CN101801998A - 养分可利用度减小下具有改良生长特性的植物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及相对于相应的野生型植物改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及相对于相应的野生型植物增加在养分可利用度减小条件下生长的植物产率的方法，包括在植物中调节编码I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达。

Description

养分可利用度减小下具有改良生长特性的植物及其制备方法
发明领域
本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及相对于相应野生型植物改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及相对于相应野生型植物增加在养分可利用度减小条件下生长的植物的产率的方法，包括调节植物中编码I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达。
发明背景
世界人口的不断增长和农业可耕种土地面积的逐渐缩小，激起了提高农业效率方面的研究。作物和园艺改良的常规方法是利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，这样的选育技术有若干缺点，即这些技术通常是劳动密集型的，并且产生通常含有异源遗传组分的植物，这些遗传组分并非总是导致期望性状从亲本植物遗传。分子生物学的进展已经允许人类改造动物和植物的种质。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质(通常为DNA或RNA的形式)及随后将所述遗传物质引入植物。这样的技术能够提供具有多种改良的经济、农艺或园艺性状的作物或植物。
特别具有经济利益的一个性状是产率。产率通常定义为来自作物的具有经济价值的可测量产出。这可以根据数量和/或质量来定义。产率直接取决于几种因素，例如：器官的数量和大小，植物构造(例如分枝数)，种子产量等等。根的发育，养分吸收和利用效率，以及胁迫耐受性也是决定产率的重要因素。因此优化上述因素之一可以有助于增加作物的产率。
种子产率是尤其重要的性状，原因在于许多植物的种子对于人类和动物营养至关重要。或是通过对种子本身的直接消耗，或者是通过对由加工的种子饲养的肉类产品的消耗，在人类的总卡路里摄取量中，诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等作物占了一半以上。它们也是糖类、油类和工业加工所用的多类代谢物的来源。种子含有胚(新的茎和根的来源)和胚乳(在萌发和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是，胚乳同化吸收糖类、油类和蛋白质的代谢前体，并将其合成为贮存高分子，以填充籽粒。
对于饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草，产率为植物生物量。对于作物如马铃薯、树薯或甜菜，产率尤其是根生物量。在粮谷作物中使用了许多许多方式代表产率。其中首要的是植物大小的估算值。根据物种以及发育阶段的不同，可以通过许多方法测量植物大小，包括植物总干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座(rosette)直径、叶长、根长、根量、分蘖数和叶数。许多物种在给定的发育阶段在植物的不同部分的大小间维持保守比例。利用这些异速生长关系可以在这些有关大小的测量结果之间进行由此及彼的外推(例如Tittonell等人(2005)AgricEcosys & Environ 105：213)。早期发育阶段的植物大小通常与发育后期的植物大小有关。具有更大叶面积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能同期增重更多(Fasoula & Tollenaar(2005)Maydica 50：39)。这是对植物在最初实现该较大尺寸时所具有的微环境或遗传优势的额外可能延续。对于植物的大小和生长速率，存在着强遗传成分(如ter Steege等人(2005)Plant Physiology 139：1078)，因此对于一系列多种多样的基因型，植物在一种环境条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小有关(Hittalmani等人(2003)Theoretical Applied Genetics107：679)。以此方式，可以使用标准环境作为田间作物在不同地点和时间所遭遇的多种多样的动态环境的代表。
对于许多作物而言，另一重要的性状是早期活力。在温带和热带稻栽培种中，改良早期活力是现代稻育种项目的重要目标。长根对于水直播稻的合适土壤锚固至关重要。在直接向涝地里播种稻米的情况下，以及在植物必须迅速透水出苗的情况下，较长的枝条均与活力有关。在进行条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于优良的出苗至关重要。改造植物早期活力的能力在农业上将具有重大的意义。例如，一直以来早期活力差限制了基于玉米带种质的玉米(玉蜀黍(Zea mays L.))杂交种引入欧洲大西洋地区。
收获指数为种子产率与地上干重之间的比值，其在许多环境条件下相对稳定，因此在植物大小和粮谷(grain)产率之间通常能够获得比较稳靠的相关性(如Rebetzke等人(2002)Crop Science 42：739)。这些方法存在固有的联系，原因是大多数粮谷生物量取决于植物叶和茎的当前的或贮存的光合作用生产力(Gardener等人(1985)Physiology of Crop Plants.Iowa StateUniversity Press，68-73页)。因此，对植物大小的选择，甚至是在发育早期阶段的选择，已经用作为未来潜在产率的指标(如Tittonell等人(2005)Agric Ecosys & Environ 105：213)。当测试遗传差异对胁迫耐受性的影响时，温室或植物生长箱环境与田间相比具有固有的优势，即，能够使土壤性能、温度、水和养分可利用度以及光强度标准化。不过，由于因缺乏风力或昆虫导致的不良授粉，或由于空间不足以让成熟根或冠层生长等等，而对产率造成的人为局限性，会限制这些受控环境在测试产率差异中的应用。因此，在生长箱或温室中在标准化条件下测量早期发育阶段的植物大小，是提供潜在遗传产率优势指标的标准作法。
另一重要的性状为增加的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是导致全世界作物损失的首要原因，使大多数主要作物植物的平均产率下降超过50％(Wang等人，Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可以因干旱、盐度、极端温度、化学毒性、养分(大量元素和/或微量元素)过量或不足、辐射和氧化胁迫而引起。提高植物非生物胁迫耐受性的能力将对全世界的农场主带来重大的经济利益，并将使得能够在不利条件下以及在原本不可能栽培作物的地域中栽培作物。
增加植物产率的能力将在诸如农业，包括生产观赏植物、树木栽培、园艺和林业等领域中具有许多应用。增加产率也可以用于在生物反应器中(用于诸如药物、抗体或疫苗等物质的生物技术生产，或用于有机废物的生物转化)及其它这类领域中使用的藻类的生产。
技术背景
同源域亮氨酸拉链(Homeodomain leucine zipper，HDZip)蛋白构成转录因子家族，其特征在于存在DNA结合结构域(HD)和邻近的亮氨酸拉链(Zip)基序。同源域通常由60个保守的氨基酸残基组成，形成与DNA结合的螺旋1-环-螺旋2-转角-螺旋3。此DNA结合位点通常为假回文结构。亮氨酸拉链邻近于同源域的C-末端，由几个七肽重复单位(至少4个)组成，其中通常每隔6个氨基酸就出现亮氨酸(偶尔为缬氨酸或异亮氨酸)。亮氨酸拉链对于蛋白质二聚化非常重要。二聚化是DNA结合的前提条件(Sessa等人(1993)EMBO J 12(9)：3507-3517)，并且可以发生在两个相同的HDZip蛋白之间(同源二聚体)，或者两个不同的HDZip蛋白之间(异源二聚体)。
同源域基因存在于所有真核生物中，并在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中构成至少89个成员的基因家族。亮氨酸拉链本身也见于除植物外的真核生物中。不过，同源域和亮氨酸拉链两者同时存在却是植物所特有的(见于拟南芥的该89个蛋白质中的至少47个)，并且除了维管植物之外，还已经在藓类植物(moss)中遇到(Sakakibara等人(2001)Mol Biol Evol 18(4)：491-502)。亮氨酸拉链位于同源域的C-末端，这两个要素特征彼此重叠3个氨基酸。
基于序列相似性标准，已将拟南芥HDZip基因分为四个不同的类别：HDZip I至IV(Sessa等人(1994)Plant Molec Biol，412-426页)。同其他三类HDZip蛋白一样，I类HDZip蛋白在同源域和亮氨酸拉链以外具有差异相当大的一级氨基酸结构。I类HDZip蛋白的特征还在于同源域和亮氨酸拉链内的两个特定特征：
1)在同源域中，除了不变的氨基酸Leu16Trp48Phe49Asn51Arg53之外，第46位为Ala(A)占据，而第56位为Try(W)占据(或者偶尔为Phe(F)占据)(Sessa等人(1997)J Mol Biol 274(3)：303-309；见图1)，这称为I类同源域，和
2)亮氨酸拉链包括6个七肽，例外是蕨类植物Ceratopteris richardii呈现7个七肽(在每个七肽内，位置被命名为a、b、c、d、e、f和g，保守的亮氨酸在d位；Sakakibara等人(2001)Mol Biol Evol 18(4)：491-502；见图1)。HDZip II、III和IV呈现仅具5个七肽的亮氨酸拉链。
至于其DNA结合特性，I类HDZip蛋白优选结合在中心位置处重叠的5bp半位点，即CAA(A/T)ATTG(Sessa等人(1993)EMBO J 12(9)：3507-3517)。
已证明不同的HDZip蛋白可以激活或者阻遏转录。在拟南芥中，利用报告基因(萤光素酶；Henriksson等人(2005)Plant Phys 139：509-518)在瞬时表达试验中在拟南芥叶子上证明了I类HDZip ATHB1、-5、-6和-16作为转录激活因子起作用。利用另一报告基因(葡糖醛酸糖苷酶；Meijer等人(2000)Mol Gen Genet 263：12-21)，两种稻I类HDZip蛋白，即Oshox4和Oshox5，在瞬时表达试验中在稻细胞悬浮培养物上作为激活因子起作用。相反，两种稻II类HDZip蛋白，即Oshox1和Oshox3，在相同的试验中作为转录阻遏物起作用(Meijer等人(1997)Plant J 11：263-276；Meijer等人(2000)，同前)。
已证明多种I类HDZip蛋白参与光应答以及参与和脱落酸(ABA)/水缺乏相关的应答(
Figure G2008800228097D00051
等人(2003)Plant Cell Environ 26：1127-1136)。过表达I类HDZip ATHB1、-3、-13、-20和-23的转基因拟南芥表明这些基因参与调控子叶以及叶的发育(Aoyama等人(1995)Plant Cell 7：1773-1785；Hanson(2000)Comprehensive summaries of UppsalaDissertations from the Faculty of Science and Technology，乌普萨拉)。ATHB3、-13、-20和-23基因是相似的，并构成I类HDZip中的一个独特的亚类。由于当这些基因组成型表达的时候引起相似的子叶形状变化，它们被称为尖子叶(pointed cotyledon，POC)HDZip基因。Hanson得出结论：在系统发生上密切相关的I类HDZip蛋白在大多数情况下在功能上也是相关的。
现已令人惊讶地发现，调节植物中编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达，使植物相对于相应的野生型植物在养分可利用度减小条件下具有增加的产率。
发明内容
根据本发明的一个实施方案，提供了相对于相应的野生型植物，增加在养分可利用度减小条件下生长的植物产率的方法，包括调节植物中编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达。
选择合适的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物与待评估植物通常为同一植物物种，或者甚至为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且指植物部分，包括种子和种子部分。
有利地，实施根据本发明的方法产生在养分可利用度减小条件下生长时相对于相应的野生型植物产率增加的植物。
如本文所定义的术语“增加的产率”是指任何如下一个或多个方面分别相对于相应的野生型植物的增加：(i)植物一个或多个部分，地上(可收获)部分，增加的生物量(重量)，或增加的根生物量，增加的根体积，增加的根数量，增加的根直径或增加的根(粗根或细根)长度，或任何其它可收获部分增加的生物量；(ii)增加的种子总产率，包括种子生物量(种子重量)的增加，并且这可以是每株植物或单粒种子基础上的种子重量增加；(iii)增加的每个圆锥花序的花朵(小花(floret))数量，其表达为饱满种子数与一级圆锥花序(primary panicle)数的比率；(iv)增加的种子饱满率；(v)(增加的)(饱满)种子数量；(vi)增加的种子大小，这也可以影响种子的组成；(vii)增加的种子体积，这也可以影响种子的组成(包括油、蛋白质和糖的总含量和组成)；(viii)增加的(单个或平均)种子面积；(ix)增加的(单个或平均)种子长度；(x)增加的(单个或平均)种子宽度；(xi)增加的(单个或平均)种子周长；(xii)增加的收获指数(HI)，其表达为可收获部分如种子的产率占总生物量的比率；和(xiii)增加的千粒重(TKW)，这通过计数饱满种子数量及其总重量外推得到。增加的TKW可起因于种子大小和/或种子重量的增加。增加的TKW还可以起因于胚大小和/或胚乳大小的增加。
优选地，增加的产率选自各分别地相对于相应的野生型植物而言的如下一个或多个方面：增加的种子总数量、增加的饱满种子数量、增加的种子总产率、增加的每个圆锥花序的花朵数量、增加的种子饱满率、增加的HI、增加的TKW、增加的根长度或增加的根直径。
因此，根据本发明，提供了相对于相应的野生型植物增加在氮可利用度减小条件下生长的植物产率的方法，所述方法包括调节植物中编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达。
以玉米为例，产率增加可以表现为如下一个或多个方面：每公顷或每英亩的植物数量的增加，每株植物的穗数的增加，行数、行粒数、粒重、千粒重、穗长度/直径的增加，等等。以稻为例，产率增加可以表现为如下一种或多种的增加：每公顷或每英亩的植物数量、每株植物的圆锥花序数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序的花朵数量、种子饱满率的增加、千粒重的增加，等等。增加的产率也可以导致改良的构造，或者可以由于改良的构造而发生。
由于根据本发明的转基因植物在氮可利用度减小条件下具有增加的产率，因此，相对于相应的野生型植物或对照植物在其生命周期相应阶段的生长速率而言，这些植物很可能呈现增加的生长速率(至少在其部分生命周期中)。增加的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括根或种子)特有的，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物甚至可以呈现早期开花。生长速率的增加可以出现在植物生命周期的一个或多个阶段，或者出现在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比原本可能的情况更晚播种和/或更早收获。如果生长速率充分增加，则可能允许再播种同一植物物种的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着播种和收获其它的稻类植物)。类似地，如果生长速率充分地增加，则可能允许再播种不同植物物种的种子(例如播种和收获稻类植物，随后，例如，播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其他适宜的植物)。在一些作物植物的情况下，也有可能从同一砧木实现额外次数的收获。改变植物的收获周期可以导致每英亩年生物量产量的增加(原因是(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获的次数增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还可能允许在更广阔的地理区域栽培转基因植物，因为种植作物的地域限制通常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，则可以避免此类不利条件。可以由生长曲线获取多种参数，来确定生长速率，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小50％所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小90％所需的时间)，等等。
实施本发明的方法产生具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了相对于相应的野生型植物增加在氮可利用度减小条件下生长的植物的生长速率的方法，所述方法包括调节植物中编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达。
与生长在相当条件下的相应野生型植物相比，无论植物是处于非胁迫条件下，还是植物接触各种胁迫，都发生产率和/或生长速率的增加。按照递增的优选次序，具有最适生长条件(生长在非胁迫条件下)的植物通常产出此类植物在给定环境中平均产量的至少90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％。此类植物的平均产量可以在收获和/或季节和/或地点的基础上计算。本领域技术人员知晓作物的平均产出产量。通常植物通过更加缓慢地生长来应答胁迫接触。在重度胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文定义为任何当植物接触时不导致植物完全停止生长和丧失重新开始生长能力的胁迫。本发明意义上的轻度胁迫导致胁迫植物的生长与非胁迫条件下的对照植物相比，下降少于40％、35％或30％，优选少于25％、20％或15％，更优选少于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，栽培的作物植物常不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱发的受损的生长通常成为农业中不期望的因素。轻度胁迫(如本文所用)是植物接触的日常非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫以及热、冷或冰冻温度、可用养分(大量元素和/或微量元素)的过量或减小而引起。非生物胁迫可以是因水胁迫(特别是由于干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫所致的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的胁迫。如本文所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。
实施本发明的方法导致在非胁迫条件下或在轻度非生物胁迫条件下生长的植物相对于相应的野生型植物具有增加的产率。因此，根据本发明，提供了相对于相应的野生型增加在非胁迫条件下或在轻度非生物胁迫条件下生长的植物产率的方法，所述方法包括调节植物中编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达。优选轻度非生物胁迫条件是减少的可用养分。
实施根据本发明的方法导致植物具有增加的非生物胁迫耐受性。如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)所报道的那样，非生物胁迫引起一系列的形态学、生理学、生物化学和分子变化，对植物生长和生产力造成不利影响。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫相互联系，并且可以通过相似的机制诱发生长和细胞损害。例如，干旱和/或盐化主要表现为渗透胁迫，导致破坏细胞中的稳态和离子分布。氧化胁迫通常与高温或低温、盐度或干旱胁迫相伴，可以引起功能及结构蛋白质的变性。所以，这些多种多样的环境胁迫通常激活相似的细胞信号传递通路和细胞应答，例如应激蛋白的产生，抗氧化剂的上调、可混溶溶质的累积以及生长停滞。
多种多样的环境胁迫激活相似的通路，正如本发明就干旱胁迫和盐胁迫条件中生长的植物所举例说明的那样。这些实施例应视为表明I类HDZip hox5多肽或其同源物参与一般性地增加非生物胁迫耐受性的显示(screen)。据报道在干旱胁迫和高盐度胁迫之间存在特别高程度的“对话”(Rabbani等人(2003)Plant Physiol 133：1755-1767)。因此，显然I类HDZip hox5多肽或其同源物，连同其增加植物干旱耐受性和盐耐受性的有用性，也将适用于保护植物抵御多种其他非生物胁迫。
如本文所定义的术语“非生物胁迫”应理解为表示如下一种或多种：水胁迫(由于干旱或过量的水)、缺氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(由于热、冷或冰冻温度)、化学毒性胁迫和氧化胁迫。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，选自水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选水胁迫是干旱胁迫。术语盐胁迫不局限于由超量常见盐引起的胁迫，而可以来自如下任何一种或多种：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等等。
非生物环境胁迫的另一实例是植物为生长和发育需要吸收的一种或多种养分的可利用度减小。由于养分利用效率对植物产率和产品质量的强烈影响，有大量化肥倾倒在田间以优化植物生长和品质。植物生产力一般受限于三种主要养分：磷、钾和氮，而这三者中的氮通常是植物生长的限速元素。因此，植物生长所需的主要营养素是氮(N)。氮是见于活细胞中的众多重要化合物(包括氨基酸、蛋白质(酶)、核酸和叶绿素)的组成成分。1.5％-2％的植物干物质是氮，约合植物总蛋白质的16％。因而，氮可利用度是作物植物生长和产量的主要限制因素(Frink等人(1999)Proc NatlAcad Sci USA 96(4)：1175-1180)，而且对蛋白质累积和氨基酸组成也具有重大影响。因此，在养分限制条件下、优选在限氮条件下生长时具有增加的产率的作物植物具有重大意义。
实施本发明的方法导致植物在非生物胁迫条件下生长时相对于相应的野生型植物具有增加的产率。因此，根据本发明，提供了相对于相应的野生型增加在非生物胁迫条件下生长的植物产率的方法，所述方法包括调节植物中编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，选自如下一种或多种：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选水胁迫是干旱胁迫。可选地或另外地，非生物胁迫是减小的养分可利用度。优选非生物胁迫是减小的氮可利用度。
增加的非生物胁迫耐受性可以表现为植物相对于相应的野生型植物具有增加的产率。特别是，此类增加的产率可以包括各自分别相对于相应的野生型植物而言的如下一种或多种增加：增加的种子总数量、增加的饱满种子数量、增加的种子总产率、增加的每个圆锥花序的花朵数量、增加的种子饱满率、增加的HI、增加的TKW、增加的根长度或增加的根直径。优选，增加的非生物胁迫耐受性是增加的对养分可利用度减小的耐受性，更优选是增加的对氮可利用度减小的耐受性。
有利地，实施本发明的方法导致植物在养分可利用度减小条件下相对于相应的野生型植物具有增加的绿度指数。绿度指数根据植物的数码图像计算。对于图像中属于植物客体的每一个像素，计算绿值与红值之比(在用于编码颜色的RGB模型中)。如本文所定义的绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。增加的绿度指数可以表明减缓或延迟的衰老，这又允许延长植物的光合活性，进而带来本领域众所周知的多种有益效果。
实施本发明的方法导致植物在养分可利用度减小条件下相对于相应的野生型植物具有增加的绿度指数。因此，根据本发明，提供了相对于相应的野生型植物增加在养分可利用度减小条件下生长的植物绿度指数的方法，所述方法包括调节植物中编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达。优选，减小的养分可利用度条件为减小的氮可利用度条件。
Rabbani等人(2003，Plant Physiol 133：1755-1767)报道在双子叶植物和单子叶植物之间存在着相似的胁迫耐受和应答分子机制。因此本发明的方法有利地适用于任何植物。
如本文所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先和子代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中上述每一种都含有目的基因/核酸序列。术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一种都含有目的基因/核酸序列。因此，如本文所用的术语“植物”涵盖可由本发明方法获得的植物、植物部分(包括种子)或植物细胞，其中上述每一种都含有编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的重组核酸序列。
在本发明方法中尤其有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或豆科牧草、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，选自：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍茎剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱芹属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、滨草(Ammophilaarenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpusspp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(如燕麦(Avenasativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatua var.sativa)、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoacarambola)、簕竹属物种(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(如欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝型油菜(Brassica rapa ssp.)[芸苔、油菜籽油菜、芜菁])、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、苔草(Carexelata)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、吉贝(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomumspp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可拉属(Colaspp.)、黄麻属物种(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynaraspp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(如非洲油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)(如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthusspp.)(如向日葵(Helianthus annus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、地杨梅(Luzulasylvatica)、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(如番茄(Lycopersiconesculentum)、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme)、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、西印度樱桃(Malpighiaemarginata)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Oleaspp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryzaspp.)(如水稻(Oryza sativa)，阔叶稻(Oryza latifolia))、黍糜(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Perseaspp.)、香芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、梯牧草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinusspp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poaspp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanumspp.)(如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番柿(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、蒲桃属物种(Szygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属物种(Triticum spp.)(如小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆锥小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、面包小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolumminus)、旱金莲(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、枣属物种(Ziziphus spp.)、苋属植物(amaranth)、洋蓟(artichoke)、天门冬属植物(asparagus)、椰菜(broccoli)、孢子甘蓝(Brussels sprouts)、甘蓝、芸苔、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝(collard greens)、亚麻、无头甘蓝(kale)、兵豆属植物(lentil)、油菜籽油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜(squash)、茶和藻类等等。根据本发明优选的实施方案，植物为作物植物，例如大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草。还优选植物为单子叶植物，例如甘蔗。更优选植物是谷类，例如稻、玉蜀黍、小麦、大麦、黑小麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。
如本文所定义的术语“I类HDZip hox5多肽或其同源物”是指这样的多肽，其从N-末端到C-末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。
另外，I类HDZip hox5多肽或其同源物可以包含如下任一或两者兼而有之：(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，而F为Phe。当从N-末端到C-末端检查蛋白质时，基序(b)位于酸性盒之前。
如上文所定义的I类HDZip hox5多肽的一个实例如SEQ ID NO：2所示，从N-末端到C末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链；并且另外包含：(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，而F为Phe。更多这样的实例在本文实施例1表A中给出。
I类HDZip hox5多肽或其同源物由I类HDZip hox5基因/核酸序列编码。因此如本文所定义的术语“I类HDZip hox5基因/核酸序列”是任何编码如上文定义的I类HDZip hox5多肽或其同源物的基因/核酸序列。
利用本领域众所周知的常规技术(例如通过序列比对)，可以容易地鉴定I类HDZip hox5多肽或其同源物。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48；443-453)算法寻找使匹配数最大化并使空位数最小化的两完整序列的比对。BLAST算法(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)计算序列同一性百分比，并统计分析两序列间的相似性。执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(the National Centre for Biotechnology Information)公开地获得。例如，使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的两两比对参数和百分比评分方法，可以容易地鉴定包含I类同源域和具5个以上七肽的亮氨酸拉链的I类HDZip hox5多肽的同源物。可以进行小量手工编辑，以优化保守基序间的比对，这对于本领域技术人员将是显而易见的(见本文实施例2和图2)。
可以利用例如如下专业数据库来鉴定I类HDZip hox5多肽的各种结构域(如同源域和亮氨酸拉链)：SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等人(2002)Nucl Acids Res 30，242-244；由位于Heidleberg的EMBL托管)、InterPro(Mulder等人(2003)Nucl Acids Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，Ageneralized profile syntax for biomolecular sequences motifs and itsfunction in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；Proceedings2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D编著，53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等人Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等人Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。可以利用专业软件如2ZIP进行亮氨酸拉链预测和七肽鉴定，该软件将标准卷曲螺旋预测算法和特征性亮氨酸重复单位的近似搜索结合在一起(Bornberg-Bauer等人(1998)Computational Approaches to IdentifyLeucine Zippers，Nucl Acids Res，26(11)：2740-2746)。I类HDZip hox5多肽序列的结构域鉴定结果示于本申请实施例4中。
此外，也可以容易地鉴定酸性盒的存在。可以利用来自ExPASy服务器的软件程序，特别是ProtParam工具(Gasteiger E等人(2003)ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.NucleicAcids Res 31：3784-3788)，计算一级氨基酸组成(以％表示)，以确定多肽结构域是否富含特定的氨基酸。然后可以将目的蛋白质的组成与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的平均氨基酸组成(以％表示)进行比较。在该Swiss-Prot数据库内，平均Asp(D)和Glu(E)含量分别为5.3％和6.6％，组合平均值为11.9％。作为实例，SEQ ID NO：2的酸性盒含9.1％的D和54.5％的E，组合平均值为63.6％(见本文实施例4)。如本文所定义的那样，富酸性盒具有高于Swiss-Prot蛋白质序列数据库中蛋白质平均氨基酸组成(以％表示)的组合Asp(D)和Glu(E)含量(以％表示)。酸性盒可能是转录激活结构域的一部分。真核生物的转录激活结构域已根据其氨基酸含量被分类，且主要的类别包括酸性的、富谷氨酰胺的和富脯氨酸的激活结构域(Rutherford等人(2005)Plant J.43(5)：769-88，及其中的参考文献)。
在I类HDZip hox5多肽或其同源物中选定数目的多肽还包含RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，而F为Phe。当从N-末端到C-末端检查蛋白质时，此基序位于酸性盒之前(见图2)。可以利用上文所述的用于比较的序列比对方法来鉴定RPFF的存在。在一些情况下，可以调整默认参数，以更改搜索的严格度。例如利用BLAST，可以增加用于报告数据库序列匹配事件的统计学显著性阈值(称为“预期”值)，以显示低严格度的匹配事件。通过这种方式可以鉴定短的几乎精确匹配的事件。
在I类HDZip hox5多肽或其同源物中，选定数目的多肽还可以包含Trp尾巴。如本文所定义的Trp尾巴是多肽C-末端包含至少一个Trp残基的最后10个氨基酸(见图2)。
在实施例表A中给出I类HDZip hox5多肽或其同源物的实例(由括号中的多核苷酸序列登录号编码)。
应该理解的是，落入“I类HDZip hox5多肽或其同源物”定义的序列不限于表A中所给出的序列，而是从N-末端到C末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链的任何多肽，均适用于实施本发明的方法。
I类HDZip hox5多肽或其同源物具有DNA结合活性，优选结合在中心位置处重叠的5bp半位点，即CAA(A/T)ATTG，如在酵母单杂交测定中检测到的那样(Meijer等人(2000)Mol Gen Genet 263：12-21)。在稻细胞悬浮液上进行的瞬时测定试验中，I类HDZip hox5多肽与GUS报告基因的共轰击导致染色斑点数目增加，这些斑点颜色也更深(Meijer等，同前)。此测定可用于证明I类HDZip hox5多肽或其同源物的激活因子功能。
I类HDZip hox5核酸序列的实例包括但不限于实施例表A中所列的那些。I类HDZip hox5基因/核酸序列及其变体可适于实施本发明的方法。I类HDZip hox5基因/核酸序列的变体包括I类HDZip hox5基因/核酸序列的部分，和/或能够与I类HDZip hox5基因/核酸序列杂交的核酸序列。
如本文所定义的术语“部分”指编码如下多肽的DNA段，所述多肽从N-末端到C末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。例如，可以通过对I类HDZip hox5核酸序列进行一处或多处缺失来制备“部分”。“部分”可以以分离的形式使用，或者可以与其他编码(或非编码)序列融合，以便例如产生组合了若干活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比预测的I类HDZip hox5“部分”要大。优选“部分”为如本文实施例1表A所列任一核酸序列所代表的核酸序列的部分。最优选“部分”为SEQ ID NO：1所示核酸序列的部分。
I类HDZip hox5基因/核酸序列的另一类变体为能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与如上文所定义的I类HDZip hox5基因/核酸序列杂交的核酸序列，所述杂交序列编码从N-末端到C末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链的多肽。优选杂交序列能够与如本文实施例1表A所列任一核酸序列所代表的核酸序列杂交，或与如上文所定义的任一前述序列的部分杂交。最优选，杂交序列能够与如SEQ ID NO：1所示的核酸序列杂交。
如本文所定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即两个互补的核酸分子都在溶液中。杂交过程也可以如此进行，即互补核酸分子之一固定于基质上，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也可以如此进行，即其中互补核酸分子之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者例如用照相平板印刷固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸序列阵列或微阵列，或称为核酸序列芯片)。为使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸分子中的发夹结构或其它二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。
在核酸杂交实验，如DNA和RNA杂交(Southern和Northern杂交)的情况下，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”取决于序列，并且在不同的环境参数下不同。熟练的技术人员知晓可以在杂交和洗涤过程中改变从而保持或者改变严格条件的多种参数。
Tm是在确定的离子强度和pH值下，50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。在低于Tm值约16℃到32℃获得最大杂交速率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂合体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用明显。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50％甲酰胺能够使杂交在30到45℃完成，不过这将降低杂交速率。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使Tm值下降约1℃。Tm值可以用取决于杂合体类型的下列方程式计算：
1.DNA-DNA杂合体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6×log[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺
2.DNA-RNA或RNA-RNA杂合体：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3.寡DNA或寡RNAd杂合体：
＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)
20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围精确。
b仅对于范围30％到75％的％GC精确。
cL＝双链体的碱基对长度。
d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
注释：对于每1％甲酰胺，Tm值降低约0.6到0.7℃，而6M尿素的存在使Tm值降低约30℃。
杂交特异性通常是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性的条件下进行。一般而言，用于核酸序列杂交试验或基因扩增检测操作的适宜严格条件如上文所述。也可以选择更高或更低的严格性条件。通常，选择在确定的离子强度和pH值下比特定序列的热解链温度(Tm)低约50℃的低严格条件。中等严格条件是温度比Tm低20℃，高严格条件是温度比Tm低10℃。例如，严格条件是至少像例如条件A-L一样严格；降低的严格条件是至少像例如条件M-R一样严格。可以通过许多已知技术中的任一来控制非特异性结合，所述技术诸如，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。下表1列出了杂交和洗涤条件的实例。
表1：杂交和洗涤条件的实例
Figure G2008800228097D00201
Figure G2008800228097D00211
Figure G2008800228097D00212
“杂合体长度”是杂交的核酸序列的预期长度。当序列已知的核酸序列杂交时，可以通过比对序列及鉴别本文所述的保守区域来确定杂合体长度。
Figure G2008800228097D00213
 在杂交和洗涤缓冲液中，可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC是0.15M NaCI和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后洗涤15分钟。杂交和洗涤可以另外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠、和高达50％的甲酰胺。
＊Tb-Tr：对于预期长度小于50个碱基对的杂合体，杂交温度应该比杂合体的解链温度Tm低5-10℃；根据上述方程式确定Tm。
±本发明还包括以PNA或修饰的核酸来代替任一或多个DNA或RNA杂交配偶体。
为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等人(2001)《分子克隆：实验室手册》第3版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)。
I类HDZip hox5核酸序列可以来自任何天然或人工的来源。该基因/核酸序列可以分离自微生物来源如酵母或真菌，或分离自植物、藻类或动物(包括人类)来源。可以通过仔细的人为操作在组成和/或基因组环境方面修饰核酸序列的天然形式。核酸序列可以为植物来源，或者来源于同一植物物种(例如对于其待引入的物种而言)或者来源于不同植物物种。优选，可以从单子叶物种，进一步优选从禾本科(Poaceae)，更优选从稻属，最优选从水稻(Oryza sativa)中分离所述核酸序列。更优选地，从水稻中分离的I类HDZip hox5核酸序列如SEQ ID NO：1所示，而I类HDZip hox5多肽序列如SEQ ID NO：2所示。
可以通过如下任何一种(或多种)方法引入遗传修饰：T-DNA激活、TILLING、定点诱变、定向进化和同源重组，或通过在植物中引入和表达编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列，调节编码I类HDZiphox5多肽或其同源物的核酸序列的表达。引入遗传修饰之后，可以实施步骤：基于表达受调节的编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列，进行选择，其中所述表达调节使植物在养分可利用度减小条件下相对于相应的野生型植物具有增加的产率。
T-DNA激活标记(Hayashi等人Science(1992)1350-1353)包括将通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10kb，从而在构型上使启动子能够指导靶基因的表达。通常天然启动子对靶基因表达的调控被破坏，基因落入新引入的启动子的控制下。启动子一般嵌入T-DNA中。此T-DNA随机插入植物基因组，例如，通过农杆菌(Agrobacterium)感染插入，并导致在插入的T-DNA附近的基因过表达。得到的转基因植物由于引入的启动子附近的基因过表达而表现出显性表型。待引入的启动子可以是任意能够在期望生物体内[在本案中是植物]指导基因表达的启动子。例如，组成型的、组织偏好型的、细胞类型偏好型的和诱导型的启动子都适用于T-DNA激活。
也可以通过TILLING(靶向诱导的基因组局部突变)技术将遗传修饰引入I类HDZip hox5基因的基因座。这是一种诱变技术，用于产生和/或鉴定并最终分离能够呈现I类HDZip hox5活性的I类HDZip hox5核酸序列的诱变变体。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体甚至可能呈现出比天然形式的基因所呈现的更高的I类HDZiphox5活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法结合在一起。TILLING一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)In Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J编著Singapore，World Scientific Publishing Co，16-82页；Feldmann等人(1994)In Meyerowitz EM，Somerville CR编著，Arabidopsis.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)In J Martinez-Zapater，J Salinas编著，Methods onMolecular Biology，82卷Humana Press，Totowa，NJ，91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中库中存在的杂双链体会在色谱图上以额外的峰的形式被检测到；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等人(2000)Nat Biotechnol18：455-7，由Stemple综述(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。
同源重组能够向基因组中的指定选择位置引入所选的核酸序列。同源重组是生物科学中常规用于低等生物体如酵母或小立碗藓(Physcomitrella)的标准技术。在植物中实施同源重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等人(1990)EMBO J.9(10)：3077-84)，而且也在作物植物如稻中描述(Terada等人(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)。用于打靶的核酸序列(可以是如上文所定义的I类HDZip hox5核酸序列或其变体)无需靶向I类HDZip hox5基因的基因座，而是可以引入到例如高表达区域。用于打靶的核酸序列可以是用于替换内源基因的改良等位基因，或可以是在内源基因之外的额外引入。
定点诱变可用于产生I类HDZip hox5核酸序列的变体。多种方法可用来实现定点诱变，最常用的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology，Wiley编著)。
定向进化也可以用来产生I类HDZip hox5核酸序列的变体。这包括反复进行DNA改组，随后是适当的筛选和/或选择，以产生I类HDZip hox5核酸序列或其部分的变体，其编码具有修饰的生物活性的I类HDZip hox5多肽或其同源物或其部分(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
T-DNA激活、TILLING、同源重组、定点诱变和定向进化是引入遗传修饰以调节编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达的方法。因此，根据本发明，提供了调节编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达的方法，包括通过T-DNA激活、TILLING、同源重组、定点诱变和定向进化中的一种或多种引入遗传修饰。
引入遗传修饰(在本案中这无需发生在I类HDZip hox5基因的基因座中)的一个优选方法是在植物中引入和表达编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列。I类HDZip hox5多肽或其同源物定义为这样的多肽：其从N-末端到C末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。待引入植物的核酸序列可以是全长核酸序列，或者可以是如上文所定义的部分或杂交序列。
蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且与其衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物活性和功能活性。为产生这样的同源物，蛋白质的氨基酸可以由具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其它氨基酸所替换。保守取代表是本领域众所周知的(例如见Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman andCompany和下表2)。可以用于本发明方法的同源物优选为如本文上面所定义的I类HDZip hox5多肽。
术语“同源物”也包括两种特殊形式的同源物，即，直系同源序列和旁系同源序列，其涵盖用于描述基因祖先关系的进化概念。术语“旁系同源物”与产生旁系同源基因的物种基因组内的基因复制有关。术语“直系同源物”与不同生物体中源于物种形成的同源基因有关。
例如，可以通过进行所谓的交互blast搜索容易地找到单子叶植物物种中的直系同源物。这可以通过如下方式实现：进行第一BLAST——包括使用所讨论的序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)针对任何序列数据库，如可公共获得的NCBI数据库，进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，可使用BLASTN或TBLASTX，而当从多肽开始时，可使用BLASTP或TBLASTN，利用标准默认值。BLAST结果可以过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对所讨论的该序列源自的生物体的序列进行反向BLAST(第二BLAST)。然后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。当第二BLAST的结果将I类HDZip hox5核酸序列或I类HDZip hox5多肽作为最高相似性的命中事件时，如果其与第一BLAST中所用的序列来自相同生物的话，则找到了旁系同源物。万一其与第一BLAST中所用序列来自不同的生物，则找到了直系同源物。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，接着建立邻接树，来辅助观察聚类。优选，这样的I类HDZip hox5多肽按照递增的优选顺序与未修饰的I类HDZip hox5多肽(优选SEQ ID NO：2；见本文实施例3)具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性或相似性(功能同一性)。I类HDZip hox5同源物之间在同源域和亮氨酸拉链之外的百分比同一性出名地低(见本文实施例3)。如SEQ ID NO：2所示I类HDZip hox5多肽的直系同源物和旁系同源物的实例可见本文实施例1的表格。
同源物可以是蛋白质“取代变体”的形式，即在氨基酸序列中至少有一个残基被除去，并在其位置上插入不同的残基。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是视施加于多肽的功能性限制而定也可以是成簇取代；插入通常在约1到10个氨基酸残基的数量级。优选氨基酸取代包括保守的氨基酸取代。保守取代表是本领域容易获得的。下表给出了保守氨基酸取代的实例。
表2：保守氨基酸取代的实例
  残基   保守取代   残基   保守取代
  Ala   Ser   Leu   Ile；Val
  Arg   Lys   Lys   Arg；Gln
  Asn   Gln；His   Met   Leu；Ile
  Asp   Glu   Phe   Met；Leu；Tyr
  Gln   Asn   Ser   Thr；Gly
  Cys   Ser   Thr   Ser；Val
  Glu   Asp   Trp   Tyr
  Gly   Pro   Tyr   Trp；Phe
  His   Asn；Gln   Val   Ile；Leu
  Ile   Leu；Val
同源物也可以是蛋白质的“插入变体”的形式，即在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括单个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端的融合以及序列内插入。通常，氨基酸序列内部的插入将小于N-或C-末端的融合，数量级为约1到10个残基。N-或C-末端融合蛋白质或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、
Figure G2008800228097D00261
表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。
蛋白质“缺失变体”形式的同源物特征在于从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。
可通过本领域众所周知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作，容易地得到蛋白质的氨基酸变体。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法是本领域众所周知的。例如，本领域技术人员熟知在DNA预定位置产生取代突变的技术，其包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其它定点诱变方法。
I类HDZip hox5多肽或其同源物可以是衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，与天然形式蛋白质(如目的蛋白质)的氨基酸序列相比，其可以包括用非天然氨基酸残基取代氨基酸、或添加非天然氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，与天然形式的多肽的氨基酸序列相比，其包括天然改变的(糖基化、酰基化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改变的氨基酸残基。与其源自的氨基酸序列相比，衍生物还可以包括一个或多个非氨基酸取代或添加，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其它配体，例如与之结合以有利于衍生物检测的报告分子，以及相对于天然蛋白质的氨基酸序列而言的非天然氨基酸残基。
I类HDZip hox5多肽或其同源物可以由I类HDZip hox5基因/核酸序列的可变剪接变体编码。如本文所用的术语“可变剪接变体”包括核酸序列中选定的内含子和/或外显子已被切除、替换或添加，或者其中内含子已被缩短或加长的变体。这样的变体可以是保留蛋白质生物活性的变体，这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性区段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。产生此类剪接变体的方法是本领域众所周知的。优选的剪接变体是这样的核酸序列的剪接变体：其编码从N-末端到C-末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链的多肽。另外，I类HDZip hox5多肽或其同源物可以包含如下之一或两者兼而有之：(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，而F为Phe。当从N-末端到C-末端检查蛋白质时，基序(b)位于酸性盒之前。进一步优选实施例1表A所列核酸序列的剪接变体。最优选SEQ ID NO：1所示核酸序列的剪接变体。
同源物还可以由编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列的等位基因变体编码，优选这样的核酸序列的等位基因变体：其编码从N-末端到C-末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链的多肽。另外，I类HDZip hox5多肽或其同源物可以包含如下之一或两者兼而有之：(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，而F为Phe。当从N-末端到C-末端检查蛋白质时，基序(b)位于酸性盒之前。进一步优选实施例1表A所列核酸序列的等位基因变体。最优选SEQ ID NO：1所示核酸序列的等位基因变体。等位基因变体天然存在，并且这些天然等位基因的用途包括在本发明的方法中。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)以及小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物的天然存在的多态性株系中SNP和INDEL形成了最大的一组序列变体。
根据本发明一个优选的方面，考虑I类HDZip hox5核酸序列的受调节的表达。调节基因或基因产物的表达的方法在本领域有详细的记载，并且包括例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的应用。可以将充当启动子或增强子元件的分离的核酸序列引入至非异源形式的多核苷酸的适当位置上(一般为上游)，从而上调I类HDZip hox5核酸序列的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代来体内改变内源启动子(参见Kmiec，美国专利No.5,565,350；Zarling等，PCT/US93/03868)，或者可以将分离的启动子以相对于本发明基因具有恰当的取向和距离的方式引入植物细胞中，从而控制基因的表达。降低基因或基因产物的表达的方法在本领域有充分的记载。
如果期望多肽表达，通常期望在多核苷酸编码区的3’端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其他植物基因或T-DNA。例如，待加入的3’端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其他真核基因。
也可以在5’非翻译区或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，以增加在细胞质中累积的成熟信使的量。已证明在植物和动物表达构建体中将可剪接内含子纳入转录单位均可以在mRNA和蛋白质水平上使基因表达提高多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等人(1987)Genes Dev.1：1183-1200)。通常当此类内含子放置在转录单位5’端附近时，其提高基因表达的作用最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6以及Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。通常见TheMaize Handbook，116章，Freeling和Walbot编著，Springer，N.Y.(1994)。
本发明还提供遗传构建体和载体，以利于用于本发明方法的核苷酸序列的引入和/或表达。
因此，本发明提供基因构建体，其含有：
(i)如上文所定义的I类HDZip hox5核酸序列；
(ii)一个或多个能够驱动(i)中核酸序列表达的控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
可以利用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建用于本发明方法的构建体。可以将基因构建体插入可商购的、适合于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体中。本发明因此提供了如上文所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
可以用含有目的序列(即编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列)的载体转化植物。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在本文都可互换使用，广义地指能够实现与之相连的序列的表达的调控核酸序列。上述术语包括源自经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括具有或没有CCAAT盒序列的TATA盒，其对于精确的转录起始是必需的)，以及通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的其他调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下其可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸序列分子的表达。如本文所用的术语“有效连接”指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，该连接使得启动子序列能够起始目的基因的转录。
有利地，可以使用任何类型的启动子驱动核酸序列的表达。启动子可以是诱导型启动子，即应答发育、化学、环境或物理刺激而具有诱导的或增加的转录起始。诱导型启动子的实例是胁迫诱导型启动子，即当植物接触各种胁迫条件时激活的启动子。另外或可选地，启动子可以是组织偏好型的启动子，即能够在某些组织，如在叶、根、种子等组织中优先起始转录的启动子。仅在某些组织中能够起始转录的启动子在本文称为“组织特异性”启动子。
在一个实施方案中，I类HDZip hox5核酸序列有效连接于组成型启动子。组成型启动子将在大多数但无需所有的生长和发育阶段具有转录活性，并且是基本上遍在地表达的。组成型启动子优选为GOS2启动子，更优选组成型启动子为稻GOS2启动子，还优选组成型启动子为基本上类似于SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：52的核酸序列，最优选组成型启动子如SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：52所示。应该明确本发明的应用并不局限于SEQ ID NO：1所示的I类HDZip hox5核酸序列，且本发明的应用也不局限于由GOS2启动子驱动的I类HDZip hox5核酸序列的表达。其它也可用于实施本发明方法的组成型启动子的实例示于下表3。
表3：组成型启动子的实例
  基因来源   表达模式   参考文献
  肌动蛋白   组成型   McElroy等人，Plant Cell，2：163-171，1990
CAMV 35S   组成型   Odell等人，Nature，313：810-812，1985
CaMV 19S   组成型   Nilsson等人，Physiol.Plant.100：456-462，1997
GOS2   组成型   de Pater等人，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992
  泛素   组成型   Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992
  稻亲环蛋白   组成型   Buchholz等人，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，1994
  玉米H3组蛋白   组成型   Lepetit等人，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992
 肌动蛋白2   组成型   An等人，Plant J.10(1)；107-121，1996
HMGB   组成型   WO 2004/070039
任选地，还可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语“终止子”包括这样的控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，传递对初级转录物进行3’加工和多聚腺苷酸化的信号以及终止转录的信号。另外的调控元件可以包括转录及翻译增强子。本领域技术人员知晓适用于实施本发明的终止子和增强子的序列。此类序列为本领域技术人员所公知或者可以容易地获得。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中进行维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
遗传构建体可任选地含有可选择标记基因。如本文所用，术语“可选择标记基因”包括任何赋予细胞表型的基因，该基因在细胞中的表达有利于鉴定和/或选择被本发明的核酸序列构建体转染或转化的细胞。适宜的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可视选择。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt(t)，赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox、或者赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺胺脲的抗性的基因)，或者提供代谢性状的基因(例如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA)。可视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS)、发光(例如萤光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。
在一个优选的实施方案中，提供基因构建体，其含有：
(i)如上文所定义的I类HDZip hox5核酸序列；
(ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的组成型启动子；和任选的
(iii)转录终止序列。
组成型启动子优选为GOS2启动子，更优选组成型启动子为稻GOS2启动子，还优选组成型启动子为基本上类似于SEQ ID NO：33或SEQ IDNO：52的核酸序列，最优选组成型启动子如SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：52所示。本发明还提供了如上文所定义的构建体在本发明方法中的用途。
本发明还包括可由本发明方法获得的植物。本发明因此提供了可由本发明方法获得的植物、或其植物部分或植物细胞，所述植物或其部分或细胞含有I类HDZip hox5核酸序列转基因。
本发明还提供了产生在养分可利用度减小条件下相对于相应的野生型植物具有增加的产率的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列。
更具体地，本发明提供了产生在养分可利用度减小条件下相对于相应的野生型植物具有增加的产率的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物、植物部分或植物细胞中引入和表达I类HDZip hox5核酸序列；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
可以将核酸序列直接引入植物细胞或植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其它部分)。根据本发明的优选方面，优选通过转化将核酸序列引入植物。
本文所述及的术语“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。可以用本发明的遗传构建体转化能够通过器官发生或者胚胎发生实现随后的克隆增殖的植物组织，并从其再生完整植物。具体的组织选择将因对于所转化的具体物种而言可获得的和最适于的克隆增殖系统而变。示例性的靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒，保持非整合的状态。可选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员已知的方式再生为转化的植物。
植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用多种转化方法的任一向适宜的祖先细胞引入目的基因。转化方法包括应用脂质体、电穿孔、增强游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化以及显微注射。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人(1882)Nature 296，72-74；Negrutiu I.等人(1987)Plant Mol.Biol.8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等人(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等人(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等人(1987)Nature 327：70)；(非整合型)病毒感染，等等。优选使用任何熟知的稻转化方法，通过农杆菌介导的转化，产生表达I类HDZip hox5基因/核酸序列的转基因稻植物，例如在以下任一文献中描述的方法：公开的欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta，199：612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6(2)：271-282，1994)，其公开的内容就如同充分阐述的那样并入本文作为参考。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol.14(6)：745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol.129(1)：13-22，2002)中所述，其公开的内容就如同充分阐述的那样并入本文作为参考。
通常在转化后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，其中所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，之后将转化的材料再生成完整植物。
在DNA转移和再生之后，可评价推定转化的植物，例如用Southern分析评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)或定量PCR监测新引入的DNA的表达水平，所有这些技术都是本领域普通技术人员所熟知的。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交以得到纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。
产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如，所有细胞经过转化而包含表达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，在转化的砧木上嫁接非转化的接穗)。
本发明显然延及由本文所述任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分和其繁殖体。本发明还延及由任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或完整植物的后代，唯一要求是所述后代与在本发明方法中由亲本产生的后代呈现相同的基因型和/或表型特性。
本发明也包括含有分离的I类HDZip hox5核酸序列的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。
本发明也延及植物的可收获部分，例如但不限于：种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎和球茎。本发明还涉及由这样的植物的可收获部分产生的产品，如干丸或干粉、油类、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
本发明还包括I类HDZip hox5核酸序列的用途以及I类HDZip hox5多肽或其同源物的用途。如上文在本发明方法中所定义的，这样的用途涉及增加在养分可利用度减小条件下生长的植物相对于相应的野生型植物的产率。优选，增加的产率是如下一种或多种：增加的每株植物的种子总产率、增加的饱满种子数、增加的种子饱满率、增加的每个圆锥花序的花朵数量或增加的收获指数。
可以在育种程序中使用I类HDZip hox5核酸序列或其变体、或者I类HDZip hox5多肽或其同源物，鉴定可能与I类HDZip hox5基因或其变体遗传连锁的DNA标记。可以使用I类HDZip hox5基因/核酸序列或其变体、或者I类HDZip hox5多肽或其同源物定义分子标记。然后可以在育种程序中使用此DNA或蛋白质标记，以选择如上文在本发明方法中所定义的在养分可利用度减小条件下生长时具有增加的产率的植物。I类HDZip hox5基因可以是例如，本文实施例1表A所列的核酸序列。
I类HDZip hox5基因/核酸序列的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变，通过诱变处理植物，引入等位基因变体；可选地，该程序可以以一系列无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体开始。然后通过例如PCR鉴定等位基因变体。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，所述等位基因变体导致植物在养分可利用度减小条件下相对于相应的野生型植物具有增加的产率。一般通过监测含有所研究序列的不同等位基因变体(例如本文实施例1表A所列任一核酸序列的不同等位基因变体)的植物的生长行为来进行选择。可以在温室或田间监测生长行为。其它任选的步骤包括将经鉴定含有较好等位基因变体的植物与其他植物杂交。例如，可使用这种方法产生目的表型特征的组合。
I类HDZip hox5核酸序列或其变体还可以作为探针用于基因(其为该基因的一部分)的遗传和物理作图，和用作为与这些基因连锁的性状的标记。这样的信息可以在植物育种中使用，以开发具有期望表型的品系。I类HDZip hox5核酸序列或其变体的这类应用仅需要长至少15个核苷酸的核酸序列。I类HDZip hox5核酸序列或其变体可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用I类HDZip hox5核酸序列或其变体探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)《分子克隆：实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，可以使用该核酸序列探测含有一组个体的限制性内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，其中所述一组个体代表了确定的遗传杂交(genetic cross)的亲本和子代。记录DNA多态性的分离，并用于计算I类HDZip hox5核酸序列或其变体在先前用此群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和应用描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员众所周知的。
核酸探针也可以用来进行物理作图(即在物理图谱上安置序列；参见Hoheisel等In：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可用于进行直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向使用大的克隆(几个kb到几百个kb；参见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏性的提高可以允许在FISH作图中应用较短的探针。
用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。在采用基于PCR的遗传作图的方法中，可能需要鉴定用于作图杂交的亲本之间在相应于本发明核酸序列的区域中的DNA序列差异。但是，通常这对作图方法不是必要的。
根据本发明的方法得到如前所述在养分可利用度减小条件下具有增加的产率的植物。此增加的产率还可以组合其它经济上有利的性状，如其他增产性状、对其他生物和非生物胁迫的耐受性、改良各种构造特征和/或生物化学和/或生理学特征的性状。
附图说明
现参考以下附图描述本发明，其中：
图1显示了不同植物来源的I类HDZip同源域的多重比对，其中使用基于改进的ClustalW算法(InforMax，Bethesda，MD)的VNTI AlignX多重比对程序，采用空位开放罚分10和空位延伸罚分0.05的默认设置。同源域不变氨基酸L16、W48、F49、N51和R53被框在纵向框中。I类HDZip的偏好氨基酸A46和W56同样被框在纵向框中。DNA结合所必需的3个螺旋以比对上方的黑框标出。6个七肽以垂直线隔开。每个七肽内的7个位置命名为a、b、c、d、e、f和g位。Leu位于每个七肽的d位，且被框在纵向框中。
图2显示了多个植物I类HDZip hox5多肽的多重比对，使用的是VNTI AlignX多重比对程序，基于改进的ClustalW算法(InforMax，Bethesda，MD)，采用空位开放罚分10和空位延伸罚分0.05的默认设置。从N-末端到C-末端，3个主要的特征性结构域被粗框线框起来，并标识为酸性盒、I类同源域和6个七肽亮氨酸拉链。另外，Trp尾巴和RPFF氨基酸基序也被框线框起来。
图3显示了双元载体(binary vector)，用于在水稻中于GOS2启动子控制之下表达水稻I类HDZip hox5。
图4详述了可以用于实施本发明方法的I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5序列的实例。多个序列来自于公共EST拼接(见本文实施例1表A)，测序质量较低。因此预期可能存在少数核酸取代。编码全长I类HDZiphox5多肽的核酸序列以起始(ATG)和终止密码子界定。
实施例
现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明，而非旨在完全地定义或以其他方式限制本发明的范围。
除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等人(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第一卷和第二卷的标准方法执行。植物分子工作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology Labfax(1993)(BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版)。
实施例1：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相关序列的鉴定
利用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)Entrez核苷酸数据库维护的序列中鉴定序列(全长cDNA、EST或基因组的)。使用了该程序，通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，寻找序列之间具有局部相似性的区域。例如，对核酸SEQID NO：1所编码的多肽运用了TBLASTN算法，使用默认设置，开启过滤器，以忽略低复杂度序列。分析结果的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行了同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在有些情况下，可以调整默认参数以更改搜索的严格度。例如，可以增加E值以显示较低严格度的匹配事件。通过这种方式可以鉴定短的几乎精确匹配的事件。
下表A提供了与SEQ ID NO：1的核酸序列相关的核酸序列的列表。
表A：与SEQ ID NO：1的核酸序列相关的序列的实例
  名称   NCBI核苷酸登录号  核苷酸SEQ ID NO   翻译的多肽SEQ ID NO   来源
  Orysa_hox5   XM_482406   1   2   水稻
  Orysa_hox16   XM_467603   3   4   水稻
  Zeama_hox5＊   CO458693DV024016   5   6   玉蜀黍
  Zeama_hox16   AY105265   7   8   玉蜀黍
Sacof_hox5＊ CA088615CA115362CA142506 9 10   甘蔗(Saccharum officinarum)
  Sorbi_hox5＊   BE363386CD432381   11   12   两色蜀黍(Sorghum bicolor)
  名称   NCBI核苷酸登录号  核苷酸SEQ ID NO   翻译的多肽SEQ ID NO   来源
  Triae_hox16＊   DR735359DR741379CD916488   13   14   普通小麦(Triticum aestivum)
Arath_ATHB1 X58821 15 16   拟南芥
  Dauca_CHB3＊＊   D26575   17   18   胡萝卜(Daucus carota)
  Glyma_HD157＊＊   AF184278   19   20   大豆(Glycine max)
  Crapl_CPHB-5   AF443621   21   22   Craterostigmaplantagineum
  Goshi_hox5＊   DT465649CD486134   23   24   陆地棉(Gossypium hirsutum)
  Lyces_hox5   BT014213.1   25   26   蕃茄(Lycopersicon esculentum)
  名称   NCBI核苷酸登录号  核苷酸SEQ ID NO   翻译的多肽SEQ ID NO   来源
  Lyces_VaHOX1   X94947   27   28   蕃茄
  Medsa_hox16＊   CB892061CA858059   29   30   紫花苜蓿(Medicago sativa)
  Aqufo_hox5   DT758247   31   32   Aquilegia formosa xAquilegia pubescens
  Poptr_hox16_1   scaff_XV.439   40   41   似欧洲山杨(Populus tremuloides)
  Poptr_hox16_2   scaff_XII.649   42   43   似欧洲山杨
  Poptr_hox16_3   lcl|scaff_VIII.1839   44   45   似欧洲山杨
  Medtr_hox16_1   CR954197.2   46   47   蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)
  Phavu_hox16   AF402605   48   49   菜豆(Phaseolus vulgaris)
  名称   NCBI核苷酸登录号  核苷酸SEQ ID NO   翻译的多肽SEQ ID NO   来源
  Lotco_hox16   AP006364   50   51   百脉根(Lotus corniculatus)
＊由多个EST登录号(显示了主要的EST)拼接的重叠群；EST测序质量通常较低，预期可能会有少数核酸取代。
＊＊来自胡萝卜和大豆的序列，与其登录号相比已进行了订正。
实施例2：I类HDZip hox5多肽序列的比对
使用来自Vector NTI(英骏公司，Invitrogen)的AlignX，其基于流行的渐进式比对Clustal算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等人(2003)Nucleic Acids Res 31：3497-3500)。可利用邻接聚类算法构建系统发生树。默认值为空位开放罚分10，空位延伸罚分0，1，且选择的权重矩阵为Blosum 62(如果比对多肽的话)。
所述多重序列比对的结果示于图2。从N-末端到C-末端，3个主要特征结构域被粗框线框起来，并标识为酸性盒、I类同源域和6个七肽亮氨酸拉链。“保守结构域”包含这3个结构域。另外，Trp尾巴和RPFF氨基酸基序也被加以框线。
实施例3：I类HDZip hox5多肽序列之间全局同一性百分比的计算
全长I类HDZip hox5多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利用矩阵全局比对工具(MatGAT)软件(BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：an application that generates similarity/identity matrices usingprotein or DNA sequences.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。
比较所用的参数有：
记分矩阵：Blosum 62
首个空位：12
延伸空位：2
多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的全局相似性和同一性的软件分析结果示于表B1。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。
与SEQ ID NO：2比较，所示多肽序列之间的同一性百分比可低至29％氨基酸同一性。
表B1：多肽序列全长范围的全局相似性和同一性的MatGAT结果
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22
  1.Aqufo_Hox5   56   54   37   34   64   36   64   35   34   36   47   37   36   38   38   36   42   41   46   49   42
  2.Arath_ATHB1   73   52   34   34   59   36   57   33   34   36   44   34   35   40   35   35   39   39   41   43   39
  3.Crapl_CPHB-5   69   66   33   35   56   37   59   33   33   33   45   39   34   37   36   36   41   39   41   44   41
  4.Dauca_CHB3   52   52   48   44   39   53   35   46   49   46   30   33   47   58   56   43   32   33   31   33   33
  5.Glyma_HD157   50   47   48   58   33   44   32   43   43   72   33   31   84   48   48   47   32   31   31   31   32
  6.Goshi_Hox5   79   74   71   53   49   38   64   36   36   37   46   38   35   39   36   35   40   39   46   49   40
  7.Lotco_Hox16   51   53   51   66   62   53   35   45   66   50   29   31   49   62   59   49   30   31   30   32   31
  8.Lyces_Hox5   75   70   72   51   45   75   50   34   34   36   46   38   34   37   36   33   41   41   45   47   41
  9.Lyces_VaHOX1   49   48   47   63   58   48   62   47   45   44   31   32   47   53   49   44   33   33   32   33   33
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22
  10.Medtr_Hox16   48   48   50   65   64   49   78   48   63   46   30   30   45   59   55   42   31   30   31   31   30
  11.Medtr_Hox16_1   52   49   50   61   81   49   67   49   61   64   33   28   77   51   48   50   32   31   29   29   32
  12.Orysa_Hox16   62   59   58   50   50   60   47   58   45   50   51   49   34   32   31   30   46   45   73   76   45
  13.Orysa_Hox5   53   47   52   48   48   52   48   50   44   45   46   59   32   32   32   30   66   66   49   50   65
  14.Phavu_HOX16   51   51   48   64   89   49   65   47   63   65   88   49   48   56   55   51   34   32   31   32   33
  15.Poptr_HOX16_1   54   54   52   71   66   52   75   50   66   73   69   48   49   71   92   48   35   35   32   34   34
  16.Poptr_HOX16_2   51   49   51   70   66   50   73   49   65   70   66   47   46   71   96   47   34   33   32   32   34
  17.Poptr_HOX16_3   52   51   47   59   59   52   63   45   59   59   62   44   44   65   63   63   34   33   30   31   33
  18.Sacof_Hox5   62   58   57   47   44   60   48   57   44   45   46   56   69   46   48   47   47   95   46   46   94
  9.Sorbi_Hox5   62   57   55   46   45   58   51   58   45   44   46   56   69   47   50   47   46   97   43   46   94
  20.Triae_Hox16   62   54   56   48   48   59   47   58   47   49   47   82   61   48   52   51   46   56   55   72   45
  21.Zeama_Hox16   63   58   59   51   49   62   51   60   49   50   47   81   62   51   49   48   46   56   57   81   45
  22.Zeama_Hox5   62   58   56   46   44   59   49   57   45   45   45   55   68   46   50   46   48   96   96   57   56
如上文所定义的那样，I类HDZip hox5多肽序列的“保守结构域”从N-末端到C-末端包含酸性盒、I类同源域和6个七肽亮氨酸拉链(见图2)。当对保守结构域而不是全长多肽序列进行同一性百分比分析时，观察到同一性百分比升高，如表B2所示。与SEQ ID NO：2比较，现在最低值高于50％氨基酸同一性。
表B2：多肽序列“保守结构域”的全局相似性和同一性MatGAT结果
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20
  1.Aqufo_hox5_CD   81   74   66   82   62   82   62   61   75   66   61   67   63   60   68   67   73   76   67
  2.Arath_ATHB1_CD   93   74   59   82   61   85   61   61   71   66   63   65   62   59   67   66   71   71   67
  3.Crapl_CPHB-5_CD   85   85   61   78   62   77   57   60   69   63   62   62   58   65   65   64   66   68   65
  4.Dauca_CHB3_CD   81   79   75   64   70   62   66   69   57   57   64   80   75   66   58   59   57   57   58
  5.Goshi_hox5_CD   94   95   89   81   66   83   63   63   74   66   63   68   63   64   67   66   73   75   67
  6.Lotco_hox16_CD   80   78   74   81   80   62   67   85   54   52   62   77   73   64   53   52   54   54   53
  7.Lyces_hox5_CD   91   92   88   79   92   77   57   61   75   68   63   66   62   60   71   69   75   76   70
  8.Lyces_VaHOX1_CD   77   75   71   79   76   84   74   71   56   57   62   73   68   60   58   58   57   57   58
  9.Medtr_hox16_CD   77   75   74   81   77   93   75   84   59   57   61   75   71   62   57   57   58   59   57
  10.Orysa_hox16_CD   93   92   85   77   92   79   92   74   75   84   58   60   58   58   82   82   94   96   82
  11.Orysa_hox5_CD   90   87   83   78   88   77   88   71   74   91   59   58   57   57   92   93   81   84   94
  12.Phavu_hox16_CD   79   79   75   80   79   81   76   75   80   76   75   71   71   65   60   60   57   58   60
  13.Poptr_hox16_1_CD   81   80   75   88   82   90   79   84   87   79   80   86   93   65   59   60   58   61   59
  14.Poptr_hox16_2_CD   79   77   74   85   79   87   76   82   84   75   75   85   98   62   57   57   56   58   57
  15.Poptr_hox16_3_CD   74   75   73   80   75   76   71   76   77   73   71   78   77   77   57   57   56   58   58
  16.Sacof_hox5_CD   89   86   80   77   87   77   86   71   73   88   96   74   79   75   72   98   79   82   98
  7.Sorbi_hox5_CD   89   86   81   77   87   77   87   71   73   89   97   74   79   76   72   99   78   82   98
  8.Triae_hox16_CD   93   92   85   79   92   80   92   74   75   98   91   77   80   77   73   88   89   95   79
  9.Zeama_hox16_CD   93   92   86   78   92   81   92   75   77   98   92   79   80   76   74   90   91   98   82
  20.Zeama_hox5_CD   89   86   81   77   87   77   87   71   73   89   97   74   79   75   72   99   100  89   91
实施例4：I类HDZip hox5多肽序列包含的结构域的鉴定
蛋白质家族、结构域和位点整合资源(Integrated Resource of ProteinFamilies，Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索常用的标签数据库的整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，这些数据库利用不同的方法学和关于充分表征的蛋白质的不同角度生物信息，以获得蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)托管。
SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果示于表C。
表C：SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果
  JnterPro  IPR000047   螺旋-转角-螺旋基序，λ样阻遏物
 PRINTS   PR00031  HTHREPRESSR
  InterPro  IPR001356   同源盒
 PRODOM   PD000010   Homeobox
 PRINTS   PR00024   HOMEOBOX
 PFAM   PF00046   Homeobox
 SMART   SM00389   HOX
 PROFILE   PS00027   HOMEOBOX_1
 PROFILE   PS50071   HOMEOBOX_2
  InterPro  IPR003106   亮氨酸拉链，同源盒相关的
 PFAM   PF02183   HALZ
  InterPro  IPR009057   同源域样
 SUPERFAMILY   SSF46689   同源域样
  InterPro  IPR012287   同源域相关的
 GENE3D   G3DSA:.10.10.60   同源域相关的
为确定多肽结构域是否富含特定氨基酸(例如在酸性盒中)，可以利用来自ExPASy服务器的软件程序，特别是ProtParam工具(Gasteiger E等人(2003)ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledgeand analysis.Nucleic Acids Res 31：3784-3788)，计算一级氨基酸组成(以％计)。然后可以将目的多肽序列的组成与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的平均氨基酸组成(以％计)进行比较。
下表(表D)对SEQ ID NO：2的酸性盒中的％Asp(D)、％Glu(E)及其组合含量与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的平均值进行了比较。
表D
  ％Asp(D)   ％Glu(E)  ％Asp(D)+％Glu(E)
  Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的平均值   5.3％   6.6％   11.9％
  SEQ ID NO：2的酸性盒   9.1％   54.5％   63.6％
酸性盒可以是转录激活结构域中的一部分。已根据真核转录激活结构域的氨基酸含量对其进行了分类，且主要的类别包括酸性的、谷氨酰胺富含的和脯氨酸富含的激活结构域(Rutherford等人(2005)Plant J.43(5)：769-88，及其中的参考文献)。
基因本体论(GO)联合会是科学家之间在多种生物学数据库上的国际性合作，其编辑部建在欧洲生物信息学研究所。GO的目标在于为描述基因产物的分子功能、生物过程和细胞组分提供可控的词汇表。当进行上文所述的InterPro扫描时，我们也对GO数据库进行了搜索。I类HDZip hox5多肽序列具有的分子功能为转录因子和序列特异性DNA结合活性，并定位于植物细胞的细胞核中(见下表(表E))。
表E
  Gene Ontology条目
同源域   分子功能：转录因子活性(GO：0003700)细胞组分：细胞核(GO：0005634)分子功能：序列特异性DNA结合(GO：0043565)
  亮氨酸拉链，同源盒相关的   分子功能：DNA结合(GO：0003677)细胞组分：细胞核(GO：0005634)
实施例5：I类HDZip hox5多肽序列的拓扑预测
利用专业软件如2ZIP进行亮氨酸拉链预测和七肽鉴定，该软件将标准卷曲螺旋预测算法和特征性亮氨酸重复单位的近似搜索结合在一起(Bornberg-Bauer等人(1998)Computational Approaches to IdentifyLeucine Zippers，Nucleic Acids Res.，26(11)：2740-2746，由位于德国Golm的马克斯普朗克研究所(Max Planck Institut)托管)。利用此软件可以鉴定潜在的亮氨酸拉链、亮氨酸重复单位和卷曲螺旋。
I类HDZip hox5多肽序列含亮氨酸拉链预测，具有至少5个、优选6个七肽。当对SEQ ID NO：2的多肽运行此算法时，发现潜在的亮氨酸拉链位于第143-178位，如下文输出所示(数字表示氨基酸位置，C表示卷曲螺旋区域，而L表示七肽内部的亮氨酸)：
1---------11--------21--------31--------41--------51--------
MDPGRVVFDSGVARRACPGGAQMLLFGGGGSANSGGFFRGVPAAVLGMDESRSSSSAAGA
61--------71--------81--------91--------101-------111-------
GAKRPFFTTHEELLEEEYYDEQAPEKKRRLTAEQVQMLERSFEEENKLEPERKTELARRL
121-------131-------141-------151-------161-------171-------
GMAPRQVAVWFQNRRARWKTKQLEHDFDRLKAAYDALAADHHALLSDNDRLRAQVISLTE
            CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC
                      L------L------L------L------L------L
                      LZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZLZ
181-------191-------201-------211-------221-------231-------
KLQDKETSPSSATITTAAQEVDQPDEHTEAASTTGFATVDGALAAPPPGHQQPPHKDDLV
CCCCCCCC
241-------251-------261-------271-------281-------291-------
SSGGTNDDGDGGAAVVVFDVTEGANDRLSCESAYFADAAEAYERDCAGHYALSSEEEDGG
301-------311-------321-------331-------341------
AVSDEGCSFDLPDAAAAAAAMFGAAGVVHHDAADDEEAQLGSWTAWFWS
实施例6：I类HDZip hox5多肽序列的测定
I类HDZip hox5多肽或其同源物具有DNA结合活性，优选结合在中心位置处重叠的5bp半位点，即CAA(A/T)ATTG，如在酵母单杂交试验中检测到的那样(Meijer等人(2000)Mol Gen Genet 263：12-21)。在稻细胞悬浮液上在瞬时测定试验中，与GUS报告基因共同轰击I类HDZip hox5多肽据报道导致了染色斑点数目增加，这些斑点的颜色也更深(Meijer等，同前)。此测定试验可用于证明I类HDZip hox5多肽或其同源物的激活因子功能。
实施例7：水稻I类HDZip hox5核酸序列的克隆
使用水稻幼苗cDNA文库(英骏公司，佩斯利，英国)作为模板，通过PCR扩增水稻I类HDZip hox5核酸序列。反转录从幼苗提取的RNA后，将cDNA克隆进pCMV Sport 6.0中。该库平均插入物大小为1.6kb，并且初始克隆数为1.67×107cfu数量级。在6×1010cfu/ml的第一次扩增之后，确定初始滴度为3.34×106cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板用于50μlPCR混合物中。PCR扩增所用引物为prm06000(SEQ ID NO：34；有义，起始密码子为粗体，AttB1位点为斜体：5’-CTTAAACA
Figure G2008800228097D00462
GATCCCGGCCG-3’)和prm06001(SEQ ID NO：35；反向，互补，AttB2位点为斜体：5’-
Figure G2008800228097D00463
GATCAGCTCCAGAACCAGG-3’)，它们包括进行Gateway重组的AttB位点。在标准条件下使用HifiTaq DNA聚合酶进行PCR。同样用标准方法扩增和纯化1116bp的PCR片段(包括attB位点；从起始到终止为1050bp)。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生(根据Gateway术语)“进入克隆”。作为
Figure G2008800228097D00464
技术一部分的质粒pDONR201购自英骏公司。
实施例8：载体构建
随后使用含所述核酸序列的进入克隆和用于稻转化的目的载体(destination vector)一起进行LR反应。此载体在T-DNA边界内包含这样的功能元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；旨在用于与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway表达盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：52)位于此Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，按照本领域众所周知的方法将所产生的表达载体(图3)转化进入农杆菌菌株LBA4044。
实施例9：植物转化
稻转化
用含表达载体的农杆菌转化水稻植物。将梗稻栽培种日本晴的成熟干种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，接着在0.2％HgCl2中孵育30分钟，继之用无菌蒸馏水洗6次，每次15分钟进行消毒。然后使无菌的种子在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下胚胎发生的盾片衍生的愈伤组织并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中继代培养另外2周增殖或者说传代培养愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚胎发生愈伤组织块3天(为了加强细胞分裂活性)。
将含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有适当抗生素的AB培养基中并在28℃培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至约1的光密度(OD600)。接着将悬浮液转移至培养皿，并将愈伤组织浸于悬浮液中15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固体共培养培养基，并在黑暗中于25℃孵育3天。在选择剂存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基上于28℃暗培养四周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛。将该物质转移至再生培养基并在光照下孵育之后，释放出胚胎发生潜力，并在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈伤组织切下并在含有植物生长素的培养基上孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。
对于一个构建体，产生了约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，只保留对选择剂呈现出耐受性的单拷贝转基因植物用以收获T1种子。在移植后三至五个月收获种子。该方法以超过50％的比率提供单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996；Chan等人，1993；Hiei等人，1994)。
实施例10：表型评估方法
10.1评估设置
产生了大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体由组织培养室转移到温室，生长并收获T1种子。保留了7个事件，每个事件中T1代就转基因的存在/缺乏而言发生3∶1分离。对于这些事件之每一个，通过监测可视标记的表达，各选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗，以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长。温室条件为短白昼(12小时光照)，日间28℃，夜间22℃，相对湿度70％。
按照T1代相同的评估方法对所有T1事件的T2代进行进一步的评估。从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。减小的养分(氮)可利用度筛选
来自六个事件的植物(T2种子)在除营养液以外均正常的条件下在花盆土中生长。从植物移植到成熟用特定的营养液浇灌花盆，所述营养液含有减少的氮(N)含量，通常低7到8倍。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下生长的植物相同。然后测量种子相关参数。
10.2统计分析：F检验
利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行全面评估。对用本发明基因转化的所有事件的所有植株的所有测量参数进行了F检验。进行F检验，以检查基因在所有转化事件上的效应，以及检验基因的总体效应，亦称为全局基因效应。真实全局基因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。显著性F检验值指向基因效应，意味着不仅仅只是基因的存在或位置引起表型差异。
10.3测量的参数
10.3.1生物量相关参数的测量
从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。
植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数数码图像上来自区别于背景的地上植物部分的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为表达为平方毫米的物理表面值(physical surface value)。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。该地上面积表明植物达到其最大叶生物量时的时间点。早期活力为萌发后三周的植物(幼苗)地上面积。
还根据植物的数码图像计算了另一参数：绿度指数。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿值与红值之比(在用于编码颜色的RGB模型中)。绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素的百分比。在养分可利用度减小的生长条件下，在开花前的末次成像中测量了植物的绿度指数。
为测量根相关参数，在特别设计的具有透明盆底的花盆中培养植物以便能够对根进行观察。在植物生长期间用数码相机透过盆底拍摄照片。利用适当的软件由照片推断根的特征，如总投影面积(这可以与根总体积有关)、超过一定粗度阈值的根的平均直径以及长度(粗根长度，或粗根的长度)。根生物量的增加表达为根总生物量(测量为植物生命周期中观察到的最大根生物量)的增加；或者表达为根/冠比(root/shoot index)(测量为根和枝条活跃生长期中根质量与枝条质量的比率)的增加。
10.3.2种子相关参数的测量
收获成熟的一级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子的数量。通过称量从植物收获的所有饱满谷壳来测量种子总产率。通过计数从植物收获的谷壳的数量测量每株植物的种子总数量。从计数的饱满种子数量和它们的总重推断得出千粒重(TKW)。收获指数(HI)在本发明中定义为种子总产率和地上面积(mm2)之间的比值，再乘以因子106。每个圆锥花序的花朵总数量在本发明中定义为种子总数量与成熟的一级圆锥花序的数量之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数量占种子(或小花)总数量的比例(表达为％)。
实施例11：在养分可利用度减小条件下生长的、表达I类HDZip hox5核酸序列的转基因稻植物的结果
在养分可利用度减小的胁迫条件下生长的、表达用于实施本发明方法的核酸序列的转基因稻植物的评估结果示于表F。显示了转基因植物与相应无效合子之间的差异百分比。
表F：在养分可利用度减小的条件下生长的、
表达用于实施本发明方法的核酸序列的转基因稻植物的评估结果
  性状   T1代差异百分比
  每株植物的种子总产率   20
  饱满种子数量   19
  种子饱满率   4
  每个圆锥花序的花朵数量   9
  收获指数   12
  开花前的绿度指数   11
实施例12：以用于本发明方法的序列转化玉米、小麦、大豆、芸苔、苜蓿、棉花
玉米转化
用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良方案进行玉米(玉蜀黍)的转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，只有特定的基因型才适于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学(University ofMinnesota))或以A188为亲本的杂种是转化供体材料的优秀来源，但是也可以成功使用其它基因型。大约授粉后11天(DAP)，当未成熟胚的长度是约1至1.2mm时，从玉米植物中收获穗。对未成熟胚与含表达载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行共培养，并通过器官发生回收转基因植物。切下的胚在愈伤组织诱导培养基、然后在含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的玉米再生培养基上生长。培养板于25℃在光照下孵育2-3周，或直到发育出芽。从每个胚中将绿芽转移到玉米生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
小麦转化
通过Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50所述的方法进行小麦的转化。转化常用栽培种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT公司获得)。对未成熟胚和含表达载体的根癌农杆菌进行共培养，并通过器官发生回收转基因植株。胚与农杆菌孵育后，在体外在愈伤组织诱导培养基、然后在含有选择试剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的再生培养基上培养。培养板于25℃在光照下孵育2-3周，或直到发育出芽。从每个胚中将绿芽转移到生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
大豆转化
根据在德克萨斯农工大学(Texas A&M)专利US 5,164,310中所述方法的改良方案转化大豆。若干商业大豆品种可以通过该方法转化。栽培种Jack(得自伊利诺斯种子公司(the Illinois Seed foundation))通常用于转化。对大豆种子进行消毒以用于体外播种。从七天龄幼苗切下下胚轴、胚根和一个子叶。进一步培养上胚轴和剩下的子叶以发育腋结。切下这些腋结并与含有表达载体的根癌农杆菌一起孵育。在共培养处理后，洗涤外植体并转移到选择培养基中。切下再生的芽并置于芽伸长培养基中。将长度不超过1cm的芽置于生根培养基中直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
油菜籽/芸苔转化
利用5-6天龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为外植体进行组织培养，并根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。商业栽培种(加拿大农业(Agriculture Canada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对芸苔种子进行表面消毒用于体外播种。从体外幼苗中切下附着有子叶的子叶柄外植体，并通过将子叶柄外植体的切割端浸入细菌悬液中来接种农杆菌(含有表达载体)。然后将外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物凝胶(Phytagar)的MSBAP-3培养基中于23℃、16小时光照培养2天。与农杆菌共培养2天后，将子叶柄外植体转移到含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基中培养7天，然后在具有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时，将其切下并转移到芽伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)中。将约2cm长的芽转移到生根培养基(MS0)中进行根诱导。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
苜蓿转化
利用(McKersie等1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(紫花苜蓿)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生的植株。获得再生植株的方法已有描述。例如，这些可以选自栽培种Rangelander(加拿大农业)或任何其它的如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)所述的商业苜蓿品种。可选地，选择RA3品种(威斯康辛大学(University of Wisconsin))进行组织培养(Walker等人，1978Am J Bot 65：654-659)。将子叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等人，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物进行共培养。外植体在含有288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在黑暗中共培养3天。将外植体在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤，并种在相同的SH诱导培养基板上，该培养基不含有乙酰丁香酮但含有适宜的选择剂和适宜的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，将体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素、含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。随后使体细胞胚在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植到盆中并在温室中生长。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
棉花转化
利用根癌农杆菌对下胚轴外植体进行棉花(陆地棉)转化。商业栽培种如Coker 130或Coker 312(SeedCo，Lubbock，TX)是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。种子表面消毒，并在黑暗中萌发。从长约1-1.5厘米的萌发的幼苗切下下胚轴。将下胚轴外植体在含表达载体的根癌农杆菌接种液中浸没5分钟，然后在MS+1.8mg/lKNO3+2％葡萄糖上于24℃在黑暗中共培养大约48小时。将外植体转移到含有适当细菌和植物可选择标记的相同培养基上(更新数次)，直至观察到胚胎发生愈伤组织。分离愈伤组织并传代培养，直至出现体细胞胚。使源于体细胞胚的小植株在生根培养基上成熟，直至发育出根。将生根的芽移植到温室的花盆土中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。

Claims (18)

1.相对于相应的野生型植物增加在养分可利用度减小条件下生长的植物产率的方法，包括在植物中调节编码I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达，和任选地选择具有增加的产率的植物，其中所述I类HDZip hox5多肽或其同源物从N-末端到C-末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。
2.根据权利要求1的方法，其中所述I类HDZip hox5多肽或其同源物还包含如下之一或两者兼而有之：(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，而F为Phe，且在此基序中允许于任何位置上的一个或多个保守改变，和/或于任何位置上的一个或两个非保守改变。
3.根据权利要求1的方法，其中所述核酸序列为I类HDZip hox5核酸序列的部分，所述部分编码从N-末端到C-末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链的多肽。
4.根据权利要求1的方法，其中所述核酸序列为能够与I类HDZiphox5核酸序列杂交的序列，所述杂交序列编码从N-末端到C-末端包含：(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链的多肽。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述I类HDZip hox5核酸序列是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选来自水稻。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述核酸序列编码I类HDZip hox5多肽SEQ ID NO：2或表A所列任一多肽序列的直系同源物或旁系同源物。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中所述调节表达是在植物中增加编码I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物的核酸序列的表达。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中通过引入遗传修饰，优选通过在植物中引入和表达编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列，来调节所述表达。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中所述I类HDZip hox5核酸序列有效连接于组成型启动子。
10.根据权利要求9的方法，其中所述组成型启动子为GOS2启动子，更优选组成型启动子为稻GOS2启动子，还优选组成型启动子为基本上类似于SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：52的核酸序列，最优选组成型启动子如SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：52所示。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述增加的产率是如下一种或多种：增加的每株植物的种子总产率、增加的饱满种子数量、增加的种子饱满率、增加的每个圆锥花序的花朵数量或增加的收获指数。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中所述养分可利用度减小是氮可利用度减小。
13.相对于相应的野生型植物增加在养分可利用度减小条件下生长的植物的绿度指数的方法，所述方法包括在植物中引入和表达编码I类HDZip hox5多肽或其同源物的核酸序列。
14.如下构建体在根据权利要求1至13中任一项的方法中的用途，所述构建体包含：
(i)I类HDZip hox5核酸序列，
(ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的一个或多个控制序列，和任选的
(iii)转录终止序列。
15.产生相对于相应的野生型植物在养分可利用度减小条件下具有增加的产率的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物、植物部分或植物细胞中引入和表达I类HDZip hox5核酸序列；
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
16.根据权利要求15的方法，其中所述增加的产率是如下一种或多种：增加的每株植物的种子总产率、增加的饱满种子数量、增加的种子饱满率、增加的每个圆锥花序的花朵数量或增加的收获指数。
17.I类HDZip hox5基因/核酸序列、或I类HDZip hox5多肽或其同源物在相对于相应的野生型植物增加在养分可利用度减小条件下生长的植物的产率中的用途。
18.根据权利要求17的用途，其中所述增加的产率是如下一种或多种：增加的每株植物的种子总产率、增加的饱满种子数量、增加的种子饱满率、增加的每个圆锥花序的花朵数量或增加的收获指数。
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