CN112390867B

CN112390867B - 蜡梅CpCO-L2基因及其编码的蛋白与应用

Info

Publication number: CN112390867B
Application number: CN202011284281.XA
Authority: CN
Inventors: 李志能; 肖建新; 眭顺照; 李名扬
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112390867A

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及蜡梅CpCO‑L2基因及其编码的蛋白与应用。本发明克隆得到蜡梅CpCO‑L2基因的完整开放阅读框1056bp，ORF框编码351个氨基酸。该基因转化拟南芥野生型后发现，转基因单株的抽葶时间、第一朵花开放时间和第一个果荚形成时间均早于野生型WT，而莲座叶数量少于WT，拟南芥内源开花基因CO、FT、TSF、SOC1、LFY、AP1的表达量均有不同程度的上调。结果表明，蜡梅CpCO‑L2基因可能具有促进植株提前开花的功能。

Description

蜡梅CpCO-L2基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及蜡梅CpCO-L2基因、其编码的蛋白和应用。

背景技术

蜡梅(Chimonanthus praecox)，属于蜡梅科(Calycanthaecae)蜡梅属(Chimonanthus)，是一种落叶灌木或者小乔木。蜡梅在我国具有悠久的栽培历史，其花在霜雪寒天傲然开放，因花黄似蜡而得名；花朵浓香扑鼻、芳香宜人；同时其自然瓶插寿命较长，最长可达3-4周，因此具有较高的观赏价值而深受人们喜爱。

高等植物的开花是其生长发育过程中至关重要的环节，是植物由营养生长向生殖生长转化的关键过程，对植物的遗传和繁殖的能力起决定性作用，对其个体和后代的发育也意义重大。随着遗传学与分子生物学技术的不断发展与完善，从对拟南芥的全基因组序列测定的完成，再到金鱼草中分离克隆得到一系列关于植物开花的基因，逐渐使研究植物成花的分子机理成为热点话题。近年来，逐渐明确植物开花是一个受内部基因条件和外部环境条件的共同影响的复杂过程，对拟南芥成花诱导的分子机理研究表明存在因转录激活因子形成的基因调控网络，其整合了多条开花途径。目前已确定的开花遗传途径有光周期途径(Photoperiod pathway)、自主途径(Autonomous pathway)、抑制途径(Inhibitionpathway)、春化途径(Vernalization pathway)、赤霉素途径(Gibberellins pathway)、温度途径(Ambient pathway)、年龄途径(Age pathway)等。

光周期途径是植物中较为保守且研究较为深入的一种开花机制，CO是光周期途径的关键调控基因，其在长日照下促进开花，短日照下不影响开花。人们研究发现，CO基因不仅参与生物钟的调控，也调控下游开花基因FT的表达。人们在其他物种中分离与克隆出许多CO同源基因，如水稻的Hd1、甜菜的BvCOL1、小麦的TaHd1以及衣藻的CrCO等，这些基因都在植物开花过程中发挥重要作用，且与CO的功能相似。

CO是植物开花光周期途径中的关键基因，其主要是感知光信号与生物钟信号，产生昼夜节律并促进开花。

Samach等利用转融合表达载体35S::CO的拟南芥植株，发现转基因植株的开花时间均较野生型提前，并且FT和SOC1的表达水平明显上调，推测可能是CO接收光信号，并传递给开花基因FT和SOC1，诱导其表达，最终导致开花，证明FT和SOC1是CO的下游基因。Yamaguchi等发现另一基因TSF也受CO的影响，TSF与FT的同源性很高，其功能与FT高度相似，可促进植物开花。研究表明，在番茄中TCOL1能与HAP5结合，则推测CO是通过代替HAP2蛋白或者核因子NF-Y，再与细胞中的CCAAT-boxs相结合，从而诱导FT和TSF的表达。

植物接受光信号的部位是叶片，而在叶片的不同组织、茎端木质部以及顶端分生组织中都检测到了CO基因的表达，因此需研究CO具体在哪个部位发挥作用以诱导开花。拟南芥中，提取CO的cDNA并将其与不同组织的特异性启动子相连接，结果显示，只有与叶片的韧皮部特异启动子AtSUC2和AtrolC连接才能诱导植株提前开花，与其他组织连接的启动子均不影响开花。因为在SUC2::CO的韧皮部中，FT基因的mRNA丰度会快速增加，转录翻译形成的FT蛋白也迅速积累增多，进而提前开花。拟南芥CO家族的各个基因对开花的调控作用存在着较大的差异。过表达CO会使植株提前开花；过表达COL1和COL2均不影响植株开花时间，但COL1能使昼夜节律缩短；过表达COL9则会推迟植株开花，但在长日照下，缺失了COL9的突变体会出现早花现象。在转COL9的植株中过表达CO会使植株的开花提前，表明COL9抑制CO和FT的表达来延迟植株开花。COL3是光形态建成的正向调控因子，且与COP1发生互作。COL3在COP1的下游发挥作用，同时影响侧根的数量和花色苷的积累。COL3突变对侧根数和花色苷的积累与cop1和det1发挥相反的作用，表明COL3不依赖COP1和DET1而独立发挥作用，并调节花芽的分化。COL5与CO类似，受GI的调控，过表达COL5会在短时间内影响开花时间和FT、SOC1的表达，组成型表达COL5会对co突变体的晚花起抑制作用，植株中COL5的缺失不影响其开花。

蜡梅属于观花植物，对于其开花期以及花发育的研究尤为重要。目前，蜡梅开花的分子作用机理的研究相对缺乏，需要进一步对其花发育及开花基因进行研究。

发明内容

本发明的目的是提供蜡梅CpCO-L2基因及其编码的蛋白与应用。

首先，本发明提供蜡梅CpCO-L2蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的蜡梅CpCO-L2蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控花期中的用途。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

本发明还提供一种使植物提前开花的方法，其为将含有所述基因的载体转入所述植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

本发明克隆得到蜡梅1056bp的CpCO-L2基因的完整开放阅读框(Opening ReadFrame)，预测分子式为C₁₆₉₃H₂₆₈₆N₅₀₂O₅₂₈S₂₃。ORF框序列编码351个氨基酸。CpCO-L2蛋白具有2个B-box结构域和1个CCT结构域，且无信号肽序列和跨膜结构，二级结构预测结果显示由34.48％α螺旋(αhelix)、12.25％的延伸链(extended strands)、2.56％β转角(βturn)和52.71％的随机卷曲(random coil)组成。通过同源序列比对发现CpCO-L2蛋白与其他物种的CO蛋白的具有较高的相似性，与玉兰(Magnolia virginiana)MvCO、莲花(Nelumbonucifera)NnCOL2的同源性分别为64.8％和66.1％。通过系统发育进化树分析，表明蜡梅与肉桂(Cinnamomum micranthum f.kanehirae)的COL2亲缘关系较近。

利用荧光定量PCR技术对CpCO-L2基因在全年不同时期以及不同组织的表达情况进行分析，结果显示：该基因在全年都有表达，其在3月8日枝芽中表达量较高且显著高于4、5月花原基分化阶段的花芽，休眠期和子房成熟期呈现先升高后降低的趋势，低温积累阶段逐渐升高，到12月9日达到最高，开花期的表达量显著低于低温积累期；该基因在叶片中的表达量最高，茎和幼果中次之，花瓣中的表达量相对较低。

构建超表达载体pCAMBIA1300-CpCO-L2并用花序侵染法转入野生型拟南芥中，收集侵染后的T₀代种子进行Hyg抗性筛选，通过对转基因T₁代植株的DNA检测以及T₂代转基因纯合体植株的荧光定量PCR检测，最终得到3个转基因株系的7个纯合体单株。选取表达量不同(高、中、低)的3个纯合体单株进行表型观察和内源开花基因的表达量分析。结果显示：转基因单株的抽葶时间、第一朵花开放时间和第一个果荚形成时间均早于野生型WT，而莲座叶数量少于WT，拟南芥内源开花基因CO、FT、TSF、SOC1、LFY、AP1的表达量均有不同程度的上调。结果表明，蜡梅CpCO-L2基因可能具有促进植株提前开花的功能。

附图说明

图1所示为蜡梅CpCO-L2基因ORF框的克隆。M(maker)：DNA分子量标准DL2000；1、2、3：cDNA为模板；CK:阴性对照。

图2所示为CpCO-L2蛋白与同源物种的蛋白序列比对。

图3所示为CpCO-L2基因与其同源基因蛋白的进化树。

图4所示为CpCO-L2基因在不同生长时期的相对表达量。**表示P＜0.01水平上差异显著。

图5所示为CpCO-L2基因在不同组织中的相对表达量。

图6所示为pCAMBIA1300-CpCO-L2的双酶切验证。M:DNA分子量标准DL2000；1:pCAMBIA1300-CpCO-L2质粒双酶切。

图7所示为转基因拟南芥的Hyg抗性筛选。A：转基因拟南芥T₀代筛选；B：转基因拟南芥T₂代纯合体。

图8所示为CpCO-L2转基因拟南芥PCR检测。M：DNA分子量标准DL2000；1～5：抗性株系；WT：野生型。

图9所示为35S::CpCO-L2拟南芥T₂代不同单株CpCO-L2基因的相对表达分析。**表示P＜0.01水平上差异显著。

图10所示为35S::CpCO-L2拟南芥T₂代植株内源开花基因的相对表达量。A～F：依次为拟南芥内源基因AtCO、AtFT、AtTSF、AtSOC1、AtLFY、AtAP1在35S::CpCO-L2拟南芥中的相对表达量。a、b、c表示P＜0.05水平上差异显著。

图11所示为35S::CpCO-L2/拟南芥T₂代植株表型观察。A:抽葶约1cm时的莲座叶数；B：开花时间情况；C：果荚出现情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1蜡梅CpCO-L2基因的克隆与分子序列结构特征分析

将从转录组获得的蜡梅CpCO-L2基因进行序列分析设计特异引物，以蜡梅cDNA第一链为模板，扩增蜡梅CpCO-L2基因，PCR反应体系及反应条件如下：

采用CpCO-L2特异引物进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。选取2号和3号片段进行回收并连接pMD19-T载体，再转化大肠杆菌感受态，再用引物M13-F(10μM)、M13-R(10μM)进行PCR检测，将结果为阳性的菌液进行测序，序列如SEQ IDNo.1所示。

将3号菌液的测序得到的序列用SeqMan翻译为氨基酸(SEQ ID No.2所示)，并用NCBI进行BLAST比对，发现其含有2个B-box结构域和1个CCT结构域。

将蜡梅CpCO-L2蛋白与玉兰、毛白杨、拟南芥、睡莲、棉花、番木瓜等植物的CO以及COL蛋白进行同源比对，结果如图2所示。发现蜡梅COL2蛋白与其他物种的同源性较高，且不同物种的CO类蛋白均具有高度保守的两个B-box结构域和一个CCT结构域。

为研究CpCO-L2在不同物种间的进化关系，将CpCO-L2蛋白序列在NCBI上进行在线blsat，选取不同物种的CO以及COL蛋白序列构建系统进化树，结果如图3所示。发现蜡梅与樟科的肉桂聚在一起且bootstrap值为81％，可信度较高，表明亲缘关系较近。

实施例2蜡梅CpCO-L2基因的表达特性分析

本实验所用的材料为‘素心’腊梅(C.praecox‘Concolor’)，种植在西南大学内，并采用常规管理方式进行管理。采取不同时期、不同组织的的蜡梅材料，提取总RNA并反转成cDNA。

选用蜡梅的Actin与Tublin基因作为蜡梅CpCO-L2基因实时荧光定量的双内参基因，运用Primer Premier 5.0软件设计内参基因和目标基因CpCO-L2的荧光定量特异性引物，再送至北京六合华大基因科技股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1实时荧光定量PCR引物

以反转录获得的蜡梅cDNA第一链为模板，对蜡梅CpCO-L2基因在全年不同时期以及不同组织的表达情况进行实时荧光定量PCR分析。反应体系和反应程序如下：

反应体系：

反应程序：

试验数据通过Bio-Rad Manager^TM Software(Version 1.1)软件进行分析，用2^-△△CT法获得目的基因的相对表达量。

(1)蜡梅CpCO-L2基因在蜡梅不同生长时期的表达特性分析

通过实时荧光定量PCR对蜡梅CpCO-L2基因在全年不同时期的不同组织中的相对表达分析，如图4所示。发现CpCO-L2在全年都有表达，但表达水平参差不齐。在花原基形成阶段，CpCO-L2的表达量呈现由高到低的趋势，其中在3月8日达到最高，且3月显著高于4、5月；在休眠阶段和子房成熟阶段的表达量相对较低，呈现出先升高后降低的趋势；低温休眠阶段逐渐升高，到12月9日达到最高，之后在蜡梅开花期的表达量下降。低温休眠期显著高于开花期。

(2)蜡梅CpCO-L2基因在蜡梅不同组织中的表达特性分析

通过实时荧光定量PCR对蜡梅CpCO-L2基因在蜡梅各组织中的表达特性分析，如图5所示。发现该基因在各个组织中均表达，其中叶片中的表达最高为3.26，茎的表达量次之，为0.53，幼果为0.38，外瓣、中瓣、内瓣依次为0.16、0.06、0.26，雄蕊和雌蕊分别为0.15和0.35。

实施例3蜡梅CpCO-L2基因拟南芥遗传转化及功能分析

根据CpCO-L2的ORF框序列本身含有的限制性酶切位点和分布特点以及植物表达载体pCAMBIA1300所含多克隆位点的特征，选用限制性内切酶SacI和XbaI作为CpCO-L2与表达载体连接的关键酶，利用Primer Premier5.0软件设计带有酶切位点的特异引物，并加入相应的保护碱基，再送北京六合华大基因有限公司进行合成，引物序列如下(下划线部分为保护碱基，方框部分为酶切位点)：

表2基因扩增引物

以蜡梅cDNA为模版并用上述特异引物进行PCR扩增，将扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收长度为1100bp左右的片段，连接到克隆载体pMD19-T上，16℃水浴放置4h，再转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，再用无菌涂棒均匀涂布在含有Amp的LB固体培养基上，37℃恒温培养10-12h，在用无菌牙签挑取单菌落于含有Amp的LB液体培养基中，37℃180rpm摇床培养10-12h，待菌液浑浊后送成都擎科公司进行测序。将测序正确的菌液进行质粒提取，并命名为pT-CpCO-L2。

提取质粒，用SacI和XbaI分别酶切pT-CpCO-L2质粒和植物表达载体pCAMBIA1300质粒，再用琼脂糖凝胶电泳检测并回收CpCO-L2小片段和pCAMBIA1300载体大片段，将回收的两个片段通过T4连接酶连接。将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，并用无菌涂棒涂布在含50mg/L Kan的LB平板上37℃倒置过夜培养，用牙签挑取单克隆进行PCR检测，将电泳检测为阳性的菌液活化后，提取质粒并进行双酶切验证(图6)。将PCR鉴定和双酶切验证均正确的阳性质粒送至成都擎科公司进行测序，确定序列正确并无碱基突变后，将其命名为pCAMBIA1300-CpCO-L2，即为CpCO-L2基因植物超表达重组载体。将pCAMBIA1300-CpCO-L2重组质粒采用电击法转化制备好的农杆菌感受态细胞。通过花序侵染法浸染哥伦比亚型拟南芥。

(1)转基因拟南芥的Hyg抗性筛选

将通过农杆菌花序侵染获得的转基因拟南芥T₀代种子播种在含50mg/L Hyg的MS固体培养基上进行阳性植株筛选，成功转入目的基因的拟南芥能够在抗性培养基上正常生长，而未成功转入的则在子叶期黄化死亡。将筛选出的抗性植株进行移栽，分别收获种子后继续进行抗性筛选，将表现出分离比接近3:1的株系各单株分别移栽收种，并继续进行抗性筛选，最终在T₂代获得3个株系7个纯合体转基因单株。T₀代和T₂代筛选结果如图7所示。

(2)转基因拟南芥PCR阳性检测

分别提取Hyg抗性筛选出的T₀代转基因拟南芥和野生型拟南芥(WT)的叶片DNA，以蜡梅CpCO-L2基因特异引物CpCO-L2-F和CpCO-L2-R进行PCR检测(结果如图8)。1-5抗性株系扩增出的片段大小与目的片段均基本一致，而野生型WT植株没有检测到条带，表明目的基因CpCO-L2已成功插入到拟南芥基因组中。

(3)实时荧光定量PCR检测转基因拟南芥CpCO-L2基因的表达量

为进一步检测分析CpCO-L2在转基因拟南芥中的表达水平，根据上述(1)和(2)中筛选和检测结果，分别提取T₂代纯合体转基因拟南芥和野生型拟南芥的幼苗整株总RNA。以反转录后的cDNA作为模板，拟南芥AtActin基因为内参，野生型拟南芥WT为对照，进行实时荧光定量PCR检测和分析，结果如图9所示。

结果显示，野生型拟南芥WT中几乎没有检测到CpCO-L2基因的表达，在所检测的3个株系7个T₂代纯合体转基因拟南芥单株中，CpCO-L2基因的表达水平各不相同，3号株系表达量最高，其中以OE3-1#单株的表达量最高，5号株系的表达量相对较低且4个单株的表达波动不大，7号株系的表达量最低。据此，选择OE3-1#作为高表达量单株，OE5-11#作为中表达量单株，OE7-1#作为低表达量单株，进行对转基因拟南芥的表型观察及功能分析。

(4)转基因拟南芥内源基因的表达特性分析

为分析35S::CpCO-L2/拟南芥植株中内源基因CO、FT、TSF、SOC1、LFY、AP1等的表达变化，用Primer Premier5.0软件设计内源基因的特异引物并送至华大基因合成，序列如表3。将CpCO-L2表达量高、中、低的转基因拟南芥和野生型拟南芥的RNA进行反转录，得到cDNA，再用荧光定量PCR测定内源基因的表达量。试验数据通过Bio-Rad Manager^TMSoftware(Version 1.1)软件进行分析，用2^-△△CT法计算目的基因的相对表达量。

表3实时荧光定量PCR引物

在35S::CpCO-L2拟南芥中，其内源开花基因CO、FT、TSF、SOC1、LFY、AP1基因的表达量都会较野生型有不同程度的提高(图10)。具体表现为：转基因拟南芥OE3-1#、OE5-11#、OE7-1#中，AtCO的表达量分别是野生型WT的5.8倍、2.2倍、1.8倍；AtFT的表达量分别是野生型WT的2.8倍、3.6倍、2.5倍；AtTSF的表达量分别是野生型WT的6倍、2.6倍、1.2倍；AtSOC1的表达量分别是野生型WT的3.1倍、2.5倍、3.8倍；AtLFY的表达量分别是野生型WT的10.7倍、23.7倍、5.9倍；AtAP1的表达量分别是野生型WT的7倍、10倍、7.2倍。拟南芥的开花受CO、FT、TSF、SOC1、LFY、AP1等基因的共同调控，且CO上调FT、TSF、SOC1、LFY、AP1等基因促进拟南芥开花。由35S::CpCO-L2拟南芥中，拟南芥内源开花基因的表达均有上调，可推测蜡梅CpCO-L2基因可能具有促进开花的功能。

(5)转基因拟南芥的表型观察

根据的荧光定量结果，将CpCO-L2表达量高、中、低的三个株系的35S::CpCO-L2/拟南芥种子播种在含Hyg抗生素的MS固体培养基中，选用野生型WT拟南芥种子播种在无抗的MS固体培养基中，14天后移栽于光照16h/黑暗8h的光周期、2000Lux照明条件和22℃、70％湿度的培养室中，野生型植株作为对照，并设置3次生物重复，每次重复中转基因和野生型植株各12个单株，以此对转基因植株进行表型观察，每天定时观察并统计植株从苗期到衰败期的表型变化，主要统计的指标为抽葶1cm时间及此时莲座叶数、第一朵花开放时间、第一个果荚形成时间等，结果如表4所示。

表4 35S::CpCO-L2/拟南芥T₂代株系表型统计

表中每组数据均为“平均值±标准差”；a、b、c、d表示P＜0.05水平上差异显著；各株系均为3次重复，每重复12棵植株

结果表明：35S::CpCO-L2拟南芥T₂代单株抽葶时间、第一朵花的开放时间、第一个果荚的形成时间均较WT更早，且均达到差异显著水平。其中，第一朵花开放时间和第一个果荚形成时间，三个转基因单株表现为差异不显著；抽葶1cm时间，OE3-1#显著早于另外两个转基因单株，但OE7-1#与OE5-11#差异不显著。同时转基因单株抽葶1cm时的莲座叶数量均显著少于野生型WT，其中OE5-11#和OE3-1#的莲座叶数差异不显著，但显著少于OE7-1#(图11)。

以上结果的分析得出，转基因植株的CpCO-L2表达量越高，其表型变化越为明显，主要表现为抽葶时间、第一朵花开放时间、第一个果荚形成时间越短，而莲座叶数越少。根据上述结果，推测蜡梅CpCO-L2基因具有促进植株提前开花的功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 蜡梅CpCO-L2基因及其编码的蛋白与应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 1

atgaggcaga tgatgaagag aaattgtggc ggcagaggtg ggtggctgcg taggtgtgac 60

tcttgccgct cggcggcgtg cacggtttac tgccgactgg attcagccta tctctgcact 120

ggctgtgatt cacgtatcca tgcagtgaac ttggatgctt cacggcacga gcgtgtgtgg 180

atgtgtgagg catgtgagcg tttgcctgcc accgtcacat gcaaagccga tgtagctgca 240

ctctgtgcgg agtgcgacgc cgacatccac tctgccaatt cactagctag acgccaccat 300

cgtgtcccaa tcctccccat ttctgggcga ctttttgatc cggcagttgc agcccatcca 360

ggtatcggac cggtgtgcca ggaggaggaa caagaggctg aagcagcatc ttggttgctg 420

ctgaatccag tgaagaacaa caatgagaat gatgggtttt tatatggagg tgaagtagat 480

gagtatttgg atcttgtgga gtatgataca tgtggtgaga aggaaagcaa tgagcaggaa 540

aatggaggga agaagaatga tgggaatgaa gttgttgtgc cagtgcagtg tgtgggaggg 600

aatgaagagc tgaggcccca tcaactgaat cttttggaaa cagagtatga ggctctgaag 660

acagggttta attacagtgc atcactaagt cacagtgttt ctttgtcatc catggaagcc 720

agcattgtac cagatgccac catgacagaa atctcaaacg gctacatcag gcctccaaag 780

ggaacaattg acctcttttc gggcccccct cttcagattc caccccaatt cactcccatt 840

gacagggagg ccagggtcct caggtacaga gaaaagagaa aaacaaggaa atttgagaag 900

acagtaaggt atgcctcaag aaaggcatat gctgaaacca ggccccggat caaaggacgc 960

tttgcaaaga gaacagacag agaggtggaa gtggatcaaa tgttcaatgc caaggtaatg 1020

actgaaagtg gttatggcat cgttcctttg ttctaa 1056

<210> 2

<211> 351

<212> PRT

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 2

Met Arg Gln Met Met Lys Arg Asn Cys Gly Gly Arg Gly Gly Trp Leu

1 5 10 15

Arg Arg Cys Asp Ser Cys Arg Ser Ala Ala Cys Thr Val Tyr Cys Arg

20 25 30

Leu Asp Ser Ala Tyr Leu Cys Thr Gly Cys Asp Ser Arg Ile His Ala

35 40 45

Val Asn Leu Asp Ala Ser Arg His Glu Arg Val Trp Met Cys Glu Ala

50 55 60

Cys Glu Arg Leu Pro Ala Thr Val Thr Cys Lys Ala Asp Val Ala Ala

65 70 75 80

Leu Cys Ala Glu Cys Asp Ala Asp Ile His Ser Ala Asn Ser Leu Ala

85 90 95

Arg Arg His His Arg Val Pro Ile Leu Pro Ile Ser Gly Arg Leu Phe

100 105 110

Asp Pro Ala Val Ala Ala His Pro Gly Ile Gly Pro Val Cys Gln Glu

115 120 125

Glu Glu Gln Glu Ala Glu Ala Ala Ser Trp Leu Leu Leu Asn Pro Val

130 135 140

Lys Asn Asn Asn Glu Asn Asp Gly Phe Leu Tyr Gly Gly Glu Val Asp

145 150 155 160

Glu Tyr Leu Asp Leu Val Glu Tyr Asp Thr Cys Gly Glu Lys Glu Ser

165 170 175

Asn Glu Gln Glu Asn Gly Gly Lys Lys Asn Asp Gly Asn Glu Val Val

180 185 190

Val Pro Val Gln Cys Val Gly Gly Asn Glu Glu Leu Arg Pro His Gln

195 200 205

Leu Asn Leu Leu Glu Thr Glu Tyr Glu Ala Leu Lys Thr Gly Phe Asn

210 215 220

Tyr Ser Ala Ser Leu Ser His Ser Val Ser Leu Ser Ser Met Glu Ala

225 230 235 240

Ser Ile Val Pro Asp Ala Thr Met Thr Glu Ile Ser Asn Gly Tyr Ile

245 250 255

Arg Pro Pro Lys Gly Thr Ile Asp Leu Phe Ser Gly Pro Pro Leu Gln

260 265 270

Ile Pro Pro Gln Phe Thr Pro Ile Asp Arg Glu Ala Arg Val Leu Arg

275 280 285

Tyr Arg Glu Lys Arg Lys Thr Arg Lys Phe Glu Lys Thr Val Arg Tyr

290 295 300

Ala Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Thr Arg Pro Arg Ile Lys Gly Arg

305 310 315 320

Phe Ala Lys Arg Thr Asp Arg Glu Val Glu Val Asp Gln Met Phe Asn

325 330 335

Ala Lys Val Met Thr Glu Ser Gly Tyr Gly Ile Val Pro Leu Phe

340 345 350

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 3

tctgcacata cacgacagtg gaaac 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 4

tactcggcgc tgaactcatt ctgct 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 5

ttgcagccca tcagtatgac cg 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 6

gttgatgggg cctcagctc 19

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 7

gttatggttg ggatgggaca gaaag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 8

gggcttcagt aaggaaacag ga 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 9

tagtgacaag acagtaggtg gaggt 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 10

gtaggttcca gtcctcactt catc 24

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 11

cgagctcatg aggcagatga tgaagagaa 29

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 12

gctctagatt agaacaaagg aacgatgcca taacc 35

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 13

cttcgtcttc cacttcag 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 14

atcataccag tctcaacac 19

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 15

tgatgctcaa gttcactctg ccaat 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 16

cgaagcaccg acaagggatt aagtc 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 17

ttccaagtcc tagcaaccct cacc 24

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 18

ttcttcctcc gcagccactc tc 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 19

tagggctcaa caggagcagt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 20

cagccaaggt tgcagttgta 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 21

gcctcaatac tgcgtaacct cc 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 22

ggtaggacgt aacatccaag cc 22

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 23

ctctatttgg tatgttccaa caaag 25

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 24

ctaataccgc caactaaagc c 21

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 25

ttcttgatcc tttcacgagg ttgg 24

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 26

cctctggcag ttgaagtaag ag 22

Claims

1.蜡梅CpCO-L2蛋白，其为由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的蜡梅CpCO-L2蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在调控植物花期中的用途，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

7.一种使植物提前开花的方法，其为将含有权利要求2或3所述基因的载体转入植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。