CN110627885B

CN110627885B - 一种小麦白粉病抗性基因及其应用

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Publication number: CN110627885B
Application number: CN201810538244.3A
Authority: CN
Inventors: 孙加强; 荆叶醒; 刘杰
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN110627885A

Abstract

本发明公开了一种小麦白粉病抗性基因及其应用。本发明的发明人从普通小麦栽培品种KN199中鉴定出来自于A基因组的小麦TaJAZ1基因，并通过稳定转基因技术证明缺失jas结构域的TaJAZ1过量表达能够导致小麦抗性增强，表明TaJAZ1正调控小麦抗性。本发明首次证明，TaJAZ1是小麦抗性的关键调控基因。

Description

一种小麦白粉病抗性基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种小麦白粉病抗性基因及其应用。

背景技术

小麦是世界性的重要粮食作物。全世界约有35％～40％的人口以小麦作为主要粮食。20世纪80年代以来随着矮秆、半矮秆品种的推广和水肥条件的改善,小麦病害的发生及危害在我国日趋严重。虽然化学防治小麦病害可以取得一定的成效,但浪费人力、物力和财力,特别是会造成环境污染。因此,在防治小麦病害上采用育种方法,选育抗病品种是最经济有效的方法。已有研究证明利用基因编辑技术将六倍体小麦中三个TaMLO等位位点突变，可赋予小麦可遗传的白粉病广谱抗性。小麦中，乙烯负调控白粉病抗性。茉莉酸在调节植物对食草动物、腐生型病原菌的抗性中起到了很重要的作用，水杨酸主要调控的是植物对活体营养型或者半活体营养型病原菌的抗性。茉莉酸和水杨酸的作用相互拮抗，因此提高植物对腐生型病原菌的抗性常会伴随对活体病原菌感病。到目前为止在小麦等主要作物育种实践中，可利用的抗病种质资源仍然过分单一，影响了新品种的增产潜力和遗传多样性。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦白粉病抗性基因及其应用。

本发明提供了一种蛋白质，获自小麦，命名为TaJAZ1蛋白，是如下(a)或(b)或(c)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)由序列表中序列1自N端第1至330位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)将(a)或(b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的蛋白质。

为了使(a)或(b)中的蛋白便于纯化和检测，可在(a)或(b)所示蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(c)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(c)中的蛋白的编码基因可通过将TaJAZ1蛋白的编码基因中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述TaJAZ1蛋白的基因(TaJAZ1基因)也属于本发明的保护范围。

所述TaJAZ1基因为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：

(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2自5’端第1-990位所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码与植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有所述TaJAZ1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有TaJAZ1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用TaJAZ1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用TaJAZ1基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。

所述重组表达载体具体可为将pUBI:cas载体的BamHI和KpnI酶切位点之间的片段替换为序列表的序列2自5’端第1至990位所示的DNA分子，得到的重组表达载体。

本发明还保护TaJAZ1蛋白或TaJAZ1基因在调控植物白粉病抗性中的应用。

所述调控为正向调控。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将TaJAZ1基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物白粉病抗性高于所述目的植物。

所述方法中，所述TaJAZ1基因可以通过以上任一所述重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

本发明还保护一种提高植物白粉病抗性的方法，是提高目的植物中TaJAZ1蛋白的活性和/或表达量，提高植物白粉病抗性。

本发明还保护以上任一所述方法或TaJAZ1蛋白或TaJAZ1基因在植物育种中的应用。

所述育种的目的是选育白粉病抗性高的植物。

以上任一所述白粉病具体可为由白粉病菌株引起的白粉病，更具体可为由白粉菌菌株E09引起的白粉病。

以上任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦属植物。所述小麦属植物具体可为小麦，例如小麦栽培品种KN199。

本发明的发明人从普通小麦栽培品种KN199中鉴定出来自于A基因组的小麦TaJAZ1基因，并通过稳定转基因技术证明缺失jas结构域的TaJAZ1过量表达能够导致小麦抗性增强，表明TaJAZ1正调控小麦抗性。本发明首次证明，TaJAZ1是小麦抗性的关键调控基因。

附图说明

图1为TaJAZ1亚细胞定位。

图2为荧光定量PCR检测茉莉酸诱导小麦KN199中TaJAZ1积累量。

图3为荧光定量PCR检测转基因小麦TaJAZ1积累量。

图4为KN199(WT)与过量表达TaJAZ1基因的小麦侵染后白粉孢子萌发表型。Bar＝250μm。

图5为KN199(WT)与过量表达TaJAZ1基因的小麦侵染后白粉孢子萌发率统计。

图6为KN199(WT)与过量表达TaJAZ1基因的小麦侵染后H2O2含量检测。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

小麦栽培品种KN199：Zou,S.,Wang,H.,Li,Y.,Kong,Z.,and Tang,D.(2018).TheNB-LRR gene Pm60confers powdery mildew resistance in wheat.New Phytologist218,298-309.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pUBI:cas载体：参考文献：He X,Qu B,Li W,et al.The Nitrate-Inducible NACTranscription Factor TaNAC2-5A Controls Nitrate Response and Increases WheatYield.[J].Plant Physiology,2015,169(3):1991-2005.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pQBV3载体：Liu,J.,Cheng,X.,Liu,P.,and Sun,J.(2017).miR156-TargetedSBP-Box Transcription Factors Interact with DWARF53 to Regulate TEOSINTEBRANCHED1 and BARREN STALK1 Expression in Bread Wheat.Plant Physiology 174,1931-1948.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pGWB5载体：Nakagawa,T.,Kurose,T.,Hino,T.,Tanaka,K.,Kawamukai,M.,Niwa,Y.,Toyooka,K.,Matsuoka,K.,Jinbo,T.and Kimura,T.(2007)Development of series ofgateway binary vectors,pGWBs,for realizing efficient construction of fusiongenes for plant transformation.J BiosciBioeng 104,34-41.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、TaJAZ1蛋白及其编码基因的获得

提取普通小麦栽培品种KN199的总RNA，并反转录为cDNA。经过大量序列分析、表达量分析与功能验证，从cDNA中发现了一个DNA编码序列，如序列表的序列2所示，其编码的蛋白质如序列表的序列1所示。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为TaJAZ1蛋白。将编码TaJAZ1蛋白的基因命名为TaJAZ1基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、TaJAZ1蛋白亚细胞定位

1、将pQBV3载体(也称为入门载体)的两个EcoRV酶切位点之间的片段替换为序列表的序列2所示的DNA分子，得到重组载体。通过“入门克隆技术”(gateway cloningtechnology,Invitrogen)将目的片段(序列表的序列2所示的DNA分子)从重组载体克隆到目的载体pGWB5上，得到表达载体35S:TaJAZ1-GFP(已经测序验证)。

2、将步骤1得到的表达载体35S:TaJAZ1-GFP导入农杆菌菌株GV3101(可参照文献：Liu,J.,Zhang,T.,Jia,J.and Sun,J.The Wheat Mediator Subunit TaMED25 Interactswith the Transcription Factor TaEIL1to Negatively Regulate Disease Resistanceagainst Powdery Mildew.Plant physiology，2016，170,1799-1816.)中，得到重组菌。

3、取步骤2得到的重组菌注射本生烟烟草，菌注射浓度的OD值为1～1.5(可参照文献：Liu,J.,Zhang,T.,Jia,J.and Sun,J.The Wheat Mediator Subunit TaMED25Interacts with the Transcription Factor TaEIL1to Negatively Regulate DiseaseResistance against Powdery Mildew.Plant physiology，2016，170,1799-1816.)，48h后，取注射部位制片，在共聚焦显微镜下观察。

结果如图1所示。结果表明，TaJAZ1定位于细胞核。

实施例3、TaJAZ1基因表达模式分析

1、在光照培养箱内水培小麦栽培品种KN199一周，用10mM茉莉酸甲酯处理，并在处理后的不同时间点(0h、1h、12h和24h)取样。

2、提取步骤1各时间点得到的样本，提取总RNA，并反转录为cDNA。以该cDNA为模板，采用引物F1：5’-GACACGCCGAAGCCAAAGAC-3’和引物R1：5’-GGCAAAGGAGGTGAAACACG-3’组成的引物对通过实时荧光定量PCR扩增鉴定TaJAZ1基因的相对表达量(以TaGAPDH为内参，采用引物F2：5’-TTAGACTTGCGAAGCCAGCA-3’和引物R2：5’-AAATGCCCTTGAGGTTTCCC-3’组成的引物对鉴定内参)。

结果如图2所示。结果表明，TaJAZ1的表达受茉莉酸的诱导。

实施例3、转基因植株的构建及表型分析

一、重组表达载体的构建

将pUBI:cas载体的BamHI和KpnI酶切位点之间的片段替换为序列表的序列2自5’端第1至990位所示的DNA分子(删除序列2中的jas结构域，目的在于使蛋白稳定性增强)，得到重组表达载体(已经测序验证)。

二、转基因植株的构建

将步骤一得到的重组表达载体通过基因枪转化法转化小麦栽培品种KN199的幼胚，得到T₀代转基因小麦植株(具体方法可参照文献：Shan Q,Wang Y,Li J,etal.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system.[J].Nature Biotechnology,2013,31(8):686-688.)。T₀代自交得到T₁代，T₁代自交得到T₂代。

三、转空载体对照植株的构建

采用pUBI:cas载体替代重组表达载体，按照步骤二进行操作，得到转空载体对照植株。

四、转基因植株TaJAZ1表达水平检测

待测植株：小麦栽培品种KN199、步骤二得到的T₂代转基因株系(#7和#16)和步骤三得到的转空载体对照植株。

提取待测植株的总RNA并反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，采用引物F1：5’-GACACGCCGAAGCCAAAGAC-3’和引物R1：5’-GGCAAAGGAGGTGAAACACG-3’组成的引物对通过实时荧光定量PCR扩增鉴定TaJAZ1基因的相对表达量(以TaGAPDH为内参，采用引物F2：5’-TTAGACTTGCGAAGCCAGCA-3’和引物R2：5’-AAATGCCCTTGAGGTTTCCC-3’组成的引物对鉴定内参)。

结果如图3所示。结果表明，转基因株系中，TaJAZ1的表达水平均显著升高至对照的100倍左右。转空载体对照植株中TaJAZ1的表达水平与小麦栽培品种KN199无显著差异。

四、转基因植株表型分析

水培待测植株，生长一周后将叶片剪下，放于培养基上培养，同时用小麦栽培品种KN199培养白粉菌菌株E09,将培养好的白粉菌轻微抖落，低密度接种至待测植株叶片上。生长72h后，对叶片固定脱色染色(具体方法可参照文献：Liu,J.,Zhang,T.,Jia,J.and Sun,J.The Wheat Mediator Subunit TaMED25 Interacts with the Transcription FactorTaEIL1 to Negatively Regulate Disease Resistance against Powdery Mildew.Plantphysiology，2016，170,1799-1816.)，利用显微镜观察并用计数器手动计数统计，发现TaJAZ1过量表达以后，小麦叶片上萌发白粉孢子中微菌落形成的比例低于对照KN199植株(图4，白色箭头表示萌发的白粉孢子，黑色箭头表示萌发后形成微菌落的白粉孢子)。统计结果也证明，TaJAZ1△jas-OE植株的萌发白粉孢子中微菌落形成的比例显著低于对照(图5)。根据Amplex Red Hydrogen Peroxide assay kit(Invitrogen)中的方法，提取并检测白粉菌侵染后小麦叶片中H₂O₂的积累量，结果表明转基因小麦中H₂O₂的积累量高于对照KN199植株(图6)。以上结果表明，TaJAZ1是小麦抗白粉病的正调控因子。

上述实验进行3次重复试验，每次重复试验中每个株系3-5株。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种小麦白粉病抗性基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 415

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 1

Met Glu Arg Asp Phe Leu Gly Thr Ile Gly His Glu Gln Leu Gln Gln

1 5 10 15

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Arg Gln Arg Ala Ala Ala Glu Asp Ala Ala

20 25 30

Ala Arg Lys Glu Ser Ala Tyr Phe Gly Gly Gly Gly Val Pro Pro Met

35 40 45

Asp Trp Ser Phe Ala Gly Arg Ala Gly Ala Ala Pro Ala Val Met Ser

50 55 60

Phe Arg Ser Ala Pro Arg Glu Glu Gln Arg Gly Glu Leu Ala Tyr Pro

65 70 75 80

Lys Gln Gln Ala Ser Arg Val Leu Thr Pro Gln Arg Ser Phe Gly Ala

85 90 95

Glu Ser His Gly Ser Val Gln Tyr Ala Ala Ala Ala Arg Ala Ala Tyr

100 105 110

Gly Gly Gln Pro Pro Gln Gln His Gln His Ala Pro Asn Gly Ala Arg

115 120 125

Val Ile Pro Met Ser Ser Pro Phe Asn Pro Asn Asn Pro Met Phe Arg

130 135 140

Val Gln Ser Ser Pro Asn Leu Pro Asn Gly Val Ala Ala Gly Ser Pro

145 150 155 160

Phe Lys Gln Pro Pro Phe Val Met Asn Asn Ala Val Ala Ala Ser Thr

165 170 175

Val Gly Val Tyr Lys Ser Arg Asp Thr Pro Lys Pro Lys Thr Ala Gln

180 185 190

Leu Thr Ile Phe Tyr Ala Gly Ser Val Asn Val Phe Asn Asn Val Ser

195 200 205

Ala Glu Lys Ala Gln Glu Leu Met Phe Leu Ala Ser Arg Gly Ser Leu

210 215 220

Pro Thr Ala Pro Thr Thr Val Thr Arg Ser Pro Asp Ala Thr Phe Phe

225 230 235 240

Thr Pro Ala Lys Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ser Pro Ala Lys Gln Met

245 250 255

Leu Ala Gln Ile Pro Gln Arg Val Ser Pro Pro Leu Pro Ala Ile Ser

260 265 270

Lys Pro Met Ser Ile Met Ser Gln Ala Ala Cys Leu Pro Lys Ser Thr

275 280 285

Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ala Val Pro Lys Ser Ser Gly Gln Leu

290 295 300

Val Val Pro Pro Thr Ser Gln Pro Ser Ser Ser Thr Leu Ala Ser Thr

305 310 315 320

Thr Ala Ala Ser Ile Met Pro Arg Ala Val Pro Gln Ala Arg Lys Ala

325 330 335

Ser Leu Ala Arg Phe Leu Glu Lys Arg Lys Glu Arg Val Thr Thr Thr

340 345 350

Ala Pro Tyr Pro Ser Ala Lys Ser Pro Met Glu Ser Ser Asp Thr Val

355 360 365

Gly Ser Ala Asn Asp Asn Asn Ser Lys Ser Ser Ser Cys Thr Glu Ile

370 375 380

Ala Phe Ser Ser Asn His Glu Glu Ser Leu Arg Leu Gly Arg Pro Arg

385 390 395 400

Asn Ile Ser Phe Ser Gly Glu Ser Pro Ser Thr Lys Leu His Ile

405 410 415

<210> 2

<211> 1248

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 2

atggagaggg acttcctggg caccataggc cacgagcagc tgcagcagca gcagcagcag 60

cagcagcgcc agcgcgccgc cgccgaggac gccgccgcca gaaaggagtc agcttacttt 120

gggggaggag gagtgccgcc catggattgg tccttcgctg gcagggccgg ggccgcgccg 180

gcggtcatgt ccttcaggtc ggcgccgagg gaggagcagc ggggcgagct cgcctacccc 240

aagcagcagg cctcccgcgt cctgacgcca cagagatcgt ttggtgctga gagccacggc 300

agcgtgcagt acgccgccgc cgcgcgtgcg gcttacggcg ggcagcctcc gcagcagcac 360

cagcatgctc ctaatggtgc tagagtgatt ccaatgtcgt cgccgttcaa tcccaacaat 420

cccatgttca gggttcagag ttcgcctaac ctcccgaacg gtgttgctgc tggtagcccg 480

ttcaaacaac cgcctttcgt gatgaacaat gcggtggctg cttcgactgt tggtgtctat 540

aaatcaaggg acacgccgaa gccaaagaca gcgcaattaa ctatcttcta tgctggttct 600

gtcaatgtat tcaacaacgt ctcagcagaa aaggctcagg agcttatgtt cttggctagc 660

agaggatctc ttccaaccgc acccactact gttactcgca gcccagatgc aacctttttc 720

actccggcta aactcgccgc ccctgaggct tcacctgcaa agcagatgct agctcagata 780

ccacagcgtg tttcacctcc tttgccagcc atttccaaac cgatgtccat catgtctcaa 840

gctgcatgtc tccccaagag cacatctagc tccaacaccg attccgcagt gccaaaatct 900

tcaggccagt tggttgtgcc tcccacaagt cagccctcgt cgtcgacact agcgtccacc 960

actgcagcaa gtattatgcc aagagctgtt cctcaagctc ggaaggcatc ccttgcccga 1020

ttcttggaga aaaggaaaga aagggtgacg actacggcgc catatccatc agccaagagc 1080

ccgatggaga gcagcgacac ggtcggaagc gccaacgaca acaacagcaa gtcctcatcg 1140

tgcacagaga tcgccttctc aagcaaccat gaagagtcgc tgcgcctagg ccggcccagg 1200

aacatcagct ttagcgggga gtccccgagt acaaaattac acatctga 1248

Claims

1.一种蛋白质，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列1自N端第1至330位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下（1）或（2）：

（1）编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）序列表中序列2自5’端第1-990位所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

5.权利要求2或3所述基因在提高小麦白粉病抗性中的应用。

6.一种培育转基因小麦的方法，其特征在于：是将权利要求2或3所述基因导入目的小麦中，得到转基因小麦；所述转基因小麦白粉病抗性高于所述目的小麦。

7.一种提高小麦白粉病抗性的方法，其特征在于：是提高目的小麦中权利要求1所述蛋白质的表达量，提高小麦白粉病抗性。

8.权利要求2或3所述基因或权利要求6或7所述方法在小麦育种中的应用；所述育种的目的为选育白粉病抗性高的小麦。