CN101981195A - 产量相关性状增强的植物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过在植物中增加硅藻高亲和力硝酸盐转运蛋白2(NRT2)多肽编码核酸序列的表达来增强植物的多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有增加的硅藻NRT2多肽编码核酸序列表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了可用于本发明方法的构建体。

Description

产量相关性状增强的植物及其制备方法

发明领域

本发明总体上涉及分子生物学领域，并涉及通过增加植物中高亲和力硝酸盐转运蛋白2(nitrate transporter 2，NRT2)多肽编码核酸序列的表达来增强植物的多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有增加的NRT2多肽编码核酸序列表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了可用于本发明方法的构建体。

背景技术

不断增长的世界人口和逐渐减少的农业可用耕地推动了提高农业效率研究之势。传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有期望特征的植物。然而，此类选育技术有若干缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常含有异质的遗传组分，这些异质的遗传组分可能不总是导致期望的性状自亲本植物传递。分子生物学的进展已经使人类能够修饰动物和植物的种质。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般为DNA或RNA的形式)以及随后将遗传物质引入植物。此类技术有能力输送具有多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物。

具有特别经济利益的性状是增加的产量。产量通常定义为作物的可测量的具有经济价值的产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产量直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物构造(例如，分枝的数量)、种子产量、叶子衰老等等。根的发育、营养吸收、胁迫耐受性和早期活力也可以是决定产量的重要因素。因此优化上述因素可以促进作物产量的增加。

种子产量是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，或是通过对种子本身的直接消耗，或是通过对饲养自加工的种子的肉类产品的消耗。它们也可以是工业加工中所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的枝条和根的来源)和胚乳(萌发期和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳可以同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以充盈籽粒。

植物生物量为饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草的产量。在谷类作物中使用了产量的许多替代参数(proxy)。其中首要的是估算植物大小。根据物种以及发育阶段的不同，可以通过许多方法测量植物大小，包括植物总干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座(rosette)直径、叶长、根长、根质量、分蘖数和叶数。许多物种在给定的发育阶段在植物不同部分的大小间维持保守的比例。利用这些比速增长关系可以从这些尺寸测量结果中的一个外推至另一个(如Tittonell等2005AgricEcosys&Environ 105：213)。早期发育阶段时的植物大小通常将与发育后期的植物大小有关。具有更大叶面积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多(Fasoula&Tollenaar2005Maydica 50：39)。除此之外，还有植物为在最初达到该较大大小而具有的微环境或遗传优势的潜在延续。对于植物大小和生长速率，存在着强遗传组分(如ter Steege等2005Plant Physiology 139：1078)，因此对于一系列不同基因型，植物在一种环境条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小有关(Hittalmani等2003Theoretical Applied Genetics 107：679)。由此，可以使用标准环境作为田间作物在不同地点和时间所遭遇到的多样动态环境的替代。

对于许多作物而言，另一重要的性状是早期活力。提高早期活力是温带和热带稻类栽培种的现代稻类育种项目的重要目标。长根对于水栽稻的土壤锚固至关重要。在直接向涝地里播种稻米的情况下，以及在植物必须迅速透水出苗的情况下，较长的枝条均与活力有关。在进行条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于优良的出苗至关重要。改造植物早期活力的能力在农业上将具有极其重要的意义。例如，一直以来早期活力弱限制了在欧洲大西洋地区引入基于玉米带种质的玉米(玉蜀黍，Zea mays L.)杂交种。

收获指数为种子产量与地上干重的比值，其在许多环境条件下相对稳定，因此在植物大小和籽粒产量之间通常能够获得比较稳固的相关性(例如Rebetzke等2002Crop Science 42：739)。这些过程固有地联系在一起，因为大多数籽粒生物量取决于植物叶和茎当前或贮存的光合作用生产力(Gardener等1985Physiology of Crop Plants.Iowa State University Press，68-73页)。因此，对植物大小的选择，甚至是在发育早期阶段的选择，已经用作为未来潜在产量的指标(如Tittonell等2005Agric Ecosys&Environ105：213)。当测试遗传差异对胁迫耐受性的影响时，温室或植物培养室与田地相比具有固有的优势：即能够使土壤性能、温度、水和养分可利用率以及光强度标准化。不过，因缺乏风力或昆虫导致不良授粉，或由于空间不足以让成熟根或冠层生长等等，对产量造成的这些人为局限性会限制这些受控环境在测试产量差异中的应用。因此，在培养室或温室标准条件下测量早期发育阶段的植物大小，是提供潜在遗传产量优势指标的标准方法。

另一重要的性状在于提高的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是全世界作物损失的主要原因，使大多数主要作物植物平均产量降低50％以上(Wang等，Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可以因为干旱、盐度、极端温度、化学毒性、养分(宏量元素和/或微量元素)过量或不足、辐射及氧化胁迫引起。提高非生物胁迫植物耐受性的能力将对全世界农场主带来重大的经济利益，并将使人们能够在不利条件下、在否则将不可能进行作物栽培的地区进行作物栽培。

因此通过优化上述因素之一可以增加作物产量。

视最终用途而定，可能更优先修饰某些产量性状。例如，对于诸如饲料或木材生产或者生物燃料资源等应用，可能期望植物营养部分的增加，而对于诸如面粉、淀粉或油料生产等应用，可能特别期望种子参数的增强。即便是在种子参数之中，也可能更优先其中的一些，这取决于应用。多种机制可以促成增加的种子产量，无论形式是增加的种子大小、还是增加的种子数量。

增强植物产量相关性状(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是修饰植物的内在生长机制，如细胞周期或者参与植物生长或防御机制的多种信号传递路径。

现已发现，通过增加植物中高亲和力硝酸盐转运蛋白2(NRT2)多肽编码核酸序列的表达，可以相对于对照植物增强植物的多种产量相关性状。增强的产量相关性状包括如下一种或多种：增强的早期活力、增加的地上生物量、增加的根生物量、增加的每株植物的种子总产量、增加的饱满种子数量、和增加的种子总数量。

发明背景

硝酸盐是作物植物的一种主要的重要氮源，并且是最常见的限制作物生长和发育的养分。在自然环境中，硝酸盐浓度可能变化范围广泛，多达5倍的数量级。第一步硝酸盐同化为胺，涉及硝酸盐流入细胞，这是一个依赖于外部硝酸盐浓度的主动过程。

已经鉴定到两类硝酸盐转运系统，高亲和力及低亲和力的。硝酸盐转运蛋白2(NRT2)是高亲和力硝酸盐转运蛋白，而大多数NRT1是低亲和力转运蛋白。第一个编码高亲和力硝酸盐转运蛋白的基因克隆自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)nrtA(或crnA)。这导致自多个物种克隆和鉴定到直向同源基因，包括自种子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、苔藓、绿藻、硅藻及其他真菌(综述见Tsay等(2007)FEBS Lett 581：2290-2300及其中包含的参考文献)。硝酸盐转运蛋白通常作为基因家族存在于基因组中，例如在拟南芥中已经鉴定到至少7种(Wirth等(2007)J Biol Chem282(32)：23541-23552)。

NRT2多肽大多一般特征在于至少11个、通常12个α螺旋构象(α螺旋)的疏水跨膜结构域(Tm)，这些结构域穿过膜并通过亲水环相连(不过在预测Tm的确切位置时必须小心谨慎)(Unkles等(2004)Proc Natl Acd Sci101(50)：17549-17554；Yin等(2007)Plant Sci 172：621-631)。NRT2多肽属于独特的第二大已知转运蛋白家族簇，即主要易化转运蛋白超家族(MFS)，该家族包括多种功能多样的转运蛋白，每种都含有MFS超家族特有的基序。然而，在硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白家族的高亲和力硝酸盐转运蛋白亚家族中，已经鉴定到一种含有许多高度保守残基的特别基序(称为硝酸盐标签序列)，(F/Y/K)-X₃-(I/L/Q/R/K)-X-(G/A)-X-(V/A/S/K)-X-(G/A/S/N)-(L/I/V/F/Q)-X_1，2-G-X-G-(N/I/M)-X-G-(G/V/T/A)，这在任何其他类别的MFS蛋白中均未观察到。此基序通常两拷贝存在，位于跨膜结构域Tm-5和Tm-11中。MFS基序可能在促进与MFS成员的转运(本案是硝酸盐转运)相关的全局构象变化方面非常重要。

在一些物种中，NRT2多肽能够自身介导硝酸盐转运，例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或小球藻Chlorella sorokiniana的NRT2转运蛋白(分别是CRNA或ChNRT2.1)。然而，在高等植物中，与雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的NRT2蛋白相似，NRT2多肽不能够自身介导转运。真正的硝酸盐转运系统实际上需要第二多肽(称为NAR2或NRT3)，因而事实上相当于二元组分(NRT2/NAR2)转运蛋白(Wirth等(2007)同上及其中所含的参考文献)。

Fraisier等(2000；Plant J 23(4)：489-496)制备并研究了在组成型或根特异性启动子的控制下过表达NpNRT2.1核酸序列的转基因烟草植物。这些作者证明单独NRT2的去调控能够引起HATS(高亲和力转运系统)介导的NO3-流入增加，从而首次表明能够在转基因植物中增加硝酸盐流入。

国际专利申请WO2007051866描述了通过在植物中调节编码植物NRT2多肽的核酸序列的表达而改良植物生长特性的方法。Good等(US20050044585)公开了氮利用蛋白质，尤其是氨基酸转移酶，水平升高的转基因植物，其中所述蛋白质处于根特异性启动子的控制下，该启动子可以是或可以不是胁迫诱导型的。这些植物显示出提高的氮吸收效率，但未报导对种子产量的影响。另外，该文献还公开在植物中过表达硝酸盐转运蛋白并未对这些植物造成有利的生长性能。

令人惊讶地，现已发现增加NRT2多肽编码核酸序列的表达可以产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。

根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，包括在植物中增加如本文定义的NRT2多肽编码核酸序列的表达。增强的产量相关性状包括如下一种或多种：增加的早期活力、增加的地上生物量、增加的根生物量、增加的每株植物的种子总产量、增加的饱满种子数量、和增加的种子总数量。

定义

多肽/蛋白质

术语“多肽”和“蛋白质”在文中可互换使用，是指通过肽键连接起来的、任意长度的氨基酸聚合物形式。

多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”在文中可互换使用，是指任何长度的无支链形式的核苷酸聚合物，所述核苷酸可以为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者两者的组合。

对照植物

选择适宜的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物一般与待评估植物为相同的植物物种，或者甚至为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且还指植物部分，包括种子和种子部分。

同源物

蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且与其源自的未修饰蛋白质形式具有相似的生物活性和功能活性。

缺失是指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。

插入是指在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括N-末端和/或C-末端融合，以及单个或多个氨基酸的内部序列插入。一般，氨基酸序列内部的插入将小于N-或C-末端的融合，数量级约1到10个残基。N-或C-末端融合蛋白或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、

表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。

取代是指蛋白质中的氨基酸用具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其他氨基酸替换。氨基酸取代一般是单残基的取代，但是视施加于多肽上的功能性限制而定也可以是成簇取代；插入通常在大约1到10个氨基酸残基的数量级。氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守取代表在本领域公知(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编辑)和下表1)。

表1：保守氨基酸取代的实例

残基	保守取代	残基	保守取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu；Val

可通过本领域公知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作，容易地进行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法在本领域公知。例如，本领域的技术人员公知在DNA预定位置进行取代突变的技术，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其他定点诱变方案。

衍生物

“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，与蛋白质的天然形式，如目的蛋白质的氨基酸序列相比，其可以包括用非天然氨基酸残基进行的氨基酸取代、或者添加非天然氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，与多肽的天然形式的氨基酸序列相比，其可以包括天然改变的(糖基化、酰基化、异戊烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改变的氨基酸残基。衍生物与其源自的氨基酸序列相比，还可以包括一个或多个非氨基酸取代或添加，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其他配体，例如与氨基酸序列结合以有利于其检测的报告分子，以及相对于天然蛋白质的氨基酸序列而言非天然的氨基酸残基。

直向同源物/旁系同源物

直向同源物和旁系同源物涵盖用于描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物为相同物种内的基因，其源自于祖先基因的复制；而直向同源物为来自不同生物体的基因，其通过物种形成起源，并且源自于共同的祖先基因。

结构域

术语“结构域”是指在进化相关蛋白质的序列比对中，在特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其他位置上的氨基酸可能因同源物不同而改变，但是在特定位置上高度保守的氨基酸则意味着对于蛋白质结构、稳定性或功能而言很可能是必不可少的氨基酸。“结构域”通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高度保守性而鉴定，其能够用作为标识符以确定任何所讨论的多肽是否属于先前鉴定到的多肽家族。

基序/共有序列/标签序列

术语“基序”或“共有序列”或“标签序列”是指进化相关蛋白质序列中短的保守区域。基序常常是高度保守的结构域部分，但也可以仅仅包括部分结构域，或者位于保守结构域之外(若基序的所有氨基酸都落在所定义的结构域之外的话)。

杂交

本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸分子都处在溶液中。杂交过程也能够这样进行，即互补核酸之一固定于基质，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也能够这样进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者通过例如照相平板印刷术固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸序列阵列或微阵列，或称为核酸序列芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸分子中的发夹结构或其它二级结构。

术语“严格性”是指进行杂交的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，在确定的离子强度和pH值，对于特定序列而言，低严格条件选择为比热解链温度(Tm)低大约30℃。中等严格条件为温度比Tm低20℃，而高严格条件为温度比Tm低10℃。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。不过，由于遗传密码的简并性，核酸序列可以在序列上有偏差而依然编码基本上相同的多肽。因此有时可能需要中等严格杂交条件来鉴定这样的核酸序列分子。

Tm是在确定的离子强度和pH值时，50％的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度特异性杂交。在低于Tm值大约16℃到32℃获得最大杂交速率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂交体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用明显(对于更高的浓度，此效应可以忽略不计)。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50％甲酰胺能够使杂交在30到45℃进行，尽管这将降低杂交速率。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使Tm值下降约1℃。取决于杂交体的类型，Tm值可以利用下列公式计算：

1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

Tm＝81.5℃+16.6×log₁₀[Na⁺]^a+0.41×％[G/C^b]-500×[L^c]^-1-0.61×％甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：

Tm＝79.8+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^b)+11.8(％G/C^b)²-820/L^c

3)寡DNA或寡RNA^d杂交体：

＜20个核苷酸：Tm＝2(l_n)

20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(l_n)

^a或用于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内准确。

^b仅对于在30％到75％范围内的％GC是准确的。

^cL＝双链体的碱基对长度。

^d寡，寡核苷酸；l_n，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

非特异性结合可以通过许多已知技术中的任一种来控制，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。对于非同源探针，可以通过改变如下条件之一来进行系列杂交：(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃降至42℃)，或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％降至0％)。熟练技术人员知晓可以在杂交过程中改变而保持或者改变严格条件的各种参数。

除杂交条件外，杂交特异性通常还是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性的条件下进行。阳性杂交给出至少为背景两倍的信号。一般，适用于核酸序列杂交测定或基因扩增检测操作的适宜严格条件如上文所示设置。也可以选择更高或更低的严格条件。熟练技术人员知晓可以在洗涤过程中改变从而保持或者改变严格条件的各种参数。

例如，长于50个核苷酸的DNA杂交体的典型的高严格杂交条件包括在1×SSC中于65℃杂交或者在1×SSC和50％甲酰胺中于42℃杂交，接着在0.3×SSC中于65℃洗涤。长于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的实例包括在4×SSC中于50℃杂交或者在6×SSC和50％甲酰胺中于40℃杂交，接着在2×SSC中于50℃洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸分子进行杂交时，杂交体的长度可以通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域来确定。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以另外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml片段化的变性鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。

为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等(2001)的《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989及年度更新资料)。

剪接变体

本文所用的术语“剪接变体”包括这样的核酸序列变体，其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换、置换或添加，或者其中内含子已被缩短或增长。这样的变体基本上保持了蛋白质的生物活性；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性区段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。预测和分离这类剪接变体的方法是本领域众所周知的(参见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics 6：25)。

等位基因变体

等位基因或等位基因变体为位于相同的染色体位置的给定基因的可选形式。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物体的天然多态性品系中SNP和INDEL形成最大的一组序列变体。

基因改组/定向进化

基因改组或定向进化是重复进行DNA改组以及继之的适当筛选和/或选择，以产生编码具有修饰生物活性的蛋白质的核酸序列的变体或其部分(Castle等(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

调控元件/控制序列/启动子

术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在文中均可互换使用，取其广义，是指能够影响与之相连的序列表达的调控性核酸序列。术语“启动子”通常是指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，其参与识别和结合RNA聚合酶及其他蛋白质，由此指导有效连接的核酸进行转录。上述术语包括源自经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括对于精确的转录起始是必需的TATA盒，带或不带CCAAT盒序列)，以及其他调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)——它们通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也涵盖合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸序列分子的表达。

“植物启动子”包含调控元件，其介导编码序列区段在植物细胞中的表达。“植物启动子”优选来源于植物细胞，例如，来源于待用欲在本发明方法中表达的以及本文所述的核酸序列转化的植物。这对于其他“植物”调控信号同样适用，例如“植物”终止子。位于可用于本发明方法的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，而不干扰启动子、开放读框(ORF)或者3’调控区如终止子或远离ORF的其他3’调控区的功能或活性。此外，还可以通过修饰启动子的序列而增加其活性，或者将其完全替换为活性更强的启动子、甚至是来自异源生物体的启动子。为在植物中表达，核酸序列分子必须，如上文所述的那样，有效连接于或者包含适宜的启动子，所述启动子将在恰当的时间点以所需的空间表达模式表达所述基因。

为鉴定功能上等同的启动子，可以例如通过将启动子与报告基因有效连接、测定所述报告基因在植物多种组织中的表达水平和模式，来分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式。公知的适宜报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活来测定启动子活性。然后可以将启动子强度和/或表达模式与参照启动子(如本发明方法中所用的启动子)相比较。可选地，可以利用本领域公知的方法，如Northern印迹(RNA分析)结合放射自显影图的密度计量分析、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996Genome Methods 6：986-994)，通过定量mRNA水平或者将本发明方法所用核酸序列的mRNA水平与持家基因如18S rRNA的mRNA水平进行比较，来测定启动子强度。通常，“弱启动子”表示驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”表示每个细胞约1/10,000个转录物到约1/100,000个转录物、到约1/500,0000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者说每个细胞约1/10个转录物到约1/100个转录物、到约1/1000个转录物。一般，“中等强度启动子”表示在所有情况下以低于在35S CaMV启动子控制下所获得的水平驱动编码序列表达的启动子。

有效连接

本文所用的术语“有效连接”是指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，从而启动子序列能够起始目的基因的转录。

组成型启动子

“组成型启动子”是指在生长和发育的大多数但不必然是所有阶段，在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中转录激活的启动子。下表2a给出了组成型启动子的实例。

表2a：植物组成型启动子的实例

遍在启动子

遍在启动子基本上在生物体所有的组织或细胞中都有活性。

发育调控型启动子

发育调控型启动子在某些发育阶段或在发生发育改变的植物部分有活性。

诱导型启动子

诱导型启动子响应化学(综述参见Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境或物理刺激而诱导或增加转录起始，或者可以是“胁迫诱导型”，即当植物接触多种胁迫条件时激活，或者是“病原体诱导型”，即当植物接触多种病原体时激活。

器官特异性/组织特异性启动子

器官特异性或组织特异性的启动子是能够在某些器官或组织(如叶、根、种子组织等)中优先起始转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是主要在植物根中转录激活的启动子，基本上排除在任何其他植物部分中的激活，但仍允许在这些其他植物部分的任何渗漏表达。能够仅在某些细胞中起始转录的启动子在文中称为“细胞特异性”启动子。

根特异性启动子的实例列于下表2b。

表2b：根特异性启动子的实例

种子特异性启动子主要在种子组织中转录激活，但不必仅在种子组织中激活(渗漏表达的情况下)。种子特异性启动可以在种子发育和/或萌发期间激活。种子特异性启动子的实例列于下表2c。种子特异性启动子的更多实例在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，其公开内容作为参考并入本文，如同充分阐述的那样。

表2c：种子特异性启动子的实例

如文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中转录激活的启动子，基本上排除在任何其他植物部分中的激活，但仍允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。

可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例示于下表2d。

表2d：绿色组织特异性启动子的实例

组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织中转录激活，基本上排除在任何其他植物部分的激活，但仍允许在这些其他植物部分的任何渗漏表达。可以用来实施本发明方法的分生组织特异性启动子的实例示于下表2e。

表2e：分生组织特异性启动子的实例

终止子

术语“终止子”包括控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，发送初级转录物进行3’加工和多聚腺苷酸化以及终止转录的信号。终止子可以源自天然基因、多种其他植物基因、或T-DNA。例如，待加入的终止子可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其它植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。

调节

就表达或基因表达而言，术语“调节”是指与对照植物相比，所述基因表达的表达水平被改变的过程，优选表达水平增加。原始未调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或随后进行翻译的mRNA的任何类型的表达。术语“调节活性”应理解为本发明核酸序列或编码蛋白质的任何表达改变，该改变导致植物产量增加和/或生长增加。

增加的表达/过表达

如本文所用的术语“增加的表达”或“过表达”表示超出原始野生型表达水平的任何形式的表达。

增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的文献记载，且包括，例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强物或翻译增强物的使用。可以将用作启动子或增强物元件的分离的核酸序列引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调编码目的多肽的核酸序列的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代，在体内改变内源启动子(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或者可以将分离的启动子在相对于本发明基因的适当方向和距离引入植物细胞中，从而控制基因的表达。

如果期望多肽表达，通常期望在多核苷酸编码区的3’末端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。

也可以在5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子，可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev.1：1183-1200)。通常内含子放置在转录单位5’末端附近时，增强基因表达的作用最大。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，N.Y.(1994)。

内源基因

本文述及的“内源”基因不仅指见于植物之中的天然形式的所讨论基因(即未经人为干预)，而且指随后(重新)引入到植物中的分离形式的所述基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这样的转基因的转基因植物可能遭遇转基因表达的实质性下降和/或内源基因表达的实质性下降。

降低的表达

本文述及“降低的表达”或者表达“减小或基本上消除”应理解为表示内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物降低。所述减小或基本上消除按照递增的优选顺序为，与对照植物相比，减小至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多。

为减小或基本上消除植物中内源基因的表达，需要一段足够长度的、基本上连续核苷酸的核酸序列。为进行基因沉默，这可以少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或更少的核苷酸，可选地，这可以多至完整的基因(包括部分或完整的5’和/或3’UTR)。基本上连续的核苷酸链可以源自编码目的蛋白质的核酸序列(靶基因)，或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸序列。优选地，基本上连续的核苷酸链能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸链按照递增的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。对于本文所讨论的减小或基本上消除内源基因表达的各种方法而言，并非必需编码(功能性)多肽的核酸序列。

减小或基本上消除表达可以利用常规工具和技术来实现。一种减小或基本上消除内源基因表达的方法是：RNA介导的沉默，其中利用倒转重复的核酸序列或其部分(在此情况中，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸序列的、基本上连续的核苷酸链)，优选能够形成发夹结构。RNA沉默法的另一实例包括以有义取向在植物中引入核酸序列或其部分(在这种情况下，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸序列的、基本上连续的核苷酸链)。RNA沉默法的另一实例包括应用反义核酸序列。基因沉默还可以通过插入诱变(例如，T-DNA插入或转座子插入)或通过Angell和Baulcombe((1999)Plant J 20(3)：357-62)、(Amplicon VIGS WO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)等所述的策略来实现。其他方法，例如应用针对内源多肽的抗体在植物原位(in planta)抑制其功能，或干扰多肽所参与的信号传递通路，对于技术人员是公知的。人工和/或天然微小RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源miRNA为单链小RNA，一般长度19-24个核苷酸。人工微小RNA(amiRNA)一般长度21个核苷酸，可以特异性地遗传改造以负调控单个或多个目的基因的基因表达。植物微小RNA靶标选择的决定因素在本领域公知。已经定义了靶标识别的经验参数，并且可用来辅助设计特异性amiRNA(Schwab等，(2005)Dev Cell 8(4)：517-27)。设计和生成amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等，(2006)Plant Cell18(5)：1121-33)。

为优化性能，用来减小植物中内源基因表达的基因沉默技术需要应用来自单子叶植物的核酸序列转化单子叶植物，而使用来自双子叶植物的核酸序列转化双子叶植物。优选，来自任何给定植物物种的核酸序列引入到相同物种中。例如，来自稻的核酸序列转化到稻植物中。然而，待引入的核酸序列来源于与其待引入的植物相同的植物物种并非是绝对必需的。内源靶基因与待引入的核酸序列之间基本上同源就足够了。

上文描述了减小或基本上消除植物中内源基因表达的多种方法的实例。本领域技术人员将能够容易地调整上述沉默方法，以便例如通过应用适当的启动子而实现内源基因在整株植物或其部分中的表达减小。

可选择标记(基因)/报告基因

“可选择标记”、“可选择标记基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任何基因，其中该表型在细胞中的表达有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸序列构建体转染或转化的细胞。这些标记基因通过一系列不同的原理使得能够鉴定核酸序列分子的成功转移。适宜的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可视选择。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予抗例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供抗

抗性的bar；提供抗草甘膦抗性的aroA或gox，或赋予抗例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺胺脲抗性的基因)、或者提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或有关木糖利用的木糖异构酶，或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性)。可视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS，或β-半乳糖苷酶及其有色底物，例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这仅仅是一小部分可能标记的名单。技术人员熟悉此类标记。取决于生物体和选择方法，优选不同的标记。

已知对于核酸序列在植物细胞中的稳定或瞬时整合，取决于所用的表达载体和所用的转染技术，仅少数细胞可以摄入该外来DNA，以及，如果期望的话，整合进其基因组。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如上文所述的那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记能够在例如突变体中使用，所述突变体中原有的这些基因例如通过常规方法缺失而没有功能。此外，编码可选择标记的核酸序列分子可与编码本发明多肽的或用于本发明方法的序列包含在同一个载体中，或者在分开的载体中引入宿主细胞。已经稳定转染了所引入的核酸序列的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。

由于一旦成功引入了核酸序列后将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明用于引入核酸序列的方法最好采用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸序列，而第二个携带标记基因。很大比例的转化体接收或者对于植物而言含有(高达40％或以上的转化体)两个载体。对于农杆菌转化，转化体通常只接收载体的一部分，即被T-DNA侧翼包围的序列，其通常是表达盒。随后可通过杂交从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合在转座子中的标记基因与期望的核酸序列一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸序列构建体来瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10％)，一旦成功进行了转化，转座子会跳离宿主细胞基因组并丢失。在另外一些情况下，转座子会跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交消除标记基因。在微生物学领域，已经研发了使得可以或便于检测此类事件的技术。另一有利的方法有赖于所谓的重组系统；其优势在于可以免除杂交消除。最著名的这类系统是称为Cre/lox系统的系统。Cre1为重组酶，其切除位于loxP序列之间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦转化成功后，其会因Cre1重组酶的表达而得以切除。其他重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。根据本发明的核酸序列可以位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。

转基因的/转基因/重组

出于本发明的目的，就例如本发明的核酸序列、含有所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体、或用所述核酸序列、表达盒或载体转化的生物体而言，“转基因的”、“转基因”或“重组”是指所有这些构建体通过重组方法产生，其中：

(a)编码可用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或

(b)有效连接于本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或

(c)(a)和(b)

不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法修饰，该修饰可以采取的形式为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒换或插入。天然遗传环境应理解为原始植物中天然的基因组或染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况下，优选保持、至少是部分地保持核酸序列的天然遗传环境。该环境至少位于核酸序列的一侧，长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。当天然存在的表达盒-例如编码可用于本发明方法的多肽的相应核酸序列与该核酸序列的天然启动子之间的天然组合——经非天然的合成(“人工”)方法例如诱变处理而被修饰时，此表达盒变成转基因表达盒。合适的方法描述在例如，US 5,565,350或WO 00/15815中。

因此，如上文所述，用于本发明目的的转基因植物应理解为指：在所述植物的基因组中，本发明方法中所用的核酸序列不在其天然基因座上，其中所述核酸序列可以进行同源或异源表达。不过，正如所提到的那样，转基因也表示：尽管在植物基因组中根据本发明的或本发明方法中所用的核酸序列在其天然位置上，但是所述序列已相对于天然序列而被修饰，和/或天然序列的调控序列已被修饰。转基因优选理解为表示：根据本发明的核酸序列在基因组中非天然的座位上表达，即同源表达，或者优选发生核酸序列的异源表达。优选的转基因植物在文中述及。

转化

本文述及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。能够随后通过器官发生或者胚胎发生进行克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可用于和最适于待转化的具体物种的克隆增殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒以非整合的状态维持。可选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员已知的方式再生为转化的植物。

外来基因转移进入植物基因组中称为转化。植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用若干转化方法的任一种向适当的祖先细胞引入目的基因。可以利用公开的转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括应用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和微粒轰击。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，(1882)Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，(1987)Plant Mol.Biol.8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等，(1987)Nature 327：70)；用(非整合型)病毒感染，等等。优选通过农杆菌介导的转化，产生转基因植物，包括转基因作物植物。有利的转化法是植物原位转化。为此，可以例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。已经证明，根据本发明尤为有利的是使转化的农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。农杆菌介导的稻转化方法包括公知的稻转化方法，例如在任一如下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta，199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)：271-282，1994)，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1)：13-22，2002)中所述，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。作为举例说明，所述方法还由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在Transgenic Plants，卷1，Engineeringand Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸序列或构建体克隆到载体中，所述载体适用于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，例如模式植物，像拟南芥(Arabidopsis thaliana，其在本发明范围内不视为作物植物)；或者作物植物，例如烟草植物，例如通过将擦伤的叶子或切碎的叶子浸在农杆菌溶液中，然后在合适的培养基中培养之。通过根癌农杆菌的植物转化由例如，

和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述，或者尤其可以参见F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants在Transgenic Plants，卷1，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页。

除了转化之后不得不再生为完整植株的体细胞，还可以转化植物分生组织的细胞，特别是可以发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育中的植物获得种子，其中一定比例的植物被转化因而是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987).Mol Gen Genet208：274-289；Feldmann K(1992).在C Koncz，N-H Chua和J Shell编辑Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。可选的方法基于花序的反复去除以及莲座中心切割部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5：551-558；Katavic(1994).Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，特别有效的方法是改良的真空浸润法，如“浸花法”(floral dip)。对于拟南芥的真空浸润，减压下用农杆菌悬液处理完整植株[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而对于“浸花法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998).The Plant J.16，735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中为母系遗传，从而降低或消除了转基因通过花粉流失的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]系统展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导转基因位点特异性整合到质体基因组中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述由Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plantbiotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)Progress towards commercialization of plastid transformationtechnology.Trends Biotechnol.21，20-28给出。最近报道了其他生物技术进步，无标记的质体转化体，这可通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。

T-DNA激活标记

T-DNA激活标记(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括将T-DNA[通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)]插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10kb处，从而在构型上使启动子能够指导靶基因的表达。通常破坏天然启动子对靶基因表达的调控，而使基因落入新引入的启动子控制。启动子一般包含于T-DNA中。此T-DNA可以例如通过农杆菌感染而随机插入植物基因组中，并导致所插入T-DNA附近的基因的表达被修饰。得到的转基因植物由于位于引入的启动子附近的基因的修饰表达而表现出显性表型。

TILLING

术语“TILLING”为“靶向诱导的基因组局部损伤”(Targeted InducedLocal Lesions In Genomes)的缩写，是一种用于生成和/或鉴定编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质的核酸序列的诱变技术。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以在强度、位置或时间(例如，如果突变影响启动子的话)上呈现出修饰的表达。这些突变变体可以比其天然形式基因呈现更高的活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法结合在一起。TILLING一般遵循的步骤有：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C，(1992)In Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J编辑，新加坡，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)In Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，第137-172页；Lightner J和CasparT，(1998)In J Martinez-Zapater，J Salinas编辑，Methods on MolecularBiology，82卷Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中合并物中存在的杂双链体在色谱图上检测为额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域公知的(McCallum等(2002)Nat Biotechnol 18：455-457，由Stemple综述(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。

同源重组

同源重组允许向基因组中的规定选定位置引入所选的核酸序列。同源重组是生物科学中常规用于低等生物体如酵母或剑叶藓(physcomitrella)的标准技术。在植物中进行同源重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMBO J.9(10)：3077-84)，而且也在作物植物，如稻中描述(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotechnol 15(2)：132-8)。

产量

术语“产量”通常表示具有经济价值的可测量产出，其一般是与规定的作物、面积和/或时期相关的。各植物部分基于其数量、大小和/或重量对产量直接做出贡献，或者真正的产量是年作物每英亩的产量，用总产量(既包括收获的产量也包括估定的产量)除以种植的英亩来确定。术语植物的“产量”可能与该植物的营养性生物质、繁殖器官、和/或繁殖体(如种子)相关。

早期活力

“早期活力”是指活跃健康充分均衡的生长(特别是在植物生长的早期阶段)，其可以因植物适应性(fitness)增强引起，例如，由于植物更好地适应其环境(即，优化能源资源的利用以及在枝条和根之间的分配)引起。具有早期活力的植物也显示出增加的幼苗存活和更佳的作物齐苗，这往往产生高均匀度的田地(作物以齐整的方式生长，即大多数植物基本上同时达到各发育阶段)，以及往往是更优更高的产量。因此，早期活力可以通过测量多种因素来确定，如千粒重、萌发率、出苗率、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和枝条生物量，等等。

增加/提高/增强

术语“增加”、“提高”或“增强”可互换，且在本申请意义上表示与文中所定义的对照植物相比，产量和/或生长多出至少5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％或40％。

种子产量

增加的种子产量自身可表现为如下一项或多项：a)种子生物量(种子总重量)的增加，这可以是基于单粒种子和/或每植株和/或每公顷或英亩的增加；b)每个圆锥花序和/或每植株花数的增加；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表达为饱满种子数与种子总数的比率)；e)增加的收获指数，其表达为可收获部分如种子的产量除以总生物量的比率；f)增加的初级圆锥花序(primary panicles)数；(g)增加的千粒重(TKW)，这通过计数饱满种子数和它们的总重量外推得到。TKW增加可来自于种子大小和/或种子重量的增加，并且也可来自胚和/或胚乳大小的增加。

种子产量的增加也可表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加自身也可表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的种子产量也可以导致改变的构造，或可以因改变的构造而发生。

绿度指数

如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿值相对于红值之比(在RGB模型中用于色度编码)。绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、在养分可利用度下降的生长条件下，在开花前的末次成像中测量植物绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物绿度指数。

植物

本文所用术语“植物”涵盖整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中上述每一种都含有目的基因/核酸序列。术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一种都含有目的基因/核酸序列。

尤其可用于本发明方法的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，选自包括如下的列表：槭树属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍茎剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱芹属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annonaspp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avenaspp.)(如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、簕竹属物种(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(如欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝型油菜(Brassica rapassp.)[芸苔、油菜籽油菜、芜菁])、Cadaba farinosa、大叶茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、苔草(Carex elata)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamustinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、大麻(Cannabis sativa)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可拉属物种(Cola spp.)、黄麻属物种(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(如非洲油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)(如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthusspp.)(如向日葵(Helianthus annus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、地杨梅(Luzulasylvatica)、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(如番茄(Lycopersiconesculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme)、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、西印度樱桃(Malpighia emarginata)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangiferaindica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Menthaspp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morusnigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)(如稻(oryza sativa)，阔叶稻(Oryza latifolia))、黍糜(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Perseaspp.)、香芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、梯牧草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenixspp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树属物种(Prosopisspp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanum spp.)(如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番柿(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobromacacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属物种(Triticum spp.)(如小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆锥小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、面包小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticumvulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、旱金莲(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vignaspp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。

发明详述

现已令人惊讶地发现，在植物中增加如本文所定义的NRT2多肽编码核酸序列的表达，可以使这些植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。根据第一种实施方案，本发明提供了增强植物相对于对照植物的产量相关性状的方法，包括增加植物中NRT2多肽编码核酸序列的表达。

增加NRT2多肽编码核酸序列表达的优选方法是在植物中引入和表达NRT2多肽编码核酸序列。

下文对“可用于本发明方法的蛋白质”的任何述及应理解为表示如本文所定义的NRT2多肽。下文对“可用于本发明方法的核酸序列”的任何述及应理解为表示能够编码这样的NRT2多肽的核酸序列。待引入植物(从而可用于实施本发明方法)的核酸序列是编码现在将要描述的该类多肽的任何核酸序列，下文也称为“NRT2核酸序列”或“NRT2基因”。

如本文所定义的“NRT2多肽”是指任何这样的多肽，其按照递增的优选顺序与SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。

可选地或另外地，如本文所定义的“NRT2多肽”是指任何这样的多肽，其包含：(i)InterPro登录号为IPR0004737的硝酸盐转运蛋白家族结构域；和/或(ii)InterPro登录号为IPR007114的主要易化转移蛋白超家族结构域；和/或InterPro登录号为IPR011701的主要易化转移蛋白超家族MSF-1结构域；和(ii)至少11个跨膜螺旋。

可选地或另外地，如本文所定义的“NRT2多肽”是指任何这样的多肽序列，当利用其构建NRT2系统发生树(例如图3和4所示的发生树)时，与来自硅藻的NRT2多肽的进化枝而非任何其他NRT2多肽进化枝聚类。

可选地或另外地，如本文所定义的“NRT2多肽”是指任何这样的多肽，其按照递增的优选顺序与本文表A所给出的任一多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。

术语“结构域”和“基序”在本文“定义”部分定义。存在用于鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax for biomolecular sequencesmotifs and its function in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings 2nd InternationalConference on Intelligent Systems for Molecular Biology)Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编辑，53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或者Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002)。进行蛋白质序列芯片(in silico)分析的一组工具可以从ExPASy蛋白质组学服务器获得(瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)(Gasteiger等ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledge andanalysis.Nucleic Acids Res 31：3784-3788(2003))。SEQ ID NO：2多肽序列的分析在下文示于本文实施例4。例如，SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽包含InterPro登录号为IPR0004737的硝酸盐转运蛋白家族结构域等等。结构域也可以利用常规技术例如通过序列比对来鉴定。本文表A和A1中多肽的比对示于图5。此类比对可用于鉴定NRT2多肽之间最保守的结构域，例如硝酸盐/亚硝酸盐转运子(porter)(NPP基序)或MSFI基序。

为比较而进行序列比对的方法是本领域公知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol. Biol.48：443-453)来寻找两序列之间匹配数最大化且空位数最小化的全局(即跨越完整序列)的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分比，并对两序列之间的相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。例如，同源物可以使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的双比对参数以及百分比的记分方法而容易地鉴定。利用可获自MatGAT软件包(Campanella等，(2003)BMCBioinformatics，10：29.MatGAT：an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences)的方法之一，也可以确定全局相似性和同一性百分比。可以进行微小的人工编辑以优化保守基序之间的比对，这对于所属领域的技术人员而言将是显而易见的。此外，除了利用全长序列进行同源物鉴定以外，还可以利用特定的结构域。可以利用上述程序采用默认参数针对完整核酸序列或多肽序列或者选择的结构域或保守基序来确定序列同一性值。本文实施例3表B描述了SEQ IDNO：2所示NRT2多肽与表A和A1所列NRT2多肽之间的同一性百分比。SEQ ID NO：2所示NRT2多肽与表A所列NRT2多肽(硅藻NRT2多肽)之间的氨基酸序列同一性百分比为至少60％。如果在SEQ ID NO：2所示NRT2多肽与表A1所列NRT2多肽(非硅藻NRT2多肽)之间进行同一性计算，则同一性百分比降至25％。

预测蛋白质亚细胞定位的任务非常重要并进行了充分研究。知晓蛋白质的定位有助于阐释其功能。用于蛋白质定位的实验方法范围广泛，从免疫定位到利用绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)标记蛋白质。与计算方法相比，此类方法虽然劳动量大但精确。最近在根据序列数据计算预测蛋白质定位方面取得了很大进步。在本领域技术人员公知的算法中，从瑞士生物信息学研究所托管的ExPASy蛋白质组学工具可获得，例如PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP、TMHMM等等。SEQ ID NO：2所示NRT2多肽的亚细胞定位预测和拓扑学在本申请实施例5中描述。

本发明以SEQ ID NO：1所示的核酸序列转化植物来进行举例说明，其编码SEQ ID NO：2的NRT2多肽序列。然而，本发明的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用编码本文所定义的NRT2多肽的任何核酸序列来实施。

NRT2多肽编码核酸序列的实例在本文实施例1表A中给出。这样的核酸序列可用于实施本发明的方法。实施例1表A中给出的多肽序列为SEQ ID NO：2所示NRT2多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。可以通过进行所谓的交互BLAST搜索，容易地找到更多直向同源物和旁系同源物。通常，这包括一次BLAST，即以查询序列(例如，利用实施例1表A中所列的任何序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST (二次BLAST)(在查询序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的情况下，二次BLAST将会针对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)序列)。然后比较一次和二次BLAST的结果。如果一次BLAST中分值靠前的命中事件来自查询序列源自的相同物种，而理想地反向BLAST导致查询序列在最高命中事件中，则鉴定到了旁系同源物；如果一次BLAST中分值靠前的命中事件不是来自查询序列源自的相同物种，且优选地反向BLAST导致查询序列处于最高命中事件之列，则找到了直向同源物。

分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中事件的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，继之以邻接树来辅助相关基因的聚类可视化和鉴定直向同源物和旁系同源物。

核酸变体也可用于实施本发明的方法。这类变体的实例包括编码实施例1表A中所给出任一多肽序列的同源物和衍生物的核酸序列，其中“同源物”和“衍生物”如本文所定义。同样可用于本发明方法的有编码实施例1表A所给出的任一多肽序列的直向同源物和旁系同源物的核酸序列。可用于本发明方法的同源物和衍生物与其源自的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物活性和功能活性。

可用于实施本发明方法的其他核酸变体包括NRT2多肽编码核酸序列的部分、与NRT2多肽编码核酸序列杂交的核酸序列、NRT2多肽编码核酸序列的剪接变体、NRT2多肽编码核酸序列的等位基因变体，以及通过基因改组获得的NRT2多肽编码核酸序列的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位基因变体和基因改组如本文所述。

NRT2多肽编码核酸序列无需是全长核酸序列，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了增强植物产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A所给出的任一核酸序列的部分、或者编码实施例1表A所给出的任一多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的部分。

例如，可以通过对核酸序列进行一个或多个缺失来制备核酸序列的“部分”。“部分”可以以分离的形式使用，或者可将其与其他编码(或非编码)序列融合，以便例如，产生组合了几种活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比针对该蛋白质部分预测的大小要大。

可用于本发明方法的“部分”编码如本文所定义的NRT2多肽，并与实施例1表A所给出的多肽序列具有基本上相同的生物活性。优选“部分”是实施例1表A所给出的任一核酸序列的部分，或是编码实施例1表A所给出的任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的部分。优选“部分”按照递增的优选次序为长度至少400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸来自实施例1表A所给出的任一核酸序列，或编码实施例1表A所给出任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列。优选“部分”是编码这样的多肽序列的核酸序列的部分，所述多肽序列按照递增的优选次序与SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。更优选“部分”是核酸序列SEQ ID NO：3的部分。最优选“部分”如SEQ ID NO：1所示。

可用于本发明方法的另一核酸序列变体为能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下，与本文所定义的NRT2多肽编码核酸序列或者本文所定义的“部分”杂交的核酸序列。

根据本发明，提供了增强植物产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达能够与实施例1表A所给出的任一核酸序列杂交的核酸序列，或者包括在植物中引入和表达能够与编码实施例1表A所给出的任一核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列杂交的核酸序列。

可用于本发明方法的杂交序列编码如本文所定义的NRT2多肽，与实施例1表A所给出的多肽序列具有基本上相同的生物活性。优选杂交序列能够与实施例1表A所给出的任一核酸序列杂交、或与这些序列之任一的部分杂交，其中部分如上文所定义；或者杂交序列能够与编码实施例1表A所给出的任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列杂交。优选杂交序列能够与编码这样的多肽序列的核酸序列杂交，所述多肽序列按照递增的优选次序与SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。最优选，杂交序列能够与SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其部分杂交。

可用于本发明方法的另一核酸序列变体为编码前文所定义的NRT2多肽的剪接变体，其中剪接变体如本文所定义。

根据本发明，提供了增强产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A所给出的任一核酸序列的剪接变体、或编码实施例1表A所给出的任一多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的剪接变体。

优选的剪接变体是SEQ ID NO：1所示核酸序列的剪接变体，或编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接变体。优选剪接变体是编码这样的多肽序列的核酸序列的剪接变体，所述多肽序列按照递增的优选次序与SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。

可用于实施本发明方法的另一核酸序列变体为编码前文所定义的NRT2多肽的核酸序列的等位基因变体，其中等位基因变体如本文所定义。

根据本发明，提供了增强产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A所给出的任一核酸序列的等位基因变体，或者包括在植物中引入和表达编码实施例1表A所给出的任一多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的等位基因变体。

可用于本发明方法的等位基因变体与SEQ ID NO：2的NRT2多肽及实施例1表A所示的任一多肽序列具有基本上相同的生物活性。等位基因变体天然存在，并且对这些天然等位基因的应用包含于本发明的方法中。优选等位基因变体为SEQ ID NO：1的等位基因变体，或编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的等位基因变体。优选等位基因变体是这样的多肽序列的等位基因变体，所述多肽序列按照递增的优选次序与SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。

基因改组或定向进化也可用于产生编码上文所定义的NRT2多肽的核酸序列的变体；其中术语“基因改组”如本文所定义。

根据本发明，提供了增强产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A所给出的任一核酸序列的变体，或者包括在植物中引入和表达编码实施例1表A所给出的任一多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的变体，其中所述变体核酸序列通过基因改组获得。

优选通过基因改组获得的变体核酸序列编码这样的多肽序列，所述多肽序列按照递增的优选次序与SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。

此外，还可利用定点诱变获得核酸序列变体。若干方法可用来实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in MolecularBiology.Wiley编辑)。

编码NRT2多肽的核酸序列可以源自任何天然或人工来源。核酸序列可以通过仔细的人为操作修饰而在组成和/或基因组环境上不同于其天然形式。编码NRT2多肽的核酸序列可以来自真核生物域，优选来自囊泡藻界(Chromalveolata)，进一步优选来自不等鞭毛门(Heterokontophyta)。更优选，编码NRT2多肽的核酸序列来自硅藻纲(Bacillariophyceae)，例如，来自如下目：曲壳藻目(Achnanthales)、硅藻目(Bacillariales)、中心硅藻目(Centrales)(例如假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana))、桥弯藻目(Cymbellales)、短缝藻目(Eunotiales)、胸隔藻目(Mastogloiales)、舟形藻目(Naviculales)、羽纹硅藻目(Pennales)(例如三角褐指藻)、棒杆藻目(Rhopalodiales)、双菱藻母(Surirellales)或Thalassiophysales。最优选，编码NRT2多肽的核酸序列来自三角褐指藻。

实施本发明的方法产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文“定义”部分有更详细的说明。

以玉米为例，产量增加可以表现为如下一个或多个方面：每公顷或每英亩建植的植物数的增加；每株植物谷穗数的增加；行数、行粒数、粒重、千粒重、谷穗长度/直径的增加；种子饱满率(为饱满种子数除以种子总数并乘以100)的增加，等等。以稻为例，产量增加可以表现为如下一个或多个方面的增加：每公顷或每英亩的植物数、每株植物的圆锥花序数、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花朵(小花)数(表达为饱满种子数占初级圆锥花序数的比率)、种子饱满率(为饱满种子数除以种子总数并乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。

本发明提供了相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码本文所定义的NRT2多肽的核酸序列的表达。

由于本发明的转基因植物具有增强的产量相关性状，相对于对照植物在其生命周期相应阶段的生长速率而言，这些植物很可能呈现增加的生长速率(至少在其部分生命周期中)。

增加的生长速率可以特异于植物的一个或多个部分(包括种子)，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生长速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解为指从成熟干种子生长至植物已经产生类似于起始材料的成熟干种子的阶段所需的时间。此生命周期可以受到诸如早期活力、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速率的增加可以发生在植物生命周期的一个或多个阶段，或者发生在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增加的(早期)活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比原可能的情况更晚播种和/或更快收获(类似的效果可以通过较早的开花时间获得；延迟开花通常不是作物期望的性状)。如果生长速率充分增加，可以允许再次播种同种植物物种的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着再次播种和收获稻类植物)。与此类似，如果生长速率充分地增加，可以允许再播种不同植物物种的种子(例如播种和收获玉米植物，随后，例如，播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其他适宜的植物)。在一些作物植物的情况下也可能从同一砧木收获增加的次数。改变植物的收获周期可以导致每公顷年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获的次数增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还允许在更广阔的地域栽培转基因植物，这是因为种植作物的地域限制通常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，就可以避免这类不利条件。可以通过自生长曲线获得多种参数，确定生长速率，这类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小的50％所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小90％所需的时间)等等。

根据本发明优选的方面，实施本发明的方法产生相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，本发明提供了增加植物生长速率的方法，所述方法包括增加植物中编码本文所定义的NRT2多肽的核酸序列的表达。

相对于生长在相应条件下的对照植物，增强的产量相关性状可以发生在植物出于非胁迫条件下或发生在植物暴露于各种胁迫的情况下。通常植物通过更加缓慢的生长来应答胁迫接触。在重度胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在文中定义为当植物接触时不导致植物完全停止生长且丧失重新开始生长的能力的任何胁迫。本发明意义上的轻度胁迫导致胁迫植物的生长，与非胁迫条件下的对照植物相比，下降不到40％、35％或30％，优选不到25％、20％或15％，更优选不到14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、农药处理)的发展，栽培的作物植物往往并不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱发的受损的生长通常成为农业中不期望的因素。轻度胁迫是植物接触的日常的生物和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫以及热、冷或冰冻温度而引起。非生物胁迫可以是由于水胁迫(特别是由于干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体例如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫所引起的那些胁迫。如本文所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员知晓给定位置的正常土壤条件和气候条件。

实施本发明的方法产生在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增强的产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供了增强植物在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下生长时的产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码NRT2多肽的核酸序列的表达。

实施根据本发明的方法产生在非生物胁迫条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增强的产量相关性状的植物。如Wang等(Planta(2003)218：1-14)所报道的那样，非生物胁迫引起一系列的形态学、生理学、生物化学和分子变化，对植物生长和生产力造成不利影响。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫相互联系，并可以通过相似的机制诱发生长和细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫和高盐度胁迫之间存在着的特别高程度的“交叉对话”。例如，干旱和/或盐度主要表现为渗透胁迫，导致破坏细胞中的稳态和离子分布。氧化胁迫通常与高温或低温、盐度或干旱胁迫相伴，可以引起功能及结构蛋白质的变性。所以，这些多种多样的环境胁迫通常激活相似的细胞信号传递通路和细胞应答，如应激蛋白的产生、抗氧化剂的上调、可混溶溶质的累积以及生长阻抑。由于多种多样的环境胁迫激活相似的通路，本发明以干旱胁迫进行的举例说明不应视为局限于干旱胁迫，而更应视为一个显示屏，表明在一般的非生物胁迫下，相对于在相当条件下生长的对照植物，如上文所定义的NRT2多肽参与增强产量相关性状。

如本文所定义的术语“非生物胁迫”应理解为表示任何如下一种或多种：水胁迫(由于干旱或过量的水)；缺氧胁迫；盐胁迫；温度胁迫(由于热、冷或冷冻温度)、化学毒性胁迫和氧化胁迫。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，选自水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选，水胁迫是干旱胁迫。术语盐胁迫不局限于食盐(NaCl)，而可以是如下一种或多种引起的任何胁迫：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等等。

实施本发明的方法产生在非生物胁迫条件下相对于在相当胁迫条件下生长的对照植物具有增强的产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供了在非生物胁迫条件下生长的植物中增强产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码NRT2多肽的核酸序列的表达。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，选自如下一种或多种：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。

非生物环境胁迫的另一实例是植物为生长和发育而需要同化的一种或多种养分的可利用率减小。由于养分利用效率对植物产量和产品质量的强烈影响，有大量化肥倾倒在田间以优化植物生长和品质。植物生产力一般受限于三种主要养分：磷、钾和氮，而这三者中的氮通常是植物生长的限速元素。因此，植物生长所需的主要营养素是氮(N)。它是活细胞中的众多重要化合物(包括氨基酸、蛋白质(酶)、核酸和叶绿素)的组成成分。1.5％-2％的植物干物质是氮，约合16％的植物总蛋白质。因而，氮利用率是作物植物生长和生产的主要限制因素(Frink等(1999)Proc Natl AcadSci USA 96(4)：1175-1180)，而且对蛋白质累积和氨基酸组成也具有重大影响。因此，在限氮条件下生长时具有增强的产量相关性状的作物植物具有重大意义。

实施本发明的方法产生在养分可利用率减小的条件下、特别是氮利用率减小条件下，相对于在相当条件下生长的对照植物，具有增强的产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供了在生长于养分利用率减小条件下、特别是氮利用率减小条件下的植物中增强产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码NRT2多肽的核酸序列的表达。养分利用率减小可以因诸如氮、磷及其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等养分的缺乏或过量所致。优选，养分利用率减小是氮利用率减小。

本发明包括可由根据本发明的方法获得的植物或其部分(包括种子)或其细胞。所述植物或其部分或其细胞含有编码如上文所定义的NRT2多肽的核酸转基因。

本发明还提供遗传构建体和载体，以利于编码如本文所定义的NRT2多肽的核酸序列在植物中的引入和/或增加表达。可以将基因构建体插入可商购的、适于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体中。本发明还提供了如本文所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供这样的构建体，其含有：

(a)编码如上文所定义的NRT2多肽的核酸序列；

(b)一个或多个能够增加(a)中核酸序列表达的控制序列；和任选的

(c)转录终止序列。

优选地，编码NRT2多肽的核酸序列如上文所定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文所定义。

优选，构建体的一个控制序列是分离自植物基因组的组成型启动子。植物组成型启动子的一个实例是GOS2启动子，优选稻GOS2启动子，更优选如SEQ ID NO：31所示的GOS2启动子。

使用含有任何上述核酸序列的载体转化植物。技术人员充分知晓载体中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择并繁殖含目的序列的宿主细胞。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。

有利地，可以使用任何类型的天然或合成启动子来增加核酸序列的表达。组成型启动子在本发明方法中特别有用，优选分离自植物基因组的组成型启动子。植物组成型启动子可以在所有情况下以低于在35S CaMV病毒启动子控制下所获得的水平驱动编码序列表达。

其他器官特异性启动子，例如用于在叶、茎、块茎、分生组织、种子(胚和/或胚乳)中优先表达的启动子，可用于实施本发明的方法。有关各种启动子类型的定义，参见本文“定义”部分。

应当清楚，本发明的实施并不局限于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的编码NRT2多肽的核酸序列，而且本发明的实施也不局限于由组成型启动子所驱动的NRT2多肽编码核酸序列的表达。

任选的，可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。另外的调控元件可以包括转录和翻译的增强子。本领域技术人员会知道适合用于实施本发明的终止子和增强子的序列。如“定义”部分所说明的那样，也可以向5’非翻译区(UTR)或在编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。这类序列为本领域技术人员公知或者可以容易地获得。

本发明的遗传构建体可以还包括为在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为染色体外遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

为检测本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择含有这些核酸序列的转基因植物，最好使用标记基因(或报告基因)。因此，遗传构建体可以任选地含有可选择标记基因。可选择标记在本文“定义”部分有更详细的说明。

已知对于核酸序列稳定或瞬时整合进植物细胞，取决于所用的表达载体和所用的转染技术，仅少数细胞可以摄入外来DNA，以及如果期望的话整合进其基因组。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如上文所述的那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记能够在例如突变体中使用，所述突变体中原有的这些基因例如通过常规方法缺失而没有功能。此外，编码可选择标记的核酸序列分子可与编码本发明多肽的或用于本发明方法的序列包含在同一个载体中，或者在分开的载体中引入宿主细胞。已经稳定转染了所引入的核酸序列的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。标记基因一旦不再需要，可以从转基因细胞中除去或切除。用于标记基因去除的技术在本领域公知，有用的技术在上文“定义”部分有说明。

本发明还提供了产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达编码如前文所定义的NRT2多肽的任何核酸序列。

更具体地，本发明提供了产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括：

(i)向植物、植物部分或植物细胞中引入和表达编码NRT2多肽的核酸序列；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物、植物部分或植物细胞。

(i)中的核酸序列可以为任何能够编码如本文所述的NRT2多肽的核酸序列。

可以将核酸序列直接引入植物细胞或植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其它部分)。根据本发明优选的方面，优选通过转化将核酸序列引入植物。术语“转化”在本文“定义”部分有更详细的说明。

遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者和Willmitzer的出版物。

通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，接着使转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与未转化的植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能性方案是在使用合适的选择剂的琼脂板上生长种子(酌情在灭菌后)，从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对转化的植物筛选可选择标记例如上文所述标记的存在。

DNA转移和再生之后，还可例如用Southern分析(DNA印迹)，评价推定转化的植物，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所公知的。

产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以呈多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞经转化含有表达盒)；转化的和非转化的组织的嫁接体(例如在植物中，转化的砧木嫁接到非转化的接穗上)。

本发明显然延及由本文所述任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及由任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，所述后代的唯一要求是呈现根据本发明方法所产生的亲本的相同基因型和/或表型特征。

本发明也包括含有有效连接于植物组成型启动子的、编码上文所定义的NRT2多肽的分离核酸序列的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。对于根据本发明方法所用的核酸序列或载体、表达盒或构建体或载体，宿主植物原则上有利地为能够合成本发明方法中所用的多肽的所有植物。

本发明的方法有利地适用于任何植物。尤其可用于本发明方法的植物包括属于植物界超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或牧草豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物为作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选植物是谷类。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。

本发明也延及植物的可收获部分，含有有效连接于植物组成型启动子的、编码(如上文所定义的)NRT2的分离核酸序列，例如但不限于：种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎和球茎。本发明还涉及由这样的植物的可收获部分衍生的、优选直接衍生的产品，如干丸或粉、油类、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

增加核酸序列或基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的文献记载，并且实例在“定义”部分提供。

如上文所述，增加编码NRT2多肽的核酸序列表达的优选方法是在植物中引入和表达NRT2多肽编码核酸序列；然而，实施所述方法的效果，即增强产量相关性状，也可以利用其他众所周知的技术实现，包括但不限于：T-DNA激活标记、TILLING、同源重组。这些技术的说明在“定义”部分提供。

本发明还包括编码如本文所述NRT2多肽的核酸序列的用途，以及这些NRT2多肽的用途：用于在正常生长条件下、在非生物胁迫生长条件(优选渗透胁迫生长条件)下、和在养分利用率减小的生长条件下、优选在氮利用率减小的条件下，增强植物的任一上述产量相关性状。

可以在育种程序中使用编码本文所述NRT2多肽的核酸序列或所述NRT2多肽本身，其中鉴定可能与NRT2多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。可以使用所述基因/核酸序列或所述NRT2多肽本身定义分子标记。接着可以在育种程序中使用此DNA或蛋白质标记，以在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。

编码NRT2多肽的基因/核酸序列的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。这类育种程序有时需要使用例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变异；可选的，此类程序可以起始于一系列无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体。然后通过例如PCR进行等位基因变体的鉴定。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，该变体提供增强的产量相关性状。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位基因变体的植物的生长行为来进行选择。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括使经鉴定含有较好等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生感兴趣表型特征的组合。

NRT2多肽编码核酸序列还可以用作探针对包含其的基因进行遗传和物理作图，以及用作与这些基因连锁的性状的标记。这样的信息可以在植物育种中使用，以培育具有所期望表型的株系。NRT2多肽编码核酸序列的这类应用仅需要长度至少15个核苷酸的核酸序列。NRT2多肽编码核酸序列可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可以用NRT2多肽编码核酸序列探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)《分子克隆：实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。另外，可以使用所述核酸序列探测含有一组如下个体的限制性内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，所述该组个体为规定的遗传杂交的亲本和子代。记录DNA多态性的分离，并用于计算NRT2多肽编码核酸序列在先前用此群体所获得的遗传图谱中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

有关在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和使用，描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行的遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员公知的。

核酸序列探针也可以用来进行物理作图(即在物理图谱上安置序列；参见Hoheisel等In：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，核酸序列探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向使用大的克隆(几个kb到几百个kb；参见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏性的提高可以允许在FISH作图中应用较短的探针。

用于遗传和物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸序列进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列的序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员公知的。采用基于PCR的遗传作图方法，可能需要鉴定作图杂交的亲本之间在相应于本发明核酸序列的区域中的DNA序列差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。

根据本发明的方法导致具有如前文所述增强的产量相关性状的植物。这些性状还可以组合其它经济上有利的性状，例如其它产量增加性状、对其他非生物和生物胁迫的耐受性、对除草剂、杀昆虫剂的耐受性、改变各种构造特征和/或生物化学和/或生理学特征的性状。

附图说明

现参考以下附图描述本发明，其中：

图1显示了针对SEQ ID NO：2的TMHMM2.0算法的图形输出。应用此算法，能够鉴定出至少11个跨膜结构域。

图2显示了针对SEQ ID NO：2的SignalP算法的图形输出。信号肽是NRT2多肽靶向分泌通路，接着由该通路靶向细胞膜所必须的。

图3为来自Yin等(2007；Plant Science 172：621-631)的系统发生树。表明植物NRT2多肽出现在单个群中，而其他主要真核生物分类也形成强的单源群，包括硅藻NRT2多肽。

图4显示了经AlignX(来自Vector NTI 10.3，Invitrogen公司)多重序列比对(和默认值)后，来自表A和A1的NRT2多肽的系统发生树。硅藻NRT2多肽如所预期的那样为单源群，圆圈代表树中用于实施本发明方法的多肽(来自硅藻，表A)与其他NRT2多肽(来自非硅藻，表A1)之间的分支点。

图5显示了来自表A和A1的NRT2多肽的AlignX(来自Vector NTI10.3，Invitrogen公司)多重序列比对。硅藻NRT2多肽与非硅藻NRT2多肽以水平线分开。通过TMHMM所预测的预测跨膜结构域(实施例5)在共有序列下以X指示，根据Hildebrand和Dahlin(2000)J Phycol 36：702-713)的预测跨膜结构域在共有序列下以H指示。如下两个基序加框显示：(1)MSF I基序(主要易化转移蛋白超家族)；和(2)NNP基序(硝酸盐/亚硝酸盐转运子)。通过SignalP预测的切割位点(实施例5)以竖线指示。

图6显示了双元载体，用于在稻中增加处于稻GOS2启动子(pGOS2)控制之下的、编码NRT2多肽的核酸序列的表达。

图7详述了用于实施本发明方法的序列实例。

实施例

现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明。如下实施例并非旨在完全界定或以其他方式限制本发明的范围。

DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第一卷和第二卷的标准方法进行。用于植物分子工作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications(UK)出版。

实施例1：鉴定与本发明方法所用核酸序列相关的序列

利用数据库序列搜索工具例如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)Entrez核苷酸数据库维护的序列中，鉴定与本发明方法中所用的核酸序列相关的序列(全长cDNA、EST或基因组序列)。BLAST程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间具有局部相似性的区域。例如，已经对本发明核酸序列所编码的多肽运用TBLASTN算法，使用默认设置，开启过滤器以忽略低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行了同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸序列(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在有些情况下，可以调整默认参数以更改搜索的严格度。例如，可以增加E值以显示较低严格度匹配。这样可以鉴定短的、几乎精确的匹配。

表A提供了与本发明方法中所用的核酸序列相关的核酸序列列表。

表A：来自硅藻的NRT2多肽序列以及编码核酸序列的实例

表A1：非硅藻NRT2多肽序列以及编码核酸序列的实例

在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究机构(Institutefor Genomic Research，TIGR)实验性地进行了装配并向公众公开。可以通过关键词搜索，或是采用BLAST算法运用目的核酸序列或多肽序列，利用真核基因直向同源物(Eukaryotic Gene Orthologs，EGO)数据库来鉴定这样的相关序列。在其他情况下，已经针对特定的生物创建了特定的核酸序列数据库，例如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建，例如针对假微型海链藻和三角褐指藻。

实施例2：NRT2多肽序列的比对

表A和A1中的所有NRT2多肽序列的多重序列比对利用AlignX算法(来自Vector NTI 10.3，Invitrogen公司)进行。硅藻NRT2多肽通过水平线与非硅藻NRT2多肽分开。通过TMHMM所预测的预测跨膜结构域(实施例5)在共有序列下以X表示，根据Hildebrand和Dahlin(2000)J Phycol36：702-713)的预测跨膜结构域在共有序列下以H表示。如下两个基序加框表示：(1)MSF I基序(主要易化转移蛋白超家族)；和(2)NNP基序(硝酸盐/亚硝酸盐转运子)。SignalP预测的切割位点(实施例5)以竖线表示。

实施例3：可以用于实施本发明方法的多肽序列之间全局同一性百分比的计算

可以用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利用本领域可用方法之一即MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences.CampanellaJJ，Bitincka L，Smalley J；软件由Ledion Bitincka托管)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。

比较所用的参数为：

记分矩阵：Blosum 62

首个空位：12

延伸空位：2

多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的全局相似性和同一性的软件分析结果示于表B。

如SEQ ID NO：2所示的NRT2全长多肽序列与表A中汇编的来自硅藻的其他NRT2多肽序列之间的同一性百分比为60％或更高。如SEQ IDNO：2所示的NRT2全长多肽序列与来自非硅藻的NRT2多肽序列之间的同一性百分比可低至26％氨基酸同一性。

实施例4：鉴定用于实施本发明方法的多肽序列所含的结构域

蛋白质家族、结构域和位点整合资源(Integrated Resource of ProteinFamilies，Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索常用的标签数据库的一个整合界面。InterPro数据库将多个数据库结合起来，这些数据库利用不同的方法学和有关充分表征的蛋白质的不同程度的生物信息以产生蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、Panther、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformatics Institute)托管。

SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果示于表C。

实施例5：用于实施本发明方法的多肽序列的亚细胞定位预测

用于蛋白质定位的实验性方法范围广泛，从免疫定位到利用绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)标记蛋白质。例如，利用基于GFP的方法结合免疫学方法，已经发现拟南芥NRT2.1多肽主要位于根皮层细胞和表皮细胞的质膜中(Wirth等(2007)同前)。

还从序列数据进行了蛋白质定位的计算预测。在本领域技术人员公知的算法中，在瑞士生物信息学研究所托管的ExPASy蛋白质组学工具处可以得到例如PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP、TMHMM等等。

跨膜结构域通常指跨膜蛋白质的单个跨膜α螺旋。之所以称为“结构域”是因为膜中的α螺旋能够独立于蛋白质的其他部分而折叠。更广义地，跨膜结构域是在膜中热动力学稳定的任何三维蛋白质结构。这可以是单个α螺旋，几个跨膜α螺旋的稳定复合物，跨膜β桶，短杆菌肽A的β螺旋，或任何其他结构。

跨膜螺旋通常长度约20个氨基酸，不过它们可以更长或者更短。TMHMM2.0是能够预测蛋白质中的跨膜螺旋的算法。该算法由丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器托管。下表D显示了利用SEQ ID NO：2多肽序列信息的TMHMM2.0输出。图1是表D输出结果的图示。根据此预测，在如SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽中鉴定到至少11个跨膜螺旋。

表D利用SEQ ID NO：2多肽序列信息的TMHMM2.0输出

定位	氨基酸坐标
		TMhelix	7-24
TMhelix	39-58
		TMhelix	65-87
TMhelix	93-115
		TMhelix	122-144
TMhelix	164-186
		TMhelix	223-245
TMhelix	255-277
		TMhelix	298-320
TMhelix	349-371
		TMhelix	384-406

还对SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽运行了SignalP算法(利用默认值；2.0版)。SignalP利用在真核生物上训练的神经网络(NN)和隐马尔可夫模型(hidden Markov models)(HMM)预测蛋白质中信号肽切割位点的存在和定位。利用NN在SEQ ID NO：2的氨基酸坐标26和27(从多肽的N-末端计数)之间发现预测的切割：LLS＊EI，其中＊是切割位点。此分析结果也示于图2。

实施例6：与用于实施本发明方法的多肽序列相关的测定法

NRT2多肽能够跨膜转运硝酸盐。存在许多测定法测量此类摄取活性，包括在异源表达系统例如非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞中测量活性(Zhou等(2000)FEBS Lett.466：225-227；Chopin等(2007)The Plant Cell19：1590-1602)。在表征给定多肽转运硝酸盐的能力时，还已经报道了根¹⁵NO₃流入量测定法和植物突变体补偿测定法(Chopin等(2007)同前)。本领域技术人员充分知晓此类实验方法来测量NRT2活性，包括SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽的NRT2活性。

实施例7：SEQ ID NO：1所示核酸序列的克隆

除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第一卷和第二卷的标准方法进行。植物分子操作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。

从处于不同繁殖阶段以及处于不同生长条件下的三角褐指藻提取mRNA，使用由该mRNA合成的cDNA作为模板，通过PCR扩增编码SEQID NO：2所示的NRT2多肽序列的三角褐指藻cDNA。

PCR扩增使用如下引物，其包括进行Gateway重组的AttB位点：

1)Prm 09462(SEQ ID NO：32，有义)：

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgcgggccttccatt-3’

2)Prm 09463(SEQ ID NO：33，反义，互补的)：

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttcaagctcaggcttcaattt-3’

在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。同样利用标准方法扩增和纯化预期长度的(包括attB位点)的PCR片段。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生Gateway术语所称的“进入(entry)克隆”。作为

技术一部分的质粒pDONR201购自英骏公司(Invitrogen)。

实施例8：使用SEQ ID NO：1所示核酸序列的表达载体构建

含有SEQ ID NO：1的进入克隆随后与用于稻转化的Destination载体一起用于LR反应。此载体在T-DNA边界内包含如下功能性元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：31)位于此Gateway盒的上游。

在LR重组步骤之后，根据本领域公知的方法将所产生的表达载体pGOS2::NRT2(图6)转化进农杆菌菌株LBA4044。

实施例9：植物转化

稻转化

用含表达载体的农杆菌转化了稻(Oryza sativa)植物。使梗稻栽培种日本晴(Nipponbare)的成熟干种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，接着在0.2％HgCl2中孵育30分钟，接着用蒸馏水洗6次，每次15分钟进行消毒。然后使消毒的种子在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下盾片来源的胚发生愈伤组织，并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中传代培养另外2周来繁殖或者增殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚发生愈伤组织块(以加强细胞分裂活性)。

含有各表达载体的农杆菌菌株LBA4404分别独立地用于共培养。农杆菌接种于含有合适抗生素的AB培养基上，并在28℃培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至光密度(OD600)约为1。接着将悬浮液转移至培养皿，并将愈伤组织浸于悬浮液中15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固化的共培养培养基中，并在黑暗中于25℃孵育3天。在选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基上于28℃暗培养四周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛。将此材料转移至再生培养基之后在光照下孵育，释放胚发生潜力并在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈伤组织切下，并在含生长素的培养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。

每个构建体产生了约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，只保留对选择剂表现出耐受性的单拷贝转基因植物用以收获T1种子。在移植后三至五个月收获种子。该方法以超过50％的比率产生了单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996，Chan等，1993，Hiei等，1994)。

实施例10：表型评估方法

10.1评估设置

产生了大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。保留了6个事件，在所述事件中T1代发生转基因存在/缺乏的3:1分离。通过监测可视标记的表达，在这些事件中各选出了大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗，以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长。温室条件为短白昼(12小时光照)，日间28℃，夜间22℃，相对湿度70％。

按照T1代相同的评估方法，对4个T1事件的T2代进行进一步的评估，但是每个事件采用更多的个体。从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。

减小的养分(氮)利用率筛选

在除营养液以外为正常的条件下在花盆土中培养来自6个事件(T2种子)的植物。从植物移植到成熟，用特定的营养液对花盆浇水，所述营养液的氮(N)含量减小，通常减小7到8倍。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如对正常条件下生长所详细描述的那样，记录生长和产量参数。

10.2统计分析：F检验

利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行总体评估。对用本发明基因转化的所有事件的所有植株的所有测量参数进行F检验。进行F检验以在所有转化事件上检查基因的效应，并检验基因的总体效应，亦称为“整体基因效应”。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。显著性F检验值指示存在基因效应，这意味着引起表型上差异的不仅仅是基因的存在或位置。

10.3测量的参数

生物量相关参数测量

从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。

植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数数码图像中区别于背景的地上植物部分的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方毫米表示的物理表面值(physicalsurface value)。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。该地上面积是在植物达到其最大叶生物量的时间点测量的面积。早期活力是发芽后三周的植物(幼苗)地上面积。根生物量增加表达为根总生物量(测量为在植物一生中观察到的最大根生物量)的增加；或者表达为根/枝条指数(测量为在根和枝条活跃生长期间根生物量和枝条生物量之间的比值)的增加。

种子相关参数测量

收获成熟的初级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干燥三天。随后使圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置使饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数，确定饱满种子数。通过称重从一株植物中收获的所有饱满谷壳来测量每株植物的种子总重量。通过计数从植物收获的谷壳数来测量每株植物的种子总数。根据计数的饱满种子数及其总重量外推得出千粒重(TKW)。收获指数(HI)在本发明中定义为每株植物的种子总重量和地上面积(mm²)之间的比值再乘以因子10⁶。每个圆锥花序的花总数在本发明中定义为种子总数与成熟初级圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数占种子(或小花)总数的比例(以％表示)。

实施例11：在正常生长条件下生长的、表达编码SEQ ID NO：2所示NRT2多肽的核酸序列的转基因稻植物的表型评估结果

在正常生长条件下生长的、在用于组成型表达的GOS2启动子控制下表达编码SEQ ID NO：2所示NRT2多肽的核酸序列的T2代转基因稻植物的评估结果在下文呈现。

与相应的无效合子(对照)相比，转基因植物在早期活力、地上生物量、根生物量、每株植物的种子总产量、饱满种子数、以及种子总数方面均显示增加，如表E所示。

表E：在用于组成型表达的GOS2启动子控制下表达编码SEQ ID NO：2所示NRT2多肽的核酸序列的T2代转基因稻植物的评估结果

性状	T2代4个事件的总体平均增加％
		早期活力	21％
地上生物量	10％
		根生物量	6％
每株植物的种子总产量	10％

饱满种子数	10％
		种子总数	13％

实施例12：在养分(氮)利用率减小的生长条件下生长的、表达编码SEQID NO：2所示NRT2多肽的核酸序列的转基因稻植物的表型评估结果

在养分(氮)利用率减小的生长条件下生长的、在用于组成型表达的GOS2启动子控制下表达编码SEQ ID NO：2所示NRT2多肽的核酸序列的转基因稻植物在如下产量相关性状方面显示出了进步的趋势：每株植物的种子总产量、饱满种子数、种子总数、每个圆锥花序的花数和收获指数。

实施例13：其他作物转化的实施例

玉米转化

用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良方案进行玉米(玉蜀黍)转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，并且只有特定的基因型才能转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188为亲本的杂种是转化供体材料的优良来源，但是也可以成功使用其它基因型。授粉后约11天(DAP)，当未成熟胚的长度是约1至1.2mm时，从玉米植物收获穗。共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生回收转基因植物。切离的胚依次生长在含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的愈伤组织诱导培养基、和玉米再生培养基上。培养板在光照下于25℃孵育2-3周，或直到芽发育。从每个胚中将绿芽转移到玉米生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的芽移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂具有耐受性和含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

小麦转化

运用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行小麦的转化。栽培种Bobwhite(可从CIMMYT，Mexico(墨西哥)获得)常用来进行转化。共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生回收转基因植株。与农杆菌孵育后，胚依次体外生长在含有选择试剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的愈伤组织诱导培养基，和再生培养基上。培养板在光照下于25℃孵育2-3周，或直到芽发育。从每个胚中将绿芽转移到生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的芽移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂具有耐受性和含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

大豆转化

根据Texas A&M专利US 5,164,310所述方法的改良方案转化大豆。若干商业大豆品种可以通过该方法转化。栽培种Jack(可以得自伊利诺斯种子公司(the Illinois Seed foundation))常用来进行转化。对大豆种子消毒以进行体外播种。从七日龄幼苗中切出下胚轴、胚根和一个子叶。进一步培养上胚轴和剩下的子叶以发育腋结。切离这些腋结并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培养处理后，洗涤外植体并转移到选择培养基中。切离再生的芽，置于芽伸长培养基中。将长度不超过1cm的芽置于生根培养基中直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性和含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

油菜籽/芸苔转化

利用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为外植体进行组织培养并根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。商业栽培种Westar(加拿大农业(Agriculture Canada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对芸苔种子表面消毒以进行体外播种。从体外幼苗中切离附着有子叶的子叶柄外植体，并通过将子叶柄外植体的切割端浸入细菌悬浮液中来接种农杆菌(含有表达载体)。随后外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基中于23℃、16小时光照培养2天。与农杆菌共培养2天后，将子叶柄外植体转移到含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基中7天，然后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时，将其切下并转移到芽伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)中。将约2cm长的芽转移到生根培养基(MS0)中进行根诱导。将生根的芽移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性和含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

苜蓿转化

利用(McKersie等1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(紫花苜蓿)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植株。获得再生植株的方法已有描述。例如，这些可以选自栽培种Rangelander(加拿大农业(Agriculture Canada))或如Brown DCW和AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)所述的任何其它商业苜蓿品种。可选的，选择RA3品种(威斯康辛大学(University ofWisconsin))用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。子叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物进行共培养。外植体在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在黑暗中共培养3天。外植体在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤，并置于相同的SH诱导培养基中，但该培养基不含乙酰丁香酮而含有合适的选择剂和合适的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素、含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。生根的幼苗移植到盆中并在温室中生长。从对选择剂表现出耐受性和含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

棉花转化

利用根癌农杆菌在下胚轴外植体上进行棉花(陆地棉(Gossypiumhirsutum L.))转化。商业栽培种例如Coker 130或Coker 312(SeedCo，Lubbock，TX)是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。种子表面消毒，并在黑暗中萌发。从发芽的幼苗中切下长度约1-1.5厘米的下胚轴外植体。下胚轴外植体在含有表达载体的根癌农杆菌接种物中浸泡5分钟，然后在MS+1.8mg/l KNO3+2％葡萄糖上在黑暗中于24℃共培养约48小时。外植体转移到含有适当细菌及植物可选择标记的相同培养基上(更新数次)，直至看到胚发生愈伤组织。分离愈伤组织，并传代培养直至出现体细胞胚。由体细胞胚获得的小植株在生根培养基上成熟，直至发育出根。将生根的枝条移植到温室的花盆土中。从对选择剂表现出耐受性和含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

实施例14：非生物胁迫筛选的实例

干旱筛选

在正常条件下在花盆土中培养来自选定数目的事件的植物，直到进入抽穗期。然后将其转移到“干燥”区域，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如针对在正常条件下生长所详述的那样，记录生长和产量参数。

盐胁迫筛选

植物生长在由椰壳纤维和argex(3:1)制成的基质上。在小植株移植到温室后的头两周期间应用正常营养液。过了头两周之后，向营养液中添加25mM盐(NaCl)，直至收获植物。如针对在正常条件下生长所详述的那样，记录生长和产量参数。

Claims (22)

1.相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，包括增加植物中编码硝酸盐转运蛋白2(NRT2)多肽的核酸序列的表达，所述NRT2多肽按照递增的优选顺序与SEQ ID NO：2所示的NRT2多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性，和任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述NRT2多肽包含：(i)InterPro登录号为IPR0004737的硝酸盐转运蛋白家族结构域；和/或(ii)InterPro登录号为IPR007114的主要易化转移蛋白超家族结构域；和/或InterPro登录号为IPR011701的主要易化转运蛋白超家族MSF-1结构域；和(ii)至少11个跨膜螺旋。

3.根据权利要求1或2的方法，其中当所述NRT2多肽用来构建NRT2系统发生树，例如图3和4所示的发生树时，其与来自硅藻的NRT2多肽的进化枝而非任何其他NRT2进化枝聚类。

4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述NRT2多肽按照递增的优选顺序与本文表A所给出的任一多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码NRT2多肽的核酸序列是表A所给出的任一SEQ ID NO核酸序列或其部分，或是能够与表A所给出的任一SEQ ID NO核酸序列杂交的序列。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A所给出的任一SEQ ID NO多肽序列的直向同源物或旁系同源物。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中通过T-DNA激活标记、TILLING或同源重组中的任何一种或多种来实现所述增加的表达。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中通过在植物中引入和表达编码NRT2多肽的核酸序列来实现所述增加的表达。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是如下一种或多种：增加的早期活力、增加的地上生物量、增加的根生物量、增加的每株植物的种子总产量、增加的饱满种子数量、或增加的种子总数量。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸序列有效连接于组成型启动子，优选植物组成型启动子，更优选GOS2启动子，最优选SEQ ID NO：31所示的稻GOS2启动子。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码NRT2多肽的核酸序列来自不等鞭毛门(Heterokontophyta)，优选来自硅藻纲(Bacillariophyceae)，更优选来自羽纹硅藻目(Pennales)，最优选来自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)。

12.可根据前述权利要求中任一项的方法获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞，其中所述植物、其部分或细胞含有有效连接于植物组成型启动子的、编码NRT2多肽的分离的核酸转基因。

13.构建体，含有：

(a)编码如权利要求1至6中任一项所定义的NRT2多肽的核酸序列；

(b)能够驱动(a)中核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的

(c)转录终止序列。

14.根据权利要求13的构建体，其中所述控制序列为植物组成型启动子，优选GOS2启动子，更优选SEQ ID NO：31所示的GOS2启动子。

15.根据权利要求13或14的构建体在制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物的方法中的用途，所述增强的产量相关性状是如下一种或多种：增加的早期活力、增加的地上生物量、增加的根生物量、增加的每株植物的种子总产量、增加的饱满种子数量、或增加的种子总数量。

16.由根据权利要求13或14的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

17.产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括：

(i)在植物、植物部分或植物细胞中引入和表达编码如权利要求1至6中任一项所定义的NRT2多肽的核酸序列；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞、植物部分或植物。

18.相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物、或源自所述转基因植物的转基因植物细胞或转基因植物部分，其中所述产量相关性状的增强因有效连接于植物组成型启动子的、编码如权利要求1至6中任一项所定义的NRT2多肽的核酸序列的表达增加而引起。

19.根据权利要求12、16或18的转基因植物、或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类植物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。

20.根据权利要求19的植物的可收获部分，其含有编码NRT2多肽的分离的核酸序列，其中所述可收获部分优选为种子。

21.从根据权利要求19的植物和/或从根据权利要求20的植物可收获部分衍生的产品。

22.编码如权利要求1至6中任一项所定义的NRT2多肽的核酸序列在增强产量相关性状中的用途，所述增强的产率相关性状包括如下一种或多种：增加的早期活力、增加的地上生物量、增加的根生物量、增加的每株植物的种子总产量、增加的饱满种子数量、或增加的种子总数量。

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