CN101979407B

CN101979407B - 一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2及其编码基因和应用

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Publication number: CN101979407B
Application number: CN201010514555XA
Authority: CN
Inventors: 高世庆; 赵昌平; 唐益苗; 郭丽香
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2010-10-14
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2030-10-14
Also published as: CN101979407A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强烟草抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

Description

一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2及其编码基因和应用。

背景技术

小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，在我国干旱地区的耕地面积约为5.7亿亩，盐碱地约为5.54亿亩，每年因干旱、盐碱等逆境我国对小麦造成的减产达700-800亿公斤，严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食生产的快速发展。

随着现代分子生物学的发展，利用基因工程技术从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，为培育作物抗逆新种质提供了理论基础。转录因子(transcription factor，TF)，又称反式作用因子，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件(cis-acting element)发生特异性相互作用的结合蛋白，该蛋白通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用激活或抑制特定基因的转录，在抗逆基因表达调控中起着重要作用。近年来，通过转录因子的结构与功能分析来鉴定、阐明各种条件下基因表达调控的机理得到了广泛关注(刘强等，2000)。Yamaguchi-Shinozaki等人的研究表明：利用rd29A启动子启动AtDREB1A基因的表达，能够有效提高小麦对干旱、高盐和低温的抗性(Yamaguchi-Shinozaki et al.，2002)。GmDREB3基因的超量表达能提高转基因拟南芥和烟草植株对干旱和低温胁迫的耐性(Chen et al.，2007)。将棉花GhDREB基因转化小麦品种扬麦10号，转基因小麦的耐旱、耐盐性得到明显提高(Gao et al.，2009)。

研究表明：锌指蛋白作为一类转录因子而广泛地参与基因表达的调控。锌指蛋白最初于1983年在非洲爪蟾卵母细胞的转录因子TFIIIA中被发现(Miller etal.，1985)，是迄今在真核生物基因组中分布最广的一类蛋白。它的得名是由于其结构特征，几个保守的氨基酸(一般为Cys和His)与一个或多个锌离子结合，形成一个在蛋白质中相对独立的区域。锌指基序无论在结构还是功能上都是多样的，它不仅可以结合DNA和RNA，还能与DNA-RNA杂交双链分子以及其他锌指蛋白或自身结合，也可以通过和膜的结合来起作用。根据锌指的保守基序的特点，可以将锌指蛋白分成9类：C2H2型、C8型、C6型、RING型、C2HC型、LIM型(C2HC5)、C4型、C3H型和C4HC3型(Berg et al.，1996)。

RING型锌指大约在19年前被界定为一种新的锌指结构域，分离得到的第一个RING型锌指蛋白基因为人类Really Interesting New Genes 1(RING1)，它参与多种信号转导途径和调控途径(Zeba et al.，2009)。RING型锌指蛋白又分为两个亚类：RING-HC(C3HC4)和RING-H2(C3H2C3)(Kam et al.，2007)。RING-HC本身含有40-60个氨基酸残基，它的保守序列为Cys-X2-Cys-X(9-39)-Cys-X(1-3)-His-X(2-3)-Cys/His-X-Cys-X-Cys-X-Cys，其中X代表任意氨基酸(Borden et al.，1996)。RING-H2基序与RING-HC的不同在于第四个半胱氨酸残基变为组氨酸残基(Freemont et al.，2000)。目前，在动物、植物和微生物等各种生物体中已经分离得到了许多RING型锌指蛋白。一些RING型锌指蛋白被认为参与转录调控的某些过程和蛋白与蛋白的相互作用(Satijn et al.，1997)。之后的研究显示，许多RING型锌指具有泛素连接酶E3活性，可以和泛素结合酶E2特异性反应，从而促进泛素化。为了保护自身的结构不被破坏，细胞内的蛋白降解必须具有高度的选择性，所以现在普遍认为，RING型锌指的泛素连接酶E3活性介导的泛素化对于细胞具有至关重要的作用(Yang et al.，2008)。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2。

本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱、耐盐相关蛋TaCRF2的编码基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。

本发明的另一目的提供上述植物抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2的应用。

本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2，来源于京花9小麦品种及其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2，是Zinc-finger类转录因子，由280个氨基酸残基组成，自SEQ ID NO.1的氨基末端第221-261位氨基酸残基是保守的Zinc-finger结构，自SEQ ID NO.1的氨基末端第132-141位氨基酸残基为核定位序列。

SEQ ID NO.1：

MSFVFRCSRA DIEAGGFPGF AAERRSMRIH AGGRPVNSNS LAFLVTVLVL

FMVLSSHQMS 60

PNFLLWMVLG VFLLATSLRM YATCQQLQAQ SQAHAADGNG FPGRTELRVH

VPPTIAHASR 120

GRLQSLRLQL ALLDREFDDL DYDALRALDT DNSPHAPSMT EEEINTLPVF

RYKFQAQQRS 180

TPSRKSSGGP SEPLVSSPES GKEKKQDADA TSKMTDDELT CSVCLEQVVA

GDLLRSLPCL 240

HRFHVNCIDP WLRQQGTCLI CKHQVSNVWH GAGSEMDAMV

280

为了使蛋白TaCRF2便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

根据本发明所公开的SEQ ID NO.1序列，本发明的转录因子TaCRF2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

根据本发明的TaCRF2编码基因具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。TaCRF2的表达受干旱、盐胁迫的诱导。

SEQ ID NO.2：

atgagctttg tgttccggtg cagcagggcc gacatcgagg ccggtggctt cccagggttt 60

gccgcggagc gccgttccat gcggattcat gccggggggc ggccggtgaa cagcaattcc 120

ttagcttttc ttgtaactgt tcttgttttg ttcatggtac tgagctcgca ccagatgtct 180

ccgaactttt tgctttggat ggtcttaggt gtgttcctat tggccaccag ccttaggatg 240

tacgctacat gccagcagct ccaagcgcag tctcaagctc atgctgcaga cggcaacggc 300

ttccctggac gcacagagtt gcgggtgcat gtcccgccaa ccatagccca tgcttcgaga 360

ggccggttgc aaagccttag actccaactt gctctgcttg accgcgagtt tgatgattta 420

gattatgatg ctctcagagc gctagatact gacaatagcc cacatgctcc ttctatgact 480

gaagaagaaa taaatactct gcctgttttc agatacaaat ttcaggcgca gcagaggagc 540

accccttctc gaaaaagtag tggtgggcca tctgaaccat tggtttcttc tcctgaatcc 600

ggcaaggaga aaaagcaaga tgcagatgca acaagcaaaa tgacagatga tgagttgacg 660

tgcagtgttt gcttagagca agttgtcgcg ggtgatctat tgagaagcct gccatgcttg 720

catcggtttc atgtgaactg cattgatcca tggttgcgcc aacaaggaac atgcctgatc 780

tgcaagcacc aggtgagcaa cgtgtggcat ggcgccggca gcgaaatgga tgccatggtg 840

含有TaCRF2基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有TaCRF2基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用TaCRF2基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。

本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有TaCRF2基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的Zinc-finger转录因子TaCRF2的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、小麦、京花9、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对或盐胁迫的耐逆性。

本发明利用RT-PCR的方法，从小麦京花9品种cDNA中克隆到了一个新的RING-H2型锌指蛋白基因TaCRF2，并对其进行了表达特性分析。通过农杆菌介导法将该基因转入了烟草中，对转基因烟草在培养基上进行了耐旱和耐盐鉴定。结果显示：转入TaCRF2基因的表达提高了烟草对干旱和盐的耐受性，过量表达TaCRF2转录因子基因提高了烟草的抗逆能力，转基因植株发育不产生任何负面作用，这对抗逆分子育种改良和提高作物的抗逆性及抗旱、节水农业生产会产生巨大推动作用和经济效益，具有非常重要理论和实践意义。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2编码基因的cDNA克隆，以京花9cDNA为模板，PCR扩增含有Zinc-finger保守域的cDNA片段，1，2：京花9片段；M：DL2000 marker(100，250，500，750，1000，2000bp)。

图2为荧光定量PCR分析TaCRF2在干旱、盐胁迫处理下的表达特征，A.干旱胁迫处理下的表达特征；B.盐胁迫处理下的表达特征。

图3为烟草农杆菌转化植株PCR检测。pBI35S-TaCRF2转基因烟草植株的PCR检测。

图4为转基因烟草耐盐鉴定。pBI35S-TaCRF2转基因烟草和W38在含有300mMNaCl培养基上的生长情况，A1，B1：分别为pBI35S-TaCRF2转基因烟草和W38在含有300mM NaCl培养基上的初始生长情况；A2，B2：分别为pBI35S-TaCRF2转基因烟草和W38在含有300mM NaCl培养基上培养14天的生长情况。

图5为转基因烟草耐旱性鉴定。pBI35S-TaCRF2转基因烟草和W38在含有5％PEG培养基的生长情况，C1，D1：分别为pBI35S-TaCRF2转基因烟草和W38在含有5％PEG培养基上的初始生长情况；C2，D2：分别为pBI35S-TaCRF2转基因烟草和W38在含有5％PEG培养基上培养37天的生长情况。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1：京花9抗旱、耐盐相关TaCRF2基因的cDNA克隆。

对生长7天左右的京花9幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取京花9总RNA。应用5’RACE试剂盒(5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL，CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(3’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL，CAT.NO.18373-019)获得TaCRF2基因的全长序列840bp。

用Trizol提取京花9幼苗的总RNA，用superscript II(invitrogen)反转录酶反转录获得到cDNA。根据TaCRF2基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-CTGGAGATTCACCATGAGCTTTGTG-3’，

P2：5’-TTACACCATGGCATCCATTTCGCTG-3’。

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为0.8-1kb左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaCRF2基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.2的自5’末端第1至840位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ ID No.2所示TaCRF2基因的重组载体命名为pTE-TaCRF2，其cDNA克隆结果如图1所示。

TaCRF2基因的序列在Genabnk上进行比对，该基因与拟南芥中Zinc-finger类转录因子具有较高同源性，而在京花9中未发现同源蛋白基因，证明TaCRF2基因是一个新的基因。

实施例2：逆境胁迫处理下TaCRF2基因的表达特征

将京花9种子种在盆中，生长7天左右取幼苗进行如下胁迫处理：1)干旱处理：将京花9幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上；2)盐处理：将京花9幼苗置于200mMNaCl溶液中；分别在上述各种处理后0、1、2、5、10、24小时取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

分别将干旱处理、盐处理后0、1、2、5、10、24小时的样品提取总RNA，以TaCRF2 DNA为探针(序列表中的序列1)，进行荧光定量分析。

荧光定量分析结果见图2。A为干旱处理的样本；B为NaCl处理的样本。

结果表明：在干旱胁迫24小时TaCRF2基因表达达到高峰；在高盐(200mMNaCl)胁迫24小时TaCRF2基因表达达到高峰，说明该基因受干旱、高盐胁迫诱导表达。

实施例3：用TaCRF2基因增强植物的抗旱、耐盐性

1、重组表达载体的构建

1)35S-TaCRF2重组表达载体的构建

以京花9的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和XbaI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和XbaI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV 35S启动子之后的SmaI和XbaI酶切位点之间，得到重组载体35S-TaCRF2。

引物序列如下：

TaCRF2[SmaI]5’-GCGCCCGGGATGAGCTTTGTGTTCCGGTGCA-3’

TaCRF2[XbaI]5’-TGCTCTAGACACCATGGCATCCATTTCGC-3’

2、转基因烟草的获得和鉴定

1)转基因烟草的获得

将上述构建的重组表达载体35S-TaCRF2分别用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，再用叶盘法分别将整合有35S-TaCRF2的根癌农杆菌EHA105转化烟草W38，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行2轮筛选，每轮筛选20-25天，得到阳性转基因植株(图3)。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。

P3(上游引物)：5’-ATGAGCTTTGTGTTCCGGTGCA-3’，

P4(下游引物)：5’-CACCATGGCATCCATTTCGC-3’。

对35S-TaCRF2转基因烟草进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得0.9Kb左右条带，结果获得转35S-TaCRF2烟草40株。

同时将pBI121空载体导入烟草W38，方法同上，作为对照，获得10个株系的转空载体烟草(筛选获得的转基因烟草用T₀代表示)。

2)转TaCRF2基因植株耐旱、耐盐性鉴定

将T₀代转35S-TaCRF2基因烟草植株及T₀代转空载体对照植株的3周龄苗的根系分别移入含有300mM NaCl、5％PEG的培养基中进行盐胁迫处理14天、干旱胁迫处理37天，观察表型并拍照。

结果表明：盐胁迫处理14天、干旱胁迫处理37天后，35S-TaCRF2转基因植株在干旱、盐胁迫条件下能够正常生根、叶片颜色深绿；所有空载体转基因植株叶片均萎蔫或失绿、发白，不能够正常生根。转基因烟草耐旱、耐盐性鉴定结果证明TaCRF2基因可以提高植物的耐旱及耐盐性。

图4为转基因烟草耐旱、耐盐性鉴定，如图4显示：35S-TaCRF2转基因植株、空载体转基因植株300mM NaCl培养基生长14天的照片；图5为pBI35S-TaCRF2转基因烟草和W38在含有5％PEG培养基上的生长37天的照片情况。

Claims

1.一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种植物抗旱、耐盐相关基因，其特征在于，编码权利要求1所述的植物抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2。

3.如权利要求2所述的植物抗旱、耐盐相关基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因的重组载体。

5.权利要求1所述植物抗旱、耐盐相关蛋白TaCRF2在提高烟草耐旱及耐盐性方面的应用。

6.权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因在提高烟草耐旱及耐盐性方面的应用。