CN112250742A

CN112250742A - 蛋白质及其相关生物材料在调控植物机械强度中的用途

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Publication number: CN112250742A
Application number: CN201910593026.4A
Authority: CN
Inventors: 翟文学; 李春荣; 刘鹏程; 江光怀
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2039-07-02
Also published as: CN112250742B

Abstract

本发明公开了蛋白质及其相关生物材料在调控植物机械强度中的用途。本发明首先公开了BCL1蛋白及其相关生物材料在调控植物机械强度中的用途。进一步公开了培育茎秆和/或叶片的脆性增加的转基因植物的方法。本发明不仅为培育脆杆、脆叶植物材料和细胞壁成分易被降解、可回收利用效率高的水稻品种方面提供了理论依据，也为水稻育种提供新的基因资源。

Description

蛋白质及其相关生物材料在调控植物机械强度中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质及其相关生物材料在调控植物机械强度中的用途。

背景技术

细胞壁的厚度和组成成分是决定植物组织机械强度的关键要素。而机械强度是作物的重要农艺性状，与作物的抗倒伏性、对病原菌的抗性和产量密切相关。植物细胞壁在结构上包括胞间层、初生壁和次生壁，是细胞在生长和发育过程中按照一定的先后次序形成的复杂网状结构。胞间层是细胞分裂产生新细胞过程中，在相邻的两个细胞之间形成的特殊结构，主要成分为果胶质，它的作用是将相邻的细胞粘连在一起，同时缓冲细胞间的挤压。初生壁位于胞间层的内侧，主要由纤维素、半纤维素和果胶等组成，它能够伴随细胞的生长而延展，具有较强的可塑性。次生壁是细胞停止生长后，在部分特化细胞的初生壁内侧继续加厚形成的壁层，主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。含有次生壁的细胞称之为厚壁细胞，主要存在于机械组织中，如表皮层以下的厚壁组织和维管束组织等，对植株起着主要的支撑和保护作用。

得益于分子生物学的快速发展，多个参与调控水稻细胞壁合成的基因已经被克隆。如编码水稻纤维素合酶的OsCesA4、OsCesA7和OsCesA9，该类基因突变后导致茎秆变脆、结实率降低、纤维素含量显著下降，是纤维素合成中的关键酶。再则，编码肉桂醇脱氢酶的FC1，该基因突变后导致茎秆的机械强度降低、产量下降、木质素含量减少，表明该基因参与调控木质素的生物合成。此外，编码糖基转移酶的BC10基因突变后，能够通过降低纤维素和阿拉伯半乳聚糖蛋白的含量导致茎秆和叶片的脆性增加。截止目前，已克隆的水稻细胞壁合成相关基因均主要参与特定细胞壁成分的调控，挖掘能够同时调控纤维素、半纤维素和木质素等多种细胞壁成分的调控因子，对于水稻抗倒伏育种具有重要的理论意义和应用价值。

农作物秸秆除能够维持植物的机械强度外，还是十分重要的可再生资源。但是，受限于细胞壁成分的降解困难，目前我国对作物秸秆的回收利用效率仍十分低下。秸秆直接还田会影响下一茬作物的生根，而田间焚烧不仅浪费资源，还会造成巨大的环境污染。因此，培育细胞壁成分易被降解、可回收利用效率高的新型作物品种具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供BCL1蛋白的新用途。

本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质为BCL1蛋白，来源于水稻(OryzasativaL.)，是如下(A1)或(A2)或(A3)或(A4)的蛋白质：

(A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A2)在序列表中序列2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(A3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

(A4)与(A1)-(A3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列表中序列2由810个氨基酸残基组成。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly--Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL
HA	9	YPYDVPDYA

本发明蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明提供了上述蛋白质在调控植物机械强度中的应用。

本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与上述蛋白质相关的生物材料在调控植物机械强度中的应用。

所述与上述蛋白质相关的生物材料为下述B1)-B10)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

上述应用中，B1)所述核酸分子为如下(C1)-(C4)中任一所示：

(C1)编码序列是序列表中序列1的第2528-4960位所示的DNA分子；

(C2)序列表中序列1所示的DNA分子；

(C3)与(C1)或(C2)限定的DNA分子序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性，且编码权利要求1中所述的蛋白质的DNA分子；

(C4)在严格条件下与(C1)或(C2)或(C3)限定的DNA分子杂交，且编码权利要求1中所述的蛋白质的DNA分子。

其中，序列表中序列1由5355个核苷酸组成，编码序列由2433个核苷酸组成。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述应用中，所述重组载体是将上述核酸分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白质的重组载体。使用所述核酸分子构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述调控植物机械强度为如下(I)或(II)或(III)：

(I)调控植物细胞壁成分的含量；

(II)调控植物茎秆和/或叶片的机械强度；

(III)增加或减弱茎秆和/或叶片的脆性。

上述细胞壁成分包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、纤维素。

本发明还提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料在培育茎秆和/或叶片的脆性增加的转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种培育茎秆和/或叶片的脆性增加的转基因植物的方法。

本发明提供的培育茎秆和/或叶片的脆性增加转基因植物的方法，包括抑制受体植物中上述蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物比受体植物茎秆和/或叶片的脆性增加。

上述方法中，所述抑制受体植物中上述蛋白质的表达量和/或活性的方法为通过对所述受体植物中上述蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默来实现的。

上述方法中，所述抑制受体植物中上述蛋白质的活性和/或含量的方法是利用CRISPR方法对所述受体植物中上述蛋白质的编码基因进行敲除来实现的。

上述方法中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1第2528-4960位所示的DNA分子。

上述方法中，所述CRISPR方法中的靶序列如序列表中序列1第2645-2667位。

上述方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物可为水稻，具体为水稻TP309。

本发明从水稻TP309的组织培养中自然突变获得水稻脆杆和脆叶突变体bcl1，该突变体除表现出茎秆、叶片均变脆的表型特征外，其细胞壁成分物质如阿拉伯糖、木糖、半乳糖、纤维素的含量均显著降低，通过克隆获得了控制水稻茎秆、叶片强度的基因BCL1。进一步通过BCL1基因组互补实验和CRISPR/Cas9基因编辑实验证实了BCL1及其编码基因在控制水稻茎秆和叶片的机械强度中发挥重要作用，为培育脆杆、脆叶植物材料和细胞壁成分易被降解、可回收利用效率高的水稻品种方面提供了理论依据，也为水稻育种提供新的基因资源。

附图说明

图1为水稻TP309和突变体bcl1茎秆的表型与扫描电镜。其中，SC代表sclerenchyma厚壁细胞；Scw代表secondary cel1 wal1次生细胞壁。

图2为水稻TP309和突变体bcl1叶片的表型与扫描电镜。其中，SC代表sclerenchyma厚壁细胞；Scw代表secondary cel1 wal1次生细胞壁。

图3为水稻TP309和突变体bcl1茎秆中细胞壁成分的含量测定结果。

图4为水稻TP309、突变体bcl1、T₃代互补载体转基因植株、T₃代BCL1基因敲除后的转基因植株的叶片的表型图。

图5为水稻TP309、突变体bcl1、T₃代互补载体转基因植株、T₃代BCL1基因敲除后的转基因植株的茎秆的表型图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的水稻TP309(也称为野生型水稻)，记载在如下文献：Chen，X.，Hao，L.，Pan，J.，Zheng，X.，Jiang，G.，Jin，Y.，Gu，Z.，Qian，Q.，Zhai，W.，and Ma，B.(2012).SPL5，a cell death and defense-related gene，encodes a putative splicingfactor 3b subunit 3(SF3b3)in rice.Mol Breed 30，939-949。由中国科学院遗传与发育生物学研究所江光怀研究员保存。公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的载体pCAMBIA1300购自CAMIA公司，澳大利亚。

下述实施例中的农杆菌EHA105和EHA105/pSoup购自CAMIA公司，澳大利亚。

下述实施例中的载体pCAMBIA1300-pYAO-cas9购自上海柯雷生物科技有限公司，货号KL-ZL1639。

本发明中所用到的培养基的组分和配比如下：

诱导培养基：用于诱导TP309产生愈伤组织。4.4g/L的MS基础培养基，2mg/L的2，4-D，30g/L的蔗糖，0.5g/L的水解酪蛋白，2.0g/L的脯氨酸，0.5g/L的谷氨酰胺，调pH至5.8后加入3.8g/L的植物凝胶。

共培养培养基：4.4g/L的MS基础培养基，2mg/L的2，4-D，30g/L的蔗糖，0.5g/L的水解酪蛋白，0.5g/L的脯氨酸，100μM/L乙酰丁香酮，调pH至5.2后加入3.8g/L的植物凝胶。

筛选培养基：用于转化后筛选抗性愈伤组织。4.4g/L的MS基础培养基，2mg/L的2，4-D，30g/L的蔗糖，0.5g/L的水解酪蛋白，0.5g/L的脯氨酸，0.5g/L的谷氨酰胺，调pH至5.8后加入3.8g/L的植物凝胶。倒培养基前，加入无菌的潮霉素B(终浓度50mg/L)和羧苄青霉素(终浓度400mg/L)。

分化培养基：用于筛选后抗性愈伤组织的再分化。4.4g/L的MS基础培养基，30g/L的山梨醇，0.5g/L的水解酪蛋白，0.5g/L的脯氨酸，0.5g/L的谷氨酰胺，18.35mg/L的铁盐(乙二胺四乙酸铁钠盐)，10ml(100×)的B5有机溶液，0.1g/L的肌醇，调pH至5.8后加入3.5g/L的植物凝胶。倒培养基前，加入无菌的KT(终浓度0.2mg/L)、NAA(终浓度0.1mg/L)、6-BA(终浓度2mg/L)和潮霉素B(终浓度40mg/L)。

生根培养基：2.2g/L的MS基础培养基，30g/L的蔗糖，0.5g/L的水解酪蛋白，调pH至5.8后加入3.2g/L的植物凝胶。

实施例1水稻脆杆、脆叶基因的发现

一、水稻脆杆、脆叶突变体bcl1的获得

水稻脆杆、脆叶突变体brittle culm and leaf 1(简称bcl1或突变体bcl1)为水稻TP309组织培养过程中的自发突变材料。

二、水稻脆杆、脆叶突变体bcl1的表型鉴定

突变体bcl1与水稻TP309相比，主要表现为：

1、茎秆(图1所示)：与水稻TP309(图中以“TP309”表示)的茎秆相比，突变体bcl1(图中以“bcl1”表示)的茎秆变脆、茎秆厚壁细胞的次生细胞壁变薄；

2、叶片(图2所示)：与水稻TP309(图中以“TP309”表示)的叶片相比，突变体bcl1(图中以“bcl1”表示)的叶片变脆、叶片厚壁细胞的次生细胞壁变薄；

3、茎秆中细胞壁成分(图3所示)：与水稻TP309(图中以“TP309”表示)的茎秆相比，突变体bcl1(图中以“bcl1”表示)的茎秆细胞壁成分的含量降低，具体地表现为阿拉伯糖、木糖、半乳糖、纤维素和葡萄糖的含量均显著降低。

三、水稻脆杆、脆叶基因BCL1的获得

采用图位克隆的方法克隆了控制水稻茎秆和叶片强度的基因，将该基因命名为BCL1基因，所述BCL1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示的DNA分子，BCL1基因的编码区序列如序列表中序列1的第2528-4960位所示，将其编码的蛋白命名为BCL1，所述BCL1的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

BCL1基因测序发现：与水稻TP309相比，水稻脆杆、脆叶突变体bcl1的表型突变是由于基因LOC_Os02g25230发生单碱基突变引起的，具体表现为序列表中序列1的第3314位核苷酸由A突变为T，导致BCL1蛋白的第263位密码子由赖氨酸(AAG)变为终止密码子(TAG)，进而引起蛋白翻译的提前终止。

实施例2 BCL1基因的功能验证

一、互补载体转基因植株的获得

为验证BCL1在水稻茎秆和叶片的脆性调控中的作用，通过在突变体bcl1中进行BCL1基因组互补实验进行功能验证。

一)、互补载体的构建

1、提取水稻TP309两周大幼苗的基因组DNA。

2、以步骤1的DNA为模板，用BCL1-com1-F和BCL1-com1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到如序列表中序列1的第1-5302位所示的大小为5302bp的扩增产物片段a(SEQ正向)。

BCL1-com1-F：5′-CACTCCATACATTGCGGGGT-3′

BCL1-com1-R：5′-ACATTCTTCCCGCTTTCGGT-3′

3、以步骤2中的片段a为模板，用BCL1-com2-F和BCL1-com2-R组成的引物对进行PCR扩增(下划线部分为与载体pCAMBIA1300同源的序列)，得到5334bp的扩增产物片段b(SEQ正向)。

BCL1-com2-F：5′-ACGACGGCCAGTGCCACACTCCATACATTGCGGGGT-3′

BCL1-com2-R：5′-TGACCACCCGGGGATCACATTCTTCCCGCTTTCGGT-3′

(下划线部分为与载体pCAMBIA1300同源的序列)

4、用限制性内切酶Sal I和Bam HI酶切表达载体pCAMBIA1300，回收约10kb大小的载体骨架。

5、将步骤3中的回收片段b通过同源重组定向克隆的方法连接到步骤4回收的载体上，得到了重组质粒pBCL1：：BCL1。

6、重组质粒pBCL1：：BCL1的测序结果表明，其包含BCL1基因完整的2433bp编码区序列(序列1第2528-4960位)，以及起始密码子上游2527bp的非编码区序列(序列1第1-2527位)和终止密码下游342bp的非编码区序列(序列1第4961-5302位)。

二)、T₀代植株的获得

1、将重组质粒pBCL1：：BCL1通过电击转化的方法分别导入到根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌。

2、用含150μM乙酰丁香酮的悬浮培养液将步骤1中的重组农杆菌稀释至OD₆₀₀在0.1-0.2之间。

3、挑选形状规则、淡黄色、颗粒状的预培养的突变体bcl1的愈伤组织于50mL无菌的三角瓶中，加入步骤2中的侵染液浸泡15-20min，吸干残余菌液后将愈伤组织转移到共培养培养基上，23℃黑暗条件下共培养48h。

4、挑选无菌、颜色鲜亮的颗粒状愈伤组织，将其放置于初次筛选培养基中，30℃黑暗培养2-3周。将长出的新的愈伤颗粒放置于二次筛选培养基上，继续培养2-3周，进行第二次筛选。

5、经过两次筛选的抗性愈伤会产生新的愈伤颗粒，从每个独立的胚性愈伤中挑选3颗到分化培养基上，每皿放置5个区域；30℃光照条件下(16h光照/8h黑暗)，培养3-4周至幼苗长出。

6、将步骤5中的幼苗转移到生根培养基中，30℃光照培养(16h光照/8h黑暗)3-4周，练苗后移栽至转基因试验田，得到T₀代植株。

三)、转基因植株的鉴定

分别提取上述T₀代植株幼苗的基因组DNA和3株突变体bcl1幼苗的基因组DNA，采用hpt-F和hpt-R组成的引物对进行PCR鉴定，有73株T₀代植株幼苗中得到目的条带为845bp大小的特异性条带，PCR鉴定中扩增得到目的条带的植株即为互补载体转基因植株，共得到73株互补载体转基因植株。3株突变体bcl1幼苗中均没有得到扩增产物。

其中，所述引物如下：

hpt-F：5′-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3′

hpt-R：5′-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3′

二、基因敲除后的转基因植物的获得

为验证BCL1在水稻茎秆和叶片的脆性调控中的作用，通过在水稻TP309中进行BCL1基因敲除实验进行功能验证。

一)、BCL1基因敲除载体的构建

1、以RGAP数据库(Rice Genome Annotation Project)公布的BCL1基因的编码区序列为参考，利用CRISPR靶位点设计网站(http：//www.rgenome.net/cas-designer/)选取了BCL1基因敲除的靶位点序列，序列为：GCCAAGGCGGTCAAGGGCAAGGG(序列表中序列1的第2645-2667位)，其中，下划线部分为PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列，分别设计靶位点引物BCL1-KO-F和BCL1-KO-R。

引物序列如下：

BCL1-KO-F：5′-GGCAGCCAAGGCGGTCAAGGGCAA-3′

BCL1-KO-R：5′-AAACTTGCCCTTGACCGCCTTGGC-3′

2、合成靶位点sgRNA序列，稀释成10μM备用。

3、探针退火：在反应体系中加入BCL1-KO-F和BCL1-KO-R各10μL，加入1μL T4 PNK酶和5μL T4连接酶缓冲液，用双蒸水定容到50μL；在37℃孵育1h后，加入2.5μL 1M的NaCl，95℃反应5s，自然退火2-3h。

4、载体酶切：用Bsa I限制性内切酶在37℃酶切pCAMBIA1300-pYAO-cas9载体4h，65℃孵育20min使Bsa I失活，胶回收载体片段。

5、将上述退火探针与酶切载体用T4连接酶连接1h，而后热击转化大肠杆菌DH5α；将测序正确的BCL1基因敲除载体命名为pBCL1-KO。

二)、T₀代植株的获得

1、将pBCL1-KO通过电击转化的方法分别导入到根癌农杆菌EHA105/pSoup中，得到重组农杆菌。

2、用含150μM乙酰丁香酮的悬浮培养液将步骤1中的重组农杆菌稀释至OD₆₀₀在0.1-0.2之间，得到侵染液。

3、挑选形状规则、淡黄色、颗粒状的预培养的水稻TP309的愈伤组织于50mL无菌的三角瓶中，加入步骤2中的侵染液浸泡15-20min，吸干残余菌液后将愈伤组织转移到共培养培养基上，23℃黑暗条件下共培养48h。

三)、转基因植株的鉴定

1、提取上述T₀代植株幼苗的基因组DNA，采用hpt-F和hpt-R组成的引物对进行PCR鉴定，目的条带为845bp大小的特异性条带，PCR鉴定中扩增得到目的条带的植株即为转基因阳性植株。

其中，所述引物如下：

hpt-F：5′-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3′

hpt-R：5′-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3′

2、将步骤1中鉴定为转基因阳性植株的基因组DNA，采用BCL1-F和BCL1-R组成的引物对进行PCR扩增，将扩增片段回收后进行测序分析(测序由北京擎科生物科技有限公司完成)。

3、将步骤2中的测序结果与水稻TP309中BCL1基因的序列进行比对，进一步确认靶位点序列发生错义突变的植株即为BCL1基因敲除后的转基因植株，共得到20株BCL1基因敲除后的转基因植株。其中，18株发生插入突变，2株发生碱基替换。具体结果如下：

7株在序列表中序列1第2662位插入一个核苷酸T，6株在序列表中序列1第2662位插入一个核苷酸A，2株在序列表中序列1第2663位-第2669位插入7个核苷酸GCCTGTC，1株在序列表中序列1第2662位和2663位插入两个核苷酸GT，1株在序列表中序列1第2662位插入一个核苷酸G，1株在序列表中序列1第2662位发生点突变由C变成A，1株在序列表中序列1第2662位和2663位发生点突变由CA变成AC。

三、转基因植株的表型分析

T₀代转基因植株自交得到的种子进行种植得到T₁代，再连续种植两次后植株即为T₃代植株，通过该方法获得T₃代互补载体转基因植株和T₃代BCL1基因敲除后的转基因植株。

将30株T₃代互补载体转基因植株、30株T₃代BCL1基因敲除后的转基因植株、30株突变体bcl1、30株水稻TP309定植于大田，在平行条件下培养，观察整个生长期内植株的表型。

T₃代互补载体转基因植株(图中以“COM-1”表示)的茎秆和叶片的机械强度得以恢复，不再易脆，与水稻TP309(图中以“TP309”表示)一致(图4和5所示)。

与水稻TP309相比，T₃代BCL1基因敲除后的转基因植株(图中以“KO-1”表示)表现出了与突变体bcl1(图中以“bcl1”表示)类似的表型特征，即茎秆和叶片变得易脆(图4和5所示)。

上述结果表明，BCL1基因参与控制细胞壁成分的含量，具体地与水稻茎秆和叶片的机械强度有关，更具体地与水稻茎秆和叶片的脆性有关。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 蛋白质及其相关生物材料在调控植物机械强度中的用途

<130> GNCFY191187

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5355

<212> DNA

<213> 水稻（Oryzasativa L.）

<400> 1

cactccatac attgcggggt actagtaatt aatcaaccgt ctggctgttg cagctagcaa 60

cgcatgcaaa tcttactgtg tgttttgtga tgctcaaatc taactgttac agtcgtactt 120

accgttgcgc cagacaagca caagccacag aaaaggtcat acgcagtaca gtactatata 180

cagtaaccgt tccatgcatg atgctaatta tctgcatgta cttttacttg gctaatgact 240

ccagattaat ttgtgtatac cacatgcatg tataccagcg tacgtatttt cctgcagtat 300

atactactac tagtagttag gtacgtacgt acgtatgtat agccactagc cagattggaa 360

agctagctgc agcctgcagg tgtagcgtat gagagcatgt gaaattccta aataattgag 420

ggtacacagc cttttgctgt cctagaaaca gtcgagaaat tcaaccaaac ttgccagctt 480

tttcaaacgc ttatttatca taatgtggat gggttagctc tagcttgctt gcttactcgc 540

tttctcccca gtggaggagg gaagtattgt acgccgccct taattgtctg tctagcttgc 600

ctgcaaatac tcactactgc tacgtgtata atgcgtgcag ttcatacgct gtccggcgcc 660

tcaccaaaac tggtacccca ccccaccctt ctatatatgt ttagccacgc acgccattga 720

caactactac gtcctttttt tccccatata gacgccacag caaaatactc aatgctacta 780

agtatacgcg attgataact attagtatgt ttggtaaaat gccactgtca cacggttaat 840

aatgacgatg aatttggctt gatgctaaaa aatgccctag attttactga ctttgtcaga 900

gagatttgta gcttttcagt cgtaaccatt tgtttttatg acttttgaat taactgatca 960

tctggacttg agattttctt tctccaccca caggaaaaaa atgaataatt ctatgttaaa 1020

taagcgatgt gctgttacta ttgcggaggt acacgtatca tgggagcagg tcaggtagcc 1080

gaaatggagg ttttgtaagg tgtttatacg gcagcggcgc ggcggcaaat ttgcgctgcc 1140

gccggccggg gggaacgaaa agggagcgag aggtaggaaa ggctaaacaa gggggagggc 1200

gtgggctctc acgccacggc ctctagggcc accaactatt ccaccgcaat aattgtggga 1260

gagaggagag gagaagagag gtgtgtggtg gtggtcatgc atagtagccg aacacaatac 1320

acttgtacaa tcctccccct tattttacat ataggccttt gtaccataaa gaatagacta 1380

ggcattatac cgagaggcat tcctcttgtg ggagtgggca gtcaaccctg ccccaaagac 1440

cagaccaaaa aaaattaaag aaaagaaaaa gggtgtagag aagtagtctg gatagagaga 1500

gagatggtgg ctctcaggct ctcaagcttg ctcctcctct tcttcttcca taaattccta 1560

ggttgcccct ctcctgcttt ctcttcttct tcaatctcca tccccatcat ctatctatcc 1620

atcatccatc agaccagacc cttcctcctc tcccctgcct accggcagca gcacccagca 1680

gtaagccccc aagcagtaag ctatagctgc ctgtgtgagg ccccaaaatc tctctactct 1740

ccctttctcc atccccacac acattcctcc gatatctagt atatctccct actacaccat 1800

catccaggct acattagttt ggtctctttt ttttttcttt tataagtttt gggtttttcc 1860

tcaccaccac cacaagcgag gagttgcaca accatccaaa gggaggggag tgcaagaatt 1920

gtgagctgcc acaagtgata tttttccaat tttgtttttg ggcaagtgta gtgcactcac 1980

tcacacacta ggcaggggca ggggcagggc ggcctataaa taaaaagaaa aaaaaagaga 2040

gagaagatat attactagta gtatttgcta ttggaagaag ccaaaggcag gggaggagga 2100

agagtcttct tctgctgctc tctctcttct cttctcaatt catcctcctt ttgtccctat 2160

caaacccttt ttttctgtct ctctctttct accttggcat tgttttctcg caaatcttgc 2220

tttctaaacc cccaaaacct cccggaaaac aacccaccca ccccgcgcgt ggatggacgg 2280

cccgcggccg ccgccgccgc ccaatgcgct gcgccgatcg cggttgtttc cgacgaccac 2340

gccgccgccg tccgccaccg ggggtctccg gcattagaac ccgggcagtt gagaattcca 2400

cgccgctacg gcgggattgg attagcgggc gggcggcggt cagggaagag gaggttctct 2460

cttgtggtcg ttgccgctgg aggtgatcga tcgatcggtc ggtcgtctcg cggggcgatc 2520

ggtcggcatg tcgacggccg ccaaggagga ggcggcagcg tcggctccgg cgccggcaat 2580

gggcggcgag gaggcggcgg cgcgggcggc gcagaagcgg tacgaggggc tcctcacggt 2640

gcgggccaag gcggtcaagg gcaagggcgc ctggtactgg gcgcacctgg agccggtgct 2700

catccccgcc gccgacaccg ggatgccgcc caaggccgtc aagctgcgct gcggcctctg 2760

ctccgccgtc ttctccgcct ccaacccatc gcgcacggct tcggagcacc tcaagcgggg 2820

cacctgcccc aacttctccg cgccaccgcc gggcgccgcc gcggcatccg gttcgtccgg 2880

ttcgcagcat cagcagcaga cgccacaggc ggcgctgcag gcgttgccgc cgcccaactc 2940

gacggcatcg tcccctatcc caatctcgtc cattgcgccc tcgtcgccgc gccacccgca 3000

ccaccactcg cagccccaac agccgcagtc gcatcaccac catcaccatc actccggcag 3060

ccggaagcgc cactcgatgc ctccggcgta cacggccgcg gagcccgtgt cccaccacca 3120

ccatctcgtc gtcgtcgacc cgtcgacggt ttactcccct ccgctgcccg ccctgccgcc 3180

gccaccaccg caacaaccgc agtcggcgct cgtgctctcc ggcggcaagg aggatctcgg 3240

cgcgttggcc atgctggagg acagcgtgaa gcggctcaag tcgcccaagg cgtcgccggg 3300

ggcgatgctg ccgaagccgc aggccgacgc ggcgctcgcc ctgctcgccg aatggtttct 3360

cgagtcgtcg ggcggcgtgt cgctgtcggc cgtggcgaac ccgaaactcc ggtccttcct 3420

ccgccacgtc ggcctgccgg agctgcagcg gacagacctg gcgggggctc ggctggatgc 3480

gcggttcgcc gaggcccgcg ccgacgccac cgcgcgcgtc cgcgacgcgc tctttttcca 3540

gctcgcggcg gacgggtggc gggagcaggt ggtaactctg tgtgtcaacc tcccaaatgg 3600

aacatccgtg ttccaccgcg gcgtgccggt ccccgccccg gcgccctcgg actacgccga 3660

ggaggtgttg ctggacgcgg tggcgtccgt gtccgcgtct ggctcctcca acgacctgca 3720

ccattgcgcg ggcatcgtgg ctgaccgctt caagtcaaag gcccttcgtg atctggagaa 3780

caagcaccat tggatggtga acctgtcctg ccaaatccat ggcttcaccc ggctggttcg 3840

ggacttcgcg cgggagctcc ctctgttccg ctccgctgcg gctaaatccg ccaagctggc 3900

cgcctacttc aatgccaagc cgacggtgcg gtccctgctg cacaagcacc aaatccagga 3960

gctcgggcat gcgtcgcttc tccgtgtggc gcatgtgcca ttcaatagca gcggcagcga 4020

ctaccgtgcg gccttcgaga tgctggagga cgtgttgacc tctgctcgcc cgctccagct 4080

cgccgtcttg gaagagtcct ataagctggt ctgcatcgac gattcggccg ccagggagat 4140

ggcggacatg ttgcaggatg ggtcattctg gagtgaggtt gaggccgtgc atctgctcgt 4200

gaagctgatc atggacatgg tgaaagagat ggagactgac aggcctctgg ttggccaatg 4260

cctgcctctc tgggaggacc tacgtggcaa ggttagggat tggtgcgata aattcaacac 4320

tgatgagggc gctgccctga atgtggtgga gaaaaggttc aggaagaact accatccagc 4380

ctggtcagcg gctttcatat tggatcctct ctacctaatc aaggatgcca gtgggcgcta 4440

cctcccgccc ttcaagttct tgactcctga tcaagagaag gatgtggaca tgctcatcac 4500

caggatggtg tcgcgggagg aggcgcacat tgcggtcatg gagctcatga aatggcggac 4560

ggaagggctg gacccgttgt atgcgcaggc ggtgcaggtc cggcagcctg acccgtccac 4620

cgggaagatg aaggtcgcaa acaagcagag cagccgcctt gtctgggaga cgtgcctgag 4680

cgagctcaag tccctcggga aggtggctgt acggctcatc ttcctccatg ccactgctag 4740

ggggttcagg tgctcaccct ccatgctgcg ttggctctct gctcctggca gtttagccgg 4800

tggcattgat cgtgcgcacc ggctagtgtt cgttgctgca aattccaagc tagagaggag 4860

ggatttctca agtgatgaag acaaggatgc tgagttactc actgaagggg acgatgatgt 4920

gctaaacgag cctggcagtt tggagcgctc ctcagtgtaa cacccttatt taattgttcg 4980

tttctttttc tctattagcc ttttttagaa gttaatccct aggaatttgc tagaatttcc 5040

accccctacc tatttttttg cctcctagaa atttcttcct cgtgcccatg ctgttaattc 5100

ttacttcctc actctagatt ttggtggggt ggggagtggg gcatgagatg gagatatgca 5160

tcctttgttc atcaagtttg gttaagaatg actgtctctt gccatatatg attccatggg 5220

gccattgaac ttgcagagat taatggaagt ctttctgtca atatgttcat agtcggtggt 5280

acaccgaaag cgggaagaat gtgtaaccat ttttttttgt gaaaattaat aatattgata 5340

tgcaattgaa tgcaa 5355

<210> 2

<211> 810

<212> PRT

<213> 水稻（Oryzasativa L.）

<400> 2

Met Ser Thr Ala Ala Lys Glu Glu Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala Met Gly Gly Glu Glu Ala Ala Ala Arg Ala Ala Gln Lys Arg Tyr

20 25 30

Glu Gly Leu Leu Thr Val Arg Ala Lys Ala Val Lys Gly Lys Gly Ala

35 40 45

Trp Tyr Trp Ala His Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Ala Ala Asp Thr

50 55 60

Gly Met Pro Pro Lys Ala Val Lys Leu Arg Cys Gly Leu Cys Ser Ala

65 70 75 80

Val Phe Ser Ala Ser Asn Pro Ser Arg Thr Ala Ser Glu His Leu Lys

85 90 95

Arg Gly Thr Cys Pro Asn Phe Ser Ala Pro Pro Pro Gly Ala Ala Ala

100 105 110

Ala Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gln His Gln Gln Gln Thr Pro Gln Ala

115 120 125

Ala Leu Gln Ala Leu Pro Pro Pro Asn Ser Thr Ala Ser Ser Pro Ile

130 135 140

Pro Ile Ser Ser Ile Ala Pro Ser Ser Pro Arg His Pro His His His

145 150 155 160

Ser Gln Pro Gln Gln Pro Gln Ser His His His His His His His Ser

165 170 175

Gly Ser Arg Lys Arg His Ser Met Pro Pro Ala Tyr Thr Ala Ala Glu

180 185 190

Pro Val Ser His His His His Leu Val Val Val Asp Pro Ser Thr Val

195 200 205

Tyr Ser Pro Pro Leu Pro Ala Leu Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gln Pro

210 215 220

Gln Ser Ala Leu Val Leu Ser Gly Gly Lys Glu Asp Leu Gly Ala Leu

225 230 235 240

Ala Met Leu Glu Asp Ser Val Lys Arg Leu Lys Ser Pro Lys Ala Ser

245 250 255

Pro Gly Ala Met Leu Pro Lys Pro Gln Ala Asp Ala Ala Leu Ala Leu

260 265 270

Leu Ala Glu Trp Phe Leu Glu Ser Ser Gly Gly Val Ser Leu Ser Ala

275 280 285

Val Ala Asn Pro Lys Leu Arg Ser Phe Leu Arg His Val Gly Leu Pro

290 295 300

Glu Leu Gln Arg Thr Asp Leu Ala Gly Ala Arg Leu Asp Ala Arg Phe

305 310 315 320

Ala Glu Ala Arg Ala Asp Ala Thr Ala Arg Val Arg Asp Ala Leu Phe

325 330 335

Phe Gln Leu Ala Ala Asp Gly Trp Arg Glu Gln Val Val Thr Leu Cys

340 345 350

Val Asn Leu Pro Asn Gly Thr Ser Val Phe His Arg Gly Val Pro Val

355 360 365

Pro Ala Pro Ala Pro Ser Asp Tyr Ala Glu Glu Val Leu Leu Asp Ala

370 375 380

Val Ala Ser Val Ser Ala Ser Gly Ser Ser Asn Asp Leu His His Cys

385 390 395 400

Ala Gly Ile Val Ala Asp Arg Phe Lys Ser Lys Ala Leu Arg Asp Leu

405 410 415

Glu Asn Lys His His Trp Met Val Asn Leu Ser Cys Gln Ile His Gly

420 425 430

Phe Thr Arg Leu Val Arg Asp Phe Ala Arg Glu Leu Pro Leu Phe Arg

435 440 445

Ser Ala Ala Ala Lys Ser Ala Lys Leu Ala Ala Tyr Phe Asn Ala Lys

450 455 460

Pro Thr Val Arg Ser Leu Leu His Lys His Gln Ile Gln Glu Leu Gly

465 470 475 480

His Ala Ser Leu Leu Arg Val Ala His Val Pro Phe Asn Ser Ser Gly

485 490 495

Ser Asp Tyr Arg Ala Ala Phe Glu Met Leu Glu Asp Val Leu Thr Ser

500 505 510

Ala Arg Pro Leu Gln Leu Ala Val Leu Glu Glu Ser Tyr Lys Leu Val

515 520 525

Cys Ile Asp Asp Ser Ala Ala Arg Glu Met Ala Asp Met Leu Gln Asp

530 535 540

Gly Ser Phe Trp Ser Glu Val Glu Ala Val His Leu Leu Val Lys Leu

545 550 555 560

Ile Met Asp Met Val Lys Glu Met Glu Thr Asp Arg Pro Leu Val Gly

565 570 575

Gln Cys Leu Pro Leu Trp Glu Asp Leu Arg Gly Lys Val Arg Asp Trp

580 585 590

Cys Asp Lys Phe Asn Thr Asp Glu Gly Ala Ala Leu Asn Val Val Glu

595 600 605

Lys Arg Phe Arg Lys Asn Tyr His Pro Ala Trp Ser Ala Ala Phe Ile

610 615 620

Leu Asp Pro Leu Tyr Leu Ile Lys Asp Ala Ser Gly Arg Tyr Leu Pro

625 630 635 640

Pro Phe Lys Phe Leu Thr Pro Asp Gln Glu Lys Asp Val Asp Met Leu

645 650 655

Ile Thr Arg Met Val Ser Arg Glu Glu Ala His Ile Ala Val Met Glu

660 665 670

Leu Met Lys Trp Arg Thr Glu Gly Leu Asp Pro Leu Tyr Ala Gln Ala

675 680 685

Val Gln Val Arg Gln Pro Asp Pro Ser Thr Gly Lys Met Lys Val Ala

690 695 700

Asn Lys Gln Ser Ser Arg Leu Val Trp Glu Thr Cys Leu Ser Glu Leu

705 710 715 720

Lys Ser Leu Gly Lys Val Ala Val Arg Leu Ile Phe Leu His Ala Thr

725 730 735

Ala Arg Gly Phe Arg Cys Ser Pro Ser Met Leu Arg Trp Leu Ser Ala

740 745 750

Pro Gly Ser Leu Ala Gly Gly Ile Asp Arg Ala His Arg Leu Val Phe

755 760 765

Val Ala Ala Asn Ser Lys Leu Glu Arg Arg Asp Phe Ser Ser Asp Glu

770 775 780

Asp Lys Asp Ala Glu Leu Leu Thr Glu Gly Asp Asp Asp Val Leu Asn

785 790 795 800

Glu Pro Gly Ser Leu Glu Arg Ser Ser Val

805 810

Claims

1.如下(A1)或(A2)或(A3)或(A4)任一所示蛋白质在调控植物机械强度中的应用：

(A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.与权利要求1中所述的蛋白质相关的生物材料在调控植物机械强度中的应用；

所述生物材料为下述B1)-B10)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

B1)所述核酸分子为如下(C1)-(C4)中任一所示：

(C1)编码序列是序列表中序列1的第2528-4960位所示的DNA分子；

(C2)序列表中序列1所示的DNA分子；

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述调控植物机械强度为如下(I)或(II)或(III)：

(I)调控植物细胞壁成分的含量；

(II)调控植物茎秆和/或叶片的机械强度；

(III)增加或减弱茎秆和/或叶片的脆性。

5.权利要求1中所述的蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在培育茎秆和/或叶片的脆性增加的转基因植物中的应用。

6.权利要求1中所述的蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在植物育种中的应用。

7.一种培育茎秆和/或叶片的脆性增加的转基因植物的方法，其特征在于：抑制受体植物中权利要求1中所述的蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物比受体植物的茎秆和/或叶片的脆性增加。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述抑制受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性的方法为通过对所述受体植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默来实现的。

9.根据权利要求7或8中任一所述的方法，其特征在于：所述抑制受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性的方法为是利用CRISPR方法对所述受体植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因进行敲除来实现的；

具体的，所述CRISPR方法中的靶序列如序列表中序列1第2645-2667位。

10.根据权利要求7或8中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为禾本科植物。