CN112175058A

CN112175058A - 耐盐相关基因剪切体的克隆、鉴定及其应用

Info

Publication number: CN112175058A
Application number: CN202011078035.9A
Authority: CN
Inventors: 叶武威; 王晓歌; 陈修贵; 陆许可; 王德龙; 王俊娟; 王帅; 郭丽雪; 陈超; 阴祖军; 赵兰杰
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-10-10
Filing date: 2020-10-10
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-10-10
Also published as: CN112175058B

Abstract

本发明公开了耐盐相关基因剪切体的克隆、鉴定及其应用。本发明首先从耐盐基因中克隆得到两种GhIRE1基因剪切体序列，分别命名为GhIRE1‑s1和GhIRE1‑s2，接下来通过构建原核表达载体进行原核表达，获得了GhIRE1‑s1和GhIRE1‑s2。为了进一步验证GhIRE1‑s1和GhIRE1‑s2的功能，分别构建了转GhIRE1‑s1拟南芥植株和转GhIRE1‑s2拟南芥植株，并对其耐逆性进行了检测。结果表明：与野生型相比，转s1拟南芥植株的耐盐性降低。说明GhIRE1‑s1具有调控植物耐盐性的功能。

Description

耐盐相关基因剪切体的克隆、鉴定及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及耐盐相关基因剪切体的克隆、鉴定及其应用。

背景技术

在农业生产中，外界自然环境中各种生物胁迫和非生物胁迫常影响作物的生长发育，降低作物产量。近些年，随着环境污染和全球气候的恶化，逆境胁迫已经成为影响作物生产的重要因素。其中，盐胁迫是主要的逆境胁迫之一。据估计，在世界范围内，盐胁迫每年造成的农业减产可达20％以上。FAO统计结果显示，截至2015年，全球有约8亿公顷土地和3200万公顷旱作耕地受盐渍化影响。在我国，约有0.37亿公顷盐碱地，约是全国耕地面积的四分之一，并且还有大面积潜在的次生盐渍化土壤。目前，对盐碱地的利用主要有两个方面，一是通过工程改良技术对盐碱地进行改良，使其适应作物生长。这种方法成本高、收益差，难以大面积推广。另一种方法是筛选和培育耐盐品种。在此过程中，耐盐基因对作物耐盐性提高尤为重要。

可变剪切现象在真核生物中普遍存在。通过可变剪切，生物可以产生多种功能相似或完全不同的转录本亚型，极大地增加了转录本和蛋白质组的复杂性。转录组测序技术，尤其是三代测序技术能够获得大量可变剪切，但是这些可变剪切的真实性和功能仍需要进一步实验验证和分析。可变剪切在作物生长发育和逆境响应过程中具有重要作用，因此基因可变剪切的发掘和研究对解析植物生命进程、培育抗逆作物品种都具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种蛋白质，其来源于棉花品种中35，将其命名为GhIRE1-s1；

所述GhIRE1-s1为如下A1)或A2)或A3)或A4)任一所示的蛋白质：

A1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2)在序列表中序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

A3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆相关的蛋白质；

A4)与A1)-A3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且与植物耐逆相关的蛋白质。

其中，序列表中序列3由678个氨基酸残基组成。

所述标签具体如表1所示。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL
HA	9	YPYDVPDYA

上述A1)-A4)任一所示的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明的第二个目的是提供与GhIRE1-s1相关的生物材料。

本发明提供的与GhIRE1-s1相关的生物材料为下述C1)至C8)中的任一种：

C1)编码GhIRE1-s1的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；

C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；

C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；

C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；

C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，C1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的cDNA分子；

2)来源于棉花的与1)限定的DNA序列具有98％以上同源性且编码植物耐逆相关蛋白的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物耐逆相关蛋白的DNA分子。

其中，序列表中序列1由2037个核苷酸组成。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GhIRE1-s1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GhIRE1-s1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GhIRE1-s1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

所述重组载体是将上述核酸分子插入表达载体中，得到表达GhIRE1剪切体s1的重组载体。使用所述核酸分子构建重组载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的一个具体实施例中，所述重组载体为将序列1所示的DNA分子构建至pEASY-Blunt E1 Expression Vector载体后得到的重组载体。

在本发明的另一个具体实施例中，所述重组载体为将序列1所示的DNA分子构建至pBI121载体后得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。所述重组微生物为含有上述重组载体的微生物。本发明的具体实施例中，所述重组微生物为含有上述重组载体的根癌农杆菌LBA4404。

本发明的第三个目的是提供GhIRE1-s1或与GhIRE1-s1相关的生物材料的新用途。

本发明提供了GhIRE1-s1或与GhIRE1-s1相关的生物材料在如下P1)-P4)任一种中的应用：

P1)调控植物耐逆性；

P2)培育耐逆性提高的转基因植物；

P3)培育耐逆性降低的转基因植物；

P4)植物育种。

上述应用中，所述耐逆性为耐盐性。

所述调控植物耐逆性具体体现在：当植物中的GhIRE1-s1含量和/或活性提高时，该植物的耐盐性降低；当植物中的GhIRE1-s1含量和/或活性降低时，该植物的耐盐性提高。

所述育种的目的为提高植物耐盐性。

进一步的，所述耐盐性为NaCl耐性。

更进一步的，所述NaCl的浓度为150mM或200mM。

本发明的第四个目的是提供一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性降低的转基因植物的方法包括如下步骤：提高目的植物中GhIRE1-s1的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性低于所述目的植物。

进一步的，所述耐逆性为耐盐性。

所述转基因植物的耐逆性低于所述目的植物具体体现在如下m1)-m3)中任一种：

m1)所述转基因植物的种子萌发率低于所述目的植物；

m2)所述转基因植物的子叶出生率低于所述目的植物；

m3)所述转基因植物的真叶出生率低于所述目的植物。

所述提高目的植物中GhIRE1-s1的含量和/或活性的方法为在目的植物中过表达GhIRE1-s1。

更进一步的，所述过表达的方法为将GhIRE1-s1的编码基因导入目的植物。

所述GhIRE1-s1的编码基因如序列表中序列1所示。

本发明最后一个目的是提供一种耐盐基因剪切体的获得方法。

本发明提供的耐盐基因剪切体的获得方法包括如下步骤：

q1)以没有基因组DNA残留的植物组织样本的总RNA为模板，用反转录酶反转录出第一链cDNA，得到植物组织样本的cDNA；

q2)以所述cDNA为模板，采用用于扩增耐盐基因cDNA序列的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

q3)将所述PCR产物进行测序，得到耐盐基因剪切体序列。

进一步的，所述q1)中，所述没有基因组DNA残留的植物组织样本的总RNA可按照如下方法获得：提取植物组织(如叶片)的总RNA，以总RNA为模板，采用action引物F1：5’-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3’和R1：5’-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3’进行PCR扩增，检测是否有基因组DNA残留：若PCR扩增得到大小约为215bp的条带，则总RNA中有基因组DNA残留，否则没有基因组DNA残留。

所述q2)中，所述耐盐基因为GhIRE1基因；

所述引物对具体为由序列4所示的DNA分子和序列5所示的DNA分子组成。

所述q3)中，所述测序的方法可按照如下方法进行：将PCR产物连入克隆载体中，得到重组载体，对所述重组载体进行测序。

更进一步的，所述耐盐基因剪切体序列为GhIRE1基因剪切体s1(GhIRE1-s1)序列或GhIRE1基因剪切体s2(GhIRE1-s2)序列；

所述GhIRE1-s1序列为依次由GhIRE1基因外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5顺序连接形成的CDS序列，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

所述GhIRE1-s2序列为依次由GhIRE1基因外显子1、部分内含子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5顺序连接形成的CDS序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

上述任一所述应用或方法中，所述植物可为植物双子叶植物或单子叶植物；进一步的，所述双子叶植物可为棉花；更进一步的，所述棉花的品种可为中35。

本发明首先从耐盐棉花材料中克隆得到两种GhIRE1基因剪切体序列，分别命名为GhIRE1-s1和GhIRE1-s2，接下来通过构建原核表达载体进行原核表达，获得了GhIRE1-s1和GhIRE1-s2的编码蛋白。为了进一步验证GhIRE1-s1和GhIRE1-s2的功能，分别构建了转GhIRE1-s1拟南芥植株和转GhIRE1-s2拟南芥植株，并对其耐逆性进行了检测。结果表明：与野生型相比，转GhIRE1-s1拟南芥植株的耐盐性降低。说明GhIRE1-s1具有调控植物耐盐性的功能。

附图说明

图1为总RNA检测结果。

图2为重组克隆载体部分序列比对结果。

图3为克隆序列测序结果比对示意图。其中，Gh_A02G1714为GhIRE1基因。

图4为基因剪切体原核表达结果。

图5为重组质粒pBI121-s1和pBI121-s2酶切验证结果。

图6为拟南芥转基因检测结果。

图7为转基因拟南芥耐盐检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的棉花品种中35记载于文献“Wang X,Lu X,Wang J,Wang D,Yin Z,Fan W,Wang S,Ye W:Mining and Analysis of SNP in Response to Salinity Stressin Upland Cotton(Gossypium hirsutum L.).PLoS One 2016,11(6):e0158142.”中，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的载体pBI121记载于文献“Chen X,Lu X,Shu N,Wang D,Wang S,Wang J,Guo L,Fan W,Lin Z,Ye W:GhSOS1,a plasma membrane Na⁺/H⁺antiporter genefrom upland cotton,enhances salt tolerance in transgenic Arabidopsisthaliana.PLoS One 2017,12(7):e0181450.”中，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、剪切体的克隆与鉴定

一、剪切体的克隆

1、提取中35叶片组织的总RNA，以总RNA为模板，采用action引物F1：5’-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3’和R1：5’-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3’进行PCR扩增，检测是否有基因组DNA残留。若PCR扩增得到大小约为215bp的条带，则总RNA中有基因组DNA残留，否则没有基因组DNA残留。

结果如图1所示，其中，CK是以cDNA为模板，采用action引物PCR扩增得到的PCR产物，1-8是以总RNA为模板，采用action引物PCR扩增得到的PCR产物。结果显示，提取的中35叶片总RNA没有基因组DNA残留。

2、将没有基因组DNA残留的中35总RNA用反转录酶反转录出第一链cDNA，得到中35叶片组织的cDNA。

3、以中35叶片组织cDNA为模板，以F2：5’-ATGGTTTCAGAAATTGGGGCTG-3’(序列4)和R2：5’-TTAAAAGTATTTCTGGAAGCATTCCTCTTC-3’(序列5)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、使用pEASY-Blunt Cloning Kit将PCR扩增产物连接到pEASY-Blunt CloningVector(全式金，CB101-01)上，得到重组载体。

对重组载体进行测序。根据测序结果对重组载体结构描述分为如下两种：

1)pEASY-Blunt Cloning Vector的多克隆位点间插入了序列1所示的DNA分子，并将序列1所示的DNA分子记作s1；

2)pEASY-Blunt Cloning Vector的多克隆位点间插入了序列2所示的DNA分子，并将序列2所示的DNA分子记作s2。

s1和s2的部分序列如图2所示。s1所示DNA分子为依次由GhIRE1基因的全部外显子即外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5顺序连接形成的CDS序列，记作GhIRE1-s1。s2所示DNA分子比s1多了一段164bp的序列，序列比对结果表明，此序列是GhIRE1基因的内含子1的部分序列，s2所示DNA分子为依次由GhIRE1基因外显子1、部分内含子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5顺序连接形成的CDS序列，记作GhIRE1-s2。GhIRE1-s1和GhIRE1-s2的结构示意图如图3所示。

将含有s1的重组载体命名为重组载体T-s1。将含有s2的重组载体命名为重组载体T-s2。

二、两个剪切体的原核表达载体构建

1、分别以重组载体T-s1和重组载体T-s2为模板，以F3：5’-ATGGTTTCAGAAATTGGGGC-3’和R3：5’-TTAAAAGTATTTCTGGAAGCAT-3’为引物进行PCR扩增，分别得到大小为2037bp的PCR产物s1和大小为2201bp的PCR产物s2。

2、采用pEASY-Blunt E1 Expression Kit(全式金，CE111-01)分别将PCR扩增产物s1、s2与pEASY-Blunt E1 Expression Vector载体骨架进行连接，得到重组载体E1-s1和重组载体E1-s2。

对重组载体E1-s1和E1-s2进行测序。根据测序结果，对重组载体E1-s1结构描述如下：向载体pEASY-Blunt E1 Expression Vector中插入核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。序列表中序列1所示的DNA分子即为GhIRE1-s1的核苷酸序列，编码序列表中序列3所示的蛋白质。

对重组载体E1-s2结构描述如下：向载体pEASY-Blunt E1 Expression Vector中插入核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子。序列表中序列2所示的DNA分子即为即GhIRE1-s2的核苷酸序列。

三、剪切体的蛋白表达分析

1、将步骤二中构建的原核表达重组载体E1-s1和E1-s2分别转入Trans1-T1 PhageResistant Chemically Competent Cell(简称Trans1-T1)(全式金，CD501-02)和Transetta(DE3)Chemically Competent Cell(简称Transetta)(全式金，CD801-02)两种感受态细胞中。

2、按照1:100的比例将含有E1-s1的Trans1-T1和Transetta菌液分别加入到2mL含50μg/mL Amp+的培养基中，37℃培养至OD＝0.4～0.6。加入0.1μM IPTG诱导蛋白表达，28℃培养6h。

3、按照1:100的比例将含有E1-s2的Trans1-T1和Transetta菌液分别加入到2mL含50μg/mL Amp+的培养基中，37℃培养至OD＝0.4～0.6。加入0.1μM IPTG诱导蛋白表达，28℃培养6h。

4、提取步骤2和步骤3中经IPTG诱导的含Trans1-T1和Transetta的蛋白，并通过蛋白免疫印迹法(Jiang S,Chen M,He N,Chen X,Wang N,Sun Q,Zhang T,Xu H,Fang H,WangY,Zhang Z,Wu S,Chen X:MdGSTF6,activated by MdMYB1,plays an essential role inanthocyanin accumulation in apple,Horticulture Research,2019,6:40)检测蛋白大小。其中一抗是His抗体，二抗是IgG(H+L)抗体。

结果描述如下：0.1μM IPTG诱导时，E1-s1和E1-s2在两种细胞中都能够表达出目标蛋白质，但E1-s1表达出的蛋白大小在75kDa～90kDa之间，E1-s2表达出的蛋白大小在40kDa～60kDa之间。说明两个GhIRE1基因剪切体序列s1与s2都能够表达出蛋白质，表达的蛋白质分别记作GhIRE1-s1和GhIRE1-s2。

实施例2、实施例1获得两个剪切体的耐盐性分析

一、重组载体pBI121-s1的构建

1、以重组载体T-s1为模板，以F4：5’-CTAGAGGATCCCCGGGATGGTTTCAGAAATTGGGGCTG-3’和R4：5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAAAAGTATTTCTGGAAGCATTCCTCTTC-3’为引物进行PCR扩增，得到大小约为2000bp的PCR片段s1’。

2、用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切载体pBI121，回收大小约为12.9kb的载体骨架1。

3、使用In-fusion HD Cloning Kit将PCR片段s1’和载体骨架1连接起来，得到重组载体pBI121-s1。

用XbaI和SacI对重组载体pBI121-s1进行双酶切，结果如图5A所示，重组载体pBI121-s1双酶切后产生两个条带(泳道2)，其中一个条带与未酶切的pBI121-s1(泳道1)大小相近，另一条与s1(泳道3)大小相近。说明向载体pBI121中插入的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子，即GhIRE1-s1的核苷酸序列。

对重组载体pBI121-s1进行测序，根据测序结果，对重组载体pBI121-s1结构描述如下：在载体pBI121的限制性酶切位点XbaI和SacI之间插入的是GhIRE1-s1的核苷酸序列。

二、重组载体pBI121-s2的构建

1、以重组载体T-s2为模板，以F4：5’-CTAGAGGATCCCCGGGATGGTTTCAGAAATTGGGGCTG-3’和R4：5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAAAAGTATTTCTGGAAGCATTCCTCTTC-3’为引物进行PCR扩增，得到大小约为2200bp的PCR片段s2’。

3、使用In-fusion HD Cloning Kit将PCR片段s2’和载体骨架1连接起来，得到重组载体pBI121-s2。

用XbaI和SacI对重组载体pBI121-s2进行双酶切，结果如图5B所示，重组载体pBI121-s2双酶切后产生两个条带(泳道2)，其中一个条带与未酶切的pBI121-s2(泳道1)大小相近，另一条与s2(泳道3)大小相近。说明向载体pBI121中插入的核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子，即GhIRE1-s2的核苷酸序列。

对重组载体pBI121-s2进行测序，根据测序结果，对重组载体pBI121-s2结构描述如下：在载体pBI121的限制性酶切位点XbaI和SacI之间插入的是GhIRE1-s2的核苷酸序列。

三、转基因拟南芥的获得

1、将步骤一和步骤二制备的重组载体pBI121-s1和pBI121-s2分别导入根癌农杆菌LBA4404(博迈德，BC301-01)，分别得到重组菌LBA4404/pBI121-s1和LBA4404/pBI121-s2。

2、采用拟南芥花序浸染法(Clough SJ,Bent AF(1998)Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J 16:735–743.)将重组菌LBA4404/pBI121-s1和LBA4404/pBI121-s2分别转入野生型拟南芥(哥伦比亚生态型拟南芥，为Arabidopsis Biological ResourceCenter的产品，详见网址http://abrc.osu.edu/)中，分别获得T0代转GhIRE1-s1拟南芥种子和T0代转GhIRE1-s2拟南芥种子。

3、将步骤2获得的T0代转GhIRE1-s1拟南芥种子和T0代转GhIRE1-s2拟南芥种子分别点播于含50mg·L^-1卡那霉素的MS固体培养基上，叶片为绿色的苗即为T1代转基因阳性苗。将阳性苗移栽到营养土中培养，并分别收获种子，即分别为T1代转GhIRE1-s1拟南芥种子和T1代转GhIRE1-s2拟南芥种子。

4、将步骤3筛选的T1代转GhIRE1-s1拟南芥种子和T1代转GhIRE1-s2拟南芥种子分别点播于含50mg·L^-1卡那霉素的MS固体培养基上，并统计每个株系中绿色拟南芥和白色拟南芥的数目。绿色拟南芥(阳性苗)数目和白色拟南芥(阴性苗)为3:1的株系，外源基因插入了一个拷贝，该株系阳性苗收到的种子即为T2代拟南芥种子，分别为T2代转GhIRE1-s1拟南芥种子和T2代转GhIRE1-s2拟南芥种子。

5、将步骤4筛选的T2代转GhIRE1-s1拟南芥种子和T2代转GhIRE1-s2拟南芥种子分别点播于含50mg·L^-1卡那霉素的MS固体培养基上，筛选叶片均为绿色的T3代转基因株系，即纯合T3代转GhIRE1-s1拟南芥和纯合T3代转GhIRE1-s2拟南芥，分别命名为s1-T3和s2-T3。

四、RT-PCR检测

1、使用植物RNA提取试剂盒提取所有s1-T3和s2-T3株系拟南芥，以及野生型拟南芥(哥伦比亚生态型拟南芥)的总RNA，并以其为模板，用反转录试剂盒反转录出第一链cDNA，cDNA浓度为50ng·μL^-1。

2、通过荧光定量PCR检测转基因拟南芥cDNA中GhIRE1基因的相对表达量。内参基因为actin，引物序列为F5：5’-CGAGGCTCCTCTTAACCCAAAGG-3’和R5：5’-GACACACCATCACCAGAATCCAGC-3’。GhIRE1-s1和GhIRE1-s2的检测引物都是F6：5’-GGAGAGTGTTGCACCAATGGCT-3’和R6：5’-GTCTCGGGAATCGACTGGCAAA-3’。在s1-T3和s2-T3转基因拟南芥株系中都选择基因相对表达量最高的株系，分别记做s1-O和s2-O。

3、使用两对检测引物对野生型拟南芥、s1-O和s2-O拟南芥的cDNA进行PCR检测。第一对检测引物为F7：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’和R7：5’-GCTTGGTCTCAATTCAGGCT-3’。第二对检测引物为F7：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’和R8：5’-CCTGTGTACAGATACAACAATGG-3’。仅第一对检测引物能够扩增出条带的拟南芥是s1-O株系，两对引物均能够扩增出条带的拟南芥是s2-O株系(图6B)。

结果如图6所示，s1-O和s2-O中GhIRE1基因的表达量与野生型相比显著增加(图6A)，同时，如图6C所示，用F7+R7引物对能在s1-O株系(泳道4)和s2-O株系(泳道3)中扩增出条带，用F7+R8引物对仅能在s2-O株系(泳道7)中扩增出条带。清水(泳道1和泳道5)和野生型拟南芥(泳道2和泳道6)用F7+R7和F7+R8引物对均不能扩增出条带。说明s1-O和s2-O株系分别超表达了GhIRE1-s1和GhIRE1-s2基因。

五、拟南芥耐盐性鉴定

1、向三个1.5mL离心管中分别加入野生型拟南芥(WT)、s1-O T3代种子和s2-O T3代种子，用0.1％(m/v)的升汞溶液浸泡10min灭菌，然后用灭菌的超纯水清洗5～7次。

2、将经步骤1灭菌后的拟南芥种子点播于MS固体培养基和含有NaCl(150mM，200mM)的MS固体培养基上。每个处理设置三个重复，每个重复点播野生型拟南芥、s1-O拟南芥、s2-O拟南芥种子各30粒。22℃，16h光照/8h黑暗条件下培养，光照强度为5000Lx。

3、培养一个月后，观察野生型拟南芥、s1-O拟南芥、s2-O拟南芥在MS培养基、含150mM NaCl的MS培养基、含200mM NaCl的MS培养基中的种子萌发率(种子萌发率＝萌发种子数/30×100％)、子叶出生率(子叶出生率＝长出子叶的种子数/30×100％)、真叶出生率(真叶出生率＝长出真叶的种子数/30×100％)。

野生型拟南芥、s1-O拟南芥、s2-O拟南芥种子在不同培养基上的萌发率统计结果如图7A，子叶出生率统计结果如图7B，真叶出生率统计结果如图7C。结果表明，在固体MS培养基上(0mM NaCl)，三个株系的种子萌发率、子叶出生率、真叶出生率都没有明显差异。在含有150mM NaCl的MS固体培养基上，野生型的种子萌发率、子叶出生率、真叶出生率分别为94.7％、80.7％和67.3％，s1-O的种子萌发率、子叶出生率、真叶出生率分别为87％、61％和32％，s2-O的种子萌发率、子叶出生率、真叶出生率分别为96.0％、84.0％和62.2％，可见野生型和s2-O的种子萌发率、子叶出生率、真叶出生率都没有明显差异，但是s1-O的种子萌发率、子叶出生率、真叶出生率则显著低于野生型和s2-O。在含有200mM NaCl的MS固体培养基上，三个株系均没有子叶和真叶产生，野生型的种子萌发率为45.5％，s1-O的种子萌发率为17.5％，s2-O的种子萌发率为38％，可见野生型与s2-O的种子萌发率显著高于s1-O。

以上结果表明：与野生型相比，s1-O的萌发和生长在盐胁迫时受到明显抑制，s2-O则变化不大。说明GhIRE1的两个剪切体表现出不同的耐盐性，GhIRE1-s1可调控植物耐盐性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 耐盐相关基因剪切体的克隆、鉴定及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2037

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggtttcag aaattggggc tgctttactt tgccaggatg ttaaatatac tgtgaattca 60

agttatgaat ttcctgaaat tggcaatgac tttgttttgc catttccatg tcaatcaaaa 120

ggtattgtta ttcgagagca taatacgaca gaatatacaa gcacttctca tcatgatgat 180

ccgatgctcc cattgtcttc ttctaatgca cctacttcac tggccaagcc tgatagcaca 240

tcagatgacc gtcataatag gaaaatgctt ctagtggcag ctccagaatc aaagcttcaa 300

ttgccacaca aagttgatag attattgaac ttgtctcaag acaatgaaaa tgaaacaagt 360

gtccctcagc ctcctttgga gaatagtgat tctagaatgt ttggtgtaca tgatctgaga 420

acacctcatg ctgatgggca tggcaaggcc attttttcca aatatccagt agtattttcc 480

tttatatttt tcataatttt ggtgggcttt gtcatcaacc acgttctttt ggctaaaagg 540

ctttctgcgt taaaagacca gcctgttgct aatataaaca ttggatcctc caacagaaag 600

aaatcccgaa gatcagggaa gattaatggt tctattgaga aaaaggatca gcacacatca 660

tctggaagcg aggatgaatt ttcacctgtt ggtgctgaca acgaaaaatt gctggacctt 720

aataaattag ttggtagctt tgatggacgt agaataggta agctaattgt attaagcaaa 780

gaaattgcaa aaggaagcaa tggtacaatt gtccttgagg gattctatga aggccgagca 840

gttgctgtga aacgtcttgt ccaagctcat catgatgttg ctttcaaaga aattcaaaat 900

ctcattgtgt ctgaccagca tccgaatatt gttagatggt atggtgtgga gtatgatcaa 960

gattttgtgt atcttgctct ggagcgttgc acttgcagtt tagatgattt gattcaaatt 1020

tactcagata cacctggaaa ctcagtcctc agcaaggacc cagcaacacg tgcaatggtt 1080

gagcataaaa ttcacctgga tttggtgaaa ggtgccatgc aggatcttaa tttgtggaaa 1140

gcaaatggcc atccgtcacc gctcttccta aaactgatga gggatgtggt ttcaggtctt 1200

gctcatttgc atgatctggg aataattcat cgagacataa agcctcaaaa tgtgctaata 1260

attaaggaaa aaacagtgtg tgcaaagctt tctgatatgg gcattagcaa gcgccttctt 1320

gaggataggt cttccttggg tcaccatgct actggctgtg gtagttcagg ttggcaagca 1380

ccggaacaac ttcttcttgg tcgccaaaca cgtgcagttg atttatttag tttgggttgt 1440

gtccttttct tctgcatcac tcggggtaag cacccgtttg gcaatcatct tgaacgtgat 1500

atcaatgttg tgaacaaccg agtgaacctt tttctagtgg agcatatccc tgaagctgtg 1560

gatctaatat cttgtttatt gaatcctgag cctgaattga gaccaagcgc attggaggtg 1620

ttgcgtcatc ctttattttg gagttgtgag atgaaactgt tttttcttca agagacaagt 1680

gatagggttg aattagaaga taggaaggtt gactctgaca tcttgaaagc attggagagt 1740

gttgcaccaa tggctcttgg tggaaaatgg aatgagaaaa tggagcatgc attcattgcc 1800

aacattgggt attaccgtcg ttataagttt gacagtgttc gagatctgtt gcgagtcatg 1860

aggaacaaat cacatcacta tagagagctt cccatagaaa ttcaggaact agtagggtcg 1920

gttccagaag ggttttatgg ttattttgcc agtcgattcc cgagactctt tattgaagta 1980

tacaaagttg ttagcagccg ctgcagggaa gaggaatgct tccagaaata cttttaa 2037

<210> 2

<211> 2201

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggtttcag aaattggggc tgctttactt tgccaggatg ttaaatatac tgtgaattca 60

agttatgaat ttcctgaaat tggcaatgac tttgttttgc catttccatg tcaatcaaaa 120

ggtattgtta ttcgagagca taatacgaca gaatatacaa gcacttctca tcatgatgat 180

ccgatgctcc cattgtcttc ttctaatgca cctacttcac tggccaagcc tgatagcaca 240

tcagatgacc gtcataatag gaaaatgctt ctagtggcag ctccagaatc aaagcttcaa 300

ttgccacaca aagttgatag attattgaac ttgtctcaag acaatgaaaa tgaaacaagt 360

gtccctcagc ctcctttgga gaatagtgat tctagaatgt ttggtgtaca tgatctgaga 420

acacctcatg ctgatgggca tggcaaggcc attttttcca aatatccagt agtattttcc 480

tttatatttt tcataatttt ggtgggcttt gtcatcaacc acgttctttt ggctaaaagg 540

ctttctgcgt taaaagacca gcctgttgct aatataaaca ttggatcctc caacagaaag 600

aaatcccgaa gatcagggaa gattaatggt tctattgaga aaaaggatca gcacacatca 660

tctggaagcg aggatgaatt ttcacctgtt ggtgctgaca acgaaaaatt gctggacctt 720

aataaattag ttggtagctt tgatggacgt agaataggta agctaattgt attaagcaaa 780

gaaattgcaa aaggaagcaa tggtacaatt gtccttgagg gattctatga aggccgagca 840

gttgctgtga aacgtcttgt ccaagctcat catgatgttg ctttcaaaga aattcaaaat 900

ctcattgtgt ctgaccagca tccgaatatt gttagatggt atggtgtgga gtatgatcaa 960

gattttgtgt atcttgctct ggagcgttgc acttgcagtt tagatgattt gattcaaatt 1020

tactcagata cacctggaaa ctcagtcctc agcaaggacc cagcaacacg tgcaatggtt 1080

gagcataaaa ttcacctgga tttggtgaaa ggtgccatgc aggatcttaa tttgtggaaa 1140

gcaaatggcc atccgtcacc gctcttccta aaactgatga ggttagtgtg ggctacagtt 1200

aactgttaaa tgatgaggat tgttcattta ctttcggatt gataatttac tgggtggact 1260

ttatcgtaat ctcctacctt ggtaactttc agatttgatc tagtccaact tcttcttcat 1320

cctccattgt tgtatctgta cacagggatg tggtttcagg tcttgctcat ttgcatgatc 1380

tgggaataat tcatcgagac ataaagcctc aaaatgtgct aataattaag gaaaaaacag 1440

tgtgtgcaaa gctttctgat atgggcatta gcaagcgcct tcttgaggat aggtcttcct 1500

tgggtcacca tgctactggc tgtggtagtt caggttggca agcaccggaa caacttcttc 1560

ttggtcgcca aacacgtgca gttgatttat ttagtttggg ttgtgtcctt ttcttctgca 1620

tcactcgggg taagcacccg tttggcaatc atcttgaacg tgatatcaat gttgtgaaca 1680

accgagtgaa cctttttcta gtggagcata tccctgaagc tgtggatcta atatcttgtt 1740

tattgaatcc tgagcctgaa ttgagaccaa gcgcattgga ggtgttgcgt catcctttat 1800

tttggagttg tgagatgaaa ctgttttttc ttcaagagac aagtgatagg gttgaattag 1860

aagataggaa ggttgactct gacatcttga aagcattgga gagtgttgca ccaatggctc 1920

ttggtggaaa atggaatgag aaaatggagc atgcattcat tgccaacatt gggtattacc 1980

gtcgttataa gtttgacagt gttcgagatc tgttgcgagt catgaggaac aaatcacatc 2040

actatagaga gcttcccata gaaattcagg aactagtagg gtcggttcca gaagggtttt 2100

atggttattt tgccagtcga ttcccgagac tctttattga agtatacaaa gttgttagca 2160

gccgctgcag ggaagaggaa tgcttccaga aatactttta a 2201

<210> 3

<211> 678

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Val Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu Leu Cys Gln Asp Val Lys Tyr

1 5 10 15

Thr Val Asn Ser Ser Tyr Glu Phe Pro Glu Ile Gly Asn Asp Phe Val

20 25 30

Leu Pro Phe Pro Cys Gln Ser Lys Gly Ile Val Ile Arg Glu His Asn

35 40 45

Thr Thr Glu Tyr Thr Ser Thr Ser His His Asp Asp Pro Met Leu Pro

50 55 60

Leu Ser Ser Ser Asn Ala Pro Thr Ser Leu Ala Lys Pro Asp Ser Thr

65 70 75 80

Ser Asp Asp Arg His Asn Arg Lys Met Leu Leu Val Ala Ala Pro Glu

85 90 95

Ser Lys Leu Gln Leu Pro His Lys Val Asp Arg Leu Leu Asn Leu Ser

100 105 110

Gln Asp Asn Glu Asn Glu Thr Ser Val Pro Gln Pro Pro Leu Glu Asn

115 120 125

Ser Asp Ser Arg Met Phe Gly Val His Asp Leu Arg Thr Pro His Ala

130 135 140

Asp Gly His Gly Lys Ala Ile Phe Ser Lys Tyr Pro Val Val Phe Ser

145 150 155 160

Phe Ile Phe Phe Ile Ile Leu Val Gly Phe Val Ile Asn His Val Leu

165 170 175

Leu Ala Lys Arg Leu Ser Ala Leu Lys Asp Gln Pro Val Ala Asn Ile

180 185 190

Asn Ile Gly Ser Ser Asn Arg Lys Lys Ser Arg Arg Ser Gly Lys Ile

195 200 205

Asn Gly Ser Ile Glu Lys Lys Asp Gln His Thr Ser Ser Gly Ser Glu

210 215 220

Asp Glu Phe Ser Pro Val Gly Ala Asp Asn Glu Lys Leu Leu Asp Leu

225 230 235 240

Asn Lys Leu Val Gly Ser Phe Asp Gly Arg Arg Ile Gly Lys Leu Ile

245 250 255

Val Leu Ser Lys Glu Ile Ala Lys Gly Ser Asn Gly Thr Ile Val Leu

260 265 270

Glu Gly Phe Tyr Glu Gly Arg Ala Val Ala Val Lys Arg Leu Val Gln

275 280 285

Ala His His Asp Val Ala Phe Lys Glu Ile Gln Asn Leu Ile Val Ser

290 295 300

Asp Gln His Pro Asn Ile Val Arg Trp Tyr Gly Val Glu Tyr Asp Gln

305 310 315 320

Asp Phe Val Tyr Leu Ala Leu Glu Arg Cys Thr Cys Ser Leu Asp Asp

325 330 335

Leu Ile Gln Ile Tyr Ser Asp Thr Pro Gly Asn Ser Val Leu Ser Lys

340 345 350

Asp Pro Ala Thr Arg Ala Met Val Glu His Lys Ile His Leu Asp Leu

355 360 365

Val Lys Gly Ala Met Gln Asp Leu Asn Leu Trp Lys Ala Asn Gly His

370 375 380

Pro Ser Pro Leu Phe Leu Lys Leu Met Arg Asp Val Val Ser Gly Leu

385 390 395 400

Ala His Leu His Asp Leu Gly Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Gln

405 410 415

Asn Val Leu Ile Ile Lys Glu Lys Thr Val Cys Ala Lys Leu Ser Asp

420 425 430

Met Gly Ile Ser Lys Arg Leu Leu Glu Asp Arg Ser Ser Leu Gly His

435 440 445

His Ala Thr Gly Cys Gly Ser Ser Gly Trp Gln Ala Pro Glu Gln Leu

450 455 460

Leu Leu Gly Arg Gln Thr Arg Ala Val Asp Leu Phe Ser Leu Gly Cys

465 470 475 480

Val Leu Phe Phe Cys Ile Thr Arg Gly Lys His Pro Phe Gly Asn His

485 490 495

Leu Glu Arg Asp Ile Asn Val Val Asn Asn Arg Val Asn Leu Phe Leu

500 505 510

Val Glu His Ile Pro Glu Ala Val Asp Leu Ile Ser Cys Leu Leu Asn

515 520 525

Pro Glu Pro Glu Leu Arg Pro Ser Ala Leu Glu Val Leu Arg His Pro

530 535 540

Leu Phe Trp Ser Cys Glu Met Lys Leu Phe Phe Leu Gln Glu Thr Ser

545 550 555 560

Asp Arg Val Glu Leu Glu Asp Arg Lys Val Asp Ser Asp Ile Leu Lys

565 570 575

Ala Leu Glu Ser Val Ala Pro Met Ala Leu Gly Gly Lys Trp Asn Glu

580 585 590

Lys Met Glu His Ala Phe Ile Ala Asn Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Tyr

595 600 605

Lys Phe Asp Ser Val Arg Asp Leu Leu Arg Val Met Arg Asn Lys Ser

610 615 620

His His Tyr Arg Glu Leu Pro Ile Glu Ile Gln Glu Leu Val Gly Ser

625 630 635 640

Val Pro Glu Gly Phe Tyr Gly Tyr Phe Ala Ser Arg Phe Pro Arg Leu

645 650 655

Phe Ile Glu Val Tyr Lys Val Val Ser Ser Arg Cys Arg Glu Glu Glu

660 665 670

Cys Phe Gln Lys Tyr Phe

675

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atggtttcag aaattggggc tg 22

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ttaaaagtat ttctggaagc attcctcttc 30

Claims

1.一种蛋白质，为如下A1)或A2)或A3)或A4)任一所示的蛋白质：

A1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述C1)至C8)中的任一种：

C1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；

C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；

C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；

C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；

C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：C1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的cDNA分子；

4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在如下P1)-P4)任一种中的应用：

P1)调控植物耐逆性；

P2)培育耐逆性提高的转基因植物；

P3)培育耐逆性降低的转基因植物；

P4)植物育种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性。

6.一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性低于所述目的植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性；

或，所述转基因植物的耐逆性低于所述目的植物具体体现在如下m1)-m3)中任一种：

m1)所述转基因植物的种子萌发率低于所述目的植物；

m2)所述转基因植物的子叶出生率低于所述目的植物；

m3)所述转基因植物的真叶出生率低于所述目的植物；

或，所述提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性的方法为在目的植物中过表达权利要求1所述蛋白质。

8.一种耐盐基因剪切体的获得方法，包括如下步骤：

q3)将所述PCR产物进行测序，得到耐盐基因剪切体序列。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述耐盐基因为GhIRE1基因；

或，所述引物对由序列4所示的DNA分子和序列5所示的DNA分子组成。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述耐盐基因剪切体序列为GhIRE1-s1序列或GhIRE1-s2序列；

所述GhIRE1-s1序列为依次由GhIRE1基因外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5顺序连接形成的CDS序列；

所述GhIRE1-s2序列为依次由GhIRE1基因外显子1、部分内含子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5顺序连接形成的CDS序列。