CN116003546B - 一种紫花苜蓿nac转录因子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫花苜蓿NAC转录因子及其应用，转录因子氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；本发明还提供了所述NAC转录因子蛋白及其编码基因在抑制转基因植物分枝中的应用。本发明利用基因工程技术实现了MsNAC73转基因植株的培育，显著抑制了植株的分枝，为紫花苜蓿新品种的培育提供了重要的理论依据，特别是优化株型、改变植物的繁殖能力提供了依据，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种紫花苜蓿NAC转录因子及其在抑制植物分枝中的应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种优质豆科牧草，因其营养价值高，产量高，适口性好等特点，在世界范围内广泛种植。紫花苜蓿不仅是一种重要的经济饲料作物，还是一种很好的水土保持植物，在畜牧业可持续发展和环境改善等方面具有重要作用。
NAC转录因子是陆生植物特有的转录调控因子，广泛参与植物的生长发育过程中，包括根系和花的发育，信号传导，器官衰老，果实成熟以及响应生物和非生物胁迫等。其N端为高度保守的150～160个氨基酸残基组成的结构域，而C端则是高度多样化的转录调控区。植物分枝对植物的产量和株型起决定性作用，影响植物的光捕获能力以及植物的繁殖过程，因此探究分枝的发育过程具有很重要的农林业实践指导意义。在水稻中过表达OsNAC2可促进水稻分蘖，增加分蘖角度，同时降低水稻的植株高度。NAC转录因子CUC2和CUC3通过激活泛素依赖多肽酶DA1的表达抑制腋芽分生组织的起始，同时泛素特异蛋白酶UBP15是DA1的直接作用底物，从而形成一个CUC2/CUC3-DA1-UBP15的调控模块，调控腋芽分生组织的起始，决定植物的分枝和株型，但在紫花苜蓿中未有NAC转录因子调控分枝的相关报道。
紫花苜蓿是异花授粉的同源四倍体，遗传背景十分复杂，利用传统育种的方式很难实现新品种的培育，因此通过遗传转化的手段挖掘影响紫花苜蓿生长发育的基因并鉴定其功能，可以为紫花苜蓿新品种的选育提供理论参考和实践指导意义。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了一种紫花苜蓿NAC转录因子，所述转录因子蛋白为A1或A2或A3：
A1、氨基酸序列如序列SEQ ID NO：2所示的蛋白质；
A2、将A1经过取代、缺失和/或插入氨基酸而衍生的蛋白质；
A3、与A1具有98.95％以上同源性的蛋白质。
进一步地，所述蛋白为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过1～3个氨基酸的缺失、插入和/或取代得到的蛋白质。
进一步地，所述蛋白为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的蛋白质。
本发明的第二个方面提供一种所述的转录因子在抑制植物分枝中的应用。
本发明的第三个方面提供一种编码所述紫花苜蓿NAC转录因子蛋白的核酸序列，所述核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述序列为B1或B2或B3或B4：
B1、与SEQ ID NO.1第1～858位所示的核酸有≥97.9％的同源性的序列；
B2、能与SEQ ID NO.1第1～858位所示的核酸进行杂交的序列；
B3、为SEQ ID NO.1第1～858位所示的核酸序列中1～18个核苷酸的缺失、插入和/或取代得到的序列；
B4、为SEQ ID NO.1所示序列的5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的序列。
优选地，所述核酸序列包含一个NAC结构域。
优选地，所述核酸序列通过紫花苜蓿中克隆和/或人工合成方法获得。
本发明的第四个方面提供一种植物过表达载体，所述载体包括所述如SEQ IDNO.1所示核酸序列或B1或B2或B3或B4的序列。
本发明的第五个方面提供任一项所述核酸序列在抑制植物分枝中的应用。
本发明的技术效果为：
1)本发明克隆了一个与紫花苜蓿分枝相关的MsNAC73转录因子基因，该基因在茎中高表达，且定位在细胞核中，可减少转基因紫花苜蓿的分枝数。
2)本发明为其有效应用提供依据，对提高植物的产量和改良植物的株型，特别是减少紫花苜蓿分枝新品种的培育具有重要意义。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1为MsNAC73基因的PCR扩增结果示意图；
图2为MsNAC73氨基酸序列分析示意图；
图3为MsNAC73基因在不同组织中的表达模式示意图；
图4为MsNAC73在烟草表皮细胞中的亚细胞定位示意图；
图5为MsNAC73基因在转基因紫花苜蓿中的PCR和鉴定鉴定结果示意图；
图6为野生型和MsNAC73转基因紫花苜蓿分枝表型示意图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1：MsNAC73基因的克隆及序列分析
植物材料准备：将紫花苜蓿WL525种子清洗干净，均匀撒在铺有双层充分浸湿的滤纸的托盘上，一周后幼苗长出第一片真叶，将生长状态良好且一致的幼苗移栽在1/2Hoagland营养液(pH＝5.8)中培养，每隔一天换一次营养液。Hoagland营养液配方为：KNO30.34g/L、NH4NO3 0.053g/L、Ca(NO3)2·4H2O 0.62g/L、MgSO40.24g/L、KH2PO4 0.06g/L、FeSO4·7H2O 0.02785g/L、EDTA-Na2 0.0373g/L、MgCl20.67mg/L、H3BO3 0.38mg/L、ZnSO4·7H2O 0.29mg/L、MnSO4 0.2mg/L、CuSO4 0.01mg/L)，28℃，16h光照/8h黑暗条件培养。培养2周后，取叶片0.2g，立即用锡箔纸包裹好液氮冷冻，保存至-80℃超低温冰箱。
总RNA的提取及cDNA的合成：叶片总RNA利用EasyPure Plant RNA Kit(购自全式金)提取，用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(购自全式金)进行cDNA的合成。
引物的设计与合成：以蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中与该基因同源性较高的NAC基因为根据，设计该基因序列引物并在生工生物公司合成，以紫花苜蓿WL525 cDNA为模板，上游引物序列和下游引物序列为：F-WL525(SEQ ID NO.3)：5’-ATGACTCAGTGTAGTTAC-3’，R-WL525(SEQ ID NO.4)：5’-TCAAGGAATGAAAGAAGT-3’，按照以下反应体系及条件进行PCR扩增：25μL体系，内含2×EX Taq super PCR Mix(购自TaKaRa)12.5μL，10μmol/L的引物F和引物R各1μL，cDNA 2μL，ddH2O补足至25μL。反应条件：预变性94℃5min；94℃30s,57℃30s,72℃1min,30个循环；72℃延伸7min。MsNAC73基因序列的PCR扩增结果如图1所示。扩增片段凝胶电泳结束后回收产物并连接至克隆载体pMD18-T(购自TaKaRa)，转化大肠杆菌DH5α(购自上海唯地生物技术公司)，鉴定后送生工生物测序，MsNAC73基因开放阅读框序列全长为858bp，详细序列结果如SEQ ID N0.1所示。
实施例2：MsNAC73氨基酸序列分析
根据MsNAC73开放阅读框序列推导出MsNAC73是一个由285个氨基酸残基组成的蛋白质，详细序列如SEQ ID No.2所示。利用DNAMAN软件对蒺藜苜蓿中MtNAC73和MsNAC73进行氨基酸序列比对，结果如图2A所示。在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析MsNAC73蛋白包含的保守域，结果显示MsNAC73属于NAC转录因子家族中NAM(no apical meristem)亚家族，搜索结果如图2B所示。
实施例3：MsNAC73在不同组织中相对表达量分析
植物材料的准备过程同实施例2，分别取紫花苜蓿的根尖(0-1cm)、根基部(2-8cm)、顶芽、节、幼叶、成熟叶、老叶、茎、叶柄以及托叶各0.2g，液氮冷冻后保存至-80℃超低温冰箱。
不同组织总RNA的提取以及cDNA的合成方法同实施例2。根据MsNAC73的cDNA序列设计特异性引物F-MsNAC73(SEQ ID NO.5)：5’-ATTACCAGGTGTCGGCAAAGATGG-3’,R-MsNAC73(SEQ ID NO.6)：5’-TCACTTCCATCAGCATCTGTGTGC-3’，紫花苜蓿伸长因子MsEF-α为内参基因，上游引物序列和下游引物序列为：F-MsEF-α(SEQ ID NO.7)：5'-GCACCAGTGCTCGATTGC-3'，R-MsEF-α(SEQ ID NO.8)：5'-TCGCCTGTCAATCTTGGTAACAA-3'。在Bio-Rad实时定量PCR仪上进行定量检测。PCR反应体系为：10μL 2×SYBR qPCR SuperMix(购自全式金)、上游引物和下游引物各0.4μL、cDNA 2μL、补水至总体积20μL。反应程序为94℃30s；95℃5s,57℃15s,72℃15s,40个循环。每个处理3次生物学重复，3次技术重复。采用2-ΔΔCT法分析数据，SAS9.0进行统计分析，Sigmplot10.0进行作图。MsNAC73表达模式如图3所示。
实施例4：MsNAC73在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。
植物表达载体构建：以MsNAC73-pMD18-T质粒为模板，设计带有特异性酶切位点的引物进行PCR扩增并将其连接至pMD18-T载体上，双酶切产物胶回收后将其与同样限制性酶切位点的线性化pHB-YFP载体链接，转化大肠杆菌，菌液PCR验证后提取质粒，转化农杆菌感受态GV3101。
瞬时转化烟草叶片：分别挑取含有pHB-MsNAC73-YFP和pHB-YFP(空载)的农杆菌单克隆，添加在含有Kan50和Rif100的LB液体培养基中，放置在28℃摇床上200rpm培养至OD600为1.2左右，5000rpm离心15min，集菌后用MS液体培养基重悬，调OD600为0.6，同时加入AS和MES(终浓度分别为用0.2mM和10mM)，轻轻混匀，室温暗处放置3h以上。用1mL的一次性注射器吸将菌液注射烟草叶片背面，暗处培养48h，剪取1cm2已注射的烟草叶片在荧光共聚焦显微镜下观察，结果如图4所示，MsNAC73定位于细胞核。
实施例5：MsNAC73基因转化紫花苜蓿及转基因株系的鉴定
植物表达载体构建过程同实施例4，本实施例中植物表达载体为pHB-Flag。
转化紫花苜蓿：将含有pHB-MsNAC73-Flag农杆菌菌株GV3101的单克隆添加至含有抗生素Kan50和Rif100的LB液体培养基中，置于28℃摇床上200rpm培养至OD600为0.8，5000rpm 18℃离心15min收集菌液，用重悬液在无菌培养瓶中将OD600调为0.4。将无菌幼苗(甘农3号)的叶片轻微夹伤后放置在上述菌液中，抽真空10min后，在超声清洗仪中超声(2～3min)至菌液微微发绿，再抽真空10min，将侵染后的叶片放置在无菌三折纸中间，25min后将叶片平铺再共培养培养基上，暗处培养5天后转移至选择培养基上，光下培养4周，期间2周继代一次。待分化出愈伤组织，将愈伤组织转移至再生培养基上培养6-8周，期间2周继代一次；待真叶长出，将幼苗转移至生根培养基上，4～8周后根系形成，移栽在营养土(草炭：蛭石＝1：2)里培养并扦插扩繁，抗性幼苗如图5A所示。
上述遗传转化方法培养基配方参考文献：Chunxiang Fu,Timothy Hernandez,Chuanen Zhou et al.Agrobacterium Protocols,Springer New York,2015.
转基因紫花苜蓿的筛选及鉴定：
抗性基因PCR验证：取野生型和MsNAC73转基因植株叶片0.2g，液氮中充分研磨后提取基因组DNA(DNA提取试剂盒购买自全式金)，PCR验证潮霉素基因，上游引物和下游引物序列为：F-潮霉素(SEQ ID NO.9)：5′-GGATATGTCCTGCGGGTAAA-3′；R-潮霉素(SEQ IDNO.10)：5′-ATTTGTGTACGCCCGACAGT-3′，PCR反应体系同实施例1，延伸时间为1min，凝胶电泳结果如图5B所示。
相对表达量检测：提取野生型和MsNAC73转基因株系叶片的总RNA，提取方法同实施例2，相对表达量检测过程同实施例3，结果如图5C所示，获得MsNAC73过表达阳性株系。
实施例6：MsNAC73转基因紫花苜蓿分枝表型分析
挑选生长一致的野生型和转基因植株，取其同样位置的茎节，去除多余的叶片，仅保留最顶端完全张开的叶片，底端切口处蘸取生根粉后在1:1基质和蛭石的材料中进行培养。分别在生长5天和30天后，观察其生长表型，统计分枝、叶片以及节间的数目，结果如图6所示，转基因株系的分枝数、叶片数以及节间数都明显小于野生型。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种紫花苜蓿NAC转录因子，其特征在于，所述转录因子蛋白的氨基酸序列如序列SEQ ID NO：2所示。
2.一种如权利要求1所述的转录因子在抑制植物分枝中的应用。
3.一种编码如权利要求1所述的紫花苜蓿NAC转录因子蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列包含一个NAC结构域。
5.一种如权利要求3所述的多核苷酸的制备方法，其特征在于，所述多核苷酸通过紫花苜蓿中克隆和/或人工合成方法获得。
6.一种植物过表达载体，其特征在于，所述载体的序列包括如权利要求3所述的多核苷酸的序列。
7.如权利要求3所述的多核苷酸在抑制植物分枝中的应用。
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