CN114524868B

CN114524868B - 甘薯叶片发育及类黄酮强化相关蛋白IbBBX29及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN114524868B
Application number: CN202210310185.0A
Authority: CN
Inventors: 何绍贞; 张欢; 刘庆昌; 翟红; 高少培; 赵宁; 高晓茹
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2042-03-28
Also published as: CN114524868A

Abstract

本发明公开了甘薯叶片发育及类黄酮强化相关蛋白IbBBX29及其编码基因与应用。本发明具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质、编码基因、相关生物材料，及其在调控植物叶片发育和/或叶片中类黄酮含量中的应用。本发明通过将IbBBX29基因导入野生型甘薯中，得到过表达IbBBX29基因的转基因甘薯植株，同时构建了IbBBX29基因敲除植株。与野生型植株相比，过表达植株的地上部、叶、茎鲜重均显著提高，叶片中类黄酮含量也明显增加。实验表明，IbBBX29基因在调控甘薯叶片发育和类黄酮合成中发挥了关键作用，为甘薯叶片发育和/或叶片中类黄酮含量调控的遗传改良提供了重要的功能基因和育种材料。

Description

甘薯叶片发育及类黄酮强化相关蛋白IbBBX29及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及甘薯叶片发育及类黄酮强化相关蛋白IbBBX29及其编码基因与应用。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)属于旋花科(Convolvulaceae)、甘薯属(Ipomoea)、甘薯组(Section Batatas)的同源六倍体植物，是重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源用块根作物。甘薯广泛分布于全世界100多个国家和地区，我国是世界上最大的甘薯生产国。甘薯地上部发达，茎叶繁殖、生长快，生长周期内可多次收获。甘薯茎叶可食用，且含有丰富的蛋白质、多酚类物质、维生素、矿质元素等营养成分，是一种优质蔬菜资源。据研究报道，甘薯叶中有较多的活性成分，如黄酮类化合物。如今发现使用合成抗氧化剂会增加人类健康受损的风险，健康无害的天然抗氧化剂得到更多的关注。越来越多的证据表明，甘薯黄酮作为一种低分子量的多酚化合物，是抗氧化剂的天然来源，具有维持和促进人体健康的生理功能，如清除自由基、抗炎、抗诱变、抗糖尿病和抗癌活性。因此，研究甘薯茎叶发育和叶器官营养品质可以提高甘薯的综合利用价值，具有重要意义。

黄酮类化合物分为几个亚类，在甘薯中已发现的有黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、儿茶素类和花青素类。以往的研究表明，黄酮类化合物在甘薯叶中的积累量高于贮藏根。不同甘薯种质之间黄酮类化合物的含量也存在显著差异。甘薯是无性繁殖作物，种间、种内杂交不亲和性、遗传资源匮乏，遗传基础狭窄都严重限制了常规育种的应用。因此挖掘甘薯类黄酮合成相关基因，利用转基因技术将类黄酮合成相关基因整合到甘薯品种中，提高甘薯类黄酮含量，对于调控甘薯发育及天然抗氧化剂合成具有重要的理论意义和实用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高甘薯叶片中类黄酮的含量和/或如何促进甘薯叶片发育。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质，名称为IbBBX29，所述蛋白质IbBBX29可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质IbBBX29的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质IbBBX29的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质IbBBX29且具有蛋白质IbBBX29功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

进一步地，所述蛋白质IbBBX29可来源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)。

进一步地，所述蛋白质为B-box家族蛋白，又称为甘薯叶片发育及类黄酮强化相关蛋白。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质IbBBX29的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子(IbBBX29基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质IbBBX29。

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为蛋白质IbBBX29编码基因(CDS)的核苷酸序列。

B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

B1)所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pMD19-T、载体pCambia1300-GFP和/或载体pFGC5941。

可用现有的植物表达载体构建含有IbBBX29基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用IbBBX29基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的IbBBX29基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得叶器官发达和/或叶片中类黄酮含量提高的转基因细胞系及转基因植株。携带IbBBX29基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌EHA105。

所述重组载体具体可为重组载体pCambia1300-IbBBX29-GFP和/或重组载体pFGC5941-IbBBX29。

所述重组载体pCambia1300-IbBBX29-GFP是将pCambia1300-GFP载体的KpnI和SalI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCambia1300-GFP载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pCambia1300-IbBBX29-GFP表达序列表中SEQ ID No.1所示的IbBBX29蛋白。

所述重组载体pFGC5941-IbBBX29是将载体pFGC5941的限制性内切酶BamHI和XbaI识别序列间的小片段替换为序列表中SEQ ID No.2的第363至562位所示的DNA分子的反向互补序列，将限制性内切酶XhoI和SwaI识别序列间的小片段替换为序列表中SEQ ID No.2的第363至562位所示的DNA分子得到的基因敲除载体。

所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA105/pCambia1300-IbBBX29-GFP和/或重组农杆菌EHA105/pFGC5941-IbBBX29。

所述重组农杆菌EHA105/pCambia1300-IbBBX29-GFP是将所述重组载体pCambia1300-IbBBX29-GFP导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。所述重组农杆菌EHA105/pFGC5941-IbBBX29是将所述重组载体pFGC5941-IbBBX29导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。

本发明还提供了下述任一种培育植物的方法：

H1)一种培育叶片形态改变的植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质IbBBX29的含量和/或活性，得到叶片形态长于、大于和/或厚于所述目的植物的叶片形态改变的植物；

H2)一种培育叶片中类黄酮含量改变的植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质IbBBX29的含量和/或活性，得到叶片中类黄酮含量高于所述目的植物的叶片中类黄酮含量改变的植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbBBX29的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质IbBBX29的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbBBX29的编码基因的表达量通过将所述蛋白质IbBBX29的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述蛋白质IbBBX29的编码基因可为下述任一种：

F1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

F2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

具体地，在本发明的一个实施方案中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbBBX29的编码基因的表达量通过将SEQ ID No.2所示的DNA分子导入所述目的植物实现。

在本发明的一个实施方案中，所述培育植物的方法包括如下步骤：

(1)构建包含SEQ ID NO.2所示DNA分子的重组载体；

(2)将步骤(1)构建的重组载体转入目的植物(如作物或甘薯)中；

(3)经筛选和鉴定获得转基因植物。所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。

本发明还提供了所述蛋白质IbBBX29或调控所述蛋白质IbBBX29活性和/或含量的物质，和/或，所述生物材料的下述任一种应用：

D1)在调控植物叶片发育和/或调控植物叶片中类黄酮含量中的应用；

D2)在制备调控植物叶片发育和/或调控植物叶片中类黄酮含量的产品中的应用；

D3)在培育叶片形态改变的植物和/或叶片中类黄酮含量改变的植物中的应用；

D4)在制备培育叶片形态改变的植物和/或叶片中类黄酮含量改变的植物的产品中的应用；

D5)在植物育种或植物种质资源改良中的应用。

本发明还提供了所述蛋白质IbBBX29或调控所述蛋白质IbBBX29活性和/或含量的物质，和/或，所述核酸分子的下述任一种应用：

E1)在提高植物叶和/或茎鲜重中的应用；

E2)在促进植物叶片变长、变大和/或变厚中的应用；

E3)在提高植物叶片中类黄酮含量中的应用；

E4)在促进植物叶片发育中的应用。

本文中，调控所述蛋白质IbBBX29活性或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质IbBBX29。

本文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

所述调控基因表达的物质具体可为本文中B1)-B3)中任一所述的生物材料。

进一步地，所述调控基因表达的物质可为提高或上调所述蛋白质IbBBX29的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。

进一步地，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低或下调所述蛋白质IbBBX29的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。所述降低所述蛋白质IbBBX29的编码基因表达可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质IbBBX29的编码基因活性下降或失活。

本发明还提供了任一所述培育植物的方法在创制叶片形态改变的植物和/或叶片中类黄酮含量改变的植物中的应用，和/或，在植物育种或植物种质资源改良中的应用。

本文中，所述植物可为作物(如农作物)。

本文中，所述植物可为下述任一种：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)旋花科植物；

G3)甘薯属植物；

G4)甘薯组植物；

G5)甘薯。

具体地，所述甘薯可为甘薯品种栗子香。

本文所述蛋白质IbBBX29可为甘薯叶发育及类黄酮强化相关蛋白。本文所述调控植物叶片发育可为促进植物叶片的发育或抑制植物叶片的发育。

进一步地，所述调控植物叶片发育包括调控叶片形态(即改变叶片形态)，所述叶片形态可为叶片长度、叶片面积和/或叶片厚度但不限于此。

具体地，所述调控叶片形态可为使叶片变长、变大和/或变厚，或，使叶片变短、变小和/或变薄。

本文所述调控植物叶片中类黄酮含量(即调控植物叶片中类黄酮合成)可为提高植物叶片中类黄酮含量或降低植物叶片中类黄酮含量。

所述叶片中类黄酮含量改变的植物可为类黄酮含量提高或降低的植物。

所述叶片形态改变的植物可为叶片变长、变大和/或变厚，或，叶片变短、变小和/或变薄的植物。

本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述IbBBX29基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明所提供的IbBBX29基因编码一个B-box家族转录因子蛋白，将该基因导入WT(野生型受体甘薯栗子香)中，得到过表达IbBBX29基因的转基因甘薯植株(IbBBX29-OE植株)，将pFGC5941-IbBBX29导入WT(野生型受体甘薯栗子香)中，得到干扰植株(IbBBX29-Ri植株)。与野生型植株相比，过表达植株的地上部、叶、茎鲜重分别提高了47.10％～57.17％、21.37％～70.94％和52.88％～66.10％，叶片中类黄酮含量增加了31.33％～63.03％，贮藏根中类黄酮含量较WT提高了36.59％～92.39％。而IbBBX29-Ri植株的地上部、叶、茎鲜重分别降低了5.57％～6.48％、27.07％～32.76％和0.21％～27.51％，叶片中黄酮类化合物含量则减少了20.41％～28.80％。此外，拟南芥转基因株系叶片中黄酮类化合物含量较Col提高了9.93％～24.51％。因此，IbBBX29基因在调控甘薯叶片发育和类黄酮合成中发挥了关键作用，为甘薯叶片发育和/或叶片中类黄酮含量调控的遗传改良提供了重要的功能基因和育种材料，为植物类黄酮生物强化提供了一个候选基因。叶片发育及类黄酮合成相关蛋白IbBBX29及其编码基因对调控植物发育及天然抗氧化剂的合成具有重要的理论意义和实用价值。

附图说明

图1为甘薯转基因植株的PCR扩增结果。

图2为甘薯植株的表型及类黄酮含量。

图3为甘薯植株块根及类黄酮含量。

图4为拟南芥植株的表型及类黄酮含量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的甘薯品种栗子香记载在如下文献中：王玉萍,刘庆昌,李爱贤,等.甘薯耐旱突变体的离体筛选与鉴定[J].中国农业科学,2003,36(9):1000-1005.，公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

下述实施例中的野生型拟南芥(WT，Col)为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)，公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

下述实施例中的克隆载体pMD19-T为宝生物工程(大连)公司产品，产品目录号为6013。

下述实施例中的载体pCambia1300-GFP为北京华越洋生物公司产品。产品编号为北京华越洋生物VECT0460。

下述实施例中的PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit为宝生物工程(大连)有限公司的产品，产品目录号为6110A。类黄酮测定试剂盒为苏州科铭生物技术有限公司产品，产品目录号为LHT-2-G。

下述实施例中的载体pFGC5941记载于如下文献中：K Mcginnis，etal.Transgene-induced RNA interference as a tool for plant functionalgenomics.Methods in Enzymology，2005，392:1-24，公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

下述实施例采用Prism 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用单因素方差分析后进行事后Tukey检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异,不同字母表示差异有统计学意义。以下实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、IbBBX29基因的获得

IbBBX29基因的获得步骤如下：

1、根据转录组分析，找到一个在甘薯叶中高表达的基因IbBBX29，通过与甘薯二倍体基因组数据库比对，得到该基因的二倍体CDS序列，并人工合成引物IbBBX29-F:5’-ATGGCGAAAGAAACGAAGAG-3’和IbBBX29-R:5’-TCAATCAAGCAGTGACGACG-3’。用植物总RNA提取试剂盒提取富含类黄酮的苏薯33的幼嫩叶器官的总RNA，将该总RNA用PrimeScript^TM 1stStrand cDNA Synthesis Kit反转录出第一链cDNA。

2、以步骤1获得的cDNA为模板，以IbBBX29-F和IbBBX29-R为引物进行PCR扩增，将扩增产物和克隆载体pMD19-T连接，得到重组载体pMD19-T-IbBBX29。将重组载体pMD19-T-IbBBX29进行测序，得到苏薯33的基因IbBBX29 CDS序列。

结果表明，步骤2获得的PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，将该序列所示的基因命名为IbBBX29基因，其编码的蛋白命名为IbBBX29蛋白或蛋白质IbBBX29，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

实施例2、IbBBX29蛋白及其编码基因在调控叶片发育和/或叶片中类黄酮含量中的应用

一、重组质粒的构建

A、重组质粒pCambia1300-IbBBX29-GFP的构建

1、人工合成序列表的SEQ ID No.2所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以IbBBX29-OE-F：5’-GGGGTACCATGGCGAAAGAAACGAAGAG-3’(下划线部分为KpnI酶切位点)，和IbBBX29-OE-R：5’-ACGCGTCGACATCAAGCAGTGACGACG’(下划线部分为Sal I酶切位点)为引物进行PCR扩增，得到N端含有限制性内切酶KpnI和C端含有限制性内切酶SalI的双链DNA分子。

2、用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切载体pCambia1300-GFP，回收大片段，同时用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收小片段。

3、将大片段与小片段连接，得到重组质粒pCambia1300-IbBBX29-GFP。

根据测序结果，对重组质粒pCambia1300-IbBBX29-GFP进行结构描述如下：

重组质粒pCambia1300-IbBBX29-GFP是将pCambia1300-GFP载体的KpnI和SalI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCambia1300-GFP载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组质粒pCambia1300-IbBBX29-GFP表达序列表中SEQ ID No.1所示的IbBBX29蛋白。

B、重组质粒pFGC5941-IbBBX29的构建

1、以人工合成的SEQ ID No.2所示的双链DNA分子为模板,用引物IbBBX29-Ri-UF：5’-TTTGGAGAGGACACGCTCGAGGTTGCTCTCCCACGCCGT-3’(下划线部分为XhoI酶切位点)和引物IbBBX29-Ri-UR：5’-AAGAAATTCTTACACATTTAAATATCCACTATCATAATCACTTCCCG’(下划线部分为SwaI酶切位点)进行PCR扩增，得到DNA片段甲。

2、完成步骤1后，用限制性内切酶XhoI和SwaI双酶切DNA片段甲，回收200bp的DNA片段1。

3、用限制性内切酶XhoI和SwaI双酶切载体pFGC5941，回收约10kb的载体骨架1。

4、将DNA片段1与载体骨架1连接，得到重组质粒pFGC5941-U。

5、用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切载体pFGC5941-U，回收约10kb的载体骨架2。

6、以人工合成的SEQ ID No.2所示的双链DNA分子为模板,用引物IbBBX29-Ri-DF：5’-AATTTGCAGGTATTTGGATCCATCCACTATCATAATCACTTCCCG-3’(下划线部分为BamHI酶切位点)和IbBBX29-Ri-DR：5’-GGTCTTAATTAACTCTCTAGAGTTGCTCTCCCACGCCGT’(下划线部分为XbaI酶切位点)进行PCR扩增，得到DNA片段乙。

7、完成步骤6后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切DNA片段乙，回收200bp的DNA片段2。

8、用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切载体pFGC5941-U，回收约10kb的载体骨架2。

9、将DNA片段2与载体骨架2连接，得到重组质粒pFGC5941-IbBBX29。

根据测序结果，对重组质粒pFGC5941-IbBBX29进行结构描述如下：将载体pFGC5941的限制性内切酶BamHI和XbaI识别序列间的小片段替换为序列表中SEQ ID No.2的第363至562位所示的DNA分子的反向互补序列，将限制性内切酶XhoI和SwaI识别序列间的小片段替换为序列表中SEQ ID No.2的第363至562位所示的DNA分子得到的基因敲除载体。

二、重组农杆菌的获得和甘薯、拟南芥转基因植株的获得

A、甘薯转基因阳性植株的获得

1、将重组质粒pCambia1300-IbBBX29-GFP转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌甲，将重组农杆菌甲命名为EHA105/pCambia1300-IbBBX29-GFP。

2、剥取长约0.5mm的栗子香的茎尖分生组织，置于胚性愈伤组织诱导固体培养基(含2.0mg/L 2，4-D和3.0％蔗糖的MS固体培养基)上，27±1℃培养8周，得到胚性愈伤组织，然后将胚性愈伤组织置于胚性愈伤组织诱导液体培养基(含2.0mg/L2，4-D和3.0％蔗糖的MS液体培养基)中，水平摇床上振荡光暗交替培养3d(具体条件为：100r/min；27℃；光暗交替培养的周期为：光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为500lx)，得到直径为0.7-1.3mm的胚性细胞团。

3、完成步骤2后，采用农杆菌介导的方法将EHA105/pCambia1300-IbBBX29转化胚性细胞团，然后置于共培养基(含30mg/L AS、2.0mg/L 2，4-D的MS固体培养基)上，28℃暗培养3d。

4、完成步骤3后，将胚性细胞团用含900mg/L头孢噻肟钠(cefotaxime sodium，CS)和2.0mg/L 2，4-D的MS液体培养基洗涤2次，然后置于选择培养基(含2.0mg/L2，4-D、300mg/L CS和0.25mg/L或0.5mg/L潮霉素的固体MS培养基)上，27±1℃暗培养10-12周(每2周需更换一次选择培养基)。

5、完成步骤4后，将胚性细胞团置于体细胞胚诱导培养基(含有1.0mg/L ABA、300mg/L CS MS固体培养基)上，27±1℃光暗交替培养(光暗交替培养的周期为：光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为3000lx)2-4周，得到抗性愈伤组织。

6、完成步骤5后，将抗性愈伤组织置于MS固体培养基上，27±1℃光暗交替培养(光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为3000lx)4-8周，即获得32株甘薯拟转基因植株，依次命名OE-1至OE-32。

7、分别提取步骤6获得的甘薯拟转基因植株(OE-1至OE-32)的幼嫩叶器官的基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以35S-F：5′-AGGAAGTTCATTTCATTTGGAGA-3′和IbBBX29-T-R：5′-TCAATCAAGCAGTGACGACG-3′为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有约750bp的条带，则相应的甘薯拟转基因植株即为甘薯转基因阳性植株。用等体积水代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶器官的基因组DNA，进行PCR扩增，作为阴性对照。用甘薯品种栗子香野生型植株的幼嫩叶器官的基因组DNA代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶器官的基因组DNA，进行PCR扩增，作为对照。用重组质粒pCambia1300-IbBBX29-GFP代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶器官的基因组DNA，进行PCR扩增，作为阳性对照。

实验结果见图1中A(M为DNA分子Marker，W为阴性对照，P为阳性对照),WT为甘薯品种栗子香野生型植株，OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5、OE-6、OE-7、OE-8均为甘薯转基因阳性植株。

B、甘薯RNAi阳性植株的获得

1、将重组质粒pFGC5941-IbBBX29转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌乙，将重组农杆菌乙命名为EHA105/pFGC5941-IbBBX29。

2、按照步骤A中2至6的方法，将EHA105/pCambia1300-IbBBX29替换为EHA105/pFGC5941-IbBBX29，其它步骤均不变，获得5株甘薯拟RNAi植株，依次命名Ri-1至Ri-5。

3、分别提取步骤2获得的甘薯拟RNAi植株(Ri-1至Ri-5)的幼嫩叶器官的基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以int-F:5′-CAACCACAAAAGTATCTATGAGCCT-3′和int-R:5′-TTCACATGTCAGAAACATTCTGATG-3′为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有888bp的条带，则相应的甘薯拟RNAi植株即为甘薯RNAi阳性植株。用等体积水代替甘薯拟RNAi植株的幼嫩叶器官的基因组DNA，进行PCR扩增，作为阴性对照。用甘薯品种栗子香野生型植株的幼嫩叶器官的基因组DNA代替甘薯拟RNAi植株的幼嫩叶器官的基因组DNA，进行PCR扩增，作为对照。用重组质粒pFGC5941-IbBBX29代替甘薯拟RNAi植株的幼嫩叶器官的基因组DNA，进行PCR扩增，作为阳性对照。

实验结果见图1中B(M为DNA分子Marker，W为阴性对照，P为阳性对照),WT为甘薯品种栗子香野生型植株，Ri-1、Ri-2、Ri-3、Ri-4、Ri-5均为甘薯RNAi阳性植株。

采用无性繁殖的方法扩繁甘薯转基因阳性植株(OE-1、OE-2、OE-5、OE-8、OE-9、OE-22、OE-23、OE-24)和甘薯RNAi阳性植株(Ri-1、Ri-2、Ri-3、Ri-4、Ri-5)，由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系。

C、拟南芥转基因植株的获得

1、将重组质粒pCambia1300-IbBBX29-GFP转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌甲，将重组农杆菌甲命名为EHA105/pCambia1300-IbBBX29-GFP。将农杆菌扩大培养，28℃200rpm过夜摇菌至OD600值在1.0～1.8。离心收集菌体，弃上清，用侵染液重悬菌体。

2、将农杆菌菌液倒入烧杯中，使植株倒置在侵染液中2min。平放植株于黑暗中，黑暗条件处理24h，正常条件培养。

3、收取侵染后植株的种子，为T1代，用2％次氯酸钠溶液消毒5min，用无菌水冲洗3～4遍，将种子平铺在添加潮霉素的1/2MS培养基上，培养12d,在抗性培养基上存活下来的是阳性苗，移栽至温室中培养。单株收取T2代种子，在抗性培养基上筛选分离比例为3：1的，转基因株系，移栽至土中，单株收取T3代种子，筛选至纯合转基因株系。

4、分别提取步骤3获得的拟转基因植株和野生型的幼嫩叶器官的基因组DNA。并以该基因组DNA为模板，以35S-F：5′-AGGAAGTTCATTTCATTTGGAGA-3′和IbBBX29-T-R：5′-TCAATCAAGCAGTGACGACG-3′为引物进行PCR扩增。如果PCR扩增产物中含有约750bp的条带，则相应的拟转基因植株即为阳性植株。

通过RT-qPCR检测不同转基因株系中IbBBX29基因的转录水平，并筛选出了3个独立的IbBBX29基因过表达的转基因株系(图4中A和B),Col为拟南芥哥伦比亚野生型，#2、#3、#6均为拟南芥过表达阳性植株。

三、转基因植株表型观察

A、将甘薯转基因植株在温室驯化大约2月移栽大田，田间生长状态如图2中A。值得注意的是，与WT(野生型甘薯品种栗子香)相比，IbBBX29-OE植株(即IbBBX29基因过表达的植株)的地上部、叶、茎鲜重分别提高了47.10％～57.17％、21.37％～70.94％和52.88％～66.10％，而IbBBX29-Ri植株(即IbBBX29基因沉默的植株)的地上部、叶、茎鲜重分别降低了5.57％～6.48％、27.07％～32.76％和0.21％～27.51％(图2中A,图2中E)。IbBBX29-OE植株叶片变长、变大、变厚(图2中B、图2中C、图2中F-H)，茎秆较WT粗(图2中D,图2中I)，而IbBBX29-Ri植株各表型的变化相反。此外，IbBBX29基因的过表达或敲除均未引起甘薯贮藏根产量的变化(图3中A,图3中B)。

B、拟南芥IbBBX29基因过表达株系表现出显著的小叶片和明显的下卷叶表型，且开花较晚，植株矮小(图4中A-E)。

四、类黄酮含量测定

类黄酮是一类多苯化合物，属于植物次生代谢物，对人体具有消炎，抗菌，降血脂，清除体内羟自由基，预防癌症等作用。

甘薯植株为甘薯品种栗子香的野生型植株(WT)、OE-1的植株、OE-9的植株、Ri-2的植株、Ri-5的植株。拟南芥植株为拟南芥哥伦比亚野生型植株(Col)、#2、#3、#6的植株。

类黄酮测定试剂盒购买自苏州科铭生物技术有限公司，产品目录号为LHT-2-G。测定的原理为：在碱性亚硝酸盐溶液中，类黄酮与铝离子形成在510nm处有特征吸收峰的红色络合物，测定样品提取液在510nm处的吸光值，即可计算样品类黄酮含量。实验需重复三次，结果取平均值。

结果表明，IbBBX29-OE植株叶片中黄酮类化合物含量明显高于WT植株，增加了31.33％～63.03％，而IbBBX29-Ri植株叶片中黄酮类化合物含量则减少了20.41％～28.80％(图2中J)。与此相一致，IbBBX29-OE植株叶片的抗氧化活性显著高于WT和IbBBX29-Ri植株(图2中K)。同时，IbBBX29-OE植株贮藏根类黄酮含量较WT提高了36.59％～92.39％(图3中C)。此外，拟南芥转基因株系叶片中黄酮类化合物含量较Col提高了9.93％～24.51％(图4中F)，这与甘薯过表达株系叶片中的黄酮类化合物含量一致(图2中J)。

上述结果表明，在甘薯中过表达IbBBX29基因可促进甘薯叶的发育，并提高甘薯中类黄酮含量，干涉(抑制)IbBBX29基因则抑制甘薯叶的发育，降低甘薯中类黄酮含量。此外，在拟南芥里异源表达IbBBX29基因抑制拟南芥的生长，但提高拟南芥叶中的类黄酮含量。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 甘薯叶片发育及类黄酮强化相关蛋白IbBBX29及其编码基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 189

<212> PRT

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.）

<400> 1

Met Ala Lys Glu Thr Lys Arg Lys Cys Glu Leu Cys Gly Asp Gly Ala

1 5 10 15

Arg Met Tyr Cys Asp Ser Asp Glu Ala Ser Leu Cys Trp Ser Cys Asp

20 25 30

Glu Lys Val His Ser Ala Asn Phe Leu Val Ala Lys His Ser Arg Thr

35 40 45

Leu Leu Cys His Ala Cys Cys Ser Pro Thr Pro Trp Thr Ala Ser Gly

50 55 60

Ala Lys Leu Cys Arg Thr Val Ser Val Cys Pro Ala Cys Leu Asp Gln

65 70 75 80

Ile Ser His Ala Gln Leu Arg Arg Asp Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu

85 90 95

Ser Asn Arg Glu Met Gly Ser Asp Val His Gln Asp Phe Ile Asp Ser

100 105 110

Gly Ser Asp Tyr Glu Ser Gly Tyr Ser Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Glu

115 120 125

Gly Asp Glu Asn Gln Val Val Pro Trp Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ser

130 135 140

Ser Ser Pro Pro Pro Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Asn Gly Asp Glu

145 150 155 160

Gly Ser Phe Ser Ser Arg Asp Phe Ser Pro Ala Leu Arg Lys Arg Phe

165 170 175

Leu Asp Asp Gln Val Val Thr Ser Ser Ser Leu Leu Asp

180 185

<210> 2

<211> 570

<212> DNA

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.）

<400> 2

atggcgaaag aaacgaagag gaagtgtgag ctgtgcgggg atggagctag gatgtactgc 60

gactcagatg aagcgagtct atgctggagc tgcgacgaga aggtccattc tgcgaatttc 120

ctcgttgcta agcactccag gacccttctc tgccacgcgt gttgctctcc cacgccgtgg 180

accgcctccg gcgccaagct ctgccgcacc gtctccgtct gccccgcctg cctcgaccag 240

attagtcatg ctcagctccg gcgggacgag ggagagggag agggagagag taatcgtgaa 300

atggggagtg atgttcatca agacttcatt gattcgggaa gtgattatga gagtggatat 360

agtagtgatg aatatgagga ggaaggcgat gagaatcaag tagtgccttg gtccgctagt 420

tcgtccccgt cctcgtcccc gcctcctgga ccaagttcga gttcttctaa cggggacgag 480

ggctctttct cctccagaga cttttctcct gcattgagaa agaggttcct ggatgatcaa 540

gtagtaactt cgtcgtcact gcttgattga 570

Claims

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述任一种：

A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A3）在A1）的N端和/或C端连接标签得到的与A1）具有相同功能的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质来源于甘薯。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述B1）至B5）中的任一种：

B1）编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，B1）所述核酸分子为下述任一种：

C1）编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

C2）核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

5.一种培育叶片形态改变的植物的方法，所述方法包括将权利要求1或2所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物，得到叶片形态长于、大于和/或厚于所述目的植物的叶片形态的植物，所述植物为甘薯属植物。

6.一种培育叶片中类黄酮含量改变的植物的方法，所述方法包括将权利要求1或2所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物，得到叶片中类黄酮含量高于所述目的植物的叶片中类黄酮含量的植物，所述植物为甘薯属植物。

7.权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4中所述核酸分子的下述任一种应用：

E1）在提高植物叶和/或茎鲜重中的应用；

E2）在促进植物叶片变长、变大和/或变厚中的应用；

E3）在提高植物叶片中类黄酮含量中的应用；

所述植物为甘薯属植物。