CN114539373A

CN114539373A - 与甘薯茎线虫病抗性相关蛋白IbPIF1及其编码基因与应用

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Publication number: CN114539373A
Application number: CN202210145797.9A
Authority: CN
Inventors: 翟红; 刘庆昌; 何绍贞; 高少培; 张欢; 霍进喜; 聂楠
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-02-17
Filing date: 2022-02-17
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2042-02-17
Also published as: CN114539373B

Abstract

本发明公开了与甘薯茎线虫病抗性相关蛋白IbPIF1及其编码基因与应用。所述IbPIF1为a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白质：a1)序列2所示的蛋白质；a2)在序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与茎线虫病抗性相关的蛋白质；a4)与序列2所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于甘薯且与茎线虫病抗性相关的蛋白质。本发明将IbPIF1蛋白的编码基因导入甘薯中，得到转基因植株，并将其进行茎线虫侵染，发现其抗性增强。说明IbPIF1蛋白在植物抗病过程中起着重要的作用，具有广阔的应用前景。

Description

与甘薯茎线虫病抗性相关蛋白IbPIF1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及与甘薯茎线虫病抗性相关蛋白IbPIF1及其编码基因与应用。

背景技术

甘薯是一种重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源植物，其地位尤为重要。我国是世界上最大的甘薯生产国，年种植面积329.1万hm²，占世界总种植面积的38.1％，年产量占世界总产量的67.3％。随着世界人口的快速增长和可耕地面积的减少，粮食生产安全受到了严重的威胁。在农业生产中，病虫害始终是农作物生产面临的严重威胁之一，影响作物的产量和品质，甘薯也不例外。而培育病虫害抗性好的甘薯品种是防治病虫害最经济最有效的手段，因此中国始终将抗病虫甘薯品种的培育作为甘薯育种的重要目标。甘薯茎线虫病在中国南北地区都有发生，在北方地区尤其严重，发病后一般造成20～30％的减产，严重时有50％以上的减产甚至绝产，甘薯生产面临严重威胁。因此进一步改良甘薯抗逆性对于提高甘薯的产量、品质具有重要意义。

甘薯遗传上表现为高度杂合性、杂交不亲和以及自交高度不育，且抗性性状和产量、品质性状呈负相关，同时甘薯的种质资源日益狭窄等，使得常规育种的应用受到限制。基因工程作为新兴的技术手段，能够不受亲缘关系的限制，打破有利基因和不利基因的连锁，对定向改良甘薯的抗性有着重要的理论意义和应用价值。

光敏色素互作因子PIF含有bHLH保守结构域，在拟南芥中PIF隶属于bHLH亚家族15，包括8个成员。所有成员都包含APB和bHLH保守结构域，其中PIF1和PIF3还含有APA，能够与phyA和phyB互作。PIF在光形态建成中作为一类负向调控因子，还参与生物钟、激素信号及胁迫响应。但是PIFs的不同成员的功能也存在差异。研究表明，PIF1可通过与蛋白质的互作或直接影响基因表达在调控种子萌发、下胚轴生长、叶绿素合成、光形态建成、避荫反应、响应活性氧胁迫和增强抗旱性等方面发挥重要作用。但在抗病性方面还未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供与甘薯茎线虫病抗性相关的蛋白质。

本发明提供的与甘薯茎线虫病抗性相关的蛋白质的名称为IbPIF1，来源于甘薯(Ipomoea batatas)，为a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白质：

a1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

a2)在序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与茎线虫病抗性相关的蛋白质；

a4)与序列2所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于甘薯且与茎线虫病抗性相关的蛋白质。

上述a2)所述的蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述a3)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a4)所述的蛋白质中，“同一性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。

上述a1)或a2)或a3)或a4)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明又提供了与上述IbPIF1蛋白质相关的生物材料，该生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码上述IbPIF1蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)序列1所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述IbPIF1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述IbPIF1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

序列1由1605个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为自5′末端起第1-1605位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码IbPIF1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码IbPIF1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码IbPIF1蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码上述IbPIF1蛋白质的核酸分子的表达盒(IbPIF1基因表达盒)是指能够在宿主细胞中表达上述IbPIF1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动IbPIF1转录的启动子，还可包括终止IbPIF1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述IbPIF1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

本发明还提供了上述IbPIF1蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了上述IbPIF1蛋白质或上述生物材料在调控植物抗病性中的应用。

本发明还提供了上述IbPIF1蛋白质或上述生物材料在培育抗病性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述IbPIF1蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。

进一步的，所述抗病性可为茎线虫病抗性。所述调控植物抗病性体现为：当植物中的IbPIF1蛋白质的含量和/或活性提高或IbPIF1基因表达水平提高时，所述植物的茎线虫病抗性提高；当植物中的IbPIF1蛋白质的含量和/或活性降低或IbPIF1基因表达水平降低时，所述植物的茎线虫病抗性降低。所述调控植物抗病性具体体现为：当植物中的IbPIF1蛋白质的含量和/或活性提高或IbPIF1基因表达水平提高时，所述植物在茎线虫胁迫条件下POD活性和木质素含量提高、丙二醛含量降低。

更进一步的，所述调控可为提高。

所述育种的目的为培育茎线虫病抗性高的植物品种。

本发明最后提供了一种培育抗病性提高的转基因植物方法。

本发明提供的培育抗病性提高的转基因植物方法包括如下步骤：提高受体植物中IbPIF1蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物。

进一步的，所述提高受体植物中IbPIF1蛋白质的含量和/或活性的方法可为在受体植物中过表达IbPIF1蛋白质。

所述抗病性可为茎线虫病抗性。

更进一步的，所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物具体体现为如下X1)-X3)中任一种：

X1)在茎线虫胁迫条件下植物POD活性高于受体植物；

X2)在茎线虫胁迫条件下植物木质素含量高于受体植物；

X3)在茎线虫胁迫条件下植物丙二醛含量低于受体植物。

所述在受体植物中过表达IbPIF1蛋白质的方法为将IbPIF1蛋白质的编码基因导入受体植物。

在本发明的一个具体实施例中，所述IbPIF1蛋白质的编码基因通过重组表达载体导入受体植物中。所述重组表达载体为pCAIbPIF1，所述pCAIbPIF1为在载体pCAMBIA3301的NcoI和PmlI酶切位点间插入了序列表中序列1自5’末端起第1-1605位所示的DNA片段后得到的载体。

上述任一所述应用或方法中，所述植物为如下E1)-E5)中任一种：

E1)双子叶植物；

E2)单子叶植物；

E3)旋花科植物；

E4)甘薯属植物；

E5)甘薯。

本发明提供了一种IbPIF1蛋白及其编码基因，进一步的，通过将IbPIF1基因导入甘薯中，得到过表达IbPIF1基因的转基因甘薯植株，并对转基因甘薯植株进行茎线虫病抗性鉴定，发现其与野生型甘薯植株相比，抗病性显著提高。说明IbPIF1基因及其所编码的蛋白在植物抗逆响应过程中起着重要的作用。本发明所提供的IbPIF1蛋白及其编码基因在改良植物抗逆性中具有重要的应用价值。本发明将在农业技术领域中具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为转基因甘薯植株的PCR检测检测结果。其中，M为Maker；W为水对照；P为质粒对照；WT为野生型甘薯植株；L1-7为转基因植株。

图2为转基因甘薯植株和野生型甘薯植株IbPIF1基因表达分析。其中，WT为野生型甘薯植株；L1-7为转基因植株。

图3为转基因甘薯植株和野生型对照植株的茎线虫病抗性分析。其中，WT为野生型甘薯植株；L4和L7为转基因植株。

图4为转基因甘薯植株和野生型对照植株的POD活性、MDA含量和木质素含量测定。其中，WT为野生型甘薯植株；L4和L7为转基因植株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的甘薯品种鲁薯3号记载于文献“翟红,商丽丽,刘庆昌.甘薯茎线虫诱导抑制差减杂交cDNA文库的构建及表达序列标签分析。农业生物技术学报，2010,18(1)：141–148”中，公众可从中国农业大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的甘薯品种商薯19记载于文献“Kang Chen,Zhai Hong,Xue Luyao,Zhao Ning,He Shaozhen,Liu Qingchang.A lycopeneβ-cyclase gene,IbLCYB2,enhancescarotenoid contents and abiotic stress tolerance in transgenicsweetpotato.Plant Science,2018,272:243–254”中，公众可从中国农业大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、与提高甘薯茎线虫病相关蛋白质IbPIF1及其编码基因的获得

1、甘薯总RNA提取

取0.1g甘薯品种鲁薯3号幼嫩叶片在液氮中研磨成粉状，加入2mL离心管，用TIANGEN的RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(目录号：DP432)提取甘薯总RNA，试剂盒中包括：裂解液RL，去蛋白液RW1，漂洗液RW，RNase-Free ddH₂O，RNase-Free吸附柱CR3，RNase-Free过滤柱CS，DNase I，缓冲液RDD，RNase-Free离心管，RNase-Free收集管。

取1μL提取的总RNA于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL提取的总RNA稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD₂₆₀)和纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，提取的鲁薯3号总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为(1.5～2)：1，表明总RNA没有降解，所得mRNA符合实验要求，可用于IbPIF1蛋白cDNA的克隆。

2、IbPIF1基因cDNA序列的克隆

设计引物进行IbPIF1 cDNA序列的克隆。引物序列具体如下：

引物1：5′-ATGGATGAGGACTTCAATCTTCCT-3'；

引物2：5′-TCAACGAGATTGATGATTCCCTG-3'。

以上述步骤1提取的总RNA经QuantScript RT Kit(TIANGEN，Beijing)反转录获得的cDNA为模板，用高保真的LA酶进行PCR扩增，得到PCR产物。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，获得长度为1605bp的扩增片段，并对其进行测序。

测序结果表明，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，并将该序列所示的基因命名为IbPIF1，该基因的编码区为序列表中序列1自5’末端起第1-1605位核苷酸。将IbPIF1基因编码的蛋白命名为IbPIF1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；序列表中序列2由534个氨基酸残基组成。

实施例2、IbPIF1蛋白在提高甘薯茎线虫病抗性中的应用

一、转IbPIF1甘薯的制备

1、植物表达载体的构建

1)根据甘薯IbPIF1基因的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，并在正向引物(引物3)和反向引物(引物4)中分别引入NcoI和PmlI酶切位点，引物序列具体如下：

引物3：5′-CATGCCATGGATGGATGAGGACTTCAATCTTCCT-3’(下划线部分为NcoI酶切位点)；

引物4：5′-GCCACGTGTCAACGAGATTGATGATTCCCTG-3’(下划线部分为PmlI酶切位点)。

2)以人工合成的SEQ ID No.2所示的DNA片段为模板，采用引物3和引物4进行PCR扩增，得到PCR产物，然后将PCR产物连接到pMD19-T载体(购自北京泽平科技有限责任公司，产品目录号为A1360)上，得到重组载体，将其命名为pGIbPIF1，并对其进行测序，保证甘薯IbPIF1基因cDNA的阅读框及酶切位点的正确。

用NcoI和PmlI酶切载体pCAMBIA3301(购自CAMBIA公司)回收约11Kb载体大片段，同时，用NcoI和PmlI酶切重组载体pGIbPIF1，回收约1.6kb中间片段，将回收的载体大片段与约1.6kb中间片段连接，得到重组载体，将其命名为pCAIbPIF1，并对其进行测序验证和酶切鉴定。

测序结果表明，重组载体pCAIbPIF1为在载体pCAMBIA3301的NcoI和PmlI酶切位点间插入了序列表中序列1自5’末端起第1-1605位所示的DNA片段后得到的载体。

2、植物表达载体转化农杆菌

1)从-80℃低温冰箱中取出200μL EHA105感受态细胞(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，置冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的重组载体pCAIbPIF1，混匀。

2)液氮冷冻1min，37℃温育5min。

3)加入800μL LB液体培养基，28℃培养2-6h。

4)取100μL菌液至含100μg/mL利福平(Rif)、25μg/mL卡那霉素(Kan)的LB固体培养基上，涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28℃培养2d。

5)取PCR鉴定呈阳性的单菌落，接种到含有100μg/mL Rif、25μg/mL Kan的LB液体培养基中，28℃培养30h至对数生长期，取适量农杆菌用MS液体培养基稀释30倍备用，即得到导入pCAIbPIF1农杆菌菌液，并将其命名为重组菌EHA105/pCAIbPIF1。

3、转IbPIF1甘薯的获得

1)转基因植株的获得

用农杆菌介导的方法将IbPIF1的编码序列导入至野生型甘薯品种商薯19中，具体方法如下：

A、选取经过悬浮培养约3d、直径为0.7-1.3mm的甘薯品种商薯19胚性细胞团，悬浮于上述步骤2制备好的重组菌EHA105/pCAIbPIF1中，5min后将菌液吸出，得到侵染过的胚性细胞团。然后将侵染过的胚性细胞团接种培养在固体培养基(含有30mg/L AS、2.0mg/L 2,4-D的MS培养基)上，28℃、黑暗共培养3d。

上述甘薯品种商薯19胚性细胞团的制备方法参照文献“Yu et al(2007)(Yu B,Zhai H,Wang YP,Zang N,He SZ,Liu QC.Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation using embryogenic suspension cultures in sweetpotato,Ipomoea batatas(L.)Lam.2007,Plant Cell,Tissue&Organ Culture，90(3):265-273)”中的方法。

B、将共培养3d后的胚性细胞团用含有500mg/L Carb和2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基洗涤2次，然后将洗涤后的胚性细胞团转至含有2.0mg/L 2,4-D、100mg/L Carb和0.3-0.6mg/L PPT的MS固体培养基上进行选择培养，培养条件为2721℃、黑暗，每2周继代培养1次。经过10-12周选择培养，将其转移至含有1.0mg/L ABA和100mg/LCarb的MS固体培养基上进行体细胞胚诱导培养，培养条件为2721℃、每日13h、3000lx的光照。诱导培养2-4周后，将抗性愈伤组织转移至MS基本培养基上进行培养，培养条件为2721℃、每日13h、3000lx的光照。培养4-8周后，形成完整的再生植株，即转基因植株。

2)转基因植株的鉴定

A、PCR检测

用CTAB法提取转基因植株和野生型甘薯植株(商薯19)的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，阳性转基因植株预计扩增片段长度约为500bp。以pCAIbPIF1载体质粒为阳性对照，水和野生型商薯19甘薯植株为阴性对照。所使用的扩增引物序列具体如下：

引物5：5'-TCTGCACCATCGTCAACCAC-3'；

引物6：5'-AAACCCACGTCATGCCAGTT-3'。

PCR检测体系如下：在0.2mL Eppendorf离心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物5(10mol/L)1μL、引物6(10mol/L)1μL、模板DNA(50ng/μL)2μL、Taq DNA聚合酶1μL，加H₂O至总体积为20μL。

PCR反应程序为94℃变性4min，57℃复性1.5min，72℃延伸1min30s，共35个循环。

电泳检测PCR产物。

结果见图1，从图中可见，转基因植株L1-L7和阳性对照均扩增出500bp左右的目标条带，表明转基因植株L1-L7均为转IbPIF1植株。

B、IbPIF1基因的表达分析

将A中鉴定得到的转IbPIF1植株扩繁后用TroZol试剂盒提取RNA，然后再用试剂盒SYBR Premix Ex Taq采用qRT-PCR检测IbPIF1基因的表达量，试剂盒SYBR Premix Ex Taq为TaKaRa(宝生物(工程)有限公司，大连)公司的产品(目录号：RR420)。同时以野生型商薯19甘薯植株(WT)为阴性对照。用于表达量的分析的引物7和引物8的序列具体如下：

引物7：5'-CGACACGGAGGGTCATAGTG-3'；

引物8：5'-CTCGACGTCTCCTTTCCGAG-3'。

实验结果见图2，结果表明：与野生型商薯19甘薯植株(WT)相比，转IbPIF1甘薯植株L1-L7中IbPIF1基因的表达量显著提高。选取转IbPIF1甘薯植株L4和L7用于下述茎线虫病抗性鉴定实验。

二、转IbPIF1植株的茎线虫病抗性鉴定

1、转IbPIF1植株茎线虫接种鉴定

将转IbPIF1甘薯块根进行甘薯茎线虫(甘薯茎线虫记载于文献“Gao S,Yu B,YuanL,Zhai H,He SZ,Liu QC(2011):Production of transgenic sweetpotato plantsresistant to stem nematodes using oryzacystatin-I gene.ScientiaHorticulturae,128:408-414”中)接种，以鉴定其对甘薯茎线虫病的抗性。同时以野生型甘薯品种商薯19块根为对照。

线虫接种方法参照文献“于波(2007)中国农业大学博士学位论文”中的方法，具体步骤如下：

1)甘薯茎线虫的增殖培养和分离

A、用浅盘法分离出线虫，在烧杯中室温沉淀，然后转入1.5mL离心管中，5000rpm室温离心2min，收集线虫，在显微镜下观察线虫口针和尾部来确认甘薯茎线虫。

B、用1mL 100mg/L硫酸链霉素(Str)消毒15min，反复轻摇使线虫与Str充分混合接触。

C、5000rpm室温离心2min，弃掉Str，用灭菌水清洗3次，每次5000rpm室温下离心2min。收集的线虫4℃灭菌水保存。

D、取10μL线虫加入90μL水稀释10倍，在显微镜下计数，重复3次确定收集线虫的浓度，以雌虫、雄虫和幼虫总和作为虫量。

E、将转IbPIF1甘薯块根及野生型甘薯块根用自来水洗净甘薯块根表面的泥土，然后用70％乙醇清洗块根进行表面消毒。每个株系各取3个块根作为重复。

F、用打孔器在甘薯块根中部打孔，用枪头将250条甘薯茎线虫注入孔中，将打孔器中的薯条插入孔中，以无菌水作对照，用熔化的石蜡封口。25℃培养45d。

2)室内茎线虫接种鉴定

接种培养45d后，沿着接种孔切开横切面，观察并统计转IbPIF1甘薯块根和野生型甘薯块根的发病面积。甘薯茎线虫病抗性的鉴定方法参照谢逸萍等(2002)，先对发病面积进行分级，然后根据病情指数来确定转基因株系的抗病性。具体如下：

A、薯块发病程度

根据薯块横切面的发病面积进行发病程度分级：

0级：无病症；

1级：发病面积占横切面的25％以下；

2级：发病面积占横切面的25％-50％；

3级：发病面积占横切面的50％-75％；

4级：发病面积占横切面的75％以上。

B、病情指数和防治效果

病情指数和防治效果按照下列公式计算：

病情指数＝[∑(各级病块数×相应病级数)/(调查总薯数×最高病级数)]×100％。

防治效果＝[(1-病情指数)/对照病情指数]×100％。

根据防治效果划分其抗性如表1所示。

表1为根据防治效果划分其抗性结果表

抗病类型	HR	R	MR	S	HS
						防治效果	>80％	60.1％～80％	40.1％～60％	20.1％～40％	<20％

其中：HR代表高抗，R代表抗病，MR代表中抗，S代表感病，HS代表高感。

转IbPIF1甘薯块根和野生型甘薯块根(对照)进行室内茎线虫接种结果如图3所示，野生型对照植株完全被线虫侵染为高感(HS)，转IbPIF1甘薯L4和L7块根横切面发病面积百分数分别为19％和20％，抗性鉴定结果均为抗病(R)。说明导入IbPIF1基因可以提高甘薯对茎线虫病的抗性。

2、生理生化指标的测定

1)POD活性测定

POD活性可以作为植物抗逆性的一项生化指标。POD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

用过氧化物酶(Peroxidase，POD)试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司，目录号：POD-2-Y)来检测步骤1中接种茎线虫后的转IbPIF1甘薯块根的POD活性。同时以野生型甘薯品种商薯19作为对照(WT)。实验需重复三次，结果取平均值。

实验结果见图4，结果表明，转IbPIF1甘薯L4和L7的POD活性均显著高于对照植株。

2)木质素含量测定

用木质素(Lignin)含量试剂盒试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司，目录号：MZS-1-G)来检测步骤1中接种茎线虫后的转IbPIF1甘薯块根的木质素含量。同时以野生型甘薯品种商薯19块根作为对照(WT)。实验需重复三次，结果取平均值。

实验结果见图4，结果表明，转IbPIF1甘薯L4和L7的木质素含量均显著高于对照植株。

3)丙二醛(MDA)含量测定

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

用丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司，目录号：MDA-2-Y)来检测步骤1中接种茎线虫后的转IbPIF1甘薯块根的MDA含量。同时以野生型甘薯品种商薯19块根作为对照(WT)。实验需重复三次，结果取平均值。

实验结果见图4，结果表明，转IbPIF1甘薯L4和L7的MDA含量均显著低于对照植株。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 与甘薯茎线虫病抗性相关蛋白IbPIF1及其编码基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1605

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggatgagg acttcaatct tcctcccacc gctacttctt cctctggttt aaccaggcat 60

aagaagtcta caatggctga agaggatatc atggagctgc tatggcagaa cggtcaagtt 120

gttgtgcata gtcaaaacca tagatcttca cataaatctc acttttccgg ggatgcggcg 180

attccggctg agcagcctgt caccaaggag attcggccgg cgggggaaga aacggcggcg 240

aatcagcatg tgttcatgca ggaggatgag atggcgtctt ggcttcacta ccctctcgaa 300

gagccctcgt ttgatcgtga tctctacgcc gatttgctgt atccaccagc ttcctcttct 360

gccgtctacg cctccccaac caccgccgcg ccaccgcgcg aaatccgtcc gcctgtatct 420

gagatccgtc agcttccgat gcatcagccg ccaactccaa ggccacctat tatacctccg 480

gcgaaacgca ccgacctcga aggcgcgcca cgtgtacaga atttcggcca tttttcgcgg 540

ctgcctaggg ctaggatcga acctggacct tcaagctcga gccaggctgc gagagaatcg 600

acggtcgtgg actcgaacga gactccgatg gtgaaagctg gatctatagt ttcacgcgtc 660

tcagaaagtg cggcgccggt ttctggcggg aatgcagggt gcggcaccgt aagcggcact 720

gtagccaccg gcacgtccac cggcaatagg gaaatgatga cgtgtgaaca aacgatgacg 780

tcatccccgg gcggctcagg agccagcgcc actgcggagc cgccacagaa gccggcgcca 840

acagcgacgg acgatcggaa gcgtaaagga agagaaacgg acgacacgga gggtcatagt 900

gaggacattg acttagagtc tgccgataca aagaagcaat cccgtggttc agctacaaag 960

agatctcgtg ctgcagaagt ccataacctc tcggaaagga gacgtcgaga taggattaat 1020

gaaaagatga gggctttgca ggaactcata ccacgttgca acaagtcaga caaagcttca 1080

atgttagacg atgcaattga gtacttgaaa tcgttacaat tgcaagtgca aatgatgtct 1140

atgggatgtg gcatggtccc tatgatgtat cctggtatcc agcagtatat gccagcaatg 1200

ggtatgaata tgagaatggg gatgtgcatg gatatgggca tgaatcgtgc aatggttcca 1260

tatccaccaa ttctacccgg ttcgtcattg ccaaatgcaa ctgcagcagc acagataaat 1320

ccacggtttg ctatgccacc atcatttcca atgccaccag ttcctatgcc agatccatct 1380

agagttcaga cctcaaacca acccgatccc atgctaaacc cactcatcac ccataatcct 1440

aacccacaac aaataccaaa ctgtgctgat ccatatcagc aattatttgg tcttcaccag 1500

gcacaagcaa cattaccgct gaatcaaaca gtggaacatc ctattaacag caagccaagc 1560

agcagcaaag atgttgggaa tccagggaat catcaatctc gttga 1605

<210> 2

<211> 534

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Asp Glu Asp Phe Asn Leu Pro Pro Thr Ala Thr Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

Leu Thr Arg His Lys Lys Ser Thr Met Ala Glu Glu Asp Ile Met Glu

20 25 30

Leu Leu Trp Gln Asn Gly Gln Val Val Val His Ser Gln Asn His Arg

35 40 45

Ser Ser His Lys Ser His Phe Ser Gly Asp Ala Ala Ile Pro Ala Glu

50 55 60

Gln Pro Val Thr Lys Glu Ile Arg Pro Ala Gly Glu Glu Thr Ala Ala

65 70 75 80

Asn Gln His Val Phe Met Gln Glu Asp Glu Met Ala Ser Trp Leu His

85 90 95

Tyr Pro Leu Glu Glu Pro Ser Phe Asp Arg Asp Leu Tyr Ala Asp Leu

100 105 110

Leu Tyr Pro Pro Ala Ser Ser Ser Ala Val Tyr Ala Ser Pro Thr Thr

115 120 125

Ala Ala Pro Pro Arg Glu Ile Arg Pro Pro Val Ser Glu Ile Arg Gln

130 135 140

Leu Pro Met His Gln Pro Pro Thr Pro Arg Pro Pro Ile Ile Pro Pro

145 150 155 160

Ala Lys Arg Thr Asp Leu Glu Gly Ala Pro Arg Val Gln Asn Phe Gly

165 170 175

His Phe Ser Arg Leu Pro Arg Ala Arg Ile Glu Pro Gly Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Ser Gln Ala Ala Arg Glu Ser Thr Val Val Asp Ser Asn Glu Thr

195 200 205

Pro Met Val Lys Ala Gly Ser Ile Val Ser Arg Val Ser Glu Ser Ala

210 215 220

Ala Pro Val Ser Gly Gly Asn Ala Gly Cys Gly Thr Val Ser Gly Thr

225 230 235 240

Val Ala Thr Gly Thr Ser Thr Gly Asn Arg Glu Met Met Thr Cys Glu

245 250 255

Gln Thr Met Thr Ser Ser Pro Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Ala

260 265 270

Glu Pro Pro Gln Lys Pro Ala Pro Thr Ala Thr Asp Asp Arg Lys Arg

275 280 285

Lys Gly Arg Glu Thr Asp Asp Thr Glu Gly His Ser Glu Asp Ile Asp

290 295 300

Leu Glu Ser Ala Asp Thr Lys Lys Gln Ser Arg Gly Ser Ala Thr Lys

305 310 315 320

Arg Ser Arg Ala Ala Glu Val His Asn Leu Ser Glu Arg Arg Arg Arg

325 330 335

Asp Arg Ile Asn Glu Lys Met Arg Ala Leu Gln Glu Leu Ile Pro Arg

340 345 350

Cys Asn Lys Ser Asp Lys Ala Ser Met Leu Asp Asp Ala Ile Glu Tyr

355 360 365

Leu Lys Ser Leu Gln Leu Gln Val Gln Met Met Ser Met Gly Cys Gly

370 375 380

Met Val Pro Met Met Tyr Pro Gly Ile Gln Gln Tyr Met Pro Ala Met

385 390 395 400

Gly Met Asn Met Arg Met Gly Met Cys Met Asp Met Gly Met Asn Arg

405 410 415

Ala Met Val Pro Tyr Pro Pro Ile Leu Pro Gly Ser Ser Leu Pro Asn

420 425 430

Ala Thr Ala Ala Ala Gln Ile Asn Pro Arg Phe Ala Met Pro Pro Ser

435 440 445

Phe Pro Met Pro Pro Val Pro Met Pro Asp Pro Ser Arg Val Gln Thr

450 455 460

Ser Asn Gln Pro Asp Pro Met Leu Asn Pro Leu Ile Thr His Asn Pro

465 470 475 480

Asn Pro Gln Gln Ile Pro Asn Cys Ala Asp Pro Tyr Gln Gln Leu Phe

485 490 495

Gly Leu His Gln Ala Gln Ala Thr Leu Pro Leu Asn Gln Thr Val Glu

500 505 510

His Pro Ile Asn Ser Lys Pro Ser Ser Ser Lys Asp Val Gly Asn Pro

515 520 525

Gly Asn His Gln Ser Arg

530

Claims

1.一种蛋白质，为a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白质：

a1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)序列1所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在调控植物抗病性中的应用。

5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在培育抗病性提高的转基因植物中的应用。

6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在植物育种中的应用。

7.一种培育抗病性提高的转基因植物方法，包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1所述蛋白质。

9.根据权利要求4-6任一所述的应用或权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述抗病性为茎线虫病抗性。

10.根据权利要求4-6任一所述的应用或权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述植物为如下E1)-E5)中任一种：

E1)双子叶植物；

E2)单子叶植物；

E3)旋花科植物；

E4)甘薯属植物；

E5)甘薯。