GS- PeHKT1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeHKT1可在杨树体内高效表达。

实施例3 PeHKT1基因的遗传转化

通过液氮冻融法将所构建的pH35GS-PeHKT1过量表达载体转入农杆菌菌株EHA105（Invitrogen），通过农杆菌介导将PeHKT1基因转入杨树。对杨树进行PeHKT1基因遗传转化试验，具体如下：

利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测PeHKT1基因在不同浓度NaCl胁迫下杨树不定根发中的表达模式，将生长45天的南林895杨组培苗，分别用含300mM/L和100mM/LNaCl MS培养基进行盐胁迫处理，于2h，6h，12h，24h，48h，72h取根，茎，叶，三个重复，以未作盐胁迫处理的为对照，经液氮速冻后，-75℃超低温冰箱保存备用。分别提取RNA，反转为cDNA（TAKARA），反转录体系为：5×PrimerScript Buffer（for Real Time）4.0μl ；PrimerScript RT Enzyme MixⅠ1.0μl；Oligo dT Primer (50μl) 1.0μl；Random 6 mer(10μM) 1.0μl；Total RNA 1μl（1μg/L）；RNase Free dH2O 补足20μl；反应条件：37℃15min；85℃ 5s；4℃ forever。

利用在线软件(https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer)设计实时定量引物，其中正向引物序列为：5'-GGCTATAGCTGCAAACGACA-3’，反向引物为：5'-AAGCCTTCCGAAGAGCATTA-3’；所用内参基因为已筛选的Efla基因（GenBank accessionnumber：AJ536671），正向引物序列为：5'-GGCAAGGAGAAGGTACACAT-3’，反向引物为：5'-CAATCACACGCTTGTCAATA-3’。qRT-PCR所用试剂为SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Roche)，在ABI 7500 Real time PCR Systems (Applied Biosystems，CA)上完成，每反转录样品三次重复，实验数据提取、分析采用7500 System SDS software (AppliedBiosystems，CA)，分析使用的参数为系统默认值。qRT-PCR反应体系：FastStart UniversalSYBR Green Master 10.0μl；正向引物(10μM) 0.6μl；反向引物 (10μM) 0.6μl；反转录cDNA（稀释3倍）3.0μl；灭菌ddH2O补足20μl。qRT-PCR反应条件：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环。

结果如图2和图3所示，图2是PeHKT1基因在不同浓度NaCl胁迫下杨树不定根发中的表达模式图；图3是过量表达PeHKT1的转基因杨的分子检测图。

采用PCR扩增技术可以快速，简便地对转基因植株进行初步的分子检测，以判断外源基因是否转入受体植物的基因组，对获得的不同转基因杨树苗进行半定量PCR和实时定量PCR检测。qRT-PCR方法同上。采用Oligo6.6设计半定量引物，其中正向引物序列为：5'-TCTTCGGCAACAGTTTCAAG-3’，反向引物为：5'-CCACACAAGCAAGGCTCTTA-3’；所用内参基因为18s基因（GenBank accession number：Z28335），正向引物序列为：5'-TCAACTTTCGATGGTAGGATAGTG-3’，反向引物为：5'-CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT-3’。半定量PCR反应体系：TakaRa rTaq(5U/μl) 1.0 μl；10×PCR Buffer(Mg²⁺ Free)2.0 μl；MgCl2（25mM）1.5 μl；dNTP Mixture（2.5 mM each）1.3 μl；正向引物(10μM) 1μl；反向引物 (10μM) 1μl反转录产物 2.0μlMilli-Q Water 灭菌ddH₂O补足20μl。反应程序：4℃，3min；94℃ 30s，55℃，30s，72℃，2min，25个循环；72℃，5min，4℃ Forever。PCR反应结束后，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用BIO RAD紫外成像系统进行观察、拍照。

为了检测转植株的抗盐性，本实验在无菌条件下，选取30d左右生长状态基本一致转基因苗（不同的转基因系），分别用含浓度为0.2%，0.3%，0.4%和0.5%NaCl的MS培养基进行盐胁迫处理，以未转基因植株盐处理为负对照，同时以未转基因的植株为正对照，每个浓度梯度5个重复，观察转基因植株的生长状况。

结果如图4和图5所示，图4是过量表达PeHKT1的转基因杨与未转基因杨的整体形态对比图，图中，左边为转基因杨，右边为未转基因杨；图5是过量表达PeHKT1的转基因杨与未转基因在4%NaCl胁迫下对比图，图中从左边到右依次为未转基因杨正对照，未转基因杨负对照，转基因杨。

过量表达PeHKT1的转基因杨抗盐性试验结果初步表明，转基因植株耐盐性高于未转基因植株，说明PeHKT1基因是杨树响应盐胁迫的重要基因，在林木基因工程领域有重要应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种杨树耐盐有关基因PeHKT1及其表达蛋白和应用

<130> 100

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2173

<212> DNA

<213> 南林895杨

<400> 1

gaaagtaatt gaagctaaaa gaaatttttt gtttagaatc acctttctat tccgatactg 60

catatattct ggttttgcta gatcattctc tacacatacc taacctacgc taaacagttg 120

ccaaatacta taaacaagca ttcctgcccc tttgatttct ttttctatta ttccactaag 180

cttgcatgat tagcagccac tcattcacag tgaattccaa ctaaagttgg tgttctatcg 240

actagctagc tagctcgatc agtagggtcc gtattgctct tttataaaca ccatatccga 300

ttgaggtgca aattaatttc ttgttagtac agatgaagag ctttgctagt tttggtaaga 360

aattagagcg ccctcgtaat ttcttttgca acaaagtaag ttgcttccat aaatcttcca 420

tgtattcaat ccggtccttc cttcaagtat tagtctttca aatacaccgt ttttgggttc 480

aacttgctta ttttgtaatc ctttccttgg ttggacatac ggctttgaag gtttcaaagc 540

caagacctgg ctcattaagg cctgcaagcc ttgacatctt ctttacttct gtttcttcgg 600

caacagtttc aagcatgtca acggtggaaa tggaggtctt ctctaacacc caacttatca 660

tcatgaccat tttgatgtta ttgggtggag aggtcttcac ttccatcctt ggactttatc 720

tgtcaaggtt caaattctct aaacatgaaa ccaaggaaag tagagtctct tctgtttacc 780

acaatcctcc aaaacgtacc aactttccag ggctagagat tgagaaacca accaatgtag 840

acctagaatg taatctcaac tctttagaca atgatcacag tctcaagttg aactcactta 900

agagccttgc ttgtgtggct atgggctatt tttcagttgt tcacataact ggttctagtt 960

tagttgctat gtatacaagc cttgttccta gtgcaagaca agtcctgggc agtaaaggaa 1020

ttaagattca gacattttct gtgttcacca cagtctctac cttttccaac tgtggttttg 1080

tgcctacaaa tgagaacatg gtagctttca agaggaatcc aggtctccta ctcattctca 1140

tccctcaaat tcttcttgga aacacattat acccatcatg cctgcgattt ctgatctgga 1200

ttttggagaa aatcacaagg aaagtggagt tcagatacat tctgatgaat actagagaga 1260

tgggctatgg ccatttgcta tccttttctc attcgtgcct tctcgctatc acagtctcgg 1320

ggtttatact ggtgcagttc atactctttt gctccatgga gtggaattca ggagctatgg 1380

atggtctgaa tccctatcag aagttgatgg gtgcattgtt tcaggttgta aattcaaggc 1440

ataccggtga atctattgtc gatctctcca tcatctctcc agcaatcttg gtgctcttcg 1500

tggttatgat gtatctccca ccatacactt cattgatgcc gaaaaagcaa caggaagagg 1560

ttgattcaga aactggccaa aaatgcaaag accaaaggaa gtctttggtt cagtgcctgt 1620

tgttctcacc tttatctact ttagccatct ttgtgattct catttgcgtc tcagagggag 1680

agaagttgaa taaagaccct ctcaacttca acgtactcaa tatcaccata gaagtcataa 1740

gtgcatatgg aaatgtcggg ttctcaactg gctatagctg caaacgacaa cttgaacctg 1800

atagctcgtg caaggatgca tggtttgggt ttgttggaag gtggagtagc ctgggaaaaa 1860

ttatcctcat cttagtaatg ctcttcggaa ggcttaagaa attcagcatc aatggtggta 1920

aagcttggaa gctatcctag ctagtatcca gtacgtagca gagcttttag aaagtccttt 1980

tgaaggcaat tagctagttt acatgaagtg attgggcttg gaatatatat agtgatgtga 2040

tctgagccct aattatattg tataagctat gagtgagctt gcatagtttt gtgtggactg 2100

aaaatctcaa cttgtagatg gtcaactatt ttataaagta atgttgggtt ggtgggttat 2160

ggaaaaaaaa aaa 2173

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> 南林895杨

<400> 2

Met Lys Ser Phe Ala Ser Phe Gly Lys Lys Leu Glu Arg Pro Arg Asn

1 5 10 15

Phe Phe Cys Asn Lys Val Ser Cys Phe His Lys Ser Ser Met Tyr Ser

20 25 30

Ile Arg Ser Phe Leu Gln Val Leu Val Phe Gln Ile His Arg Phe Trp

35 40 45

Val Gln Leu Ala Tyr Phe Val Ile Leu Ser Leu Val Gly His Thr Ala

50 55 60

Leu Lys Val Ser Lys Pro Arg Pro Gly Ser Leu Arg Pro Ala Ser Leu

65 70 75 80

Asp Ile Phe Phe Thr Ser Val Ser Ser Ala Thr Val Ser Ser Met Ser

85 90 95

Thr Val Glu Met Glu Val Phe Ser Asn Thr Gln Leu Ile Ile Met Thr

100 105 110

Ile Leu Met Leu Leu Gly Gly Glu Val Phe Thr Ser Ile Leu Gly Leu

115 120 125

Tyr Leu Ser Arg Phe Lys Phe Ser Lys His Glu Thr Lys Glu Ser Arg

130 135 140

Val Ser Ser Val Tyr His Asn Pro Pro Lys Arg Thr Asn Phe Pro Gly

145 150 155 160

Leu Glu Ile Glu Lys Pro Thr Asn Val Asp Leu Glu Cys Asn Leu Asn

165 170 175

Ser Leu Asp Asn Asp His Ser Leu Lys Leu Asn Ser Leu Lys Ser Leu

180 185 190

Ala Cys Val Ala Met Gly Tyr Phe Ser Val Val His Ile Thr Gly Ser

195 200 205

Ser Leu Val Ala Met Tyr Thr Ser Leu Val Pro Ser Ala Arg Gln Val

210 215 220

Leu Gly Ser Lys Gly Ile Lys Ile Gln Thr Phe Ser Val Phe Thr Thr

225 230 235 240

Val Ser Thr Phe Ser Asn Cys Gly Phe Val Pro Thr Asn Glu Asn Met

245 250 255

Val Ala Phe Lys Arg Asn Pro Gly Leu Leu Leu Ile Leu Ile Pro Gln

260 265 270

Ile Leu Leu Gly Asn Thr Leu Tyr Pro Ser Cys Leu Arg Phe Leu Ile

275 280 285

Trp Ile Leu Glu Lys Ile Thr Arg Lys Val Glu Phe Arg Tyr Ile Leu

290 295 300

Met Asn Thr Arg Glu Met Gly Tyr Gly His Leu Leu Ser Phe Ser His

305 310 315 320

Ser Cys Leu Leu Ala Ile Thr Val Ser Gly Phe Ile Leu Val Gln Phe

325 330 335

Ile Leu Phe Cys Ser Met Glu Trp Asn Ser Gly Ala Met Asp Gly Leu

340 345 350

Asn Pro Tyr Gln Lys Leu Met Gly Ala Leu Phe Gln Val Val Asn Ser

355 360 365

Arg His Thr Gly Glu Ser Ile Val Asp Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ala

370 375 380

Ile Leu Val Leu Phe Val Val Met Met Tyr Leu Pro Pro Tyr Thr Ser

385 390 395 400

Leu Met Pro Lys Lys Gln Gln Glu Glu Val Asp Ser Glu Thr Gly Gln

405 410 415

Lys Cys Lys Asp Gln Arg Lys Ser Leu Val Gln Cys Leu Leu Phe Ser

420 425 430

Pro Leu Ser Thr Leu Ala Ile Phe Val Ile Leu Ile Cys Val Ser Glu

435 440 445

Gly Glu Lys Leu Asn Lys Asp Pro Leu Asn Phe Asn Val Leu Asn Ile

450 455 460

Thr Ile Glu Val Ile Ser Ala Tyr Gly Asn Val Gly Phe Ser Thr Gly

465 470 475 480

Tyr Ser Cys Lys Arg Gln Leu Glu Pro Asp Ser Ser Cys Lys Asp Ala

485 490 495

Trp Phe Gly Phe Val Gly Arg Trp Ser Ser Leu Gly Lys Ile Ile Leu

500 505 510

Ile Leu Val Met Leu Phe Gly Arg Leu Lys Lys Phe Ser Ile Asn Gly

515 520 525

Gly Lys Ala Trp Lys Leu Ser

530 535

<210> 3

<211> 417

<212> DNA

<213> 南林895杨

<400> 3

tgcattgttt caggttgtaa attcaaggca taccggtgaa tctattgtcg atctctccat 60

catctctcca gcaatcttgc tgctcttcgt ggttatgatg tatctcccac catacacttc 120

attgatgccg aaaaagcaac aggaagaggt tgattcagaa actggccaaa aatgcaaaaa 180

ccaaaggaag tctttggttc agtgcctgtt gttctcacct ttatctacct tagccatctt 240

tgtgattctc atttgcgtct cagagagaga gaagttgaag aaagaccccc tcaacttcaa 300

cgtactcaat atcaccatag aagtcgtaag tgcatacgga aatgtcgggt tctcaactgg 360

ctatagctgc aaacgacaac ttgaacctga tagctcgtgc aaggatgcat ggtttgg 417

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PeHKT1短片段正向引物

<400> 4

tggactccaa agccagagca a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PeHKT1短片段反向引物

<400> 5

ccaaaccatg catccttgca 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE gene-specific outer primer

<400> 6

atctattgtc gatctctcca tc 22

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE gene specific inner primer

<400> 7

tgccgaaaaa gcaacaggaa gaggttga 28

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE Outer Primer

<400> 8

gcgagcacag aattaatacg act 23

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE Inner Primer

<400> 9

cgcggatccg aattaatacg actcactata gg 32

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE Outer Primer

<400> 10

catggctaca tgctgacagc cta 23

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE Inner Primer

<400> 11

cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc gatg 34

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE gene-specific outer primer

<400> 12

agaacccgac atttccgtat gc 22

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE gene specific inner primer

<400> 13

ggtgagaaca acaggcactg aaccaaagac 30

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PeHKT1 ORF正向引物

<400> 14

atgaagagct ttgctagt 18

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PeHKT1 ORF反向引物

<400> 15

ctaggatagc ttccaagctt tacca 25

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物序列

<400> 16

ggctatagct gcaaacgaca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物

<400> 17

aagccttccg aagagcatta 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物序列

<400> 18

ggcaaggaga aggtacacat 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物

<400> 19

caatcacacg cttgtcaata 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物序列

<400> 20

tcttcggcaa cagtttcaag 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物

<400> 21

ccacacaagc aaggctctta 20

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物序列

<400> 22

tcaactttcg atggtaggat agtg 24

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物

<400> 23

ccgtgtcagg attgggtaat tt 22

Claims

1. 一种杨树耐盐重要基因PeHKT1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的杨树耐盐重要基因PeHKT1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.含有权利要求1所述的杨树耐盐重要基因PeHKT1的载体。

4.根据权利要求3所述的含有杨树耐盐重要基因PeHKT1的载体，所述载体，其特征在于：在PeHKT1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，在PeHKT1基因的3’端组装有强终止子NOS。

5.根据权利要求3所述的含有杨树耐盐重要基因PeHKT1的载体，所述载体，其特征在于：所述载体组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，用潮霉素进行转基因杨树的筛选；所述载体组装有能促使组装于其间的PeHKT1基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中的LB和RB序列。

6.含有权利要求1所述的杨树耐盐重要基因PeHKT1的宿主细胞。

7.权利要求1所述的杨树耐盐重要基因PeHKT1在杨树抗盐胁迫中的应用。