CN101638659A - 蝴蝶兰光周期相关基因PhalCOL的序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蝴蝶兰光周期相关基因PhalCOL的序列及其应用，旨在提供一种PhalCOL基因、以及含有该基因的重组植物表达载体、含有重组植物表达载体的植物细胞系和植物转化体，以及该基因在促进植物营养生长和缩短开花时间中的应用和应用原位杂交检测PhalCOL基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法。本发明的PhalCOL基因是从蝴蝶兰中克隆出来的，其全长共987bp，编码328个氨基酸残基的蛋白，实验发现该基因能够影响植株的发育，促进植物营养生长和生殖生长，缩短开花时间。该基因为基因工程改良植物的生长进程，对植物的花期进行调控提供了有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

Description

蝴蝶兰光周期相关基因PhalCOL的序列及其应用

技术领域：

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的，与光周期相关的CONSTANS-like基因-PhalCOL基因、含有该基因的重组植物表达载体、含有上述重组植物表达载体的转基因植物转化体，以及PhalCOL基因在促进植物生长发育上的应用，还有应用原位杂交检测PhalCOL基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法。

背景技术：

日照长度(即光周期)是影响开花时间的主要因素之一。拟南芥是一种典型的长日照植物，长日照能促进拟南芥开花，而短日照则会抑制开花。目前的研究发现，光周期途径中的主要调控基因有CONSTANS(CO)，CRY2/FHA，GIGANTEA(GI)，FT和FWA，它们的突变体在长日照(LD)条件下延迟开花，但在短日照(SD)条件下开花时间与野生型相似。

CO是植物光周期信号传导途径中的关键基因，在光受体和生物钟的共同调控下，基因表达量在一天之内呈节律性变化。Putterill等最早于1995年在拟南芥中找到一个比野生型开花延迟的突变体，然后采用图位克隆的方法分离到了CO基因，该基因在根和叶中表达，在长日照下CO促使拟南芥开花，但是短日照条件下不起作用。后来，Yano等在水稻中克隆到拟南芥的CO同源基因HD1，HD1突变后水稻对光周期的敏感性降低。

CO蛋白是一个转录因子，它不是决定植物开花的最终产物，而是通过调控下游基因FT和SOC1的表达控制开花时间。超表达CO基因后，FT和SOC1的表达量增加，开花时间提前，但是在FT突变体中超表达CO基因效果并不明显，说明CO是依赖于FT来调控植物开花时间。CO位于生物钟输出途径，在生物钟和开花时间之间起着纽带作用。

蝴蝶兰是兰科植物中栽培最广泛、最受欢迎的种类之一，花形似蝴蝶，别致美丽、色彩艳丽，花期长达数月之久，观赏价值极高，在热带兰中素有“兰花皇后”之美誉，国内外一直视其为花中珍品，倍受人们青睐。在我国，蝴蝶兰消费主要集中在春节、中秋、国庆、元旦等重大节日，生产上确保蝴蝶兰如期上市非常重要，花期调控是生产中的关键环节之一。影响蝴蝶兰生长发育与开花的因子有肥料、基质、温度、光照、激素等，生产上主要通过调控这几个因子来实现对蝴蝶兰的花期调控。

光照是影响蝴蝶兰花芽分化、花梗生长乃至开花的重要因素。Kubota等表明，冷处理中给以适当光照可诱导兰花产生花芽，完全黑暗下无花芽产生。曾爱平认为在一定的范围内，光照越强，抽梗率越大、花梗生长越快、花朵数越多、始花期越早；在蝴蝶兰栽培中特别是花芽分化期要给予充足的光照，否则抽梗率降低、花梗伸长缓慢、花期延迟。Vaz等研究指出在蝴蝶兰生长期间每天给予20h或更长的光照时间会严重影响其花芽分化，抑制开花并缩短蝴蝶兰的寿命。因此，在兰花的花期调节中应适时的给予适当的光照才能保证正常花芽的分化和开花，甚至提早开花。但光照影响蝴蝶兰开花的分子机理尚无报道。

发明内容：

本发明的第一目的是提供了一种在蝴蝶兰中表达的，与光周期相关的CONSTANS-like基因-PhalCOL基因、以及含有该基因的重组植物表达载体、含有上述重组植物表达载体的植物细胞系和植物转化体。

本发明的第二个目的是提供PhalCOL基因在促进植物营养生长和缩短开花时间中的应用。

本发明的第三个目的是提供了应用原位杂交检测PhalCOL基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法。

本发明以蝴蝶兰杂交种“婚宴”(Phalaenopsis hybrida cv.Wedding Promenade)的花芽为材料，提取其总RNA，再将mRNA逆转录成cDNA第一链，以该cDNA第一链模板，根据PhalCOL基因保守区域设计引物进行PCR扩增，获得572bp的核心片段，根据RACE方法，设计引物，PCR扩增获得5’端和3’端序列，最后拼接获得全长cDNA序列，该cDNA序列长度为1202bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，其开放阅读框为自5’端第15位至第1001位碱基，共987bp，将此开放阅读框命名为PhalCOL基因，其编码的蛋白的氨基酸序列具有328个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为PhalCOL。

将蝴蝶兰的PhalCOL基因编码的蛋白质序列用ClustalW2分析其同源性，结果显示PhalCOL基因具有两个保守的B-box-type锌指域和一个CCT域，它分别和大麦的COL具有49％的同源性，和水稻Hd1具有45％同源性，和拟南芥的AtCOL4具有46％的同源性，AtCOL3具有45％的同源性以及AtCO有36％的同源性。

本发明人将上述PhalCOL基因与植物表达载体连接，通过农杆菌介导，将含有PhalCOL基因的重组植物表达载体转化到烟草的叶片中，经组织培养成含有PhalCOL基因的转基因烟草。通过实验发现，该转基因烟草与野生型烟草相比，转基因烟草前期营养生长更旺盛，长得更快些，在开花时间上，转基因植株都比野生型烟草提前开花，10个转化株的平均开花时间为41天，而野生型的平均开花时间为65天。由此表明，外源PhalCOL基因为具有功能的结构基因，其在宿主烟草中实现了超量表达，促进了转基因烟草的营养生长和生殖生长，从而缩短了开花时间，因此该基因能影响植株的发育。

从上述结果分析可以表明，本发明的PhalCOL基因是一个新的与光周期相关的CONSTANS-like基因，该基因能促进植物的营养生长和生殖生长，缩短开花时间，从而影响植株的发育。

因此可以将本发明的PhalCOL基因应用到促进植物生长发育和缩短开花时间中。本发明的PhalCOL基因与植物表达载体连接，通过农杆菌介导进入植物细胞、组织或器官，通过组织培养成转基因的植物转化体，从而实现促进该植物的营养生长和生殖生长，缩短开花时间。所述的植物表达载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI系列载体、pBin系列载体、Gateway^TW系列载体、pCAMBIA系列载体或其它衍生植物表达载体等，上述载体均为公开销售的商品。

本发明所述的检测PhalCOL基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法，包括以下步骤：

(1)制备蝴蝶兰的组织切片；

(2)将带有标记的特异性探针与蝴蝶兰的组织切片杂交结合；

(3)根据标记对原位杂交结果进行检测；

所述的带有标记的特异性探针的序列为如SEQ ID NO.3所示序列的反义RNA链，该反义RNA链具体是指与SEQ ID NO.3所示序列互补的RNA链，该RNA链可以通过现有的很多方法获得，然后使其带上标记作为与蝴蝶兰的组织切片杂交的特异性探针。

所述的标记可以为地高辛、生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素，通过本领域技术人员公知的技术手段结合到探针上。

本发明所述的制备蝴蝶兰的组织切片是按照常规的方法制备的，其具体步骤如下：取蝴蝶兰的新鲜组织材料，立即置于4％多聚甲醛中固定12小时，再以乙醇梯度脱水，包埋于石蜡块中，将包埋好的材料修块后用切片机进行8μm连续切片，并将切片粘片于预涂过多聚赖氨酸的载玻片上，然后切片在42℃上展片，40℃烘烤过夜。所述的杂交结合过程如下：石蜡样品切片后脱蜡，复水并以蛋白酶消化组织蛋盐酸白，经预杂交后与事先变性处理的带有标记的特异性探针分子在杂交液中50℃共浴16小时。杂交后，以血清封闭探针，利用特异性抗体与杂交上的探针分子结合，并进行显色反应，用中性树胶封片，显微观察并照相。所述的PhalCOL基因以蓝色分布在切片上。因此可以利用本方法观察到PhalCOL基因在各个器官，各个发育阶段的表达量。

本发明首次从蝴蝶兰克隆中的CONSTANS-like基因-PhalCOL基因，并且通过实验证明该基因能够影响植物生长发育进程，促进了营养生长，并促使植物提前开花。因此，本发明提供的蝴蝶兰PhalCOL基因为基因工程改良植物的生长进程，对植物的花期进行调控提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

附图说明：

图1是PhalCOL基因编码的氨基酸序列与COL同源基因的氨基酸序列比较图，其中AtCO(Acc.No.NP_197088)，AtCOL3(Acc.No.Q9SK53.1)，AtCOL4(Acc.No.Q940T9.2)，Hd1(Acc.No.ABB17664)，HvCOL(Acc.No.AAM74069)，具有一致性和相似性的氨基酸分别用黑色和灰色阴影表示，COL基因的B-box域和CCT域在序列上用横线注明，▲暗示锌指域中半胱氨酸残留基；

图2是通过RT-PCR检测不能发育花梗的幼年期植株的根、茎和叶中的PhalCOL基因表达量的电泳显示图，其中1为根，2为茎，3为叶，A为PhalCOL基因，B为蝴蝶兰的ACTIN基因(Genebank登录号为AF246714)；

图3是通过RT-PCR检测没有发育花梗的成年植株的根、茎和叶中的PhalCOL基因表达量的电泳显示图，其中1为根，2为茎，3为叶，A为PhalCOL基因，B为蝴蝶兰的ACTIN基因(Genebank登录号为AF246714)；

图4是通过RT-PCR检测刚发育花梗的成年植株，花梗长度小于1cm时，根、茎、花梗和叶中的PhalCOL基因表达量的电泳显示图，其中1为根，2为茎，3为叶，4为花梗，A为PhalCOL基因，B为蝴蝶兰的ACTIN基因(Genebank登录号为AF246714)；

图5是通过RT-PCR检测花梗长度为4cm的成年植株的根、茎、花梗和叶中的PhalCOL基因表达量的电泳显示图，其中1为根，2为茎，3为叶，4为花梗，A为PhalCOL基因，B为蝴蝶兰的ACTIN基因(Genebank登录号为AF246714)；

图6是目的基因(PhalCOL)的PCR鉴定图，其中M为Marker、1-10为PhalCOL转基因烟草株系编号、CK为野生型烟草、PBI121为转入空载体烟草。

图7是根中蝴蝶兰PhalCOL基因的原位杂交结果图；

图8是叶中蝴蝶兰PhalCOL基因的原位杂交结果图；

图9是花梗中蝴蝶兰PhalCOL基因的原位杂交结果图；

图10是花柄中蝴蝶兰PhalCOL基因的原位杂交结果图；

图11是子房中蝴蝶兰PhalCOL基因的原位杂交结果图；

图12是花柄中的蝴蝶兰PhalCOL基因的正义探针原位杂交结果图，为负对照；

图13，14是花芽中蝴蝶兰PhalCOL基因的原位杂交结果图；

图15是花器官原基开始发育的花蕾中蝴蝶兰PhalCOL基因的原位杂交结果图；

图16是花芽中蝴蝶兰PhalCOL基因的正义探针原位杂交结果图，为负对照；

图17、18和19是花器官都具备的花蕾中蝴蝶兰PhalCOL基因的原位杂交结果图；

图20是花蕾中蝴蝶兰PhalCOL基因的正义探针原位杂交结果图，为负对照；

具体实施方式：

下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。

实施例1：

一、蝴蝶兰PhalCOL基因的克隆，及其同源性分析。

(1)以蝴蝶兰杂交种“婚宴”(Phalaenopsis hybrida cv.Wedding Promenade)为试验材料，植物材料在温室正常条件下生长(L/D，16h/8h；25-28℃)。

(2)RNA提取：用Trizol reagent(购自Invitrogen公司)进行试验材料的总RNA提取，整个操作过程严格按照Trizol试剂的RNA提取流程说明。

(3)采用M-MLV反转录酶(购自Promgra公司)逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照试剂说明书进行。

(4)基因的克隆：以逆转录的蝴蝶兰花芽cDNA第一链为模板，利用引物PCOF和PCOR进行PCR扩增，获得572bp的核心片段。

引物：PCOF：5′-TTC ATT C(C/T)G C(A/C)A A(C/T)C C(A/T)C TTG C-3′

      PCOR：5′-CTC TGC ATA(C/G/T)GC(C/T)TT(C/T)CT(A/T/C)GA A-3′

采用Golden DNA polymerase(TIANGEN)进行PCR扩增，加样体系参照酶的说明书，其PCR反应程序为：94℃变性4min，随后进行35个循环反应(94℃ 30s，51℃ 45s，72℃ 1min)，72℃延伸5min。

利用该572bp的核心片段，根据RACE方法，设计扩增3’端序列的引物PCO3A和PCO3B，以及扩增5’端序列的引物PCO5A和PCO5B，引物为：

PCO3A：5-AAGAACAGGCGGTTTGAG-3

PCO3B：5-GAGAAAACAATACGCTACGC-3

PCO5A：5′-GCAGTCCGCCGATTTCATTATTCC-3′

PCO5B：5′-CAAACAAGGGAACCACAGGCACT-3′

3’端序列PCR扩增反应程序为：采用Golden DNA polymerase(TIANGEN)进行PCR扩增，加样体系参照酶的说明书，其PCR反应程序为94℃变性3min，随后30个循环反应(94℃ 30s，53℃ 45s，72℃ 1min)，72℃延伸5min。

5’端序列PCR扩增反应程序为：采用Golden DNA polymerase(TIANGEN)进行PCR扩增，加样体系参照酶的说明书，其PCR反应程序为95℃变性1min，接着5个循环反应(94℃ 30s，72℃ 2min)，再接着5个循环反应(94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 1.5min)，最后30个循环反应(94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 1.5min)，72℃延伸10min，4℃终止反应。

对5’端和3’端序列的扩增序列进行测序，最后与核心片段拼接获得全长cDNA序列，其序列如SEQ.ID.NO.1所示，该序列长度为1202bp，该序列的开放阅读框为SEQ.ID.NO.1的自5’端第15位至第1001位碱基，共987bp，将该开放阅读框命名为PhalCOL基因，该基因编码由328个氨基酸残基组成的多肽，蛋白质的pI/Mw分别为5.60/34871.31。将蝴蝶兰PhalCOL基因编码的氨基酸序列用ClustalW2分析其同源性，结果显示PhalCOL基因有两个保守的B-box-type锌指域和一个CCT域，它分别和大麦的COL有49％的同源性，和水稻Hd1有45％同源性，和拟南芥的AtCOL4有46％的同源性，AtCOL3有45％的同源性以及AtCO有36％的同源性(见图1)。

二、蝴蝶兰PhalCOL基因表达模式分析

在蝴蝶兰不同的生长发育阶段，用Trizol reagent(Invitrogen)分别提取蝴蝶兰植株的根、叶片、花梗以及茎的总RNA，测定OD260后定量取出2ugRNA，然后再使用oligo-dT引物和PrimeScriptTM Reverse Transcriptase(购自Takara公司)进行逆转录反应(方法参考说明书)，以跨越内含子的特异引物CF：5′GTGCCTGTGGTTCCCTTG 3′与CR：5′ACCGCCTGTTCTTTCTCT 3′，进行PCR扩增，反应程序为94℃变性4min，随后进行32个循环反应(94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 1min)，72℃延伸5min。反应产物以1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果如图2、3、4和5所示，其中对照为来自蝴蝶兰的ACTIN基因(登录号AF246714)，可通过常规方法扩增得到，扩增该对照的ACTIN基因(登录号AF246714)的引物为：5’-TGGAAACTGCCA AGACG-3’，5’GCAGCGAAGATTCAAAA-3。从电泳图中可以看出，PhalCOL基因在幼年苗和成年苗的根、茎、叶和花梗中都能强烈表达，在不同的生长阶段，在叶片中的表达都很强，而在茎中的表达随花梗的发育发生明显的变化，推测该基因与花梗的发育有着密切的关系。

三、蝴蝶兰PhalCOL基因在烟草中的表达及转基因植株的表型鉴定。

(1)含目的基因PhalCOL表达载体的构建

以前面逆转录得到的cDNA为模板，使用Takara公司的LA Taq酶进行扩增，反应体系按说明书，扩增引物为

PhCOF：5’AATTCTAGAATGGGAGGCAAAGGTGTGGAAGGC3’

PhCOR：5’CATGGATCCTTAGAAGGATGGAACTACGCCGTA3’

反应程序为94℃ 4min；94℃ 30sec，60℃ 45sec，72℃ 2min，35cycles；72℃ 5min。

将扩增得到的PhalCOL基因与Takara公司的pMD18-T载体连接，转化进入大肠杆菌中(具体流程参见T载体的说明书)。

提取含有PhalCOL基因的T载体质粒，利用酶切位点Xba I和BamH I将PhalCOL基因从T载体上切下，与带有35s启动子和nos终止子的植物表达载体pBI121同样用Xba I和BamHI酶切后连接，连接酶用T4DNALigase(购自Takara公司)，具体操作按说明书方法进行，构建表达载体pBI121-35s-PhalCOL。

(2)将重组质粒pBI121-35s-PhalCOL采用电击法转化到根瘤农杆菌LBA4404中。

取1μl重组质粒pBI121-35s-PhalCOL与刚制好的农杆菌LBA4404感受态细胞混匀，冰上放置10min。

将此混合物转移至已预冷的电极杯电击。

向电击杯中加入1000μl的YM液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中，28℃，220-250rpm复苏2-4小时。所述的YM液体培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。

将转化产物涂布于YM+Kan(卡那霉素)50mg/L+硫酸链霉素25mg/L的平板上，放于28℃培养箱培养48小时。

挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，选取含有目的基因片段的根瘤农杆菌LBA4404克隆作为阳性克隆。

(3)利用叶盘法转化烟草

挑取阳性克隆，接种于含有Kan(卡那霉素)50mg/L和硫酸链霉素25mg/L的YM液体培养基中，28℃ 200rpm振荡培养24-36h，使OD₆₀₀＝0.5左右。

将菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，15min离心收集菌种，再用同等体积的MS液体培养基悬浮菌种，准备浸染叶片。所述的MS培养基是本领域常用培养基，其配方参考(Murashige T and Skoog F，1962)。

于无菌条件下将烟草无菌苗的成熟叶片除去叶边缘，切成0.5×1.0cm的小块，浸泡在制备好的菌液中。

10min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，放在含有质量分数为3％蔗糖和质量分数为0.6-0.7％琼脂的MS培养基中，置于24±1℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下共培养48小时。

当看到叶片与培养基接触边缘长出白色农杆菌时，将叶片转移至不加激素的MS液体培养基中，于28±1℃恒温摇床上振荡漂洗45-60min，夹出叶片放于灭菌的滤纸上除去多余的液体培养基。

将叶片转入生芽筛选培养基，置于24±1℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下培养，所述的生芽筛选培养基是每升MS培养基中含有500mg Carbenicillin(羧苄青霉素)、300mg Kanamicine(卡那霉素)、0.1mgNAA(α-萘乙酸)、1.0mg BA(6-苄基腺嘌呤)、0.59g MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]、30g蔗糖、6-7g琼脂、pH 5.7-5.8；约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下并转入生根培养基进行筛选，置于24±1℃光照培养箱中，14h光照/10h黑暗条件下培养筛选，所述的生根培养基为每升MS培养基含有200mg Carbenicillin、100mg Kanamicine、15g蔗糖和6-7g琼脂、pH5.7-5.8；

待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，温室中培养。

(4)转基因植株的分子鉴定。

DNA的提取采用Takara的“Universal Genomic DNA Extraction Kit”。以转基因植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，以

PhCOF：5’AATTCTAGAATGGGAGGCAAAGGTGTGGAAGGC3’

PhCOR：5’CATGGATCCTTAGAAGGATGGAACTACGCCGTA3’

为扩增引物，采用Golden DNA polymerase(TIANGEN)进行PCR扩增，加样体系参照酶的说明书，反应程序为94℃变性4min，随后35个循环(94℃ 30sec，60℃ 45sec，72℃ 2min)，72℃延伸5min。电泳检测，检测结果如图6所示。PCR结果表明携带有外源蝴蝶兰PhalCOL基因的表达质粒已经插入到烟草基因组中。

(5)转基因植株进行表型鉴定。

将转基因烟草植株和野生型烟草同等条件下进行培养，与野生型烟草相比，转基因烟草前期营养生长更旺盛，长得更快些。在开花时间上，转基因植株都比野生型烟草提前开花，同等培养条件下，野生型烟草需要65天开花，而转入PhalCOL基因的烟草只需要41天开花。根据结果表明，外源PhalCOL基因在宿主烟草中实现了超量表达，促进了转基因烟草的营养生长和生殖生长，从而促进了开花时间。试验结果表明，蝴蝶兰PhalCOL基因为有功能的基因，可以影响植株的发育，具有促进营养生长和生殖生长，从而缩短开花时间的作用。

由上述结果分析表明，本发明的PhalCOL基因是一个新的与光周期相关的CONSTANS-like基因，该基因能促进植物的营养生长和生殖生长，缩短开花时间，从而影响植株的发育。

四、应用原位杂交检测PhalCOL基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法

(1)取蝴蝶兰的根、叶、花梗、花柄、花芽、顶芽、腋芽及刚发育的花蕾。将所取的新鲜材料立即置于4％多聚甲醛中固定12小时。再以乙醇梯度脱水，包埋于石蜡块中。

(2)将包埋好的材料修块后用切片机进行8um连续切片，并将切片粘片于预涂有多聚赖氨酸的载玻片上，然后切片在42℃上展片，40℃烘烤过夜。

(3)将PhalCOL基因中一段特异的长573bp的片段(序列如SEQ ID NO.3所示)PCR扩增，其引物为：5’TTTCATTCTGCCAACCCTCTTG-3’，5’-CTCTGCATAGGCTTTTCTCGAA-3’利用Golden DNA polymerase(TIANGEN)酶进行PCR扩增，加样体系参照酶的说明书，其PCR反应程序为：94℃变性4min，随后进行30个循环反应(94℃ 30s，51℃ 45s，72℃ 1min)，72℃延伸5min。

将上述扩增出573bp的片段连接在pGEM-T载体(购自promega公司)的多克隆位点上，用SphI(购自Takara公司)酶切该质粒DNA，使其线性化，用DIG RNA Labeling Kit(购自Roche公司)中的Sp6RNA多聚酶转录上述线性化的DNA，将得到的带有地高辛标记的antisense RNA为探针；同样，用SpeI(Takara)酶切该质粒DNA，使其线性化，用DIG RNALabeling Kit(Roche)中的T7RNA多聚酶转录线性化的DNA，将得到的带有地高辛标记的sense RNA作为反应的对照。具体步骤参考试剂说明书。

(4)石蜡样品切片后脱蜡，复水，在0.2M HCl中变性20min，清洗后用1％牛血清白蛋白封阻反应再与事先变性处理的探针分子在杂交液中50℃共浴16小时。

(5)杂交后，用2×SSC溶液(配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》)清洗玻片，以2％兔血清(购自北京鼎国公司)封闭探针，再用anti-Dig-AP(购自Roche公司)进行免疫反应。

(6)在载玻片上滴加氮蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)(购自sigma公司)配成显色液，37℃黑暗处显色反应6-12hrs。

(7)用中性树胶封片，显微观察并照相。

原位杂交阳性结果呈蓝紫色分布在细胞中，结果如图7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20所示，在上述图中，im为花序分生组织，fm为花分生组织，fp为花原基，lp为唇瓣原基，sp为萼片原基，pp为花瓣原基，b为苞片，s为萼片，l为唇瓣，p为花瓣，ac为药帽，c为柱头，pl为花粉粒，r为蕊喙。PhalCOL基因在根、叶、花梗、花柄及子房中都有表达，它显著地累积在细胞分裂区域和微管束区域，其中，在叶片微管束、叶肉细胞及子房中累积的更多。在蝴蝶兰花发育的早期阶段，PhalCOL基因主要在花序分生组织、花分生组织及花原基中表达。花发育的后期阶段，大量的PhalCOL基因转录的mRNA累积在萼片原基、唇瓣原基及花瓣原基中。当花蕾形成后，PhalCOL mRNA在所有的花器官中都能观察到，其中，在花粉粒和蕊喙中的信号强于在其它花器官中的信号。

因此可以利用原位杂交的方法检测PhalCOL基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布。

序列表

<110>中国科学院华南植物园

<120>蝴蝶兰光周期相关基因PhalCOL的序列及其应用

<160>3

<210>1

<211>1202

<212>DNA

<213>蝴蝶兰“婚宴”(Phalaenopsis hybrida cv.Wedding Promenade)

<220>

<221>CDS

<222>(15)...(1001)

<400>1

ACGCGGGGAG AAAAATGGGA GGCAAAGGTG TGGAAGGCGG GGGAGCCTAC TGGGAACTAG 60

AAGCGCGGAA GTGCGACGGC TGCAAGGGGC CGCCGGCGGC GGCGGTGCTC TTCTGCAGGG 120

CTGATGCCGC TTTCCTCTGC GCCACTTGCG ATGCGCGCGT GCACGGCGCG AATAAGCTCG 180

CTTCCCGGCA CGAGCGCGTC TGGCTCTGCG AGGTGTGCGA GCAAGCGCCG GCCGCCGTCA 240

CCTGCAAGGC TGACGCCGCC GCACTCTGCT CCGCTTGCGA CGCTGATATC CACACAGCCA 300

ATCCCCTCGC AAGCCGCCAC CAACGAGTGC CTGTGGTTCC CTTGTTTGAA TCCCCTGTCC 360

CCGACCCGGA CCTCCTTTAT GATGCCGATG AAGGCGAAGA AGACAGCGCT GGTGCTGCAT 420

CTTGGATACT GCCTGCTCCG GCGAAGGATA CGGTTCAAGG AATAATGAAA TCGGCGGACT 480

GCTTCGCCGA TGTCCATCCG TACCTGGATC TGGAGTACGC TTCGTCGGTG GAAGCCGGGA 540

TTTATCAGTC TGACAGCGTC GTGCCGGCGG GAGCGGGAGC TTCGTCAGGT CTCATCATGC 600

TCGATTTCGG TAAACCCAAG CCGAAGACTC ATAGCTACAC CATCAGCCAC AGCATGTCGT 660

CATCAGAGGT GGCAGTGGTA CCGGACGGTG GCGGTAGCGC CTTGGCGGAC GTGTCTAATT 720

GTGCCGGCGG CAGCGGCGGC ATGGGGGAGA GATCGGCGAT GATGGATCGG GAGGCGAGGG 780

TGATGAGATA CAGGGAAAAG AGAAAGAACA GGCGGTTTGA GAAAACAATA CGCTACGCTT 840

CGAGGAAGGC GTACGCAGAG ACGAGACCGA GAATAAAGGG GAGGTTTGCG AAGAGGACGG 900

AAGTGGAGTT GGAGATCGAT CAGATCTACT CGTCGGCGGC AGCCGCCACG GCTGCTTTCA 960

TGGAATCTGT TCAAGACTAC GGCGTAGTTC CATCCTTCTA AGACATCATG CGAACTCTTA 1020

TCACTCTGCT TTCGCCATGA TTGACTGCAA GAAGCGTATT GCCGTTTGTG GGAGTGAAAT  1080

CATCGTAGTC GGAGCAGATA AAGGCTCCTT GTTTTTGCAG CCTTCTTAAT TATTGTATAC  1140

TTTTTGGATA TTTCGACTTT TTCGATTCTG ATAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA  1200

AA                                                                 1202

<210>2

<211>328

<212>PRT

<213>蝴蝶兰“婚宴”(Phalaenopsis hybrida cv.Wedding Promenade)

<400>2

Met Gly Gly Lys Gly Val Glu Gly Gly Gly Ala Tyr Trp Glu Leu

1                5                  10                  15

Glu Ala Arg Lys Cys Asp Gly Cys Lys Gly Pro Pro Ala Ala Ala

                20                  25                  30

Val Leu Phe Cys Arg Ala Asp Ala Ala Phe Leu Cys Ala Thr Cys

                35                  40                  45

Asp Ala Arg Val His Gly Ala Asn Lys Leu Ala Ser Arg His Glu

                50                  55                  60

Arg Val Trp Leu Cys Glu Val Cys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Val

                65                  70                  75

Thr Cys Lys Ala Asp Ala Ala Ala Leu Cys Ser Ala Cys Asp Ala

                80                  85                  90

Asp Ile His Thr Ala Asn Pro Leu Ala Ser Arg His Gln Arg Val

                95                  100                 105

Pro Val Val Pro Leu Phe Glu Ser Pro Val Pro Asp Pro Asp Leu

                110                 115                 120

Leu Tyr Asp Ala Asp Glu Gly Glu Glu Asp Ser Ala Gly Ala Ala

                125                 130                 135

Ser Trp Ile Leu Pro Ala Pro Ala Lys Asp Thr Val Gln Gly Ile

                140                 145                 150

Met Lys Ser Ala Asp Cys Phe Ala Asp Val His Pro Tyr Leu Asp

                155                 160                 165

Leu Glu Tyr Ala Ser Ser Val Glu Ala Gly Ile Tyr Gln Ser Asp

                170                 175                 180

Ser Val Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ser Ser Gly Leu Ile Met

                185                 190                 195

Leu Asp Phe Gly Lys Pro Lys Pro Lys Thr His Ser Tyr Thr Ile

                200                 205                 210

Ser His Ser Met Ser Ser Ser Glu Val Ala Val Val Pro Asp Gly

                215                 220                 225

Gly Gly Ser Ala Leu Ala Asp Val Ser Asn Cys Ala Gly Gly Ser

                230                 235                 240

Gly Gly Meu Gly Glu Arg Ser Ala Met Met Asp Arg Glu Ala Arg

                245                 250                 255

Val Met Arg Tyr Arg Glu Lys Arg Lys Asn Arg Arg Phe Glu Lys

                260                 265                 270

Thr Ile Arg Tyr Ala Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Thr Arg Pro

                275                 280                 285

Arg Ile Lys Gly Arg Phe Ala Lys Arg Thr Glu Val Glu Leu Glu

                290                 295                 300

Ile Asp Gln Ile Tyr Ser Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Phe

                305                 310                 315

Met Glu Ser Val Gln Asp Tyr Gly Val Val Pro Ser Phe

                320                 325         328

<210>3

<211>573

<212>DNA

<213>蝴蝶兰“婚宴”(Phalaenopsis hybrida cv.Wedding Promenade)

<400>3

TTCATTCCGC CAATCCTCTT GCAAGCCGCC ACCAACGAGT GCCTGTGGTT CCCTTGTTTG  60

AATCCCCTGT CCCCGACCCG GACCTCCTTT ATGATGCCGA TGATGGCGAA GAAGACAGCG  120

CTGGTGCTGC ATCTTGGATA CTGCTTGCTC CGGCGAAGGA TACGGTTCAA GGAATAATGA  180

AATCGGCGGA CTGCTTCGCC GATGTCCATC CGTACCTGGA TCTGGAGTAC GCTTCGTCGG  240

TGGAAGCCGG GATTTATCAG TCTGACAGCG TCGTGCCGGC GGGAGCGGGA GCTTCGTCAG  300

GTCTCATCAT GCTCGATTTC GGTAAATCCA AGCCGAAGAC TCATAGCTAC ACCATCAGCC  360

ACAGCATGTC GTCATCAGAG GTGGCAGTGG TACCGGACGG TGGCGGTAGC GCCTTGGCGG  420

ACGTGTCTAA TTGTGCCGGC GGCAGCGGCG GCATGGGGGA GAGATCGGCG ATGATGGATC  480

GGGAGGCGAG GGTGATGAGA TACAGGGAAA AGAGAAAGAA CAGGCGGTTT GAGAAAACAA  540

TACGCTACGC TTCTAGAAAA GCCTATGCAG AGA                               573

Claims (10)

1.一种蝴蝶兰光周期相关的PhalCOL基因，其特征在于所述的PhalCOL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第15位至第1001位碱基所示。

2.一种由权利要求1所述的PhalCOL基因编码的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种含有权利要求1所述的PhalCOL基因的重组植物表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组植物表达载体，其特征在于所述的重组植物表达载体中的载体为载体pBI121。

5.一种含有权利要求3所述的重组植物表达载体的植物细胞系。

6.一种含有权利要求3所述的重组植物表达载体的植物转化体。

7.根据权利要求6所述的植物转化体，其特征在于所述的植物转化体中的受体植物为烟草。

8.权利要求1所述的PhalCOL基因在促进植物营养生长和缩短开花时间中的应用。

9.一种利用原位杂交检测PhalCOL基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备蝴蝶兰的组织切片；

(2)将带有标记的特异性探针与蝴蝶兰的组织切片杂交结合；

(3)根据标记对原位杂交结果进行检验；

所述的带有标记的特异性探针的序列为如SEQ ID NO.3所示序列的反义RNA链。

10.根据权利要求9所述的利用原位杂交检测PhalCOL基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法，其特征在于所述的标记为地高辛、生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素。

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