CN105177022B - 一种药用野生稻基因OobZIP1及其表达载体和构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种药用野生稻基因OobZIP1及其表达载体和构建方法，具体地，该药用野生稻基因OobZIP1的序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。该野生稻基因OobZIP1具有完整CDS区，且上调基因表达显著，它们属于bZIP家庭的G亚族；该OobZIP1具有转录激活活性；该OobZIP1获得的转基因植株中OobZIP1表达量显著增高，具有抗盐和抗旱的抗逆性。

Description

一种药用野生稻基因OobZIP1及其表达载体和构建方法

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域，具体涉及一种药用野生稻基因OobZIP1及其表达载体和构建方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的第一大粮食作物。非生物胁迫如干旱等会严重影响水稻的生长发育及产量。

在稻属(Oryza)中，仅有亚洲栽培稻(O.sativa L.)和非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud)2个为栽培种，其余20余种均为野生稻，由于长期在野生状态下生长，经过抵御病虫害的侵袭和不良环境的自然选择，野生稻蕴含了大量的优良基因，是一个天然的基因宝库(鄂志国等，遗传，2008(11):1397-1405.，2008)。但因其与栽培稻(AA染色体组)之间存在严重的生殖障碍，其有利性状目前未得以高效利用。

bZIP(Basic Leucin zipper)转录因子即碱性亮氨酸拉链蛋白，它广泛存在于动物、植物、微生物当中，是一类结构较为保守的转录调控因子。目前，水稻bZIP转录因子家族成员中，有OoABI5(Zou et al.,2008)、OsbZIP23(Xiang et al.,2008)、OsbZIP72(Lu etal.,2009)、OoABF1(Hossain et al.,2010)、OoABF2(Hossain et al.,2010)、OsbZIP60(喻旭等，2011)、OsbZIP46(Tang et al.,2012)、OsbZIP39(Takahashi et al.,2012)、OsbZIP52(Liu et al.,2012)、OsbZIP58(Wang et al.,2013)、OsbZIP71(Liu et al.,2014)等被成功克隆，且对干旱、高盐、高温、低温以及其他生物胁迫表现出良好的抗性。因此，针对药用野生稻中bZIP转录因子家族基因的研究，以及将有利性状的基因介导入栽培稻，对获得具有优良性状的栽培稻植株具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与栽培稻具有较高同源性、能有效提高抗逆性的药用野生稻基因OobZIP1。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种药用野生稻基因OobZIP1，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

作为优选，上述药用野生稻基因OobZIP1，通过以下步骤制得：

1)提取药用野生稻RNA；

2)合成cDNA第一链；

3)PCR扩增：以cDNA第一链为模板，采用如SEQ ID No.2所示的上游引物以及如SEQID No.3所示的下游引物，进行PCR扩增，获得目的基因条带，电泳切胶回收。

作为优选，上述药用野生稻基因OobZIP1，所述步骤3)中，采用50μL反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mM MgSO₄ 3μL；上游引物(10μM)1.5μL，下游引物(10μM)1.5μL；模板5μL；KOD-Plus-Neo(1U·μL-1)1μL；ddH₂O 28μL；其中所述模板为cDNA第一链；

PCR反应程序为：94℃预变性2min；循环(98℃，10sec；68℃，1min)40次；最后72℃延伸5min。

本发明的目的之二在于提供上述药用野生稻基因OobZIP1的表达载体的构建方法，包括以下步骤：

a)PCR扩增：以该基因的重组质粒为模板，采用如SEQ ID No.4的上游引物以及如SEQ ID No.5所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；

b)双酶切：用Sac I和Not I对步骤a)得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回收后得到酶切基因片段；

c)连接：用Sac I和Not I对质粒pet32a(+)进行双酶切，切胶回收后，与步骤b)得到的酶切基因片段进行连接，得到重组原核表达载体pet32a-OobZIP1。

本发明的目的之三在于提供上述的药用野生稻基因OobZIP1的另一表达载体的构建方法，所述表达载体为超表达载体，包括以下步骤：

a)PCR扩增：以该基因的重组质粒为模板，以如SEQ ID No.6所示的上游引物和如SEQ ID No.7所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；

b)双酶切：用Sma I和Xba I对步骤b)得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回收后得到酶切基因片段；

c)连接：用Sma I和Xba I对质粒pCAMBIA1301进行双酶切，切胶回收后，与步骤b)得到的酶切基因片段进行连接，得到表达载体pCAMBIA1301-OobZIP1。

本发明的目的之四在于提供一种氨基酸序列，该氨基酸由上述的药用野生稻基因OobZIP1编码，所述氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。

本发明的目的之五在于提供上述的药用野生稻基因OobZIP1在增强水稻抗逆性中的应用。

本发明的目的之六在于提供上一种转基因植株的制备方法，由上述表述载体转化农杆菌感受态细胞，并介导入成熟愈伤组织培养得转基因植株。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明同时提供了一种药用野生稻基因OobZIP1，是通过药用野生稻RNA扩增而得；经同源性基因比对，该药用野生稻基因OobZIP1具有完整CDS区，且上调基因表达显著，进化树分析表明，它们属于bZIP家庭的G亚族；

2.本发明提供的药用野生稻基因OobZIP1，经转化重组质粒pGBKT7-OobZIP1的酵母菌株，在单缺(SD/-Trp)和三缺(SD/-Trp/-His/-Ade)培养基上均能正常生长且在β-半乳糖苷酶显色反应中均显示蓝色，而转化空载体pGBKT7的酵母菌株只能在单缺(SD/-Trp)培养基上生长且β-半乳糖苷酶显色反应中不显色，说明OobZIP1激活了下游报告基因Trp、His、Ade和LacZ的表达，具有转录激活活性；

3.采用pCAMBIA1301载体构建表达载体，通过根癌农杆菌介导法将其导入水稻品种日本晴，并获得转基因植株，经qRT-PCR验证，T1转基因植株中OobZIP1表达量显著增高；该转基因植株在高盐和20％PEG6000胁迫下均比日本晴长势好，说明OobZIP1提高转基因植株的抗逆性。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为OobZIP1分别在四叶期和抽穗期药用野生稻中的表达模式，其中，其中a为四叶期，b为抽穗期；

图2为OobZIP1与栽培稻同源基因氨基酸序列比对情况；

图3为重组原核表达载体PCR检测图，其中M泳道为marker，1泳道为重组原核表达载体pet-32a-OobZIP1；

图4为重组原核表达载体酶切图，其中M泳道为marker，1泳道为酶切后重组原核表达载体pet-32a-OobZIP1；2泳道为未酶切重组原核表达载体pet-32a-OobZIP1；

图5为重组超表达载体PCR检测图，其中M泳道为marker，1泳道为阴性对照，2-14泳道为重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP1的克隆；

图6为重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP1双酶切图，其中M泳道为marker，1泳道为酶切后重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP1；2泳道为未酶切重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP1；3泳道为OobZIP1目的基因CDS；

图7为转OobZIP1基因酵母菌株生长情况及β-半乳糖苷酶活性显色反应；其中，a为SD/-Trp培养基，b为SD/-Trp/-His/-Ade培养基，c为β-半乳糖苷酶活性滤纸显色反应；培养基试验分区如右下方所示；

图8为转OobZIP1基因组织培养过程图；其中，a为诱导继代的愈伤组织；b为选择情况；c为分化情况；d为转基因苗炼苗情况；

图9为转基因植株PCR鉴定情况，其中，M泳道为marker；1-10泳道为转OobZIP1基因植株鉴定；

图10为OobZIP1在日本晴和转基因苗中的表达量；其中，NIP1表示转化受体日本腈中OobZIP1同源基因的表达量，b1-71表示转OobZIP1基因的转基因苗中目的基因的表达量；

图11为转基因植株耐盐性鉴定(高盐胁迫下生长情况)，其中，a、b、c分别为转基因植株处理前、处理3d、恢复3d生长情况；各小图中，左边为对照植株日本晴，右边为转基因植株；

图12为转基因植株抗旱性鉴定(20％PEG6000条件下生长情况)，其中，a、b、c分别为处理前、处理25d、恢复7d生长情况；各小图中，图左边为对照植株日本晴，右边为转基因植株；

图13为药用野生稻基因bZIP家族结构域结构；

图14为bZIP家族基因在药用野生稻和拟南芥中的系统进化树，其中，编号comp119604.c0为药用野生稻基因OobZIP1。

具体实施方式

以下具体实施方式中，如未特殊说明，所使用菌株、质粒、试剂或仪器均为市售；所述仪器的按基因试验要求进行前处理；以下实施方式中各步骤，如未特殊说明，均为本领域常规操作。

一种药用野生稻基因OobZIP1，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

该基因编码的氨基酸如SEQ ID No.16所示：

SEQ ID No.16：

MAYDEAVATQ KTGKTASPPK DQPTPCPFPD WSAVQAYYGS GVLPPTYFAP AIAPGHAPPP 60

YMWGPQPIMP PPFGTPYAAM YPHGGAYPHP LMPMMANPLS MEPAKSASSK EKGSNKKLKE 120

VDGAAVSTGS GDSKKTMTSS GDYSAEGSSD VNDLKVGKTG RKRRLDDGAG AETSAAAKME 180

NALAPSQILG STAVLPNHSF PAQVIRPSAT NSRALGTPMS PPPGVIVPSH TGVSSELLIK 240

DERELKREKR KQSNRESARR SRLRKQAETE DLATRVESLT AENTSLRSEI SRLSESSEKL 300

RLENSALMGK LEDPAASTQA ETSLQKTTTA SSPRVVENFL SMIDSTNKTS VRHTEHAEPK 360

LRQLLGSSPA TDVVAAS 377

该基因的bZIP转录因子家族的保守结构域氨基酸序列位于245-304位。将OobZIP1编码的氨基酸序列和栽培稻中同源基因编码的氨基酸进行序列比对，结果如图2所示，发现OobZIP1与栽培稻同源基因Os05g0569300有17个氨基酸差异。OobZIP1与其同源基因的差异大部分位于非保守序列区域，在保守区域仅有278位的氨基酸R与同源基因不同，说明OobZIP1与栽培稻同源基因有相似的结构和功能。

实施例1：药用野生稻基因OobZIP1目的基因的制备

一种药用野生稻基因OobZIP1，通过以下步骤制得：

1)提取药用野生稻RNA；

2)合成cDNA第一链：采用ZeroBack Fast Ligation Kit试剂盒合成cDNA第一链；

3)PCR扩增：以cDNA第一链为模板，采用如SEQ ID No.2所示的上游引物以及如SEQID No.3所示的下游引物，进行PCR扩增，获得目的基因条带，电泳切胶回收；

其中，PCR扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mMdNTPs 5μL；25mM MgSO₄ 3μL；上游引物(10μM)1.5μL，下游引物(10μM)1.5μL；模板5μL；KOD-Plus-Neo(1U·μL-1)1μL；Autoclaved，distilled water 28μL；其中所述Template cDNA为cDNA第一链稀释10倍；

PCR反应程序为：95℃预变性15min后，按照95℃，20sec；60℃，32sec荧光信号采集，进行40个循环扩增；融解曲线反应程序：由60℃递进升温到95℃步进0.5℃，恒温10sec。

由本实施例得到的目的基因条带，将其与pZeroBack载体按0.5-15：1的摩尔比进行连接，得到目的基因重组质粒。将重组质粒转化为大肠杆菌感受态，用如SEQ ID No.8所示的上游引物和如SEQ ID No.9所示的下游引物对大肠杆菌感受态重组质粒进行PCR检测，将检测到的阳性菌液送生工生物工和公司进行测序鉴定，其序列如SEQ ID No.10所示，SEQID No.10包括OobZIP1CDS区域和CDS区域前200bp左右和CDS区域前后400bp左右。

本实施例中，取四叶期药用野生稻叶、鞘、根和抽穗期药用野生稻叶、鞘、穗、茎部位提取RNA，反转录合成cDNA第一链，稀释10倍后，取5μL为模板，以Actin基因为内参基因进行PCR，如图1所示，基因OobZIP1在四叶期和抽穗期，叶片中表达量最高；在四叶期，其表达量由多至少依次为叶、根、鞘；在抽穗期，其表达量由多至少依次为叶、鞘、茎和穗。综上所述，OobZIP1不具备组织特异性表达，在各个组织中均有表达，但在叶片和根中表达量较高，这与叶片和根在抗逆情况下行使的功能有关。

实施例2：药用野生稻基因OobZIP1原核表达载体的构建

一种药用野生稻基因OobZIP1原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：

a)PCR扩增：以实施例1得到的目的基因重组质粒为模板，采用如SEQ IDNo.4的上游引物以及如SEQ ID No.5所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；

SEQ ID No.4：CGAGCTCATGGCTTATGATGAAGCTGT；

SEQ ID No.5：ATTTGCGGCCGCGCTTGCAGCGACAACATCAGTG；

b)双酶切：用Sac I和Not I对步骤a)得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回收后得到酶切基因片段；

c)连接：用Sac I和Not I对质粒pet32a(+)进行双酶切，切胶回收后，与步骤b)得到的酶切基因片段用T4连接酶进行连接，得到重组原核表达载体pet32a-OobZIP1。

本实施例中，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃，90sec；58℃，90sec；72℃，90sec)；72℃延伸10min。酶切体系为50μL：10×QuickCut Buffer 5μL；Not I、Sac I各1μL；≤1μg的质粒；加灭菌水至50μL。置于37℃，4h后进行凝胶电泳检测。

本实施例中，将重组原核表达载体pet32a-OobZIP1转化大肠杆菌DH5DH5α，涂布于加有Amp+的LB培养基中，12-16h后挑取克隆扩大培养，提取质粒进行PCR、酶切及测序验证；

其中PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃，90sec；58℃，90sec；72℃，90sec)；72℃延伸10min。

酶切体系为50μL：10×QuickCut Buffer 5μL；Not I、Sac I各1μL；≤1μg的质粒；加灭菌水至50μL。置于37℃，4h后进行凝胶电泳检测。重组原核表达载体PCR检测图如图3所示，重组原核表达载体酶切图如图4所示，表明OobZIP1已与载体连接。

实施例3：药用野生稻基因OobZIP1超表达载体的构建

一种药用野生稻基因OobZIP1表达载体的构建方法，包括以下步骤：

a)PCR扩增：以实施例1得到的目的基因重组质粒为模板，采用带有Sma I、Xba I酶切位点的如SEQ ID No.6的上游引物以及如SEQ ID No.7所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；

SEQ ID No.6：TCCCCCGGGATGGCTTATGATGAAGCTGTTGCTA；

SEQ ID No.7：GCTCTAGATTAGCTTGCAGCGACAACATCAGTG；

b)双酶切：用Sma I和Xba I对步骤a)得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回收后得到酶切基因片段；

c)连接：用Sma I和Xba I对质粒pCAMBIA1301进行双酶切，切胶回收后，与步骤b)得到的酶切基因片段用T4连接酶进行连接，得到重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP1。

本实施例中，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃，90sec；58℃，90sec；72℃，90sec)；72℃延伸10min。

酶切体系为50μL：10×QuickCut Buffer 5μL；Sma I、Xba I各1μL；≤1μg的质粒；加灭菌水至50μL。置于37℃，4h后进行凝胶电泳检测。

将本实施例4得到的重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP1热击转化大肠杆菌DH5α，分别随机挑取阳性克隆，扩大培养后抽提质粒，并对质粒进行酶切、PCR特异性扩增及测序鉴定，以确保载体上插入目的基因。重组质粒酶切及PCR扩增电泳图如图5、6所示，其中均有目的基因片段大小条带，表明载体上已插入目的基因，将酶切及PCR鉴定有目的条带的克隆送样测序，分析测序结果表明目的基因与载体连接正确，OobZIP1没有发生移码。

实施例4：表达载体pCAMBIA1301-OobZIP1的介导

本实施例提供重组超表述载体pCAMBIA1301-OobZIP1转化农杆菌感受态细胞，并介导入成熟愈伤组织培养获得转基因植株的方法，本实施例中，所使用的水稻品种为日本晴。

表达载体pCAMBIA1301-OobZIP1在水稻上的表达方法，包括以下步骤：

1)农杆菌感受态的转化

在无菌环境下，挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于2mL YEP(Str+，Chl+)培养液中，28℃，250rpm振荡培养过夜。将菌液转移至200mL YEP(Str+，Chl+)培养液中，在28℃，250rpm条件下暗培养至OD600＝0.3。将菌液转入50mL无菌离心管，4℃，5000rpm离心10min，弃上清，用20mL预冷的1mM HEPES(pH＝7.0)重悬，重复3次，弃上清。用2mL预冷的10％甘油重悬，用1.5mL无菌离心管分装，每管分装40μL待用，或-70℃保存。

取2μL表达载体pCAMBIA1301-OobZIP1(质粒浓度大于50ng·μL^-1)加入到盛有80μL农杆菌EHA105感受态细胞的离心管中，用移液器小心打匀。将混合液移至电击杯中，2500伏特高压下电击1-2次，加入800μL YEP(不含抗生素)液体培养基，混匀后移回原离心管，28℃，250rpm条件下暗培养7-8h，激进行活。培养检测得到阳性菌液。

2)水稻愈伤组织的培养

挑选饱满无菌斑且胚完好的水稻成熟种子除去谷壳，作为诱导材料；诱导材料消毒，接种消毒后的种子，用微孔透气型医用胶带封好培养皿，28℃条件下暗培养约2周后，挑取自然分裂的淡黄色和、致密球状的胚性愈伤组织，继代培养一次；

3)挑取转化成功的农杆菌单克隆，加入约5mL YEP(Kan+，Chl+)液体培养基，28℃，250rpm条件下培养20-36h至菌液OD₆₀₀为0.8-1.0；

4)挑取继代培养基中自然分裂的愈伤组织，放入步骤3)的农杆菌菌液28℃暗条件下共培养2-3d；

5)晾干后的愈伤组织置于28℃光照选择培养2周，进行第一次选择；后再经28℃光照培养2周，进行第二次选择，得到抗性愈伤组织；

6)抗性愈伤组织的分化、生根，得到转化苗；

7)转化苗炼苗7d后移栽至大田，得到转基因植株。

检测实施例

1.OobZIP1的转录活性鉴定

a)以实施例1得到的目的基因重组质粒为模板，以带有Nco I、Sma I酶切位点的如SEQ ID No.11所示的上游引物和以如SEQ ID No.12所示的下游引物，分别扩增，切胶回收，经Nco I、Sma I双酶切后，纯化得到目的片段；

b)用Nco I、Sma I双酶切质粒pGBKT7并纯化，得到酶切质粒；

c)连接目的片段和酶切质粒，构建成重组载体pGBKT7-OobZIP1；

d)将重组载体pGBKT7-OobZIP1转化大肠杆菌感受态，培养过夜得到阳性菌液；

e)从步骤d)的阳性菌液中，提取出重组质粒；

f)PCR反应：对步骤e)的重组质粒进行双酶切，

其中，PCR反应程序为94℃预变性5min；35个循环(94℃，90sec；58℃，90sec；72℃，90sec)；72℃延伸10min；

酶切体系为50μL：10×QuickCut Buffer 5μL；Nco I、Sma I各1μL；≤1μg的质粒；加灭菌水至50μL。

酶切产物用于琼脂糖凝胶电泳，检测有目的片段插入的质粒送生工生物公司测序。

g)利用Clontech公司的Yeastmaker Yeast Transformation System 2(Cat.No.630439)试剂盒，进行重组质粒进行转化酵母感受态并分别置于SD培养基、SD/-Trp培养基和SD/-Trp/-His/-Ade培养基，得到菌落；其中，重组质粒在SD/-Trp培养基和SD/-Trp/-His/-Ade培养基上的生长情况见图7中a和b；

h)对步骤g)的菌落进行β-半乳糖苷酶滤纸显色反应试验，观察显色情况，见图7中c和d。

pGBKT7转空载体质粒和重组质粒pGBKT7-OobZIP1转化酵母感受态细胞，经30℃培养3-5d后发现，如图7中a所示，转化pGBKT7-OobZIP1重组质粒和pGBKT7空载体的酵母菌在SD/-Trp的单缺培养基上均能生长，表明pGBKT7载体上的Trp基因已表达，各质粒已成功转入酵母菌中；如图7中b所示，在三缺培养基(SD/-Trp/-His/-Ade)中，转空载体酵母菌不能生长，转pGBKT7-OobZIP1重组质粒的酵母菌能正常生长，说明重组质粒酵母菌中pGBKT7载体上的His、Ade基因也被激活。在β-半乳糖苷酶活性滤纸显色反应中，转空载体酵母菌株不显色，转化重组质粒的酵母菌株变成蓝色，说明重组质粒中pGBKT7载体上的LacZ基因已表达。综上所述，OobZIP1具有转录激活。

2.转基因植株鉴定

实施例4中，农杆菌侵染水稻成熟胚愈伤组织后，经过共培养、筛选、预分化、分化、生根培养和炼苗后，得到转基因OobZIP1植株85株，如图8所示。

图8中a为诱导继代的愈伤组织；b为选择培养情况；c为分化情况；d为转基因苗炼苗情况。

待转基因植株长至3-4叶期，剪取少量叶片，提取DNA进行PCR鉴定，其结果如图9所示，在10个植株中，阳性株系占90％，说明OobZIP1的转化成功率高。

3.转基因植株目的基因表达量

挑选受试日本晴和转基因阳性株系，以反转录后稀释10倍的cDNA为模板，以Actin为内参基因，以SEQ ID No.13为上游引物，以SEQ ID No.14为下游引物，利用实时荧光定量PCR检测转化受体日本晴和转基因苗中目的基因的表达量；其表达量如图10所示，左边为受试日本晴中NIP的表达量，右边为转基因阳性株系中NIP的表达量，可见，转基因植株中，OobZIP1表达量有显著增加，远远高于其同源基因在日本晴中的表达。

4.T₁转基因植株耐盐性鉴定

利用实施例4得到的转基因植株育种得到转基因种子，挑取正常发芽且芽长基本一致的转基因种子，于PCR板中于温室(26℃，16/8h光暗培养)中培养至三叶一心期后，将其置于200mM NaCl中培养，3d后观察其生长情况。

如图11所示，a、b、c分别为植株处理前、处理3d、恢复3d生长情况；其中每张图的左边为日本晴植株，右边为转基因植株；可见，日本晴叶子基本全部萎蔫，转基因株系仍有较大的绿叶率，用水清洗根部后恢复培养于营养液中，再观察其恢复生长情况，日本晴基本全部萎蔫枯黄，转基因株系中仍有新叶长出；说明相比日本晴，转基因植株具有较强的抗高盐性。

5.T₁转基因植株抗旱性鉴定

利用实施例4得到的转基因植株育种得到转基因种子，挑取正常发芽且芽长基本一致的种子，于PCR板中于温室(26℃，16/8h光暗培养)中培养至三叶一心期后，将其置于20％PEG6000中培养，25d后观察其生长情况。

如图12所示，a、b、c分别为植株处理前，处理25d，恢复7d生长情况；其中每张图的左边为日本晴植株，右边为转基因植株；可见，日本晴叶子萎蔫情况严重，老叶全部枯黄，转基因株系大部分老叶枯黄，但仍有部分叶片未萎蔫，恢复处理7d后，转基因植株有新叶长出，且长势良好，对照日本晴仅有少量新叶，且植株矮小，说明，转基因株系对20％PEG6000模拟干旱处理有较好的抗性且在逆境后恢复性好。

基因分析

1.野生稻基因bZIP1转录因子基因分析

本发明中，所述药用野生稻基因OobZIP1的筛选过程包括以下步骤：

1)利用通过四叶期药用野生稻20％PEG6000处理得到的bZIP转录因子家族CDS序列进行本地Blast；

2)药用野生稻转录谱测序bZIP转录因子家族基因结构域分析；

3)药用野生稻转录谱测序bZIP转录因子家族基因进化树构建；

构建进化树具体参数设置为：邻接法NJ(Neighbor-Joining)模型，模式采用Poission correction，缺口设置为Pairwise Deletion，Bootstrap值为1000；

4)差异基因筛选

DEG-seq利用标准化的log2(fold change)和q-value来进行筛选，差异基因筛选条件为q-value<0.005且|log2(fold change)|>1。

具体操作方法如下：

1)药用野生稻转录组测序数据本地BLAST

从NCBI下载ncbi-blast-2.2.29+-ia32-win32.tar.gz，解压到D盘，并将文件夹更名为blast，双击win32-ia32.exe安装程序，产生两个文件夹：bin和doc。将药用野生稻转录组测序所得到的四个数据库，包括unigene.fasta(拼接后的转录本)、unigene.blast.cds.fasta(通过blast比对得到的CDS)、unigene.estscan.cds.fasta(通过estscan预测得到的CDS)、unigene.blast.pep.fasta(通过blast比对得到的CDS编码的氨基酸)、unigene.estscan.pep.fasta(通过estscan预测得到的CDS编码的氨基酸)，将其拷贝到bin文件夹中，运行命令将数据库进行格式化(转化成二进制数据)，完成数据库的构建。利用栽培稻bZIP转录因子家族CDS序列进行本地Blast。数据库的构建用于查找与抗旱相关的药用野生稻转录因子家族的组成成员。

2)药用野生稻转录谱测序bZIP转录因子家族基因结构域分析

将拼接得到药用野生稻转录本的unigenes通过hmmscan搜索PFAM(http://pfam.xfam.org/search)，给出unigenes的功能域及蛋白家族注释信息，从中得到具有bZIP结构域的unigenes，选择编码蛋白质序列具备完整的bZIP保守结构域的基因用于进一步分析。

如图13所示，完整bZIP家族结构域的有83个，将有完整bZIP家族结构域的83个基因导入MEME(Machanick et al.,2011)中，结果其motif与bZIP的保守结构域相似。

3)药用野生稻转录谱测序bZIP转录因子家族基因进化树构建

将注释成功的bZIP氨基酸序列在蛋白质数据库PFAM(http://pfam.xfam.org/search)网站上，利用Search功能筛选出具有完整bZIP结构域的unigenes。多重序列比对采用ClustalX2.0(Larkin et al.,2007)，参数默认。用MEGA5.0(Tamura et al.,2011)，构建进化树具体参数设置为：邻接法NJ(Neighbor-Joining)模型，模式采用Poissioncorrection，缺口设置为Pairwise Deletion，Bootstrap值为1000。

其进化树如图14所示，转录谱中bZIP家族差异表达基因OobZip1(图中comp119604.c0)属于bZIP家族中的G亚族，说明这个基因与拟南芥转录因子家族G亚族的基因具有相似的功能。

4)差异基因筛选

转录谱测序中，基因差异表达的输入数据为基因表达水平分析中得到的readcount数据，先采用TMM对Read count数据进行标准化处理，之后用DEG-seq进行差异分析。DEG-seq利用标准化的log2(fold change)和q-value(用2003年Storey方法校正后的p-value来进行筛选，差异基因筛选条件为q-value<0.005且|log2(fold change)|>1。

2.基因组序列分析

用CTAB法提取药用野生稻基因组DNA，对基因组DNA进行PCR扩增连接pZeroBack载体并测序，测序结果如序列表SEQ ID No.15所示，OobZIP1基因组DNA全长3939bp。由SEQ IDNo.15与SEQ ID No.1的比较可知，OobZIP1基因组包含了OobZIP1目的基因片段的所有外显子和内含子。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种药用野生稻基因OobZIP1，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的药用野生稻基因OobZIP1的表达载体的构建方法，包括以下步骤：

a）PCR扩增：以该基因的重组质粒为模板，采用如SEQ ID No.4的上游引物以及如SEQID No.5所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；

b）双酶切：用Sac I和Not I对步骤a）得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回收后得到酶切基因片段；

c）连接：用Sac I和Not I对质粒pet32a(+)进行双酶切，切胶回收后，与步骤b）得到的酶切基因片段进行连接，得到重组原核表达载体pet32a-OobZIP1。

3.如权利要求2所述的表达载体。

4.如权利要求1所述的药用野生稻基因OobZIP1的表达载体的构建方法，所述表达载体为超表达载体，包括以下步骤：

a）PCR扩增：以该基因的重组质粒为模板，以如SEQ ID No.6所示的上游引物和如SEQID No.7所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；

b）双酶切：用Sma I和Xba I对步骤a）得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回收后得到酶切基因片段；

c）连接：用Sma I和Xba I对质粒pCAMBIA1301进行双酶切，切胶回收后，与步骤b）得到的酶切基因片段进行连接，得到表达载体pCAMBIA1301- OobZIP1。

5.如权利要求4所述的表达载体。

6.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质由权利要求1所述的药用野生稻基因OobZIP1编码，其氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。

7.如权利要求1所述的药用野生稻基因OobZIP1在增强水稻抗逆性中的应用。