CN102718850A - 植物耐逆相关蛋白GmP1及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物耐逆相关蛋白GmP1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。将GmP1基因导入植物中过表达，可显著提高植物耐旱性和耐盐性。本发明提供的蛋白及其编码基因可用于培育耐旱和耐盐的作物品种，具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物耐逆相关蛋白GmP1及其编码基因和应用。
背景技术
环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，对农业的危害已成为一个全球性的问题。土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题，据统计全球盐碱土约有10亿公顷，占世界陆地面积近7.6％。我国盐碱土约有0.2亿多公顷占全国耕地面积的1/3。因此提高作物的抗旱和耐盐能力已经成为我国农业生产和科研中的重要内容。
在长期的进化过程中，不同植物形成了不同的机制来适应干旱和盐分的胁迫，然而大多数农作物都对干旱和盐分非常敏感。由于我国常年受到干旱胁迫的影响，我国粮食每年平均受灾面积达2000万公顷，损失粮食占全国因灾减产粮食的50％，因此缺水干旱不仅是困扰我国农业生产的主要因素，而且已成为制约我国经济发展和社会进步的重要因素之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐逆相关蛋白GmP1及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，名称为GmP1蛋白，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.))，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白的基因(GmP1基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因可为如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pBI121载体的多克隆位点得到的重组质粒。
扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥(如哥伦比亚生态型拟南芥)。所述耐逆性具体可为耐旱性和/或耐盐性。
将GmP1基因导入植物中过表达，可显著提高植物的耐旱性和耐盐性。本发明提供的蛋白及其编码基因可用于培育耐旱和耐盐的作物品种，具有很高的应用价值。
附图说明
图1为转基因植物的耐盐性鉴定结果。
图2为转基因拟南芥植物的耐旱性鉴定结果。
图3为GmP1蛋白在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。GmP1基因制备既可采用以cDNA为模板PCR扩增，也可采用人工合成。
大豆品种文丰7号(中国国家种质资源库；统一编号：ZDD02611)：公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：Guo-An Zhou，Ru-Zhen Chang，Li-JuanQiu.Overexpression of soybean ubiquitin-conjugating enzyme gene GmUBC2confers enhanced drought and salt tolerance through modulating abioticstress-responsive gene expression in Arabidopsis.Plant Mol Biol (2010)72：357-367。
哥伦比亚生态型拟南芥：公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：Guo-An Zhou，Ru-Zhen Chang，Li-Juan Qiu.Overexpression of soybeanubiquitin-conjugating enzyme gene GmUBC2 confers enhanced drought and salttolerance through modulating abiotic stress-responsive gene expression inArabidopsis.Plant Mol Biol(2010)72：357-367。
pBI121载体：公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：Guo-AnZhou，Ru-Zhen Chang，Li-Juan Qiu.Overexpression of soybeanubiquitin-conjugating enzyme gene GmUBC2 confers enhanced drought and salttolerance through modulating abiotic stress-responsive gene expression inArabidopsis.Plant Mol Biol(2010)72：357-367。
农杆菌C58C1：公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：Guo-An Zhou，Ru-Zhen Chang，Li-Juan Qiu.Overexpression of soybeanubiquitin-conjugating enzyme gene GmUBC2confers enhanced drought and salttolerance through modulating abiotic stress-responsive gene expression inArabidopsis.Plant Mol Biol(2010)72：357-367。
实施例1、植物耐逆性相关蛋白将其编码基因的发现
用200mM NaCl水溶液浸泡大豆品种文丰7号的幼苗(萌发后生长2周)的根部6小时，收获叶片提取RNA并反转录成cDNA第一链，以该cDNA为模板，用引物P1F和P1R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(约900bp)。
P1F：5’-ATGGAGGGGAAGGAGCAGGA-3’；
P1R：5’-TCACTTGGACTTGAAGGGAA-3’。
PCR反应体系：10×Buffer 2μl，dNTP 2.5mM，P1F 5μM，P1R 5μM，cDNA 20ng，Taq酶1U，加去离子水至20μl。
PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，62℃30s(每循环降低0.3℃)，72℃1min，扩增32个循环；最后72℃延伸8min。
将PCR扩增产物进行测序，根据测序结果发现了大豆耐逆性相关蛋白将其编码基因。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GmP1蛋白(由289个氨基酸残基组成)。将编码GmP1蛋白的基因命名为GmP1基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示(870bp)。
实施例2、植物耐逆相关蛋白及其编码基因的功能验证
一、重组表达载体的构建
1、用200mM NaCl水溶液浸泡大豆品种文丰7号的幼苗(萌发后生长2周)的根部6小时，取叶片提取RNA并反转录得到cDNA。
2、以步骤1的cDNA为模板，用F1(下划线标注Xba I酶识别位点)和R1(下划线标注Xho I酶识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-GCTCTAGA ATGGAGGGGAAGGAGCAGGA-3’；
R1：5’-CTGCTCGAGTCACTTGGACTTGAAGGGAA-3’。
3、用限制性内切酶Xba I和Xho I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Xba I和Xho II双酶切pBI121载体，回收载体骨架(约14kb)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pBI121-GmP1。
根据测序结果，对重组质粒pBI121-GmP1的结构描述如下：在pBI121载体的XbaI和Xho I酶切位点插入了序列表的序列2所示DNA得到的重组质粒(序列表的序列2所示DNA置于35S启动子控制下)。
二、转基因植物的获得
1、将重组质粒pBI121-GmP1转入农杆菌C58C1，获得重组农杆菌。
2、将重组农杆菌通过蘸花法转化(Clough SJ Bent AF，Floral dip：a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.ThePlant Journal，1998，16：735-743.)哥伦比亚生态型拟南芥。
3、将获得的T0代种子种植在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选，获得阳性植株。
4、将获得的阳性植株逐代在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选，第T2代获得20个纯合株系。
5、将20个纯合株系的T2代植株用P1F和P1R组成的引物对分别进行PCR鉴定(靶序列为870bp)。PCR鉴定阳性的植株将PCR产物进行测序验证。
结果表明，20个纯合株系中，有12个株系为纯合的转基因株系。
三、转空载体植物的获得
用pBI121载体代替重组质粒pBI121-GmGST2，其它同步骤二，得到转空载体植株。
四、抗性鉴定
1、耐盐性鉴定
随机选取2个纯合的转基因株系(P1-L19和P1-L17)的T2代植株，和转空载体植株的T2代植株、哥伦比亚生态型拟南芥(野生型，WT)一起进行耐盐性鉴定。每个株系采用32粒种子。
将种子均匀的播种于营养土中，22℃，16h光照/8h黑暗条件下生长10天；然后用200mM Nacl水溶液处理一次(使土壤自然完全吸透盐水)；4周后观察植株生长情况并拍照(见图1)。
野生型植株和转空载体植株的表型(抽薹植株数和平均株高)没有显著差异。转基因植株的生长情况明显优于野生型，具体表现为转基因株系的抽薹植株数目明显多于野生型，平均株高明显高于野生型，表现出很高的耐盐性。
2、耐旱性鉴定
随机选取2个纯合的转基因株系(P1-L19和P1-L17)的T2代植株，和转空载体植株的T2代植株、哥伦比亚生态型拟南芥(野生型，WT)一起进行耐旱性鉴定。每个株系采用32粒种子。
将种子均匀MS培养基上，于4℃放置3天；然后转移至培养室于22℃，16h光照/8h黑暗条件下生长1周；然后移栽至土壤中生长1周；然后停止浇水20天；然后恢复浇水3天，此时进行拍照(见图2)和存活率统计(叶片恢复绿色并能继续生长的植株计为存活，存活率为存活的植株数占总植株数的百分数)。
P1-L19和P1-L17株系的存活率分别为78.13％、59.38％，野生型只有15.63％存活，转空载体植株只有15％存活。结果表明，GmP1基因在植物中过表达可以提高转基因植株的抗旱性。
实施例3、植物耐逆性蛋白的亚细胞定位
1、亚细胞定位载体pCAMBIA1302-GmP1：GFP载体的构建
将GmP1基因编码蛋白与pCAMBIA1302载体的EGFP融合，并置于35S启动子控制下，具体方法为：
根据上述GmP1 cDNA序列设计引物，序列如下所示：YXBPIP1F：5’-CCATGGATGGAGGGGAAGGAGCAGG-3’(下划线标注的是Nco I酶识别位点)，YXBPIP1R：5’-ACTAGTCTTGGACTTGAAGGGA-3’(下划线标注的是Spe I酶识别位点)；
用200mM NaCl溶液浸泡萌发后生长2周的大豆品种文丰7号的幼苗的根部6小时，取叶片提取RNA并反转录得到第一链cDNA，以该cDNA为模板，以YXBP1F和YXBP1R为引物进行PCR扩增。
PCR扩增得到约900bp的片段，克隆至测序载体pMD18-T载体中，挑选测序验证正确的克隆提取质粒，用Nco I和Spe I双酶切，将得到的片段插入到pCAMBIA1302载体的Nco I和Spe I酶识别位点之间，得到重组载体。对该重组载体进行酶切和测序鉴定，将GmP1与GFP正确融合的重组载体命名为pCAMBIA1302-GmP1：GFP。
2、pCAMBIA1302-GmP1：GFP载体在洋葱表皮细胞中的瞬时表达
用基因枪将亚细胞定位载体pCAMBIA1302-GmP1：EGFP转化至洋葱表皮中，并通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光在洋葱表皮细胞中的位置。实验中质粒DNA的金粉包埋按照Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System的方法(Kikkert J R，1993)，采用Bio-Rad PDS-1000/He基因枪进行轰击，可裂膜压力为1.1kPa，洋葱表皮至可裂膜距离为6cm，转化后继续22℃培养12h。将轰击后在22℃培养12小时后的洋葱表皮细胞直接放在载玻片上用激光共聚焦显微镜(Olympus，FV500)观察。选用标准的GFP(激发波长488nm，发射波长525nm，并加强)和可见光明场下对同一视野进行序列扫描，两次扫描结果保存成单独的图像，最后由显微镜操作系统(Fluoview，版本4.3)对两次扫描形成的图像进行叠加。所有得到的扫描图像都通过Adobe
CS进行编辑整理，形成最终的图片。pCAMBIA1302是全细胞表达的载体，空载体在洋葱表皮细胞的细胞膜、细胞质和细胞核中均可以发出强烈的绿色荧光信号(图3A所示，其中A1-A3分别表示在暗场、明场和明暗叠加场下pCAMBIA1302空载体的在洋葱表皮细胞中瞬时表达时发出的绿色荧光)。本实验只在洋葱表皮细胞质膜的位置处检测到GmP1：EGFP蛋白的荧光信号(图3B所示，其中B1-B3分别表示在暗场、明场和明暗叠加场下pCAMBIA1302-GmP1：EGFP在洋葱表皮细胞中瞬时表达时发出的绿色荧光)，结果表明GmP1蛋白位于细胞质膜上。
Claims (10)
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入pBI121载体的多克隆位点得到的重组质粒。
6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任一片段的引物对。
7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。
10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
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