CN100471953C - 新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn,以及培育耐逆植物的方法 - Google Patents
新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn,以及培育耐逆植物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100471953C CN100471953C CNB2006100114934A CN200610011493A CN100471953C CN 100471953 C CN100471953 C CN 100471953C CN B2006100114934 A CNB2006100114934 A CN B2006100114934A CN 200610011493 A CN200610011493 A CN 200610011493A CN 100471953 C CN100471953 C CN 100471953C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plant
- gene
- expression vector
- cknhx
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 238000010008 shearing Methods 0.000 title description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 63
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 241000223019 Caragana korshinskii Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 24
- 241000223025 Caragana microphylla Species 0.000 claims description 16
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims description 4
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000124033 Salix Species 0.000 claims description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 claims 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 claims 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 10
- 108090000084 Antiporters Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 25
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102100026397 ADP/ATP translocase 3 Human genes 0.000 description 5
- 101000718437 Homo sapiens ADP/ATP translocase 3 Proteins 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000003669 Antiporters Human genes 0.000 description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 4
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- RTYJTGSCYUUYAL-YCAHSCEMSA-L carbenicillin disodium Chemical compound [Na+].[Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)C(C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 RTYJTGSCYUUYAL-YCAHSCEMSA-L 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000250366 Nicotiana gossei Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001494501 Prosopis <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 235000001560 Prosopis chilensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000014460 Prosopis juliflora var juliflora Nutrition 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N hygromycin A Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](C(=O)C)O[C@@H]1Oc1ccc(\C=C(/C)C(=O)N[C@@H]2[C@@H]([C@H]3OCO[C@H]3[C@@H](O)[C@@H]2O)O)cc1O YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000004162 soil erosion Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010937 topological data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明提供了一种新的CkNHX基因和其剪切修饰基因CkNHXn。该基因来源于灌木植物柠条(Caragana korshinskii Kom)。该基因编码Na+/H+逆转运蛋白。利用所克隆得到的cDNA，构建了酵母表达载体和植物表达载体。利用酵母突变株通过互补实验验证了该基因的耐盐功能。此外，还获得了转基因植物。针对转化植株的抗盐性能的测试表明，该基因的转入可以使转基因植物具有抗盐性。
Description
技术领域
本发明涉及一种Na+/H+逆转运蛋白CkNHX以及修饰蛋白CkNHXn。具体地，本发明涉及一种来源于沙漠灌木植物柠条(Caragana korshinskii Kom)的NHX类Na+/H+逆转运蛋白，命名为CkNHX，以及其修饰蛋白CKNHXn。本发明还涉及编码这类Na+/H+逆转运蛋白的基因，含有这类基因的载体，和利用这类基因培育耐盐植物的方法。
背景技术
由于生态环境的变化，加上干旱、少雨和土地的盐碱化，可导致可耕种土地的大面积盐渍化，严重影响人类的生存(Wang W X，Vinocur B，AltmanA(2003).Plant responses to drought，salinity and extremetemperatures：towards genetic engineering for stress tolerance.Planta，218：1-14)。如何改良盐碱地，维护生态环境，抑制水土流失，恢复植被，培育耐逆性植物是作物、林牧草育种的主要目标之一。尤其是传统的林木耐盐、抗旱抗逆品种(系)遗传改良途径主要采用杂交育种、选择育种等方法，但由于林木繁殖周期长，遗传杂合性高，许多性状的遗传机理不明，使得利用常规育种手段很难定向培育出具有耐盐性状的林木新品种。将基因工程技术与常规育种方法相结合，可望在培育出转基因的抗盐新树种，为我国西部长远、高效和持续育种提供保障。
Na+/H+逆转运蛋白基因编码的是定位于液泡膜上的一类离子膜转运蛋白，可以通过将钠离子在胞内区域化，维持胞内离子动态平衡，极大地消除这类离子胁迫对植物正常的生理代谢和细胞组织结构的影响和破坏，提高植物的耐逆性(Apse M P，Aharon G S，Snedden W A，Blumwald E(1999).Salttolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ 0antiporterin Arabidopsis.Science，285：1256-1258)。该类基因定位于植物液泡膜上，可增强植物的耐盐性(Venema K，Quintero F J，Pardo J M，and DonaireJ P(2002)The Aaradbi dopsis Na+/H+ exchanger AtNHX1 catalyzes lowaffinity Na+ and K+ transport in reconstituted liposomes.JBC 277(4)：2413-2418)。目前尚未检索到来自灌木植物柠条的编码NHX的基因CkNHX。
发明人从沙漠灌木植物柠条(Caragana korshinskii Kom)分离、克隆到编码NHX类Na+/H+逆转运蛋白的基因，命名为CkNHX，所编码的蛋白命名为CkNHX。此外，对该蛋白进行了剪切修饰，构建了较CkNHX蛋白耐盐活性高的CkNHXn蛋白。此外，构建了分别适用于单、双子叶植物的表达载体，转化双子叶模式植物烟草和木本模式植物毛白杨。转基因植株具有明显的耐盐性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有较强耐盐性的CkNHX基因，该基因来源于柠条(Caragana korshinskii Kom)，其核苷酸序列与氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。应当指出的是，对本发明的NHX类Na+/H+逆转运蛋白进行一个或几个非保守区域氨基酸的替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因而，本发明也包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少90％同源性，尤其具有至少95％的同源性，但同时具有柠条中CkNHX基因活性的功能类似物。
本发明的另一个目的是提供一种编码柠条CkNHX的基因，在SEQ ID NO：1中所示的基因为来源于柠条的NHX类基因，含有NHX类基因保守的Na_H_exchanger结构域序列，但不限于所列的序列。由于这类基因所编码的蛋白是定位于叶泡膜上的，是植物膜蛋白，目前在国际上较难获得这类纯化蛋白，但可以采用互补法来验证该基因所编码的蛋白功能。该基因的酵母功能互补实验表明该基因的转入的确可以提高酵母耐盐敏感菌株的耐盐性。
本发明的另一个目的是提供一种编码柠条CkNHXn的剪切基因，所述序列见SEQ ID NO：3，其编码的蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：4，其酵母互补实验呈现出较全长CkNHX蛋白强的耐盐活性。
本领域的普通技术人员可以理解，对本发明的基因进行一个或几个核苷酸的替换、插入或缺失所得到的具有其相同功能的类似物同样也包含在本发明的范围内。
本发明的再一个目的是提供一种培育耐盐植株的方法，该方法包括用本发明的基因CkNHX或CkNHXn构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成植株。
本发明的又一个目的是提供一种包含本发明基因CkNHX或CkNHXn的表达载体。可使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括但不限于，双元农杆菌载体，例如pBIN19，pBI121，pB221，含DRE、ARE元件的启动子以及用于单子叶植物微弹轰击的载体。载体还可包括3’非翻译区域。3’非翻译区域是指一种基因的部分，它含有一种包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA前体加工或基因表达的DNA片段。本发明的CkNHX基因的3’非翻译区域可被用于在植物中表达。
本发明的载体也可含有适当的启动子。在本发明中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)和Ubiqutin启动子。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
本发明的表达载体在需要时也可包括增强子，不论是翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域包括但不限于ATG起始密码子和邻接区域。起始密码子必需与编码区域的阅读框同向，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是多种不同的来源，可以是天然的或合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域，或来自结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。同样，可使用产生通过颜色变化(例如GUS)或发光(例如荧光酶)来识别的化合物的酶，或抗化学试剂(例如除萎剂)。另外，也可不用任何筛选标记。
本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，电穿孔、激光穿孔等导入植物细胞。
可使用本发明的方法转化的植物宿主包括单子叶植物和双子叶植物，例如：杨树、豆科灌木、禾本科牧草和作物(小麦、玉米、水稻)、苜蓿、大豆、油菜、棉花、花生等。
附图说明
图1.CkNHX基因cDNA全长序列，SEQ ID NO：1。
图2.CkNHX基因所编码的氨基酸序列，SEQ ID NO：2。
图3.CkNHX所编码膜蛋白的跨膜和磷酸化位点分布的拓扑图，其中圆圈所示的为磷酸化位点，斜体数字为磷酸化的氨基酸位点，其余为可能的跨膜处氨基酸位点；CYT表示为胞质界面；VAC表示叶泡内面。
图4.CkNHXn基因ORF核苷酸序列，SEQ ID NO：3。
图5.CkNHXn基因所编码的氨基酸序列，SEQ ID NO：4。
图6.CkNHX基因5’UTR核苷酸序列，SEQ ID NO：12。
图7.CkNHX基因3’UTR核苷酸序列，SEQ ID NO：13。
图8.CkNHX的酵母表达载体pYES2-NHX的构建图。
图9.CkNHXn的酵母表达载体pYES2-NHXn的构建图。
图10.转CkNHX和CkNHXn基因的酵母耐盐互补实验。
图11.CkNHX植物表达载体pCkNHX构建图。
图12.农杆菌转染CkNHX的烟草植株，转基因烟草筛选所用抗生素浓度，Kan 600mg/L，Cb 500mg/L。
图13.CkNHX转基因烟草的PCR鉴定。
图14.CkNHX转基因烟草的RT—PCR鉴定。
图15.烟草植株的耐盐性实验，(A)：野生烟草的耐盐试验；(B)：转CkNHX的烟草300mM的NaCl耐受试验。
具体实施方式
下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员应当理解，下述实施例不是用于限制的目的，本发明的实质性的保护范围由后附的权利要求所限定。
实施例中所用试剂如下：
高保真度Pyrobest Taq、Premix Ex Taq、AMV、RNA酶抑制剂、各种限制性内切酶、One Step RNA PCR试剂盒、pMD18-T Vector购自大连宝生(TaKaRa)公司；DNA纯化回收试剂盒购自鼎国生物技术公司；T4DNA连接酶和RNase A购自MBI公司；ABA、DNase(RNase free)购自Sigmag公司。
实施例1、柠条CkNHX基因的克隆
取生长2-3个月的柠条幼苗(购自中科院新疆吐鲁番沙漠植物园柠条种子萌发而成)为材料，用100uM ABA(Sigma公司)过夜诱导。取叶片，洗净后，放入经DEPC处理、灭菌后的匀浆器中，加入TRIzol(Invitrogen)研磨、匀浆，室温放置5分钟，加入氯仿抽提两次，取上清，用异丙醇沉淀总RNA，空气干燥后，溶于适量DEPC水。以带polyT的引物进行逆转录获得cDNA。
polyT的引物序列如下：
Oligo dT-Primer：5’-CGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ IDNO：5)
RT反应条件如下：
于65℃温浴10分钟，立即于冰上淬冷，然后加入
反应条件为1.30℃，10min；2.42℃，1h；3.99℃，5min；4.5℃，5min。取适量上述逆转录产物以下9对引物(三条正向引物与三条反向引物组合)进行PCR扩增(所设计引物为巢式PCR扩增引物，所获得扩增片段互有重叠)。
正向引物：
L1 5’-GCAGGGTTTCAGGTGAAAAAGAAGCA-3’(SEQ ID NO：6)
L2 5’-GAAAAATGGAAGTTTGTTAGTGATAGTCC-3’(SEQ ID NO：7)
L3 5’-CACCATGTCGGGGCACACTCAAC-3’(SEQ ID NO：8)
反向引物：
R1 5’-GTACAATGATGATGATGATGGGTCAGAG-3’(SEQ ID NO：9)
R2 5’-AGATGGCTTATGGTACACGGCCTTCTCG-3’(SEQ ID NO：10)
R3 5’-CTTCTCAACGCCATTGATGACCATTG-3’(SEQ ID NO：11)
PCR条件
1.95℃ 1min
2.94℃ 30s
3.60℃ 40s
4.72℃ 2min 2 29个循环
5.72℃ 10min
6.4℃ 终止反应
将PCR产物(L1分别与R1、R2、R3组合扩增的片段分别约为1.5Kb；L2分别与R1、R2、R3组合扩增的片段分别约为0.8Kb；L3分别与R1、R2、R3组合扩增的片段分别约为0.5Kb)分别连接到pUCm-T载体(MBI公司)上用于测序，将上述9个测序序列采用本领域公知公用的DNAMAN软件进行序列拼接后，在万维网上NCBI数据库中与已知NHX类基因(AF515632)进行比对分析，确证上述PCR克隆到的是NHX类基因片段。
再以这段经拼接的序列为模板设计以下引物分别从上述逆转录反应片段中进行5’、3’-RACE扩增，获得基因5’和3’端序列(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)。具体方法操作参见BD Biosciences Clontech的BDSMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Cat.No.634914)。
5’-RACE引物
5’-CGCCCAGTTCCAGTGGCCCAATATCCA-3’(SEQ ID NO：14)
3’-RACE引物
5’-CTTGGAAGAGCAGCTTTTGTTTTCCCC-3’(SEQ ID NO：15)
在基因5’和3’序列的基础上，设计以下特异性引物采用高保真Pyrobest Taq进行PCR扩增获得基因ORF全长。
正向引物(含BamH I酶切位点，以下划线示出)
5’-GCCGGATCCCGTCTTTCTCCTCTGTCTC-3’(SEQ ID NO：16)
反向引物(含Sac I酶切位点，以下划线示出)
5’-CGCGGAGCTCAATGATGATGATGATGGGTCAGAG-3’(SEQ ID NO：17)
PCR反应条件如下：
上述逆转录cDNA模板质粒 1μL
正反向引物各 1μL
dNTP 2μL
ddH2O 13.8μL
Pyrobest Taq 0.2uL
10×buffer 2μL
—————————————
Total： 20μL
PCR程序为：
a)95℃ 2min
b)94℃ 30s
c)55℃ 1min
d)72℃ 3min 2 29cycles
e)72℃ 10min
f)4℃ pause
所获得的CkNHX基因cds全长序列为2547bp(SEQ ID NO：1)，含有1618bp开放阅读框架，编码539个氨基酸组成的多肽(SEQ ID NO：2)，其5’端为652bp，3’端为262bp，并将其克隆入pMD18-T Vector中。
实施例2、CkNHXn基因的构建
参考文献报道(Yamaguchi T，Apse M P，Shi H Z，and Blumwald E(2003).Topological analysis of a plant vacuolar Na+/H+ antiporter revealsa luminal C terminus that regulates antiporter cation selectivity.PNAS.100(21)：12510-12515)，利用下述引物将第435位氨基酸后加上终止密码子形成C端截短的CkNHXn(即将第435位后肽段去处)(参见图3)。所用引物为：
正向引物为(含Sac I位点)
5’-CGCGCCGAGCTCATGGCTTTTGAAATTGTCT-3’ (SEQ ID NO：18)
反向引物为(含Xba I位点)
5’-CCGCGCTCTAGACTAAGTCATCAAACCAAACACC-3’(SEQ ID NO：19)
采用高保真度Pyrobest Taq，以上述逆转录产物为模板进行PCR扩增，方法同前。获得了约为1.3kb大小片段的CkNHXn基因(SEQ ID NO：3)，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。将该基因连入pMD18-T Vector，测序验证后采用Sac I和Xba I进行双酶切，连入用同样酶双切的pYES载体(Invortrogene)，构建成pYES-NHXn酵母表达载体(参见图9)。
实施例3、用于酵母功能互补实验
1.酵母表达载体的构建
按常规分子生物学手段(F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，精编分子生物学实验指南。科学出版社，2001)，以PCR技术在CkNHX编码区域以及CkNHXn编码区域两端分别引入SacI和XbaI位点，采用SacI和XbaI双酶切，然后连入用同样酶双切的pYES2.0(Invortrogene)，构建成pYES-NHX和pYES-NHXn两个酵母表达载体。其构建图谱如图8、9所示，经酶切、PCR鉴定和测序确保插入片段无误后，转入盐敏感酵母突变体ANT3(详见参考文献：Quintero FJ，Blattb MR，and Pardo JM(2000).Functional conservationbetween yeast and plant endosomal Na+/H+ antiporters.FEBS Lett 471，224-228)。具体操作参照Invortrogene pYES2.0 protocol，Cat No.V825-20。
2.酵母耐盐功能互补实验
1)将空载pYES2.0、pYES-NHX、pYES-NHXn分别转入酵母突变体ANT3(Jose M.Pardo博士馈赠，参见文献Quintero FJ，Blattb MR，andPardo JM(2000).Functional conservation between yeast and plantendosomal Na+/H+ antiporters.FEBS Lett 471，224-228)，并于基本SC培养基(详细配方参照Invortrogene pYES2.0 protocol，CatNo.V825-20)中30℃培养过夜，稀释到0.3OD，在含有2％半乳糖和1％棉子糖诱导SC培养基(详细配方参照Invortrogene pYES2.0protocol，Cat No.V825-20)中，诱导培养4-6hr。
2)将诱导后的菌液进行10倍系列梯度稀释(1×、10×、100×、1000×及5000×)，点4μl于70mM NaCl的选择性SC平板培养基(详细配方参照Invortrogene pYES2.0 protocol，Cat No.V825-20)上，30℃培养4-5天，观察照相。结果见图10。
由于所获得盐敏感酵母突变体ANT3对盐敏感(即不耐盐)，而一旦在该酵母菌株中转入耐盐基因，可以增强该菌株的耐盐能力。在图10中，第一行为含有空载体pYES2.0的酵母突变体ANT3在70mM NaCl培养基上的生长情况。可见在菌液稀释10倍、100倍时，其仍然可以生长；但稀释1000倍和5000倍时，则不能生长。而转入有pYES-NHX和pYES-NHXn的菌株在1000倍和5000倍稀释时，仍然可以生长，且第三行的pYES-NHXn菌株在稀释1000倍时与pYES-NHX相比生长状况较好。这个酵母互补实验表明CkNHX和CkNHXn两个基因序列的转入可增强该盐敏感酵母突变体ANT3对盐的耐受性。这两个基因片段所表达的蛋白均具有耐盐能力，且表达部分缺失序列CkNXn具有比CkNHX更强的耐盐性。
实施例4、用于转化的植物表达载体的构建
CkNHX表达载体的构建按常规分子生物学手段进行(F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，精编分子生物学实验指南。科学出版社，2001)。以实施例1中扩增得到的CkNHX基因为模板，PCR扩增该基因的ORF(采用pyrobestTaq(TaKaRa公司))。
所用引物如下：
正向引物(含BamH I位点)：
5’-CGCCGGATCCATGGCTTTTGAAATTGTCTCAA-3’(SEQ ID NO：20)
反向引物(含Sac I位点)：
5’-GTCAGAGCTCTCAACGCCATTGATGACCATT-3’ (SEQ ID NO：21)
PCR反应体系及条件同前。
获得约1.6Kb PCR产物片段，回收。采用BamH I和Sac I双酶切，将其插入pBI121双元表达载体(Chen PY，Wang CK，Soong SC，To KY(2003)Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application incloning T-DNA insertion from transgenic plants.Molecular Breeding11：287-293)中CaMV 35S启动子后面，得到一个双元表达载体，其图谱如图11所示，经测序鉴定插入片段无误后，转化农杆菌LBA4404(Hoekema A，Hirsch PR，Hooykaas PJJ，Schi lperoort RA(1983)A binary plant vetorstrategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacteriumtumefaciens Ti-plasmid.Nature 303：179-180)，再提质粒，经酶切、PCR确认后，证明成功转化入农杆菌中，该表达载体可直接用于植物，如烟草、毛白杨、禾本科牧草等植物的转化。
实施例5、CkNHX基因的烟草转化
1.植物材料的准备
在不含激素的MS培养基上(刘敏著，花卉组织培养与工厂化生产，地质出版社，2006年6月，19—20页)培养烟草(W38)(中科院植物所)的无菌苗，培养温度为25-28℃。
2.农杆菌的培养
将含有目的表达载体的农杆菌接种到20ml(30mg/L Str、50mg/L Kan)YEP液体培养基(详细配方参照Invortrogene pYES2.0 protocol，CatNo.V825-20)中，28℃，220rpm摇菌16-18h，使农杆菌培养至对数期OD600值0.6-0.8。
取菌液1-2mL转入40mL不含抗生素的YEP中，28℃，220rpm摇菌过夜。
3.转化
将菌液倒入无菌培养皿中(40mL/per)，把刚划好伤口的叶片，放入菌液中侵染10-20min后，用无菌水漂洗一下，将叶片上的菌液用灭菌滤纸稍吸干，转入不加抗生素的MS培养基上(刘敏著，花卉组织培养与工厂化生产，地质出版社，2006年6月，19—20页)。浸染过的叶片接种在MS培养基上，平放并稍捻入培养基，28℃暗培养条件下共培养2-4天，直至可看见农杆菌菌斑。
4.选择培养：
立即将共培养的、可看见农杆菌菌斑的转化叶片放入含抗生素(Cb500mg/L、Kan 500mg/L)的筛选分化培养基中，筛选培养3-4周。待出芽后，转入含抗生素(Cb 500mg/L、Kan 500mg/L)的生根培养基中。获得转基因植株如图12。
分化培养基组成：
含6-BA 2mg/L，NAA 0.1mg/L，羧苄青霉素500mg/L，卡那霉素300mg/L的MS培养基。
生根培养基组成：
含NAA 0.1mg/L，羧苄青霉素500mg/L，卡那霉素300mg/L的MS培养基。
实施例6、转CkNHX基因的烟草转化株鉴定
1)转CkNHX烟草植株基因组DNA的PCR检测
采用CTAB法(F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，精编分子生物学实验指南。科学出版社，2001)提取植物总DNA，采用前面载体构建所述引物(SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21)进行PCR检测，结果如图13。可见在DNAMarker约1.6kb处具有明显PCR扩增条带，其中第8泳道为阴性对照(野生W38烟草基因组DNA)；第5泳道为阳性对照(以质粒pCkNHX为模板)；第6泳道为负对照(以水为模板)；第7泳道为DNA MarkerDGL2000(由上至下DNA大小为19325，2000，1600，1000，750，500，250，100bp)；第1—4和9—12泳道为烟草转化植株基因组DNA的PCR产物。这表明所获得的烟草转化株已含有该基因片段。
2)烟草转CkNHX苗RT-PCR检测
对前面所检测到的阳性转化植株进行CkNHX的RT—PCR检测，考察转化植株中CkNHX转录情况。按照常规技术，采用Trizol试剂提取转化植株的RNA，采用TakaRa公司的one-step RT-PCR试剂盒进行RT-PCR检测，其结果见图14。第1泳道为DNA MarkerDGL2000(由上至下DNA大小为19325，2000，1600，1000，750，500，250，100bp)；第2—11为阳性烟草转化植株RT-PCR产物；第12泳道为阴性对照(野生W38烟草)，其中以烟草的Actin引物进行转录表达检测(约为1Kb)，CkNHX转录带在约1.6Kb位置。
该图表明在所检测的阳性烟草转换株中均有烟草Actin的转录(约0.9kb)，而转化株2，5，6，7，8，9，10中可见1.6Kb处该CkNHX转录带。这表明CkNHX在这些转化株中已获得转录。
所用烟草Actin引物序列如下，所有操作按TakaRa公司的one-stepRT-PCR试剂盒(DRR024A)操作说明进行。
正向引物：
5’-GCTGGATTTGCTGGTGATGAT-3’(SEQ ID NO：22)
反向引物：
5’-CGATC TGCAATGCCAGGAA-3’(SEQ ID NO：23)
实施例7、CkNHX基因烟草转化株的耐盐性鉴定
将PCR和RT-PCR验证的烟草植株，在添加了不同浓度(100、200、300、400mM NaCl)NaCl的培养基(MS)上进行耐盐试验。以同样发育期的对照野生植株在100、200、300、400mM NaCl的培养基上进行耐盐试验，以42天为期观察耐盐性(图15A)。结果表明野生植株在42天培养时间内，可耐受200mM NaCl；而一旦盐浓度超过300mM到400mM时，植株无法生根并开始黄化，以致死亡。
图15B是前面所验证了的CkNHX转化植株的耐盐实验。可见即使加入300mM的NaCl，转入CkNHX的烟草仍可正常发育、生根，生长。这说明将CkNHX基因转入烟草，可以提高烟草受体的耐盐性。
现有技术中目前尚未有通过转基因的手段获得可耐受300mM的NaCl的转基因植株。
IB056039-序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
中国林业科学研究院林业研究所
<120> IB056039
<130> 新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn，以及培育耐逆植物的方法
<160> 23
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 2547
<212> DNA
<213> 柠条(Caragana korshinskii Kom)
<400> 1
<210> 2
<211> 538
<212> PRT
<213> 柠条(Caragana korshinskii Kom)
<400> 2
<210> 3
<211> 1305
<212> DNA
<213> 柠条(Caragana korshinskii Kom)
<400> 3
<210> 4
<211> 434
<212> PRT
<213> 柠条(Caragana korshinskii Kom)
<400> 4
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
<210> 12
<211> 652
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
<210> 13
<211> 278
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
Claims (15)
1.一种来源于灌木植物柠条(Caragana korshinskii Kom)的NHX类Na+/H+逆转运蛋白，其氨基酸序列由SEQ ID NO：2或4所示。
2.编码权利要求1的逆转运蛋白的基因。
3.权利要求2的基因，其核苷酸序列由SEQ ID NO：1或3所示。
4.一种表达载体，其包含权利要求2或3的基因。
5.权利要求4的表达载体，其是植物表达载体。
6.权利要求5的表达载体，其是双元农杆菌载体。
7.权利要求5的表达载体，其中所述植物表达载体含启动子，所述启动子含DRE元件。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求4所述的表达载体。
9.权利要求8的宿主细胞，其是大肠杆菌细胞、酵母细胞或农杆菌细胞。
10.权利要求2或3的基因在转化植物获得转基因植物中的应用。
11.权利要求10的应用，其中所述植物选自单子叶植物或双子叶植物。
12.权利要求11的应用，其中所述单子叶植物选自由小麦、玉米、水稻、禾本科牧草组成的组，所述双子叶植物选自由杨树、大豆、棉花和油菜组成的组。
13.权利要求2或3的基因在提高植物抗逆境胁迫中的应用。
14.权利要求13的应用，其中所述逆境胁迫为盐胁迫。
15.一种培育抗逆境胁迫的植物的方法，包含构建含权利要求2或3的基因的植物表达载体；用所述构建的植物表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成转基因植株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2006100114934A CN100471953C (zh) | 2006-03-15 | 2006-03-15 | 新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn,以及培育耐逆植物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2006100114934A CN100471953C (zh) | 2006-03-15 | 2006-03-15 | 新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn,以及培育耐逆植物的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101037693A CN101037693A (zh) | 2007-09-19 |
| CN100471953C true CN100471953C (zh) | 2009-03-25 |
Family
ID=38888866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2006100114934A Expired - Fee Related CN100471953C (zh) | 2006-03-15 | 2006-03-15 | 新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn,以及培育耐逆植物的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100471953C (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103421812A (zh) * | 2013-05-03 | 2013-12-04 | 华中农业大学 | 利用花花柴KcNHX1基因培育耐高温拟南芥的方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101701037B (zh) * | 2009-11-05 | 2012-09-05 | 复旦大学 | 一种调控植物耐盐和抗旱性的转运蛋白及其编码基因和应用 |
| CN102443591B (zh) * | 2010-09-30 | 2013-09-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | CkGST基因的用途 |
| CN103254297B (zh) * | 2012-02-16 | 2015-01-07 | 中国科学院微生物研究所 | 获自盐碱湖微生物的抗逆相关蛋白imsal1及其编码基因和应用 |
| CN105713911A (zh) * | 2016-02-29 | 2016-06-29 | 南京农业大学 | 牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法 |
| CN111088260A (zh) * | 2020-01-16 | 2020-05-01 | 南京农业大学 | 萝卜耐盐基因RsNHX1及应用 |
| CN112322629B (zh) * | 2020-10-13 | 2022-07-19 | 河南农业大学 | 基因GhNHX4A在植物耐盐性能方面的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1535982A (zh) * | 2003-04-09 | 2004-10-13 | 中国科学院植物研究所 | 番杏的Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用 |
-
2006
- 2006-03-15 CN CNB2006100114934A patent/CN100471953C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1535982A (zh) * | 2003-04-09 | 2004-10-13 | 中国科学院植物研究所 | 番杏的Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 植物Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性的研究进展. 张俊莲等.草原与草坪，第4期. 2005 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103421812A (zh) * | 2013-05-03 | 2013-12-04 | 华中农业大学 | 利用花花柴KcNHX1基因培育耐高温拟南芥的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101037693A (zh) | 2007-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100510075C (zh) | 一种柠条转录因子CkAREB及其在抗逆植物培育中的应用 | |
| CN101050461B (zh) | 来源于拟南芥的与耐逆性相关的转录因子及其编码基因与应用 | |
| US9809827B2 (en) | Transgenic maize | |
| CN100471953C (zh) | 新的CkNHX基因及其剪切修饰基因CkNHXn,以及培育耐逆植物的方法 | |
| CN101775381A (zh) | 植物抗逆相关的蛋白激酶及其编码基因与应用 | |
| CN103740731B (zh) | 紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用 | |
| CN101775070B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN107383179A (zh) | 一种与植物耐逆性相关蛋白GsSLAH3及其编码基因与应用 | |
| CN110128514A (zh) | 水稻孕穗期耐冷性相关蛋白CTB4b及编码基因与应用 | |
| CN107641627B (zh) | 一种调控番茄i型腺毛形成的h基因、h蛋白及其应用 | |
| CN106148390A (zh) | Chy锌指蛋白转录激活辅因子及其应用 | |
| CN102718850A (zh) | 植物耐逆相关蛋白GmP1及其编码基因和应用 | |
| CN103710357B (zh) | 紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用 | |
| CN104725495A (zh) | 棉花GhWRKY51转录因子及其编码基因与应用 | |
| CN102719449A (zh) | 苹果抗逆相关基因MdSIMYB1的克隆及其应用 | |
| CN109971766A (zh) | 一种与植物耐逆相关蛋白PwRBP1及其编码基因与应用 | |
| CN103172716B (zh) | 植物抗热基因及其应用 | |
| US8802931B2 (en) | Salt resistant transgenic plants | |
| CN106831967B (zh) | 降低iaa10蛋白及其编码基因表达在提高植物对水稻矮缩病毒抗性中的应用 | |
| CN106367433B (zh) | 提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及其应用 | |
| CN106892973A (zh) | 植物抗逆性相关蛋白GhMYB4及编码基因与应用 | |
| US20130174299A1 (en) | Method for production of stolon-forming plant having improved tuber production ability or stolon production ability compared with wild type, and stolon-forming plant produced by the method | |
| CN107663232B (zh) | 植物抗逆相关蛋白OsIAA18及其编码基因与应用 | |
| CN104988175B (zh) | 番茄HsfA1a基因在提高植物自噬体活性及抗旱性中的应用 | |
| CN107176983B (zh) | 蛋白质PpLEA3-3在调控植物抗逆性中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090325 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |