CN101591383A - 一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。该植物耐逆性相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还提供了所述蛋白质的编码基因。将该植物耐逆性相关蛋白的编码基因导入植物细胞，可获得对盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因植物品种。本发明对改良、增强植物的抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

Description

一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

干旱、盐碱等非生物逆境是影响农作物产量和品质的主要限制因素。据统计，世界干旱、半干旱区占地球陆地面积的33％，盐碱地占地球陆地面积的7.6％，有5.54亿亩的盐碱地有待开垦利用。

利用常规育种方法改良作物的抗逆性受到周期长、优异种质资源缺乏的制约。随着现代分子生物学和基因工程的发展，利用基因工程技术，从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控的分子机理，从而培育抗逆作物新种质成为了可能。目前，通过基因工程技术已将许多抗旱，耐盐和耐低温相关的基因(主要包括：合成各类渗透保护剂的酶类基因、抗氧化酶类基因、LEA蛋白类基因以及转录因子和信号传导有关的蛋白激酶基因)导入到作物中，获得了一些抗逆性显著提高的转基因植株。

通过基因工程技术将抗逆相关的功能基因导入作物，从而提高作物的抗逆性已有大量的报道。Lilius等将编码胆碱脱氢酶的基因(BetA)导入烟草和马铃薯，获得了抗盐和耐低温的转基因植株(Lilius et al.，1996)。Nakamura等将甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)导入烟草，增加了烟草中的甜菜碱的含量，同时明显提高了烟草对盐和寒冷胁迫的耐受能力(Nakamura et al.，1997)。Thomas等将甘露醇1-磷酸脱氢酶基因(mltD)导入拟南芥，增强了拟南芥的耐盐性(Thomas et al.，1995)。在植物体内，抗氧化系统由许多酶组成，如SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶。SOD是植物体内清除活性氧的关键酶，植物中已有几种SOD酶基因被克隆出来并在转基因植株中得到了活验证性。McKersie等将烟草Mn-SOD导入苜蓿，转基因苜蓿在干旱胁迫环境下的产量和存活率都有了显著提高(McKersie etal.，1999)。LEA基因(编码胚胎发育后期丰富蛋白)是最受关注的与抗旱有关的非酶类功能蛋白。Xu等将大麦的LEA蛋白基因HVA1导入水稻后，在干旱条件下转基因水稻比对照水稻生长快，解除胁迫后恢复也快，表明通过转LEA蛋白基因来提高植物的耐旱性有着很大的潜力(Xu et al.，1996)。植物对干旱、高盐等逆境胁迫的耐性是多基因控制的数量性状，其生理、生化过程是基因相互作用、共同调节的，导入单个功能基因虽然在一定程度上提高了植物的抗逆性，但提高幅度不大，往往不能达到有效增强植物抗逆性的目的(Liu et al.，1998；刘强等，2000)。

近年来，通过转录因子的结构与功能的分析来鉴定、阐明各种条件下基因表达调控的机理得到了广泛关注(刘强等，2000)。拟南芥的AtMYC2和AtMYB2转录因子，在逆境胁迫下表达增强，同时也增强了干旱应答基因rd22和AtADH1的表达(Abe etal.，2003)。Yamaguchi-Shinozaki等人的研究结果表明，通过转基因，AtDREB1AcDNA和rd29A启动子能有效提高农作物对干旱、高盐和低温的抗性(Yamaguchi-Shinozaki et al.，2002)。将拟南芥AtDREB1A基因导入普通小麦品种Bobwhite26，可以明显提高转基因小麦的耐旱性(Pellegrineschi et al.，2004)。将大豆GmDREB基因转化小麦品种鲁麦22号，转基因小麦的耐旱、耐盐性得到明显提高(Gao et al.，2005)。AtDREB1A/CBF3基因的超量表达能提高转基因拟南芥植株对低温胁迫的耐性(Seki et al.，2001)。GmDREB3基因的超量表达能提高转基因拟南芥和烟草植株对干旱和低温胁迫的耐性(Chen et al.，2007)。转ABF3基因的拟南芥，对低温、热、氧化胁迫的耐性比野生型拟南芥明显增强(Kim et al.，2004)。ABF2/AREB1过表达的转基因拟南芥对干旱胁迫耐性显著增强(Fujita et al.，2005)。

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper，bZIP)蛋白是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类蛋白。研究表明：bZIP蛋白不仅参与种子贮藏基因的表达、光形态的发生以及器官建成的控制(Finkelstein et al.，2000；Finkelstein etal.，2002)，还参与植物对脱落酸、光和发育中各种信号的反应(Jakoby et al.，2002)。植物bZIP类转录因子的共同特点是：1)含有与特异DNA序列相结合的碱性结构域，大约由20个氨基酸组成，它紧靠亮氨酸拉链结构域的N末端，能与专一的DNA序列相互作用(Landschulz et al.，1988)；2)参与寡聚化作用的亮氨酸拉链区与碱性区紧密相连，典型的特征是每7个氨基酸的第7位含有一个亮氨酸。亮氨酸拉链形成一个两亲的螺旋结构，该结构参与bZIP蛋白与DNA结合之前的二聚体化；3)转录因子的N-末端含有酸性激活区；4)以二聚体形式结合DNA，肽链N-末端的碱性区与DNA直接结合。除了共有上述两种保守的结构域外，有些植物的bZIP蛋白还共有其它一些结构域，如：脯氨酸、谷氨酞胺和酸性氨基酸丰富的结构域，这些特殊的结构域可能与转录激活结构域相互作用从而调控下游基因的表达(Suzuki et al.，2003)。

bZIP类转录因子识别核心序列为ACGT的顺式作用元件，如CACGTG(G盒)、GACGTC(C盒)、TACGTA(A盒)等，一些受光或脱落酸(ABA)诱导的基因的启动子区都含有这些元件。G盒元件普遍存在于受ABA、生长素、茉莉酸、水杨酸诱导的基因中，还是光诱导基因中最常见的顺式作用元件之一，拟南芥HY5、GBF2等bZIP类转录因子都能与G盒元件特异结合，激活光诱导基因的转录(Foster et al.，1994)。

许多干旱胁迫应答基因的表达也受ABA的诱导。植物种子在发育或水分亏缺等逆境中，其内源ABA的含量大量增加(Bray et al.，1997)。分析发现这些基因的启动子有保守的ABA应答元件(ABRE，CACGTG)，其中ACGT为核心序列，其保守序列为PYCGTGGC。ABRE作为顺式作用元件参与ABA调节的基因表达，与ABRE作用的反式作用因子已被克隆，其结构中含有保守的亮氨酸拉链结构，在亮氨酸拉链的邻近区域具有一个碱性区域，属于转录因子bZIP家族成员(Guiltinan et al.，1990；Hobo et al.，1999)。Choi(2000)报道bZIP类转录因子ABF/AREB能够激活含有ABRE元件的基因的表达(Choi et al.，2000；Fujita et al.，2005)。在拟南芥的ICK1、rd29B、rab18、KIN2、KAT2、ADH1、CHS、racS、SUS1等抗逆相关基因的启动子区域发现了ABRE顺式作用元件(Kang et al.，2002；Kim et al.，2004)。ABRE元件参与ABA调节的基因表达，与ABRE相互作用的bZIP转录因子已被分离，如烟草的TAF-1(Oeda et al.，1991)、水稻的OSBZ8(Nakagawa et al.，1996b)、TRAB1(Hobo et al.，1999；Kagaya et al.，2002)、拟南芥的ABF1-4(Choi et al.，2000)、玉米的ABP9(王磊等，2002)、大麦的HvABI5和HvVP1等(Casaretto et al.，2003)，其结构中含有保守的亮氨酸拉链结构域和碱性DNA结合域(Guiltinan et al.，1990)。

Marc Jakoby等对拟南芥基因组全序列分析发现了大量的bZIP类转录因子，其数量是酵母、蠕虫和人的4倍多。根据bZIP转录因子的结构差异，可以将其划分为10个亚族：A亚族，B亚族，C亚族，D亚族、E亚族、F亚族、G亚族、H亚族、I亚族、S亚族，其中，A亚族包括13个成员，如ABF1、ABF2/AREB1、ABF3、ABF4/AREB2、GBF4、ABI5、AREB3、DPBF2等(Jakoby et al.，2002；Satoh et al.，2004)。Choi等首次克隆到的拟南芥的ABF/AREB bZIP类转录因子基因属于A亚族，其成员分别为：ABF1、ABF2(AREB1)、ABF3、ABF4(AREB2)。ABF1主要参与低温、ABA胁迫应答反应，ABF3主要参与ABA、高盐、低温、热、氧化胁迫应答反应，ABF2/AREB1、ABF4/AREB2主要参与ABA、干旱、高盐、热、氧化胁迫应答反应(Choi et al.，2000；Uno，et al.，2000)。

综上所述，转录因子在调节植物的逆境反应，提高植物的抗逆性中起着至关重要的作用(刘强等，2000；Yamaguchi-Shinozaki et al.，2002)。目前，利用抗逆相关的转录因子基因改良和提高拟南芥、烟草、水稻等植物的抗逆性，取得了很大成功。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的耐逆性相关蛋白，名称为GmAREB1，来源于大豆，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由439个氨基酸残基组成，是bZIP类转录因子。自序列1的氨基末端第355-405位氨基酸残基是保守的bZIP结构，自序列1的氨基末端第357-360位氨基酸残基为核定位序列。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列1的上述结构域外进行取代和/或缺失和/或添加。

为了使(a)中的GmAREB1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的GmAREB1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的GmAREB1的编码基因可通过将序列表中序列2自5′端第20至1336位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述植物耐逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2自5′末端第20至1336位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)其序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列2由1406个脱氧核糖核苷酸组成，自5’末端的第20至1336位脱氧核糖核苷酸为GmAREB1的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第20至22位脱氧核糖核苷酸为GmAREB1的起始密码子，自5’端的第1337至1339位脱氧核糖核苷酸为GmAREB1的终止密码子。GmAREB1的表达受干旱、盐、脱落酸和低温胁迫的诱导。

含有GmAREB1基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有GmAREB1基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GmAREB1构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为将pBI121的SmaI和XbaI位点间的小片段取代为序列表中序列2的自5’末端的第20-1336位脱氧核苷酸得到的35S-GmAREB1。

所述重组表达载体具体可为将pBI121-rd29A的SmaI和SpeI位点间的小片段取代为序列表中序列2的自5’末端的第20-1336位脱氧核苷酸得到的29A-GmAREB1；所述pBI121-rd29A是用rd29A启动子取代pBI121的CaMV 35S启动子得到的重组载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。

本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有GmAREB1基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的bZIP转录因子GmAREB1的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、小麦、大豆、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对盐胁迫的耐逆性。

本研究以耐盐性较强的大豆(Glycine max L.)栽培品种铁丰8号为实验材料，得到了抗逆相关的bZIP转录因子GmAREB1(Glycine max ABA Responsive ElementBinding)蛋白及其编码基因，并将GmAREB1基因导入烟草，显著提高了植物的耐盐性。本发明的耐逆性相关蛋白及其编码基因对改良、增强植物的抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为Northern分析GmAREB1在干旱、盐、酸和低温胁迫处理下的表达特征

图2为GmAREB1蛋白与ABRE的结合特异性检测电泳图

图3为转基因烟草耐盐性鉴定

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、大豆耐逆性相关蛋白GmAREB1编码基因的筛选及其cDNA克隆

对生长14天左右的大豆铁丰8号(购自英骏公司)幼苗进行高盐(200mM NaCl)处理12小时，用Trizol提取大豆总RNA。应用5’RACE试剂盒(5’RACE System forRapid Amplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL，CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA EndsKit)(GIBCOBRL，CAT.NO.18373-019)获得GmAREB1基因的全长序列。

用Trizol(invitrogen)提取大豆铁丰8号幼苗的总RNA，用superscriptII(invitrogene)反转录酶反转录获得到cDNA。根据GmAREB1基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-GGTCAAAAGATGAACTTCAG-3’，

P2：5’-GGCTTCCTTCGTATAGATGTC-3’。

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1.3-1.4kb左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl AcadSci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的GmAREB1基因的开放阅读框(ORF)为序列表中序列2的自5′末端第20至1336位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质。将含有序列表中序列2的自5′末端第20至1336位脱氧核糖核苷酸的GmAREB1基因的重组载体命名为pTE-GmAREB1。

GmAREB1基因的序列在Genabnk上进行比对，该基因与拟南芥中bZIP类转录因子具有较高同源性，而在大豆中未发现同源蛋白基因，证明GmAREB1基因是一个新的基因。

实施例2、逆境胁迫处理下大豆GmAREB1基因的表达特征

将大豆铁丰8号种子种在盆中，生长2个星期后取幼苗进行如下胁迫处理：1)干旱处理：将大豆幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上；2)盐处理：将大豆幼苗置于200mM NaCl溶液中；3)ABA处理：将大豆幼苗置于200μM的ABA溶液中；4)冷处理：将小麦幼苗置于4℃培养箱；光照培养，分别在上述各种处理后0、0.5、1、3、6、12小时取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

分别将干旱处理、盐处理、ABA处理和冷处理后0、0.5、1、3、6、12小时的样品提取总RNA，以GmAREB1 DNA为探针(序列表中的序列1)，进行Northern分析。

探针标记的具体步骤如下：

探针标记为随机六聚体引物法，每1-2张膜加入探针DNA约50-100ng(pTE-GmAREB1)和适量DNA分子量标记，加水至14.5μl，100℃煮沸变性5min后立即置于冰浴中5min，瞬时离心，然后加入下列成分，终体积25μl，于37℃反应5h以上。

5×Oligo Buffer                    5μl

Klenow Fragment(5U/μl)            0.5μl

10×Buffer                         2.5ul

BSA(10mg/ml)                       1μl

α-³²P-dCTP(10mCi/ml)              1.5μl

附：1ml 5×Oligo Buffer中含有：

160μl    H₂O

250μl    1M Tris-HCl

25μl     1M MgCl₂

5μl      1M Mercaptoethanol

500μl    2M HEPES

20μl     100mM dATP

20μl     100mM dGTP

20μl     100mM dTTP。

Northern blot分析结果见图1。图1中，A为干旱处理的样本；B为脱落酸处理的样本；C为NaCl处理的样本；D为冷处理的样本。

结果表明：在干旱胁迫10小时后GmAREB1基因表达达到高峰；在高盐(200mMNaCl)胁迫10小时后GmAREB1基因表达达到高峰。冷胁迫24小时后GmAREB1基因表达达到高峰，ABA(200uM)胁迫5小时后GmAREB1基因表达达到高峰。说明该基因受干旱、高盐、冷胁迫和ABA诱导。

实施例3、凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)

1、GmAREB1基因的原核表达

将GmAREB1基因的全长序列插入原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点中，由于pGEX-4T-1的多克隆位点前面有GST(谷胱苷肽)基因，这样GmAREB1与GST蛋白就形成了融合蛋白，将构建好的表达载体转化受体大肠杆菌BL21，通过向培养基中添加诱导物IPTG诱导融合蛋白(GmAREB1-GST)的产生，经SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的诱导表达。

按照MicroSpin GST Purification Module Kit说明书的步骤纯化GmAREB1-GST融合蛋白。

2、ABRE探针的标记

根据已知序列合成ABRE探针序列，ABRE探针序列如下：

野生型探针正义链ABRE(+)：GAAGTCCACGTGGAGGTGG

野生型探针反义链ABRE(-)：TCCCACCTCCACGTGGACT

突变型探针正义链mABRE(+)：GAAGTAACATGTTCGGTGG

突变型探针反义链mABRE(-)：TCCCACCGAACATGTTACT

使用T4多聚核苷酸激酶(T4-Polynucleotide Kinase，PNK)对ABRE片段进行(γ-³²P)dATP标记，标记体系如下：

H₂O                 18.6uL

10X PNK buffer      2.5uL

ABRE片段            1uL

T4-PNK              1uL

(γ-³²P)dATP        2uL

37℃标记30分钟，加入1uL 0.5M EDTA终止反应，65℃10分钟灭活酶，4℃备用。

3、标记的ABRE探针与纯化的GmAREB1蛋白进行结合反应

结合反应体系如下：

5X binding buffer         4uL

GmAREB1纯化蛋白           10uL

标记的ABRE探针            2uL

50％甘油                  2uL

H₂O                       2uL

5X binding buffer：

12.5mM HEPES-KOH(pH 7.6)

250mM KCl

2.5mM DTT

2.5mM EDTA

结合反应在冰上进行30分钟，反应的同时配好的SDS-PAGE胶200V进行1小时的预电泳，结合反应后加入1uL上样缓冲液(0.025％溴酚兰)进行SDS-PAGE电泳，170V电泳1-2小时后卸下电泳板，将胶放到水中，在将胶上的水吸干后压X光片检测GmAREB1蛋白与标记的ABRE探针的结合特性。

分析结果见图2，图2中A为EB染色后的胶；B为Commassie Blue染色后的胶。A中，1为野生型ABRE探针；2为野生型ABRE探针+GmAREB1-GST融合蛋白；3为突变型ABRE探针+GmAREB1-GST融合蛋白；4为突变型ABRE探针+GST蛋白；B中1’为野生型ABRE探针；2’为野生型ABRE探针+GmAREB1-GST融合蛋白；3’为突变型ABRE探针+GmAREB1-GST融合蛋白；4’为突变型ABRE探针+GST蛋白。

结果显示：只有野生型ABRE和纯化GmAREB1蛋白结合，而突变ABRE不与纯化GmAREB1蛋白结合，结果证明纯化GmAREB1蛋白与ABRE具有结合特异性，GmAREB1属于bZIP类转录因子。

实施例4、用GmAREB1基因培育耐盐胁迫植物

1、重组表达载体的构建

1)35S-GmAREB1重组表达载体的构建

以大豆铁丰8号的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和XbaI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和XbaI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV 35S启动子之后的SmaI和XbaI酶切位点之间，得到重组载体35S-GmAREB1。

引物序列如下：

5’[SmaI]5’-GGGGCCCGGGGGTCAAAAGATGAACTTCAG-3’

3’[XbaI]5’-CCCCGGGTCTAGAGGCTTCCTTCGTATAGATGTCA-3’

2)29A-GmAREB1重组表达载体的构建

以大豆铁丰8号的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和SpeI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向插入载体pBI121-rd29A中的rd29A启动子之后的SmaI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体29A-GmAREB1。其中，pBI121-rd29A是用rd29A启动子取代pBI121的CaMV 35S启动子得到的重组载体。

引物序列如下：

5’[Sma I]5’-GGGGCCCGGGGGTCAAAAGATGAACTTCAG-3’

3’[Spe I]5’-CCCTCGCACTAGTGGCTTCCTTCGTATAGATGTC-3’

2、转基因烟草的获得和鉴定

1)转基因烟草的获得

将步骤1构建的重组表达载体29A-GmAREB1、35S-GmAREB1分别用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，再用叶盘法分别将整合有29A-GmAREB1和35S-GmAREB1的根癌农杆菌EHA105转化烟草W38，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行2轮筛选，每轮筛选10-15天，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。

P3(上游引物)：5’-GGGGGTCAAAAGATGAACTTCAG-3’，

P4(下游引物)：5’-GAGGCTTCCTTCGTATAGATGTCA-3’。

对29A-GmAREB1、35S-GmAREB1转基因烟草进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得1.3Kb左右条带，结果获得转29A-GmAREB1烟草、转35S-GmAREB1烟草各15株。

同时将pBI121空载体导入烟草W38，方法同上，作为对照，获得15个株系的转空载体烟草。

筛选获得的转基因烟草用T₀代表示；

3、转GmAREB1基因植株耐盐性鉴定

将15株T₀代转29A-GmAREB1烟草植株、15株T₀代转35S-GmAREB1烟草植株、15株T₀代转空载体对照植株的3周龄苗的根系分别移入含有200mM NaCl的培养基中进行盐胁迫处理35天。观察表型并拍照同时进行存活率统计和基因表达量检测。

结果表明，盐胁迫处理35天后，15株29A-GmAREB1转基因植株中有11株在盐胁迫条件下生长正常，根系发达，叶片颜色深绿；15株35S-GmAREB1转基因植株中有10株在盐胁迫条件下生长正常，根系发达，叶片颜色深绿；所有的15株空载体转基因植株叶片均失绿、发白，由于盐离子毒害导致植株死亡。

转基因烟草耐盐性鉴定结果证明GmAREB1基因可以提高植物的耐盐性。

图3A显示的是1株29A-GmAREB1转基因植株、1株空载体转基因植株盐胁迫处理35天的照片；图3B显示的是1株35S-GmAREB1转基因植株、1株空载体转基因植株盐胁迫处理35天的照片；图3C和图3D是空载体转基因植株不进行盐胁迫处理，生长35天的照片。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARY81329

<160>2

<210>1

<211>439

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>1

Met Asn Phe Arg Asn Phe Gly Val Gly Asp Asn His Pro Thr Trp Asp

1               5                   10                  15

Ala Met His Gly Lys Thr Pro Ala Asn Asn Asn Val Thr Gly Thr Thr

            20                  25                  30

Leu Leu Arg Gln Pro Ser Thr Ile Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe

        35                  40                  45

Gln Ser Thr Met Gly Gly Ile Gly Lys Asp Phe Gly Ser Met Asn Met

    50                  55                  60

Asp Glu Leu Leu Lys Asn Ile Trp Thr Ala Gly Glu Thr Gln Ala Met

65                  70                  75                  80

Val Phe Ser Ala Val Ala Ala Ala Gly Gly Val Glu Gly His Asn Asn

                85                  90                  95

Asn Ser Asn Asn Asn Pro Ile Asn Cys Ser Gly Leu Gln Arg Gln Gly

            100                 105                 110

Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gln Lys Thr Val Glu Glu Val

        115                 120                 125

Trp Arg Asp Leu Ile Lys Glu Ser Gly Gly Glu Ala Asn Asp Gly Gly

    130                 135                 140

Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Ser Asn Pro Gln Met Gln Ala Thr Leu

145                 150                 155                 160

Gly Glu Met Thr Leu Glu Glu Phe Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg

                165                 170                 175

Glu Asp Val Pro Gln Gln Gln Gln Asn Gly Lys Pro Asn Asp Asn Gly

            180                 185                 190

Trp Phe Gly Asp Phe Pro Arg Pro Lys His Asn Asn Thr Ser Leu Leu

        195                 200                 205

Leu Gly Phe Gln Gln Pro Asn Arg Ser Asn Gly Asn Gly Asn Leu Gly

    210                 215                 220

Glu Asn Thr Asn Leu Val Ser Lys Gln Gln Pro Pro Pro Leu Ser Leu

225                 230                 235                 240

Asn Ser Asn His Ser Gln Arg Gln Ala Gln His Gln His Gln His Gln

                245                 250                 255

Gln His Pro Pro Pro Leu Phe Pro Lys Pro Ala Asn Val Thr Phe Ala

            260                 265                 270

Gly Ala Pro Thr His Leu Leu Asn Asn Ala His Gln His Ala Ser Pro

        275                 280                 285

Gly Arg Arg Gly Gly Leu Ile Gly Val Ala Ala Glu His Ser Met Asn

    290                 295                 300

Val Gly Met Val Gly Leu Ala Thr Ala Asn Val Thr Ala Ser Pro Ser

305                 310                 315                 320

Ser Lys Ile Ser Pro Asp Val Ile Thr Arg Ser Asn Asn Asn Val Asp

                325                 330                 335

Asn Ser Pro Ile Ser Pro His Tyr Val Ile Asn Arg Gly Arg Lys Phe

            340                 345                 350

Ser Ala Ile Glu Lys Val Val Glu Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys

        355                 360                 365

Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr

    370                 375                 380

Phe Glu Leu Glu Ala Glu Val Ala Lys Leu Lys Glu Leu Asn Arg Glu

385                 390                 395                 400

Leu Gln Arg Lys Gln Glu Glu Ile Met Glu Met Lys Lys Asn Lys Asp

                405                 410                 415

Leu Asp Pro Ala Cys Arg Pro Arg Ile Ser Lys Ile Gln Cys Leu Arg

            420                 425                 430

Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp

        435

<210>2

<211>1406

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>2

ggggcccggg ggtcaaaaga tgaacttcag gaactttggt gttggagata accaccccac    60

ttgggatgcc atgcatggga agacaccagc aaataataat gttactggca ctactctgct    120

gagacagccc tcaacaatat actcattgac atttgatgag tttcagagca ccatgggtgg    180

gattgggaag gatttcgggt ccatgaacat ggatgaactc ttgaagaaca tatggacagc    240

tggagagact caagccatgg tgttttcagc cgttgccgcc gcaggaggag tagaaggcca    300

taacaacaac agcaacaaca accctattaa ctgtagtggt ttgcaaagac aaggctcttt    360

gacattgcca aggactctta gtcagaaaac agttgaggag gtttggaggg acttgatcaa    420

agaaagtggt ggtgaggcca acgatggtgg aagtggtggc aatggtggct catcaaatcc    480

tcaaatgcaa gcaacattgg gagaaatgac attggaggag tttttggtga gagctggtgt    540

tgtgagagaa gatgttcccc aacaacaaca aaatggaaaa ccaaacgaca atggatggtt    600

tggtgacttt cctagaccaa aacataacaa cactagccta cttcttgggt ttcaacaacc    660

aaatagaagt aatgggaatg ggaatttggg tgagaacact aacttagttt caaaacaaca    720

acctcctcct ttatcattaa actcaaacca ctctcaaaga caagcacaac accaacacca    780

acaccaacaa catccaccac cactttttcc aaagccagca aatgtaactt ttgctggtgc    840

tcctacgcat ttgttgaaca atgctcatca acatgctagc cctggcagaa ggggagggtt    900

gattggagtt gctgctgagc attcaatgaa tgttggaatg gttggtttag ccacagctaa    960

tgtcacagct tctccctcaa gtaaaatatc accagatgta attacaagga gtaataataa    1020

tgttgataac tctccaatat caccacatta tgtaatcaac aggggaagga aattcagtgc    1080

catagagaaa gtggttgaga ggagacaaag gagaatgatt aaaaatagag aatcagcagc    1140

gagatcaagg gctcgtaagc aggcctacac tttcgaacta gaagctgaag ttgcaaaact    1200

taaggaatta aacagagaat tacaaagaaa acaggaagaa atcatggaaa tgaagaaaaa    1260

taaggatttg gaccctgcat gcagaccaag gataagtaaa atacaatgct tgagaaggac    1320

acttactgga ccatggtaga ttatgtgaat gtgagtcatt gtttcaaagt gacatctata    1380

cgaaggaagc ctctagaccc ggggaa                                         1406

Claims (10)

1、一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列1的下述bZIP结构域和核定位序列外进行取代和/或缺失和/或添加：所述bZIP结构域为自序列1的氨基末端第355-405位氨基酸残基，所述核定位序列为自序列1的氨基末端第357-360位氨基酸残基。

3、权利要求1或2所述蛋白的编码基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述蛋白编码基因为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2自5′末端第20-1336位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)其序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

5、含有权利要求3或4所述基因的表达盒或重组表达载体。

6、根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为35S-GmAREB1或29A-GmAREB1；所述35S-GmAREB1是将pBI121的SmaI和XbaI位点间的小片段取代为序列表中序列2的自5’末端的第20-1336位脱氧核苷酸得到的；所述29A-GmAREB1是将pBI121-rd29A的SmaI和SpeI位点间的小片段取代为序列表中序列2的自5’末端的第20-1336位脱氧核苷酸得到的；所述pBI121-rd29A是用rd29A启动子取代pBI121的CaMV 35S启动子得到的重组载体。

7、含有权利要求3或4所述基因的细胞系或重组菌。

8、一种培育耐逆植物的方法，是将权利要求3或4所述基因导入植物细胞中，得到耐逆植物。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求5或6所述的重组表达载体导入植物细胞中。

10、根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述耐逆植物是耐盐植物。

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