CN103757031A

CN103757031A - 一种调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2及其应用

Info

Publication number: CN103757031A
Application number: CN201410039361.7A
Authority: CN
Inventors: 胥猛; 宣磊; 黄敏仁
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2014-01-27
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2034-01-27
Also published as: CN103757031B

Abstract

本发明公开了一种调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2及其应用，该转录因子基因PeSHR2的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明以南林895杨初生不定根为材料，通过RACE技术克隆了PeSHR2基因。同时，采用通路克隆技术构建其杨树过量表达载体pH35GS-PeSHR2，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeSHR2可在杨树体内高效表达，从而调控根系构型的重塑。其中，PeSHR2基因是调控杨树根系形态检测的关键基因。本发明通过将PeSHR2基因转入杨树，过量表达PeSHR2的转基因杨产生单一粗壮不定根，似主根，同时伴有大量次级不定根和不定芽，且该类根生不定芽可以生长发育为新植株，说明PeSHR2基因是控制杨树根系构型重塑的关键调节因子，在林木基因工程领域有重要应用价值。

Description

一种调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2及其应用。

背景技术

杨树是林木分子生物学研究的模式物种，研究杨树生根性状基因表达调控模式具有重要的理论意义。不定根发生与根系响应逆境胁迫的可塑性是植物重要的抗逆适应机制，是植物发育与进化生物学领域的前沿和热点。尽管拟南芥、水稻和玉米等一年生草本植物根系发育调控的分子机理研究已经取得了突破性进展，许多分子调控模式和信号传导途径被揭示。但是，一年生草本植物与林木的抗逆适应机制有着许多不同之处。因此，深入开展杨树不定根发育调控的分子机理研究，对于揭示物种间器官发生和适应性进化机制的异同有重要的理论意义。

“根深叶茂”，两者是相辅相成的。长期以来，国内外研究者对杨树生长发育的研究主要集中于地上部分，对生根性状的兴趣和重视程度不够，使得杨树根系的研究相对滞后。随着人们对林木根系作用认识的增强和技术手段的进步，系统研究杨树不定根发育调控的分子机理有其必要性和迫切性，所挖掘的特异基因资源在林木基因工程领域具有广阔的应用前景。

SHORT-ROOT（SHR）和SCARECROW（SCR）蛋白都属于GRAS转录因子家族，对根尖干细胞微环境（stem cell niche）的特化和维持起关键作用。拟南芥SHR基因在中柱（stele）内转录并翻译，SHR蛋白通过向相邻细胞的扩散诱导内皮层的形成和SCR的表达，SCR可以通过一个正向反馈回路激活自身的转录，高丰度的SCR阻止SHR蛋白向相邻细胞转移，从而避免形成更多的内皮层。这种反馈调节机制一方面维持了根的径向模式（radial paterning）而形成中柱、内皮层、皮层和表皮，另一方面也巧妙地调控根尖干细胞的不对称分裂和分化。另有研究发现，PLETHORA（PLT）基因在QC和周围干细胞区域表达，WUSCHEL-related homeobox 5 （WOX5）基因也在QC区域特异性表达，它们与SHR/SCR一起组成复杂的根尖分生组织调控网络，对根尖干细胞微环境的特化和维持至关重要。综上可知，SHR/SCR信号转导通路具有组织特异性，它们与相关基因及植物激素之间的调控网络仍不是十分清楚，在杨树中尚未有SHR/SCR基因家族功能研究的相关报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2。本发明的另一目的是提供一种杨树根系构型调控相关转录因子基因PeSHR2的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

含有所述的调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2的载体。

所述载体在PeSHR2基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，能使PeSHR2基因在杨树体内高效表达。

所述载体在PeSHR2基因的3’端组装强终止子NOS，可有效终止PeSHR2基因的转录。

所述载体组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，用潮霉素进行转基因杨树的筛选。

所述载体组装用于促使组装于其间的PeSHR2基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中的LB和RB序列。

含有所述的杨树根系构型调控相关转录因子基因PeSHR2的宿主细胞。

所述的调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2在杨树根系生长发育中的应用。

所述的调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明以南林895杨初生不定根为材料，通过RACE技术克隆了PeSHR2基因。同时，采用通路克隆技术构建其杨树过量表达载体pH35GS-PeSHR2，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeSHR2可在杨树体内高效表达，从而调控根系构型的重塑。其中，PeSHR2基因是调控杨树根系形态检测的关键基因。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过将PeSHR2基因转入杨树，过量表达PeSHR2的转基因杨产生单一粗壮不定根，似主根，同时伴有大量次级不定根和不定芽，且该类根生不定芽可以生长发育为新植株，说明PeSHR2基因是控制杨树根系构型重塑的关键调节因子，在林木基因工程领域有重要应用价值。

附图说明

图1是植物表达载体pH5GS的结构示意图；

图2是过量表达PeSHR2的转基因杨分子检测图；

图3是过量表达PeSHR2的转基因杨与未转基因杨的整体表型对比图；图中，左边为未转基因杨，右边为转基因杨；

图4是过量表达PeSHR2的转基因杨与未转基因杨的根形态对比图；图中，左边为未转基因杨，右边为转基因杨。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。

实施例1通过RACE技术克隆PeSHR2基因

以南林895杨初生不定根为材料，采用常规方法符合使用要求的提取cDNA、RNA。使用Oligo 6设计特异性引物扩增PeSHR2基因短片段，其中，PeSHR2短片段正向引物为：5’-CTCAAACTAGCCATACATC-3’，PeSHR2短片段反向引物为：5’-AATATAGTGTATAACACCTC-3’。高保真PCR反应体系：10×LA PCR Buffer（Mg²⁺ free）5.0μL；2.5mM dNTP Mixture 8.0μL；25mM Mg²⁺ 5.0μL；LA Taq DNA Polymerase（5U/μL）0.5μL；正向引物（10μM）2μL；反向引物（10μM）2μL；模板（895杨cDNA）1μL；加无菌ddH₂O补足50μL。反应程序：预变性94℃，3min；94℃，40s，55℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。对产物测序，获得的PeSHR2基因短片段序列如SEQ ID NO.3所示。

依据上述PeSHR2基因短片段序列设计3’末端的RACE引物，进行3’RACE，获得3’ cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序，Blast确认上述片段与其它植物相关的基因同源。以相同的方法，根据获得的正确的3’ cDNA末端片段序列设计5’末端的RACE引物，进行5’RACE，获得5’ cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序。

3’RACE正向引物：3'RACE gene specific outer primer：5'-TGAAACTGTGAGAATAAGGAAAC-3’， 3' RACE gene specific inner primer：5'-TGGTTCTGTTGGTGATGCAAATG-3’； 3' RACE Outer Primer：5'-TGATTTTACTAGCTCAAGATA-3’， 3' RACE Inner Primer：5'-GGAATGTTCAAGGAACATAGTTAGGGT-3’； 5' RACE Outer Primer：5'-TGAGCATAGAGATGGTGTTCT-3’， 5' RACE Inner Primer：5'-CAGGTTCCTCTTTCCATGTTAAGTAAAT-3’； 5' RACE gene-specific outer primer：5'-ACACCAGAGGTTTGCTCCACTTC-3’， 5' RACE gene specific inner primer：5'-TTGCACCACCACTAGCTTGTGCCTGTTG-3’。

（1）3' RACE 反应

1）反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：1μg Total RNA，4μL dNTP Mix，2μL 3' RACE Adapter，2μL 10X RT Buffer，1μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water补齐20μL。轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1h；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物。

2）3' RACE巢式PCR

反应体系：Outer 3' RACE Component：5.0μL 10×LA PCR Buffer（Mg²⁺ Free），5.0μL MgCl₂（25mM），8.0μL dNTP Mixture（each 2.5mM），2.0μL 3' RACE gene-specific outer primer，2.0μL 3' RACE Outer Primer（10μM），1μL RT reaction product，0.5μL TakaRa LA Taq（5U/μL），26.5μL Nuclease-free Water，Total volume50μL。Inner 3' RACE Component：5.0μL 10×LA PCR Buffer（Mg²⁺ Free），5.0μL MgCl₂（25mM），8.0μL dNTP Mixture（each 2.5mM），2.0μL 3' RACE gene specific inner primer，2.0μL 3' RACE Inner Primer（10μM），1μL Outer 3' RACE PCR product，0.5μL TakaRa LA Taq（5U/μL），26.5μL Nuclease-free Water，Total volume50μL。

反应程序：94℃，3min；94℃，30sec，60℃，30sec，72℃，1min，35cycles；72℃，7min。

3）纯化片段与克隆载体的连接反应：采用TaKaRa公司的pMD19-T simple Vetor克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进。反应体系（5μL）：2.2μL纯化回收的PCR产物，0.3μL pMD-19 Simple Vector，2.5μL Solution I。反应条件：16℃ 30min；4℃过夜。

4）大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化；取5μL纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μL感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；加入800μL LB液体培养基，37℃&100rmp 摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层800μL培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。

5）阳性克隆筛选及测序分析：从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃&250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。反应体系（20.0μL）: 2.0μL 10×PCR Buffer（Mg²⁺free），1.5μL MgCl₂（25mM），1.3μL dNTP Mixture （each 2.5 mM），1.0μL 3' RACE gene specific inner primer（10μM），1.0μL 3' RACE Inner Primer（10μM），0.1μL菌液，1.0μL rTaq，12.1μL Milli-Q Water。反应程序：94℃，3min；94℃，30sec，60℃，30sec，72℃，1min，28cycles；72℃，7min。菌液PCR检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司（上海）测序鉴定。

（2）5' RACE 反应

1）RNA处理（RNA Processing）

CIP反应，将如下成分加入到RNase-free的小离心管中：10μg Total RNA，2μL 10X CIP buffer，2μL Calf Intestine Alkaline Phosphatase （CIP），Nuclease-free Water补齐20μL。轻混匀，短暂离心；37℃温育1h。加入以下试剂到CIP反应离心管：15μL Ammonium Acetate Solution，115 μL Nuclease-free Water，150 μL acid phenol:chloroform。充分涡旋，室温高速离心（≧10000 g）5min。转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL氯仿，充分涡旋，室温高速离心（≧10000 g）5min。转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL异丙醇，充分涡旋，冰浴10min。最大转速离心20min，用0.5ml预冷的70%乙醇冲洗沉淀，最大转速离心5min，小心弃乙醇，气干沉淀。以11μLNuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP’RNA，冰上放置进一步用于TAP反应，或者-20℃保存。TAP反应，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：5μL CIP’d RNA （from f above），1μL 10X TAP buffer，2μL Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP），2μL Nuclease-free Water。轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得CIP/TAP-treated RNA ；进入接头连接步骤，或-20℃保存反应物。5' RACE接头连接，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：2μL CIP/TAP-treated RNA，1μL 5' RACE Adapter，1μL 10X RNA Ligase Buffer，2μL T4 RNA Ligase（2.5U/μL），4μL Nuclease-free Water。轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得Ligated RNA；进入反转录步骤，或-20℃保存反应物。

2）反转录（Reverse Transcription）：将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中；2μL Ligated RNA，4μL dNTP Mix，2μL Random Decamers，2μL 10X RT Buffer，1μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water补齐20μL。轻轻混匀，短暂离心；42℃温育1h，即得RT reaction；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物。

3）5' RACE巢式PCR：反应体系、反应条件与3' RACE的巢式PCR一致。

4）PCR产物克隆测序，实验操作与3' RACE克隆一致，获得基因序列片段。

Blast确认上述片段与拟南芥/水稻AtSHR基因高度同源。

采用BioEdit软件对3' RACE和5' RACE序列进行比对拼接，并使用FGENESH（http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic =fgen）预测其阅读框。根据基因全长序列设计引物（扩增子包含起始密码子及终止密码子），再次进行PeSHR2基因的全长扩增和测序验证。其中，PeSHR2 ORF正向引物为：5'ATGGACATAACTCTCTTCAGTC3’，PeSHR2 ORF反向引物为：5'TTAGGGTTTCCATGCAGAAG3'；高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer （Mg²⁺ free） 5.0μL；2.5mM dNTP Mixture 8.0μL；25mM Mg²⁺ 5.0μL；LA Taq DNA Polymerase（5U/μL） 0.5μL；正向引物（10μM） 2μL；反向引物（10μM） 2μL；模板（895杨cDNA）1μL；加无菌ddH₂O 补足 50μL。反应程序：预变性94℃ 3min；94℃ 40s，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min。最终获得基因全长cDNA序列为1693 bp，包含一个1326bp的完整阅读框，命名为PeSHR2基因，序列如SEQ ID NO.1所示，其所编译表达蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2 PeSHR2基因植物表达载体构建

利用通路克隆技术构建PeSHR2基因的过量表达载体。使用特异PCR引物（实施例1的PeSHR2 ORF引物），以cDNA为模板，进行PCR扩增，将PeSHR2基因ORF构建到入门载体。入门载体为pCR^TM8/GW/TOPO^TM vector （Invitrogen）。反应体系为：Fresh PCR product （purified） 10~20ng；Salt solution 1μL；pCR^TM8/GW/TOPO^TM vector 1μL；加无菌ddH₂O 补足 6μL。反应程序为：室温静置30min。

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，带PeSHR2基因的入门载体与植物表达载体pH35GS进行LR反应。载体质粒如图1所示。反应体系为：linearized entry clone 100ng；purified destination vector （100ng/μL） 1.5μL；LR Clonase

enzyme mix 2μL；加TE（pH 8.0）补足10μL；。反应条件：25℃ 1h。经LR反应后PeSHR2基因导入植物表达载体pH35GS中，在PeSHR2基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，它能使PeSHR2基因在杨树体内高效表达；在PeSHR2基因的3’端组装了强终止子NOS，可有效终止PeSHR2基因的转录；在载体质粒上组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选；在载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeSHR2基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pH35GS-PeSHR2，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeSHR2可在杨树体内高效表达。

实施例3 PeSHR2基因的遗传转化

通过液氮冻融法将所构建的pH35GS-PeSHR2过量表达载体转入农杆菌菌株EHA105（Invitrogen），通过农杆菌介导将PeSHR2基因转入杨树。实验结果如图1~4所示，图1是植物表达载体pH35GS的结构示意图；图2为过量表达PeSHR2的转基因杨分子检测图；图3为过量表达PeSHR2的转基因杨与未转基因杨的整体形态对比，图中，左边为未转基因杨，右边为转基因杨；图4为过量表达PeSHR2的转基因杨与未转基因杨根系比较，图中，左边为未转基因杨，右边为转基因杨。从结果可以明显得出，过量表达PeSHR2的转基因杨产生单一粗壮不定根，似主根，同时伴有大量次级不定根和不定芽，且该类根生不定芽可以生长发育为新植株，说明PeSHR2基因是调控杨树根系构型重塑的关键调节因子，在林木基因工程领域有重要应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2及其应用

<130> 100

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1693

<212> DNA

<213> 南林895杨

<400> 1

gaaaaaagtg aaatttgagt ttagcaaagg ttctgcctct agagtcaaag ggggcctcgc 60

cgatcaccca tggacataac tctcttcagt ccaaaagaca cactgacaca cttctttcct 120

tcccaccagc aaagcaatga tcaagtagca gctatagaca tgcaaagcaa tagcagcaac 180

aacaacaata atcagcctca aactagccat acatcaacaa gccggtcttc ggactccggt 240

gaggcctgtg gaggaggaaa caagtgggca tcaaagcttc ttagtgagtg tgcaagagca 300

atctcagaga aggactctag caagatccac caccttctat ggatgttaaa tgagcttgcc 360

tctccttatg gagattgtga tcagaaattg gcatcttatt tcttgcaagc tctattctgt 420

aaggctaccg agtctggtca acggtgtttc aaaaccctaa ccacagtagc tgaaaagagc 480

cactcctttg attcagctag gaaattgata ctaaaattcc aagaggtaag cccgtggact 540

actttcggtc atgtagcttc aaatggtgca attttagagg ccttagatgg ggaaagcaaa 600

ctccacataa ttgatatcag caataccctt tgcacacagt ggcctacttt gctagaagct 660

ttagccacaa gaaatgatga gacgccgcga ttaaagctca ccgttgtggt aactgctagc 720

attgtaagat cagtcatgaa agaaataggc caaggaatgg agaagtttgc taggttaatg 780

ggagtgccct ttgagtttaa agtaattagt gtgctaaatc atataggaga gctcacaaag 840

gaaggactgg gtgttcaaga agatgaagca gtcgcgatta attgcattgg ggcattgaaa 900

agagttgaag tagatgaaag aagttctgta atccagttgt tccgatcact taaccctcga 960

gttgtgacaa tcgttgagga agaagctgat tttactagct caagatatga cttcgtcaag 1020

tgttttgaag agtgcctgag gtgttataca ctatattttg agatgctaga ggagagcttt 1080

gtcccaacta gtaatgagag attgatgttg gagagggaat gttcaaggaa catagttagg 1140

gttttggctt gtgatgaaga aactggtgga ggagagtgtg aaagaagaga gcggggtgtc 1200

cactggtctg aaaggctaag ggaggcattt tcccctgttg gattcagtga tgatgttgtc 1260

gatgatgtca aggcattgct taagagatac aaagctgggt gggcacttgt gctacctcaa 1320

ggagatcatg agtcaggaat ttacttaaca tggaaagagg aacctctagt atgggcttct 1380

gcatggaaac cctaaaaggg ttatggccag aacaccatct ctatgctcaa attcgaggct 1440

cggcatggca atttattcac aggatgggaa cggcgcgcca tgaactcata ttgataatta 1500

attatagagt actactactt tcacttttca tttcttcttc ttatatattc atgcatgttt 1560

gtatcttatg cactccaact tttcttttcc tatgttatat gcttgggagt ttgtgttgct 1620

tttcaacaac tctagataat tgtatttgtt tgaaggtgtt tgcacttgtg cctctttttt 1680

gcaaaaaaaa aaa 1693

<210> 2

<211> 441

<212> PRT

<213> 南林895杨

<400> 2

Met Asp Ile Thr Leu Phe Ser Pro Lys Asp Thr Leu Thr His Phe Phe

1 5 10 15

Pro Ser His Gln Gln Ser Asn Asp Gln Val Ala Ala Ile Asp Met Gln

20 25 30

Ser Asn Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Gln Pro Gln Thr Ser His Thr

35 40 45

Ser Thr Ser Arg Ser Ser Asp Ser Gly Glu Ala Cys Gly Gly Gly Asn

50 55 60

Lys Trp Ala Ser Lys Leu Leu Ser Glu Cys Ala Arg Ala Ile Ser Glu

65 70 75 80

Lys Asp Ser Ser Lys Ile His His Leu Leu Trp Met Leu Asn Glu Leu

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Gly Asp Cys Asp Gln Lys Leu Ala Ser Tyr Phe Leu

100 105 110

Gln Ala Leu Phe Cys Lys Ala Thr Glu Ser Gly Gln Arg Cys Phe Lys

115 120 125

Thr Leu Thr Thr Val Ala Glu Lys Ser His Ser Phe Asp Ser Ala Arg

130 135 140

Lys Leu Ile Leu Lys Phe Gln Glu Val Ser Pro Trp Thr Thr Phe Gly

145 150 155 160

His Val Ala Ser Asn Gly Ala Ile Leu Glu Ala Leu Asp Gly Glu Ser

165 170 175

Lys Leu His Ile Ile Asp Ile Ser Asn Thr Leu Cys Thr Gln Trp Pro

180 185 190

Thr Leu Leu Glu Ala Leu Ala Thr Arg Asn Asp Glu Thr Pro Arg Leu

195 200 205

Lys Leu Thr Val Val Val Thr Ala Ser Ile Val Arg Ser Val Met Lys

210 215 220

Glu Ile Gly Gln Gly Met Glu Lys Phe Ala Arg Leu Met Gly Val Pro

225 230 235 240

Phe Glu Phe Lys Val Ile Ser Val Leu Asn His Ile Gly Glu Leu Thr

245 250 255

Lys Glu Gly Leu Gly Val Gln Glu Asp Glu Ala Val Ala Ile Asn Cys

260 265 270

Ile Gly Ala Leu Lys Arg Val Glu Val Asp Glu Arg Ser Ser Val Ile

275 280 285

Gln Leu Phe Arg Ser Leu Asn Pro Arg Val Val Thr Ile Val Glu Glu

290 295 300

Glu Ala Asp Phe Thr Ser Ser Arg Tyr Asp Phe Val Lys Cys Phe Glu

305 310 315 320

Glu Cys Leu Arg Cys Tyr Thr Leu Tyr Phe Glu Met Leu Glu Glu Ser

325 330 335

Phe Val Pro Thr Ser Asn Glu Arg Leu Met Leu Glu Arg Glu Cys Ser

340 345 350

Arg Asn Ile Val Arg Val Leu Ala Cys Asp Glu Glu Thr Gly Gly Gly

355 360 365

Glu Cys Glu Arg Arg Glu Arg Gly Val His Trp Ser Glu Arg Leu Arg

370 375 380

Glu Ala Phe Ser Pro Val Gly Phe Ser Asp Asp Val Val Asp Asp Val

385 390 395 400

Lys Ala Leu Leu Lys Arg Tyr Lys Ala Gly Trp Ala Leu Val Leu Pro

405 410 415

Gln Gly Asp His Glu Ser Gly Ile Tyr Leu Thr Trp Lys Glu Glu Pro

420 425 430

Leu Val Trp Ala Ser Ala Trp Lys Pro

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 南林895杨

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gaaacaagtg ggcatcaaag cttcttagtg agtgtgcaag agcaatctca gagaaggact 120

ctagcaagat ccaccacctt ctatggatgt taaatgagct tgcctctcct tatggagatt 180

gtgatcagaa attggcatct tatttcttgc aagctctatt ctgtaaggct accgagtctg 240

gtcaacggtg tttcaaaacc ctaaccacag tagctgaaaa gagccactcc tttgattcag 300

ctaggaaatt gatactaaaa ttccaagagg taagcccgtg gactactttc ggtcatgtag 360

cttcaaatgg tgcaatttta gaggccttag atggggaaag caaactccac ataattgata 420

tcagcaatac cctttgcaca cagtggccta ctttgctaga agctttagcc acaagaaatg 480

atgagacgcc gcgattaaag ctcaccgttg tggtaactgc tagcattgta agatcagtca 540

tgaaagaaat aggccaagga atggagaagt ttgctaggtt aatgggagtg ccctttgagt 600

ttaaagtaat tagtgtgcta aatcatatag gagagctcac aaaggaagga ctgggtgttc 660

aagaagatga agcagtcgcg attaattgca ttggggcatt gaaaagagtt gaagtagatg 720

aaagaagttc tgtaatccag ttgttccgat cacttaaccc tcgagttgtg acaatcgttg 780

aggaagaagc tgattttact agctcaagat atgacttcgt caagtgtttt gaagagtgcc 840

tgaggtgtta tacactatat t 861

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PeSHR2短片段正向引物

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3'RACE gene specific outer primer

<400> 6

tgaaactgtg agaataagga aac 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE gene specific inner primer

<400> 7

tggttctgtt ggtgatgcaa atg 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE Outer Primer

<400> 8

tgattttact agctcaagat a 21

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE Inner Primer

<400> 9

ggaatgttca aggaacatag ttagggt 27

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE Outer Primer

<400> 10

tgagcataga gatggtgttc t 21

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE Inner Primer

<400> 11

caggttcctc tttccatgtt aagtaaat 28

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE gene-specific outer primer

<400> 12

acaccagagg tttgctccac ttc 23

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5' RACE gene specific inner primer

<400> 13

ttgcaccacc actagcttgt gcctgttg 28

Claims

1.一种调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述的调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2的载体。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述载体在PeSHR2基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S。

4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述载体在PeSHR2基因的3’端组装强终止子NOS。

5.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述载体组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，用潮霉素进行转基因杨树的筛选。

6.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述载体组装用于促使组装于其间的PeSHR2基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中的LB和RB序列。

7.含有权利要求1所述的杨树根系构型调控相关转录因子基因PeSHR2的宿主细胞。

8.权利要求1所述的调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2在杨树根系生长发育中的应用。

9.权利要求1所述的调控杨树根系构型的转录因子基因PeSHR2的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。