CN103710357A

CN103710357A - 紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用

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Publication number: CN103710357A
Application number: CN201310717761.4A
Authority: CN
Inventors: 申玉华; 徐振军; 杨晓坡; 林景卫; 李望丰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-12-23
Also published as: CN103710357B

Abstract

本发明涉及一种紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用。本发明应用RT-PCR和RACE技术从紫花苜蓿基因组中克隆NAC家族相关基因，命名为MsNAC2，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，并构建了含有加强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的融合表达载体。本发明应用荧光定量PCR技术分析了该基因在紫花苜蓿中的表达模式，以及该基因与逆境胁迫（冷害，盐害，干旱）之间的关系，发现该基因在烟草中过表达可提高转基因烟草植株的抗寒、抗旱和耐盐性，该基因可用于其他单双子叶植物的遗传转化，提高其抗逆性。

Description

紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用。

背景技术

NAC转录因子(包括NAM、ATAF1/2和CUC2)是植物特有的一种具有多种调控作用的转录因子，广泛存在与陆生植物中，这类转录因子的主要结构特点是N端为保守的大约150个氨基酸残基的NAC结构域，可以结合DNA和其他蛋白，可以分成从A～E5个保守区；C端则为高度多样性的转录激活调控区，富含丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸等，研究发现有些NAC蛋白的C-端具有蛋白结合活性。目前已有研究表明NAC家族的一些成员在逆境应答网络中起作用。拟南芥中ANAC019、ANAC055和ANAC072受到干旱、高盐以及脱落酸(ABA)的诱导表达，它们能显著提高植株的耐旱能力(Tran et al.,2004)。拟南芥LOV1基因能增强植株的抗冻能力(Yoo et al.,2007)。来自水稻的SNAC1/2(stress-responsive NAC2)基因受到干旱、高盐、低温、伤以及ABA的诱导表达，其过表达植株耐冷、抗盐并能抵御干旱(Hu et al.,2008)。过量表达OsNAC6基因的水稻虽然生长慢、产量低，但却显示出对干旱、高盐以及枯萎病的较强抗性(Nakashimaet al.,2007)。尽管NAC基因的功能还有待深入研究，但它们在植物遗传工程方面已展现出了巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用。

本发明提供紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2，其具有：

1）SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；或

2）SEQ ID No.11所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明提供了含有上述基因MsNAC2的表达载体。

在本发明的一个实施例中，得到的含有基因MsNAC2的表达载体为pBIGFP-MsNAC2。

该表达载体的构建方法为：以紫花苜蓿叶的总RNA反转的cDNA为模板，进行PCR反应，引物序列为：

上游引物：5′-TCTAGAATGATCAGTCGATGGAAACACTTC-′3（SEQ ID NO.13）

下游引物：5′-GGTACCGACTTGGGCAGATACATAAAGAC-′3（SEQ ID NO.14）；

将RT-PCR扩增产物回收后连接在pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，选取阳性克隆进行测序，用XbaI和KpnI将MsNAC2基因从pMD18-T上卸载下来，回收后连接到含有eGFP植物表达载体pBIGFP的XbaI和KpnI位点中，构建得到pBIGFP-MsNAC2。

含有上述表达载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了含有基因MsNAC2的转化植物细胞。

本发明提供了MsNAC2基因在制备转基因植物中的应用。

优选地，所述的植物为拟南芥、烟草、洋葱、水稻或棉花。

本发明提供了MsNAC2基因在提高植物抗逆性方面的应用。

所述的抗逆性是指抗寒、抗旱或耐盐性。

本发明还提供了克隆紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2的方法，包括以下步骤：

（1）利用RT-PCR方法从紫花苜蓿基因组中扩增获得NAC的保守区片段序列；

（2）根据步骤（1）的保守区序列设计3′RACE引物，然后以紫花苜蓿总RNA为模板，进行3′RACE片段扩增；

（3）设计5′RACE引物扩增5′RACE片段；

（4）用DNAMAN5.2软件将保守区序列，3′RACE片段和5′RACE片段拼接成完整的全基因序列。

其中，步骤（1）的RT-PCR方法中，所用引物序列为：

上游引物序列为5′-ACCAAACGGTTCAAGGCCGAACC-′3（SEQID NO:1），下游序列为5′-CGATACTCGTGCATGATCCAATTG-′3（SEQ ID NO:2）。

步骤（1）紫花苜蓿的总RNA经反转录后得到cDNA，其PCR反应程序为：94℃预变性5min，（94℃10s，55℃20s，72℃1min）30个循环，72℃10min。

其中，步骤（2）的3′RACE引物序列为5′-GTTCAAGGCCGAACCGGGCTG-3′（SEQ ID NO:3）。该步骤使用3′-Full RACE Set Agarose Regular试剂盒扩增3′RACE片段。

其中，步骤（3）的5′RACE引物5′-AGCCCGGTTCGGCCTTGAACC-3′（SEQ ID NO:4）。该步骤使用5′-Full RACE Set Agarose Regular试剂盒扩增5′RACE片段。

本发明具有下列优点及有益效果：

本发明提供了紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2（核苷酸序列如SEQ ID No.11所示）及其在作物育种中的应用。该基因不仅受低温和高盐诱导高表达，而且还受干旱和ABA胁迫诱导表达。洋葱表皮亚细胞定位研究表明MsNAC2为核定位基因。先前报道的抗逆基因在功能方面多数具有单一性，而研究发现本发明MsNAC2基因在提高转基因烟草植株的抗寒、抗旱和耐盐性等方面均据有较明显的功效。该基因可用于其他单双子叶植物的遗传转化，显著提高其抗逆性。

附图说明

图1为融合表达载体pBIGFP-MsNAC2结构示意图。

图2为表达载体pBIGFP结构示意图。

图3为MsNAC2在胁迫诱导后的相对表达。其中，A图为250mMNaCl胁迫处理下MsNAC2在叶片和根中的相对表达；B图为10%PEG6000胁迫处理下MsNAC2在叶片和根中的相对表达；C图为100μM ABA诱导下MsNAC2在叶片和根中的相对表达；D图为4℃处理下MsNAC2在叶片和根中的相对表达。

图4为MsNAC2基因亚细胞定位照片。其中，A图为含MsNAC2-GFP融合基因的转基因烟草在白光下的图片；B图为含MsNAC2-GFP融合基因的转基因烟草在紫外光下的图片；C图为对照组只含GFP绿色荧光蛋白基因的转基因烟草在白光下的图片；D图为对照组只含GFP绿色荧光蛋白基因的转基因烟草在紫外光下的图片。

图5为逆境胁迫下转MsNAC2基因烟草生长情况，250mM NaCl处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部失绿，变为淡黄色。

图6为逆境胁迫下转MsNAC2基因烟草生长情况，10%PEG处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部变为水渍状。

图7为逆境胁迫下转MsNAC2基因烟草生长情况，4℃处理6d后再进行恢复培养10d后，转基因烟草植株叶片要明显大于野生型，根系也比野生型发达。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2的获得

首先根据豆科植物花生NAC转录因子基因AhNAC2和AhNAC3（EU755023和EU755022）序列，设计苜蓿NAC基因同源引物，上游引物序列为5′-ACCAAACGGTTCAAG GCCGAACC-′3（SEQ ID NO.1），下游序列为5′-CGATACTCGTGCATGATCCAATTG-′3（SEQ ID NO.2）。然后，利用RT-PCR技术从紫花苜蓿基因组中首先扩增获得NAC的保守区片段序列。

1、紫花苜蓿总RNA的提取：采用TaKaRa RNAiso Plus提取总RNA。

2、cDNA第一链的合成：

反应体系如下：

反转录程序为：42℃60min，70℃15min。

3、PCR反应：

PCR反应程序为：94℃预变性5min，（94℃10s，55℃20s，72℃1min）30个循环，72℃10min。

4、保守区克隆：将上述RT-PCR扩增产物用Takara DNA凝胶回收试剂盒进行回收，回收产物连接在pMD18-T载体上，操作步骤按Takara pMD18-T说明书进行。连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基上培养，挑取单克隆菌落，用Takara质粒提取试剂盒提取质粒，用EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定后，选取阳性克隆进行测序，测序由北京英俊生物公司完成。

5、RACE

根据保守区序列设计引物：

3′RACE上游引物：5′-GTTCAAGGCCGAACCGGGCTG-3′（SEQ ID NO.3）

5′RACE下游引物：5′-AGCCCGGTTCGGCCTTGAACC-3′（SEQ ID NO.4）

使用3′-Full RACE Set Agarose Regular试剂盒进行3′RACE片段扩增。使用5’-Full RACE Set Agarose Regular试剂盒进行5′RACE片段扩增。

6、最后用DNAMAN5.2软件将保守区序列，3′RACE片段和5′RACE片段拼接成完整的全基因序列。拼接长度为1358bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。将该序列输入NCBI blastp中发现，这个基因编码的氨基酸序列与豆科植物NAC家族基因亲缘关系很近。比如与蒺藜苜蓿NAC基因同源性为89%，与鹰嘴豆NAC基因同源性为87%，与大豆NAC基因同源性为结构同源性＞77%。因此该基因是一个新鉴定的NAC家族的基因，并将其命名为MsNAC2。

实施例2实时荧光定量PCR检测MsNAC2基因在逆境胁迫条件下在紫花苜蓿中的表达特性

将生长两周的苜蓿幼苗转入分别含有250mmol·L^-1NaCl、10%PEG6000、100μmol·L^-1脱落酸（ABA）MS液体培养基中进行胁迫处理，冷害处理则是在4℃冰箱中进行。PEG6000、ABA和4℃的处理时间为1、2、4、8、12和24h，NaCl的处理时间为1、2、4、8、12、24和48h，以未作处理的做对照，处理完成后分别提取叶片和根的总RNA，根据MsNAC2的全长cDNA序列设计荧光定量表达引物，上游引物序列为5-TGGTGAAGATGACCCTTTTGC-3′（SEQ IDNO:5），下游引物序列为5′-AAGCTCCACTTGCAGTTGCAG-3′（SEQID NO:6）。以紫花苜蓿Actin基因（EU664318）为内参基因，内参基因上游引物序列为5′-CAGGTCGTGATCTCACAGACG-3′（SEQ IDNO:7），下游引物序列为5′-TCTTCTCAACAGCTGAGCTCG-3′（SEQID NO:8）。用SYBR Green I法对不同胁迫处理时间点的样品进行实时Real-Time PCR定量分析，参见图3。在本实验设定的处理时间范围内，MsNAC2在冷胁迫下诱导效果最明显（图3中的D图），2h时在根中的表达量达到最高峰，为对照的4.408倍，随后表达量降低，在24h时达到第二个峰值，为对照的3.387倍。在叶片中的表达是先降低而后逐渐升高，在12h时为对照的1.029倍，24h时为对照的2.412倍；PEG胁迫下（图3中的B图），1h时MsNAC2表达量在根中达到第一个峰值，为对照的1.496倍，随后表达量降低，在12h时达到第二个峰值，为对照的1.347倍。而在叶片中的表达量均低于对照组；在ABA诱导下（图3中的C图），1h时MsNAC2表达量在根中达到最高峰，为对照的1.424倍，随后逐渐降低。在叶片中的表达量同样均低于对照组；MsNAC2在250mM NaCl胁迫下呈现的表达趋势是先下降而后升高，在48h时MsNAC2表达量在根中为对照的1.469倍。同样MsNAC2基因在根中的表达量要明显高于在叶片中的表达量（参见图3中的A图）。定量分析结果表明，该基因在冷害胁迫下在根部和叶片中均上调表达，在盐胁迫、干旱胁迫和ABA诱导下，在根部上调表达，在叶片中表达量下调。

实施例3MsNAC2基因的亚细胞定位

将MsNAC2基因构建到含有eGFP基因的融合表达载体pBIGFP中，构建成融合表达载体pBIGFP-MsNAC2（详见实施例4）。然后结合农杆菌介导的瞬时表达技术以及激光共聚焦检测技术，成功的将表达载体pBIGFP-MsNAC2转化洋葱表皮。然后在荧光显微镜下观察该基因的表达部位，以不含MsNAC2的载体pBIGFP为对照，结果见图4，其中，转pBIGFP-MsNAC2的洋葱表皮细胞，在紫外光下只有在细胞核中可以观察到GFP绿色荧光信号（图4中的B图），图4中的A图为转pBIGFP-MsNAC2的洋葱表皮细胞在白光下的照片；而对照组，转pBIGFP的洋葱表皮细胞的细胞核内和细胞质中都可以观察到清晰的GFP的绿色荧光信号（图4中的D图），图4中的C图为转pBIGFP的洋葱表皮细胞在白光下的照片。结果表明MsNAC2基因为核定位基因。

实施例4植物表达载体pBIGFP-MsNAC2的构建

1、根据分离出的紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2设计引物：

上游引物：5′-TCTAGAATGATCAGTCGATGGAAACACTTC-′3（SEQ ID NO.13）

下游引物：5′-GGTACCGACTTGGGCAGATACATAAAGAC-′3（SEQ ID NO.14）

以紫花苜蓿叶的总RNA反转的cDNA为模板，进行PCR反应。

2、将上述RT-PCR扩增产物进行回收，回收产物连接在pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，选取阳性克隆进行测序。

3、用XbaI和KpnI将MsNAC2基因从pMD18-T上卸载下来，回收后连接到含有eGFP植物表达载体pBIGFP的XbaI和KpnI位点中，植物表达载体构建完成，命名为pBIGFP-MsNAC2。该载体结构图见图1。

实施例5紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2转化烟草

将构建好的植物表达载体转化农杆菌LBA4404。用电击法将质粒pBIGFP-MsNAC2转到农杆菌LBA4404中，然后用农杆菌侵染烟草叶盘，叶盘在含有卡那霉素筛选培养基（MS+0.5mg/L BA+0.01mg/LIAA+Kana50mg/L）的选择下，成功的诱导和筛选出抗性小芽，将抗性小芽转入生根培养基（1/2MS+0.5mg/L IBA+Kana50mg/L）中诱导出茁壮的根，然后移入花盆中炼苗，获得转基因烟草。

随机选取10株转基因烟草，提取DNA进行PCR检测，以野生型烟草为对照。PCR检测，根据与目的基因MsNAC2并联的抗性筛选基因NPTII来设计引物，上游引物为5'-AACAGACAATCGGCTGCTCT-3'（SEQ ID NO.9），下游引物为5'-CCACCATGATATTCGGCA AGCA-3'（SEQ ID NO.10），PCR能够扩增出550bp的片段。PCR结果表明，这10株转化植株全部是PCR阳性材料，这初步证明了外源基因已经整合到烟草基因组中。（NPTII基因和MsNAC2基因并联在同一个表达载体上，NPTII是pBIGFP-MsNAC2载体上的一种标记基因）

实施例6紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2转化烟草阳性植株的功能分析

待实施例5获得的阳性转基因烟草开花结实后，收集T1代转基因种子进行胁迫实验。

将转基因烟草种子和野生型烟草种子同时播种在MS₀培养基上进行发芽，待幼芽萌发20d后，将幼芽分别移栽至分别含有250mMNaCl和10%PEG的MS培养基中，20d后记录结果。冷害处理时将发芽后30d的烟草幼苗放置在4℃冰箱中，冷处理6d后再进行恢复处理10d，然后记录结果。

（1）250mM NaCl处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部失绿，变为淡黄色，结果见图5。（耐盐性）

（2）10%PEG处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部变为水渍状，结果见图6。（抗旱性）

（3）4℃处理6d后再进行恢复培养10d后，转基因烟草植株叶片要明显大于野生型，而且，根系也比野生型发达，结果见图7。（抗寒冷）

上述结果证明，来源于紫花苜蓿NAC转录因子基因（MsNAC2）是一个有效的逆境相关基因，能够应用于培育转基因抗逆植物的操作中，可显著提高植物的抗逆性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种紫花苜蓿逆境响应基因，其为MsNAC2，具有：

1）SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；或

3）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述基因的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其为pBIGFP-MsNAC2。

4.含有权利要求2或3所述载体的宿主细胞。

5.权利要求1所述的基因在制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1所述的基因在提高植物抗逆性方面的应用。

7.克隆权利要求1所述紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）设计5′RACE引物扩增5′RACE片段；

（4）用软件将保守区序列，3′RACE片段和5′RACE片段拼接成完整的全基因序列，得到紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1）的RT-PCR方法中，所用引物序列中上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游序列如SEQ ID NO.2所示。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（2）的3′RACE引物序列如SEQ ID NO.3所示。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（3）的5′RACE引物序列如SEQ ID NO.4所示。