CN102905555B

CN102905555B - 可再水化的食品

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Publication number: CN102905555B
Application number: CN201180027569.1A
Authority: CN
Inventors: M.J.贝里; J.卡西; R.A.根加比舒恩; A.P.奥尔梅罗德; S.P.雷德弗恩; J.西尔瓦德; J.E.威尔金森
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 2010-06-08
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2031-05-25
Also published as: AU2011263991B2; AU2011263991A1; EA201291418A1; EP2579731B1; WO2011154253A1; US8784913B2; EP2579731A1; US20130101701A1; BR112012028277A2; CA2795033A1; ES2452527T3; CN102905555A

Abstract

干燥的可再水化的食品如在干燥的汤、干燥的饮料、早餐谷物、酸奶和干燥的调味汁中的用途是广泛的。然而，已经观察到，当干燥组分是水果和/或蔬菜时，再水化后的组分就不像干燥前的水果和/或蔬菜。也就是说，它们不再有新鲜的外观，而是褪色并缺乏硬度。这种转变是由于干燥过程中发生的细胞损伤。尤其地，据信，细胞的两亲物的插入、相变为凝胶相和膜融合使磷脂膜去稳定。本发明力图通过提供干燥的可再水化的食品等解决上述技术问题，该食品是水果、蔬菜或其部分，其再水化后具有改善的外观、质地和再水化特性。具体而言，提供了干燥的可再水化的食品，所述食品包含少于10％w/w水和至少0.02％w/w的脱水蛋白及其衍生物，所述脱水蛋白及其衍生物包含选自K,I,K,E,K,L,P,G；K,I,K,E/D,K,L/I,P,G；和K,I,K,E/D,K,L/I/T/V,P/H/S,G的氨基酸序列，其中所述干燥的可再水化的食品是蔬菜或其部分和/或水果或其部分的未破损的组织，不是种子，其中所述未破损的组织具有至少0.5毫米的最短线性尺寸，优选0.5至25的最短线性尺寸，更优选为0.5至10毫米。还提供了包含干燥的可再水化的食品的食品产品以及用于制备干燥的可再水化的食品的方法。

Description

可再水化的食品

本发明涉及干燥的可再水化的食品，尤其是作为水果、蔬菜或其部分的食品。本发明还涉及所述食品的制备方法和包括上述干燥的可再水化的食品的食品产品，如干燥的汤、干燥饮料、早餐谷物、酸奶(yoghurt)和干燥调味汁。

干燥的可再水化的食品例如在干燥的汤、干燥饮料，早餐谷物、酸奶和干燥调味汁中的应用是普遍的。然而，已经观察到，当干燥组分是水果和/或蔬菜时，再水化后的组分不像干燥前的水果和/或蔬菜。也就是说，它们不再有新鲜的外观，而是褪色并且缺乏硬度。这种转化是由于干燥过程中发生的细胞损伤。尤其地，据信，通过细胞两亲物的插入、相变为凝胶相和膜融合，磷脂膜被去稳定。

Serrano等(Food Sci. Tech. Int., 9(3), 157-161 (2003))讨论了对于食品脱水的潜在应用，公开了已经观察到在种子胚胎发生的成熟过程期间以及在经历水胁迫的所有植物组织中胚胎发生晚期丰富的(LEA)蛋白是高水平丰富的。LEA蛋白包括脱水蛋白等。作者指出，LEA蛋白在干燥期间可以通过与渗压剂相似的机制使蛋白和膜稳定。这是通过赋予细胞结构的优先水化，然后实际上在干燥期间替换水。渗压剂也有利于渗透调节，并在干燥期间充当有效的羟自由基清除剂。作者还公开，三种生物系统似乎一致作用以达到干燥耐受性：参与渗压剂合成的酶；专门用于膜和蛋白的干燥保护的蛋白(LEA蛋白)；以及抗氧化酶和分子。

本发明力图通过提供干燥的可再水化的食品等解决上述技术问题，该食品是水果、蔬菜或其部分，其再水化后具有改善的外观、质地和再水化特性。

发明概述

在本发明的第一个方面，提供了干燥的可再水化的食品，所述食品包含少于10％w/w水和至少0.02％w/w的脱水蛋白及其衍生物，所述脱水蛋白及其衍生物包含选自K,I,K,E,K,L,P,G；K,I,K,E/D,K,L/I,P,G；和K,I,K,E/D,K,L/I/T/V,P/H/S,G的氨基酸序列，并且其中所述干燥的可再水化的食品是蔬菜或其部分和/或水果或其部分的未破损的组织，且不是种子，其中所述未破损的组织具有至少0.5毫米的最短线性尺寸，优选0.5-25毫米的最短线性尺寸，更优选为0.5-10毫米。

术语“可再水化的”是指食品可以再水化至完全水化的蔬菜或其部分和/或水果或其部分的水含量的至少50％w/w、优选至少60％w/w、最优选至少70％w/w。优选地，术语“可再水化的”是指食品可以再水化至完全水化的蔬菜或其部分和/或水果或其部分的水含量的不超过99％w/w、优选不超过97％w/w、最优选不超过95％w/w。

其衍生物包括糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白，其中截短的脱水蛋白仍然包含关键的K区段(见下文)。

通过逗号分隔氨基酸序列中的相邻位置，并且最频繁观察到的氨基酸第一个列出且单个位置处的每个氨基酸用正斜杠分隔。

本发明人惊讶地观察到，通过将水果和/或蔬菜组织中脱水蛋白浓度升高至高于天然发现的浓度，获得再水化后具有改善的外观、质地和再水化特性的干燥的可再水化的食品。虽然现有技术的确建议LEA蛋白可以在保护植物免受水胁迫中发挥作用，令人惊讶的是，单独使用脱水蛋白导致了干燥的再水化水果和/或蔬菜的上述性能的这种改善，因为三种生物系统似乎一致作用以达到干燥耐受性。

根据Roberts等(The Plant Cell, 5, 769-780 (1993))提供的数据，已经计算出，种子可以包含约0.5％的干重水平的脱水蛋白。然而，关于该水平为什么这么高在文献中没有一致意见。如此，种子不是本发明的主题，因此将其排除。

优选地，干燥的可再水化的食品包含0.02-20，优选0.1-5，最优选0.2-2.5％w/w的脱水蛋白及其衍生物。脱水蛋白的天然水平低于0.02％w/w。脱水蛋白及其衍生物优选具有1-150，优选5-100，最优选5-50kD的分子量。优选更低分子量的脱水蛋白及其衍生物，因为它们更容易注入水果或蔬菜组织。

脱水蛋白及其衍生物优选源自野茶树(Camellia sinensis)、连翘属(Forsythia)和卷柏属(Selaginella)，更优选源自野茶树，尤其是具有与SEQ.ID NO. 1(见图3b)至少80％相同的，优选与之至少90％、95％或99％相同的氨基酸序列。据观察，当茶树组织枯萎时，SEQ.ID NO.1的脱水蛋白上调47倍，因此假定，这种特定脱水蛋白在干燥过程中保护植物组织中具有重要作用。根据下文发明详述中所述的结果，随后证明了这一情况。

另一种优选的源自野茶树的脱水蛋白(截短的形式)具有与SEQ.ID NO.2(见图4b)至少80％相同，优选与之至少90％、95％或99％相同的氨基酸序列。

另一种优选的源自野茶树的脱水蛋白(另一种截短的形式)具有与SEQ.ID NO.3(见图5b)至少80％相同，优选与之至少90％、95％或99％相同的氨基酸序列。

据认为，仍包含关键的K区段(见下文)并被标记为SEQ.ID NO.2和3的茶脱水蛋白SEQ.ID NO.1的截短形式将更加容易并深入地注入水果和/或蔬菜组织，因此提供了与全长形式(SEQ.ID NO：1)相比增强的保护性活性。截短的形式也可以具有更高的功能活性，因为会去除蛋白的一些调控区。

可再水化的食品可以额外包括选自海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、棉子糖、酶抗氧化剂或非酶活性氧种类清除剂的化合物。认为上述种类在水果或蔬菜组织经历脱水时可以通过各种不同的机制保护水果或蔬菜组织的完整性。例如，认为糖在干燥期间首先通过诱导细胞结构的优先水化，然后通过实际替代水以保护细胞结构而保护细胞膜。另外，糖可以作为有效的羟自由基清除剂起作用而控制干燥期间看到的活性氧种类的增加的产生。脱水后，损害了细胞的电子传输链，因此产生渐增量的活性氧中间体。因此，期望酶抗氧化剂或非酶活性氧种类清除剂改善水果或蔬菜组织以减少的细胞损伤抵抗干燥的能力。合适的酶抗氧化剂包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶。合适的非酶活性氧种类清除剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽和类胡萝卜素。

蔬菜可以选自菠菜、西兰花、洋葱、茄子、小胡瓜、土豆、南瓜、蘑菇、胡萝卜、茶、芦笋、萝卜、韭菜、甜菜、花椰菜、块根芹、朝鲜蓟、薄荷、百里香、牛至、迷迭香、欧芹、鼠尾草、细香葱、马郁兰、罗勒、月桂叶、龙蒿、旱芹和大蒜，水果可以选自柠檬、覆盆子、红醋栗、黑莓、悬钩子、蓝莓、草莓、菠萝、香蕉、桃、杏、荔枝、苹果、梨、番茄、辣椒、黄瓜和芒果。

在本发明的第二方面，提供了食品产品，所述食品产品包括根据本发明的第一方面的干燥的可再水化的食品。所述食品产品可以选自干燥的汤、干燥的饮料、早餐谷物、酸奶和干燥的调味汁。所有上述食品产品的特征在于包括干燥的水果或蔬菜组分，该组分在使用时再水化。

在本发明的第三方面，是根据本发明的第一方面的干燥的可再水化的食品的制备方法，该方法包括以下步骤：

（a）用脱水蛋白及其衍生物注入不包括种子的蔬菜或其部分或水果或其部分以产生注入的食品，所述脱水蛋白及其衍生物包括选自K,I,K,E,K,L,P,G；K,I,K,E/D,K,L/I,P,G；和K,I,K,E/D,K,L/I/T/V,P/H/S,G的氨基酸序列；和

（b）干燥注入的食品从而产生根据本发明的第一方面的干燥的可再水化的食品。

本发明的第三方面的令人惊讶的观察结果是下列事实，通过将脱水蛋白简单扩散入水果和/或植物组织，获得了脱水后具有改善的外观、质地和再水化特性的干燥的可再水化的食品。

优选在真空下进行本发明的第三方面的步骤(a)。可以预期，在真空下，注入更快。可以在3-70，优选10-50，最优选15至30℃的温度进行本发明的第三方面的步骤(a)。在太低的温度，注入过程太慢，而在太高的温度，组织结构被破坏。

在本发明的第四方面，提供了根据本发明的第一方面的干燥的可再水化的食品的制备方法，该方法包括以下步骤：

（a）将基因克隆进植物表达载体从而产生修饰的植物表达载体，其中所述基因编码脱水蛋白及其衍生物，其中，所述脱水蛋白及其衍生物包括选自K,I,K,E,K,L,P,G；K,I,K,E/D,K,L/I,P,G；和K,I,K,E/D,K,L/I/T/V,P/H/S,G的氨基酸序列；

（b）通过植物转化将修饰的植物表达载体引入目标作物从而产生转基因的目标作物；

（c）生长转基因的目标作物从而表达脱水蛋白及其衍生物；并且然后

（d）干燥转基因的目标作物从而产生根据本发明的第一方面的干燥的可再水化的食品。

在本发明的第五方面，提供了具有与SEQ.ID NO.1相同的氨基酸序列的脱水蛋白及其衍生物。

在本发明的第六方面，提供了具有与SEQ.ID NO.2相同的氨基酸序列的脱水蛋白及其衍生物。

在本发明的第七方面，提供了具有与SEQ.ID NO.4至少80％相同，优选与之至少90％、95％或99％相同的氨基酸序列的脱水蛋白及其衍生物。

附图简要说明

现在将参考下列附图示例本发明，其中：

图1示出显示保守的序列基序的概括的脱水蛋白分子的特征结构，其中Y区段通常位于朝向氮末端，Ф区段是主要由甘氨酸和极性氨基酸组成的重复区域，S区段包含一片(a trace of)可磷酸化丝氨酸残基，以及K区段富含赖氨酸且构成推定的两亲性α-螺旋形成结构域(字母序列是指相应的氨基酸序列)；

图2显示通过DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱纯化后鳞叶卷柏脱水蛋白级分的十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)板，其中列(1)是分子量标记物(千道尔顿)，列(2)是总鳞叶卷柏提取物，列(3)-(15)是用0.02 M:1 M KCl梯度洗脱的提取物的级分(箭头表明脱水蛋白条带的位置)；

图3在图3a中以示意图形式、在图3b中以核苷酸和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的形式显示茶脱水蛋白基因；

图4在图4a中以示意图形式、在图4b中以核苷酸和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的形式显示截短形式的图3的茶脱水蛋白(SEQ.ID NO.1的截短体122-201)；

图5在图5a中以示意图形式、在图5b中以核苷酸和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的形式显示截短形式的图3的茶脱水蛋白(SEQ.ID NO.1的截短体163-201)；

图6显示连翘脱水蛋白基因的核苷酸和推导的氨基酸序列(SEQ.ID NO.4)；

图7显示重组茶脱水蛋白的SDS-PAGE凝胶板，其中箭头表示脱水蛋白融合蛋白条带的位置，列(1)是分子量标记物(千道尔顿)，列(2)是IPTG诱导的具有pDEST 17-脱水蛋白构建体的大肠杆菌的细胞裂解液上清液，列(3)是在加样后从Ni-NTA柱洗脱的未结合的蛋白，列(4)-(8)是连续柱洗涤后洗脱的污染的蛋白，以及列(9)-(15)是洗脱缓冲液应用后收集的级分；

图8显示重组茶脱水蛋白(364-606)的SDS-PAGE凝胶板，其中箭头表示脱水蛋白融合蛋白条带的位置，列(1) 是分子量标记物(千道尔顿)，列(2) 是IPTG诱导的具有pDEST 17-脱水蛋白构建体的大肠杆菌的细胞裂解液上清液，列(3) 是在加样后从Ni-NTA柱洗脱的未结合的蛋白，列(4)-(8) 是连续柱洗涤后洗脱的污染的蛋白，以及列(9)-(15) 是洗脱缓冲液应用后收集的级分；

图9显示重组茶脱水蛋白(487-606)的SDS-PAGE凝胶板，其中箭头表示脱水蛋白融合蛋白条带的位置，列(1) 是分子量标记物(千道尔顿)，列(2) 是IPTG诱导的具有pDEST 17-脱水蛋白构建体的大肠杆菌的细胞裂解液上清液，列(3) 是在加样后从Ni-NTA柱洗脱的未结合的蛋白，列(4)-(8) 是连续柱洗涤后洗脱的污染的蛋白，以及列(9)-(15) 是洗脱缓冲液应用后收集的级分；

图10显示重组连翘属脱水蛋白的SDS-PAGE凝胶板，其中箭头表示脱水蛋白融合蛋白条带的位置，列(1) 是分子量标记物(千道尔顿)，列(2) 是IPTG诱导的具有pDEST 17-脱水蛋白构建体的大肠杆菌的细胞裂解液上清液，列(3) 是在加样后从Ni-NTA柱洗脱的未结合的蛋白，列(4)-(8) 是连续柱洗涤后洗脱的污染的蛋白，以及列(9)-(15)是洗脱缓冲液应用后收集的级分；

图11显示(A)用水、(B)鳞叶卷柏脱水蛋白和(C)从毕赤酵母表达的茶脱水蛋白注入后完全干燥并再水化的红辣椒；

图12显示用各种脱水蛋白或水和对照注入的再水化的红辣椒组织片的长度对宽度的图，其中“Res Plt”是指实施例1的鳞叶卷柏脱水蛋白，“TD”是指实施例2的完全的茶脱水蛋白，“TD(364-606)”是指实施例2的截短的茶脱水蛋白，“连翘属”是指实施例2的连翘属脱水蛋白，“生的(raw)”是指已经根据实施例5干燥并再水化的生的红辣椒组织片，“水-VI”是指已经根据实施例5用水真空注入、干燥并然后再水化的生的红辣椒组织片，“完全生的”是指生的红辣椒组织片；

图13显示没有被注入、干燥并再水化(图13a)，没有被注入、但是根据本实施例6干燥并再水化(图13b)，根据实施例6被注入水、干燥并再水化(图13c)；以及根据实施例6用鳞叶卷柏脱水蛋白注入、干燥并再水化(图13d)的青椒(辣椒)片的负荷(N)对距离(mm)图；

图14显示在干燥(左手图像)和然后再水化(中间图像)之后用毕赤酵母表达的茶脱水蛋白(上面图像)或水(下面图像)注入的菠菜叶子，以及中间图像中显示一片叶子的部分的光学显微镜图像(右手图像)；

图15显示在(a)用台盼蓝染色的活洋葱表皮中、和(b)已经热烫然后用台盼蓝染色的洋葱表皮中的可见光显微镜图像(10倍放大)；和

图16显示在(a)实施例2的全长茶脱水蛋白，(b)去离子水，(c) bis-tris海藻糖缓冲液和(d) BSA的bis-tris海藻糖缓冲液溶液注入后用台盼蓝的摄取染色的干燥并再水化的洋葱表皮的可见光显微镜图像(10倍放大)。

发明详述

脱水蛋白基因由植物物种间表现高水平的保守性的独特结构域组成。图1显示脱水蛋白的概括结构的示意图。每种蛋白是由K、Φ、S和Y区段的多个拷贝组成。例如，每个多肽K区段可以出现最高11次，而Y区段通常在N-末端附近的1-3个串联重复中被发现。四个主要区段被其它保守性更差并且通常重复的区域所间插。在进化过程中K、Φ、S和Y区段的严格保守表明，它们限定了这些蛋白中的功能单元。脱水蛋白的特征可在于在羧基末端附近发现的K,I,K,E,K,L,P,G氨基酸序列，该序列通常在蛋白内是重复的。这种氨基酸序列形成K区段的部分。更常见地，从可得的公开数据的比对显现的脱水蛋白的羧基末端肽为：E, K, K, G/S, I/V/M/L/F, M/L/V, D/E, K, I, K, E/D, K, L/I, P, G。

实施例1：复苏植物鳞叶卷柏(Selaginella lepidophylla)脱水蛋白的提取和纯化

用脱水蛋白抗体探测来自鳞叶卷柏的蛋白提取物，以检测鳞叶卷柏((一种复苏植物，这是已知显示显著的耐旱性的植物)组织中的脱水蛋白样蛋白。一旦被鉴定，通过离子交换色谱纯化该蛋白。

a) 从鳞叶卷柏组织制备全蛋白提取物

在咖啡研磨机中将已经在室温脱水5小时的完全水化的整个鳞叶卷柏植物(所以它是部分脱水的)研磨至面粉样稠度。将该粉末以200 g/L的浓度悬浮在包含25mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、20 mM NaCl和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的预冷(4℃)的pH 6.0的提取缓冲液中。将悬浮液在4℃搅拌3小时，然后在搅拌机中混合1分钟，然后将匀浆在4℃进一步搅拌12小时。通过在4℃在10,000 rpm离心30分钟而沉淀不溶性物质。随后将上清过滤通过两个单独层的粗棉布。在偶尔摇动的情况下在70℃孵育10分钟而变性非热稳定的蛋白。该溶液在冰上迅速冷却，过滤通过Whatman 1号纸。通过30,000 rpm离心1小时而沉淀任何剩余的不溶性物质。

b) 通过蛋白质印迹检测鳞叶卷柏全蛋白提取物中的脱水蛋白

将约20μL等份的鳞叶卷柏总蛋白提取物加样至电泳凝胶(12％ Novex双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(bis-tris))，在MES和十二烷基硫酸钠(SDS)跑胶缓冲液中在200V跑胶约40分钟。在30 V将凝胶上的蛋白印迹到硝酸纤维素片1小时。通过在含有5%奶粉的三(羟甲基)氨基甲烷(tris)缓冲盐水(TBS)(封闭缓冲液)中浸没1小时来封闭硝酸纤维素上的未结合位点。然后在于封闭缓冲液中1:1000稀释的兔多克隆脱水蛋白抗血清(Stressgen Bioreagents)中孵育印迹1小时。用包含0.05％聚山梨醇酯20(吐温20)的TBS四次连续5分钟洗涤之后，将硝基纤维素浸泡在碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔抗体(Invitrogen)中。用包含0.05％聚山梨醇酯20(吐温20)的TBS四次连续5分钟洗涤之后，通过加入5 mL 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/硝基蓝四唑(BCIP/NBT)溶液(Sigma)检测偶联物结合的脱水蛋白。

c) 从鳞叶卷柏组织全蛋白提取物纯化脱水蛋白。

在10mM tris.HCl、1mM乙二醇四乙酸(EGTA)、1mM二硫苏糖醇(DTT)，pH 8.0的缓冲液中在4℃过夜透析20 mL鳞叶卷柏总蛋白提取物。用500mL相同缓冲液平衡20 mL基于二乙氨基乙基交联的琼脂糖的离子交换柱(DEAE-Sepharose CL-6B)。透析过的提取液以约每秒1滴的速率通过该柱。添加样品之后，用20ml柱缓冲液洗涤该柱。然后通过应用100mL0.02M:1M KCl梯度以4mL级分洗脱蛋白。通过十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳鉴定包含纯脱水蛋白的级分，如图2中所示，并合并级分9-15(包含纯的脱水蛋白)。

实施例2：分离野茶树脱水蛋白cDNA、克隆全长和截短的脱水蛋白序列以及在大肠杆菌中表达并纯化重组的脱水蛋白

该过程涉及以下步骤：

（a）从枯萎和未枯萎的茶芽(野茶树)构建互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库；

（b）选择仅仅在枯萎的cDNA文库中存在并且由47个独立的cDNA克隆(多于任何其它被检测的脱水蛋白)所代表的茶脱水蛋白重叠群的cDNA；

（c）将选择的脱水蛋白cDNA序列克隆进大肠杆菌(E.coli)表达载体pDEST17并转化进大肠杆菌；

（d）在培养中繁殖转化的大肠杆菌并诱导表达相应的茶脱水蛋白；

（e）裂解大肠杆菌细胞，用镍离子-氮川三乙酸树脂(Ni-NTA)纯化表达的脱水蛋白；以及

（f）在使用前用水透析该纯化的脱水蛋白。

从枯萎的茶芽分离的总RNA

收获来自野茶树品种assamica的茶芽(两片叶和一个芽)，枯萎19小时(在部分密封的塑料袋中)。按照制造商的说明书使用植物RNA分离试剂盒(Qiagen)分离总核糖核酸(RNA)。

从mRNA合成cDNA以形成cDNA文库

按照制造商的说明书使用多聚腺苷酸分离试剂盒(Qiagen)从500μg总RNA纯化mRNA。将5μg多聚腺苷酸-mRNA分子以及2.8μg包含Xho1限制位点的多聚腺苷酸接头引物(Stratagene)加热至72℃5分钟，然后在冰上骤冷2分钟。在室温下初始孵育10分钟之后，用在1×RT缓冲液(Stratagene)中的75单位的逆转录酶(来自Stratagene的Stratascript RT)、2.5 mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(包括脱氧腺苷三磷酸(dATP)、胸苷三磷酸(dTTP)、5-甲基脱氧胞苷三磷酸和脱氧鸟苷三磷酸(dGTP))(Amersham-Pharmacia)和40单位的核糖核酸酶(RNAse)阻断剂(Stratagene)在50μL反应中在42℃逆转录mRNA 60分钟。

通过添加11μL DNA聚合酶1(9单位/μl)(Stratagene)、20μL10x第二链合成缓冲液(Stratagene)、6μL dNTP(40 mM)(Amersham-Pharmacia)和2μL RNAse H(1.5单位/μL)(Stratagene)在200μL反应中在16℃用45μL的第一链合成反应合成第二链cDNA 150分钟。通过添加20.7μL dNTP(10mM)和1.8μL克隆的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)(在超嗜热古细菌激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)中发现的酶)(2.5单位/ μL)而在72℃钝化180μL的第二链合成反应30分钟。通过用等体积的1:1 v/v酚/氯仿提取一次并用等体积的氯仿提取一次，然后用0.1体积的3M乙酸钠溶液(pH 5.2)和2体积的乙醇在-20℃沉淀cDNA过夜而终止反应。将cDNA重悬于9μL EcoR1(从大肠杆菌菌株分离的核酸内切酶)连接物(Stratagene)中，并用4单位的T4 DNA连接酶(Stratagene)(T4是大肠杆菌的噬菌体)在1×连接酶缓冲液(Stratagene)+ 1 mM 核糖核苷酸ATP(rATP)(Stratagene)中在8℃孵育过夜。通过加热至70℃30分钟，然后在冰上骤冷2分钟而终止连接反应。然后通过添加1μL T4多核苷酸激酶(10单位/μl)(Stratagene)、1μl连接酶缓冲液(10x)和1 μl rATP (10mM)而在22μl反应中在37℃使cDNA末端磷酸化30分钟。通过使反应加热至70℃30分钟而终止磷酸化反应。然后使用标准的分子生物学方法用Xho 1限制性酶(Stratagene)消化cDNA。通过使用作为柱缓冲液的1×STE(100mM NaCl，20mM三(羟甲基)氨基甲烷- HCL (pH 7.5), 10mM EDTA)(Stratagene)使cDNA通过1mL(平床体积)柱(来自Clontech的Chroma Spin-400)而将cDNA按大小分级分离为12 x 100 μL级分。然后，在溴化乙锭-1.2％琼脂糖三(羟甲基)氨基甲烷-硼酸盐-EDTA(TBE)电泳凝胶(用Sigma试剂在内部制备)上使5μL的每个级分可视化。然后合并包含cDNA的前四个级分，乙醇沉淀并重悬于10μL 10mM三(羟甲基)氨基甲烷(pH7.6)中。

用在1×连接缓冲液+1 mM rATP中的2单位T4 DNA连接酶在5 μL反应中在12℃将10 ng的合并的cDNA连接进20 ng pBluescript SK+ Xho1/EcoR1消化的载体中过夜。然后，根据制造商的说明书将cDNA文库转化进XL10-Gold 超感受态细胞(Stratagene)中。估计初始cDNA文库的大小为250,000个克隆，平均插入物大小为1072bP(碱基对)。手工挑取2592个克隆并制备DNA用于测序。

扩增cDNA用于测序

菌落在225 r.p.m.和37℃在包含100μg/mL羧苄青霉素(Sigma)的2.5 mL 2TY肉汤(每升16g胰蛋白胨、10g NaCl、10g酵母提取物(pH 7.3)) (用Sigma试剂在内部制备)中生长过夜。按照制造商的说明书使用montage质粒小规模制备(96)试剂盒(Millipore)分离质粒DNA。然后按照制造商的说明书使用PicoGreen DNA定量试剂盒(Molecular Probes BV)定量DNA并稀释至50 ng /μL。

表达序列标签的测序、重叠群的编译和同系物的鉴定

根据标准的荧光双脱氧测序方法用5 μL 0.1μg/μL的模板DNA和1μl 1 pmol/μL的引物在Applied Biosystems Genetic Analyser 3100上进行DNA测序。对总共1971个表达序列标签(EST)克隆进行测序，这些中的1772个产生了良好质量的序列数据。将这些EST序列编译成重叠群。通过对以下EMBL公共数据库'plantdna'、'em_pl'、'emnew_pl'、'em_est_pl'、'em_gss_pl'、'em_nonpl'、'emnew_nonpl'、'em_est_nonpl'和'em_gss_nonpl'进行blasting而用这些重叠群的每个的共有序列鉴定基因功能。使用TblastX和blastN搜索程序，将约500,000个结果解析到数据库中。对于每个茶基因鉴定单一的(最好注释的)同源物(对于单一EST基因是自动的)。

由47个独立的cDNA克隆代表的单一重叠群表现出与AF220407(河岸葡萄(Vitis riparia)脱水蛋白样蛋白(Dhn) mRNA)的显著的同源性(期望值3e-11)。茶脱水蛋白表现出与脱水蛋白家族的成员相关联的所有典型的性状。该序列包含N-末端Y区段、S区段、C-末端附近的Φ区段和两个K区段，分别示意性且事实上地(SEQ. ID. 1)如图3a和3b中所示。没有其它单一重叠群代表如此多独立的cDNA克隆。

将全长的和截短的茶脱水蛋白克隆进pDEST17表达载体

根据Gateway Expression System (Invitrogen)说明书产生全长野生型茶脱水蛋白和两个截短的茶脱水蛋白。通过使用包含12 attB核苷酸的脱水蛋白模板特异性引物(Invitrogen)(见表1)，在两步骤的聚合酶链式反应(PCR)过程中，将attB序列(来自大肠杆菌的工程化的外源区域)(Invitrogen)加入cDNA载体(来自Invitrogen的pBluescript)的脱水蛋白序列的任一端。在全长的和截短的茶脱水蛋白序列周围设计特异性引物以产生全长或截短的DNA中的任一种。第二步将通用attB序列(Invitrogen)加入全长的或截短的茶脱水蛋白序列以允许它被插入pDONR 221载体(Invitrogen)中。然后将pDONR 221载体与pDEST17细菌表达载体(具有T7启动子和核糖体结合位点)(Invitrogen)重组，pDEST17细菌表达载体编码组氨酸残基，组氨酸残基用于加入脱水蛋白以允许蛋白的纯化。

设计茶脱水蛋白截短体(脱氧核苷酸编号364-606)以包含蛋白的C-末端的Φ和两个K区段。高度保守的K区段结构域被认为对于脱水蛋白活性是至关重要的。较小的茶脱水蛋白截短体(脱氧核苷酸编号487-606)仅仅由C-末端的Φ和一个K区段组成。图4a和5a分别显示每种茶叶脱水蛋白截短体的图示的核苷酸序列，图4b和5b显示每种茶叶脱水蛋白截短体的实际的核苷酸和推导的氨基酸序列(分别为SEQ. ID. 2和3)。

分离连翘(Forsythia suspensa) 脱水蛋白cDNA 并将其克隆进pDEST17

除了茶脱水蛋白外，通过对从连翘树皮中分离的多聚腺苷酸RNA的实时聚合酶链式反应(RT-PCR)而分离另一种脱水蛋白基因。N-末端的连翘属序列的缺乏意味着需要另一种策略来克隆连翘属脱水蛋白。从氨基酸序列数据鉴定了与脱水蛋白具有同源性的短肽T,D/E,E,Y,G,N,P,V,Q,H。这种短肽序列的存在连同文献中的数据，例如Close (Physiologica Plantarum, 100, 291-296 (1997))的表1中公开的被子植物脱水蛋白的保守的氨基酸序列，提供了克隆连翘属脱水蛋白的另一种方法。为了实现这一目标，根据Close (Physiologica Plantarum, 100, 291-296 (1997))，设计针对‘Y-区段’脱水蛋白结构域T/V,D,E,Y,G,N,P(见图1)的两条简并的正向引物(FOR-D4和FOR-D5)。它们会说明苏氨酸和缬氨酸之间的N-末端共有区域的残基的变化。因此，引物FOR-D4 (ACIGAYGARTAYGGIAAYCC) (SEQ. ID. 5)利用苏氨酸作为第一个氨基酸，而FOR-D5 (GTIGAYGARTAYGGIAAYCC) (SEQ. ID. 6) 利用缬氨酸作为第一个氨基酸。根据Close (Physiologica Plantarum, 100, 291-296 (1997))设计针对‘K-区段’结构域(E,K,K,G,I,M,D,K,I,K,E,K,L,P,G) (见图1)的反义引物FOR-R2 (ARYTTYTCYTTDATYTTRTCCAT) (SEQ. ID. 7)。在上述的引物序列中，字母“I”代表肌苷(其与任何碱基结合)，在随附的格式化的序列表中已经被“N”替代，这导致和肌苷相同的技术效果。然后，使用从连翘属树皮提取的总的多聚腺苷酸化的RNA作为模板，通过RT-PCR，使用这些引物来合成连翘属脱水蛋白cDNA序列。然后设计引物从而使用GIBCO 5’ RACE (cDNA末端的快速扩增) 系统试剂盒2.0版(Life Technologies)来捕获连翘属cDNA的3'和5'末端。

将连翘属cDNA插入载体(pGEM^?-T Easy载体，来自Promega)，并用Gateway Expression System (Invitrogen)克隆进如上所述的pDEST17。图6显示连翘属核苷酸和推导的氨基酸序列。表1显示了用于将连翘属脱水蛋白序列克隆进pDEST17的引物。

表1：用于产生脱水蛋白序列侧翼的attB(来自大肠杆菌的工程化的外源区域)重组目标位点的聚合酶链式反应(PCR)引物

* 12attB2 TD也被用作茶脱水蛋白(364-606)和茶脱水蛋白(487-606)的反向引物。

重组脱水蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

pDEST 17细菌表达载体将6个连续的组氨酸残基加至表达的蛋白的C-末端。通过经过组氨酸标签结合镍亲和性基质(来自Invitrogen的Pro-Bond Purification System的Ni-NTA)，组氨酸标签允许从细胞裂解物的可溶级分快速分离蛋白。用Pro-Bond Purification System (Invitrogen) 从大肠杆菌中纯化pDEST 17中表达的组氨酸融合蛋白。下面提供进一步的细节。

a) 细胞培养和蛋白表达

将携带各种脱水蛋白序列的pDEST 17转化进大肠杆菌菌株BL21 Star (DE3) One Shot (Invitrogen)(设计用于改善基于T7启动子的表达系统中的蛋白产量的化学感受态BL21宿主)。将具有pDEST 17脱水蛋白构建体的细胞涂布在包含100μg/mL氨苄青霉素的溶原性肉汤(LB)琼脂平板上并37℃孵育过夜。用这些细胞的单一集落接种2.5mL包含100μg/ mL氨苄青霉素的LB培养基并在37℃振摇过夜。使用2.5mL培养物接种50mL包含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，并在37℃振摇直到培养物的A₆₀₀(在600 nm处的吸光度)为0.6。通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM而诱导脱水蛋白表达。在相同条件继续生长另外5小时。通过在10,000 rpm离心10分钟而收获细胞并保存在-20℃直到需要时。

b) 细胞裂解

将细胞团块剧烈地重悬于8mL结合缓冲液(NaPO4, 0.5 M NaCl, 10 mM咪唑pH 8.0)中。添加蛋白酶抑制剂苯甲脒至终浓度为1 mg/mL。通过五个连续的周期的液氮中速冻、随后在30℃水浴中快速解冻而进行裂解。添加脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase I(降解双链和单链DNA和染色质的非特异性核酸内切酶))至最终浓度为1μg/mL并将裂解液在冰上孵育30分钟。通过在4℃在10,000 rpm离心1小时而沉淀不溶性物质。

c) 蛋白纯化和分析

将8 mL大肠杆菌裂解液上清加入2mL已经用结合缓冲液预先平衡的镍离子-氮川三乙酸树脂(Ni-NTA)。在室温轻度搅动孵育混合物一小时以允许组氨酸标签化蛋白的结合。通过在800 g (重力的800倍)离心浆液1分钟并滗去上清而去除可溶级分中未结合的物质。用五次连续应用洗涤缓冲液(50 mM NaPO4, 0.5 M NaCl, 100 mM咪唑)而去除进一步的污染。通过加入8ml洗脱缓冲液(50 mM NaPO4, 0.5 M NaCl, 250 mM咪唑)从树脂洗脱组氨酸标签化蛋白。在1mL等份中收集级分并通过SDS-PAGE凝胶电泳分析(图7至图10)。使用NuPAGE电泳系统(Invitrogen Ltd)进行SDS-PAGE凝胶电泳。相应地合并包含脱水蛋白的级分。使用Bradford蛋白测定(Bio-Rad)计算相对蛋白浓度。

实施例3：重组脱水蛋白在毕赤酵母中的表达及其纯化

由Invitrogen Corporation (1600 Faraday Avenue, Carlsbad, CA 92008, USA) 作为蛋白的完全资助付费生产商，进行全长茶脱水蛋白在毕赤酵母中的表达及随后的纯化。

实施例4：脱水蛋白注入的影响 - 再水化组织的观察

制备红辣椒(辣椒属)片(1cm³)并完全浸没在0.1 mg/mL脱水蛋白溶液(从实施例1获得的鳞叶卷柏脱水蛋白或从实施例3获得的毕赤酵母表达的茶脱水蛋白)中，在室温真空注入两小时。还制备了水注入的片作为对照。在60℃将注入的植物组织干燥六小时并通过在水中室温浸泡过夜而进行再水化。

图11显示了与水注入的对照(A)相比，用鳞叶卷柏来源的脱水蛋白(B)和从毕赤酵母表达的茶脱水蛋白(C)注入的红辣椒片的更大的再水化。

实施例5：脱水蛋白注入的影响 - 再水化组织的尺寸

为了评估不同的脱水蛋白对红辣椒(辣椒)组织尺寸的影响，再水化后，用0.5 mg/mL的脱水蛋白水溶液或单独的水在室温真空渗透红辣椒片4小时，在37℃干燥16小时，在室温在水中再水化4-5小时。通常，用圆的1 cm直径的软木打孔器制备的10-15片植物组织用于每种脱水蛋白。作为对照，根据本实施例也干燥并再水化生红辣椒组织片。再水化的样品的长度和宽度如图12所示，其中“Res Plt”是指实施例1的鳞叶卷柏脱水蛋白，“TD”是指实施例2的完全的茶脱水蛋白，“TD(364-606)”是指实施例2的截短的茶脱水蛋白，“连翘属”是指实施例2的连翘属脱水蛋白，“生的”是指已经根据本实施例干燥并再水化的生的红辣椒组织片，“水-VI”是指已经根据本实施例用水真空注入、干燥并然后再水化的生的红辣椒组织片，“完全生的”是指生的红辣椒组织片。

与没有脱水蛋白注入的对照相比，再水化组织的测量的尺寸表明了脱水蛋白注入的组织的更大的再水化。事实上，脱水蛋白注入的组织的尺寸接近于没有注入、干燥或再水化处理的新鲜片的尺寸。

实施例6：脱水蛋白注入的影响 - 再水化组织的机械特性

用0.05 mg/mL的水溶液的形式的实施例1的鳞叶卷柏脱水蛋白或水真空注入(在室温过夜)应用圆形1 cm直径的软木打孔器制备的10-15片青椒(辣椒属)。然后在45℃将注入的青椒片干燥7.5小时并再水化(在室温3小时)。然后用Dartec Servohydraulic机械试验机使再水化片进行压缩试验以评价它们的机械性能。具体而言，以40 mm/sec的十字头速度将片压缩至2 mm的高度，测定为了做到这一点的负荷(N)。图13中示出两种注入的(水注入片的图13c和鳞叶卷柏脱水蛋白注入片的图13d)变体的结果，连同没有被注入但是根据本实施例干燥并再水化的生的青椒片的对照(图13b)和没有被注入、干燥并再水化的生的青椒组织片(图13a)。

与未注入和水注入的对照相比，再水化的鳞叶卷柏脱水蛋白注入片在压缩期间需要更大的力。这表明，与再水化的对照相比，再水化的脱水蛋白注入片更坚固。脱水蛋白的注入给出了与没有注入、干燥并再水化的生的青椒片的那些最接近的结果。

实施例7：脱水蛋白注入的影响 – 叶组织的观察

将菠菜叶浸泡在根据实施例3的毕赤酵母表达的茶脱水蛋白的0.2mg/mL水溶液以及水对照中，然后两者都在室温真空注入3小时。将注入的叶在40℃脱水过夜，然后在室温再水化最长3小时。

干燥的(左手图像)和再水化的叶子(中间图像)的图像、以及再水化的组织的内部结构的光学显微镜图像(右手图像)如图14中所示。可以观察到，与水注入的对照(下面图像)相比，在干燥和再水化后，脱水蛋白注入的菠菜(上面图像)有更大的叶，以及在再水化后更开放的、塌陷更少的组织结构。这表明脱水蛋白注入的叶的更大的再水化。

实施例8：干燥的植物材料中脱水蛋白的检测和定量

a) 在红辣椒中自然发现的脱水蛋白的提取和评价

在60℃烘箱干燥红辣椒果皮直至恒重，称重，在液氮下在研钵中研磨，并且研磨的材料置于2 mL Eppendorf管中，通过在4℃振荡1小时并在14,000 rpm离心以每100 mg研磨的材料1 mL提取物用组织提取试剂1(Invitrogen)(包含50mM三(羟甲基)氨基甲烷，pH7.4，250mM NaCl, 5mM EDTA, 2mM Na₃VO₄, 1mM NaF, 20mM Na₄P₂O₇, 0.02% NaN₃,去垢剂和0.5mM苯甲基磺酰氟)提取，并将上清液快速冷冻并储存在-80℃。使用Bradford蛋白测定(Bio-Rad)定量总蛋白。

将10 μL蛋白提取物上样于4-12％双-(2-羟基-乙基)-氨基-三(羟甲基)-甲烷SDS-PAGE凝胶。以0.5、0.1和0.05 mg/mL的浓度制备10μL实施例3的茶脱水蛋白，并上样于凝胶。在200 V跑胶30分钟以分离蛋白。蛋白标准品(All Blue Precision Plus Protein Standards (Bio-Rad))也和上述样品一起跑胶。

在半干印迹模块中将蛋白从SDS-PAGE凝胶转移到0.2μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen)。然后漂洗PVDF膜并在滤纸之间干燥。然后将具有转移的蛋白的干燥膜在封闭缓冲液(用作洗涤缓冲液和稀释液(PBST)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液和聚山梨醇酯20(Tween 20)+ 4％脱脂奶粉(SMP)溶液，pH 7.2)中孵育30分钟，然后移去。然后用在PBST+SMP中1:1000稀释的兔抗-脱水蛋白多克隆抗体(Agrisera, Vannas, Sweden)将膜孵育2小时。连续6次在PBST中洗涤4分钟后，用在PBST+SMP中1:5000稀释的过氧化物酶偶联的亲和纯的驴抗-兔免疫球蛋白G二级抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, MD)将膜孵育1小时。孵育后，6×4分钟洗涤膜，然后排水并使用化学发光底物(如Super Signal West Pico化学发光底物)显色并在ChemiDoc-XRS(化学发光)成像系统(Bio-Rad)中成像。

将膜上的红辣椒脱水蛋白带的强度与脱水蛋白标准品的浓度梯度的强度比较，用眼睛估计红辣椒中的红辣椒脱水蛋白的相对浓度并回复计算至每克干燥的红辣椒核心的存在的量。结果表明，红辣椒中脱水蛋白的天然水平从不可检测变化至最低的脱水蛋白标准品浓度的约20％，也就是说，等价于每g干重0.1 mg脱水蛋白的约0.01 mg/mL或0.01 % w/w。

b) 用外源的脱水蛋白注入红辣椒并估计其水平

用圆的1 cm直径的软木打孔器对红辣椒果皮挖芯，在水中冲洗片并在纸巾上吸干。制备实施例3的茶脱水蛋白的1mg/mL水溶液，在10 mL烧杯中使用2mL该溶液来覆盖3个辣椒芯。然后在室温将这些片真空注入4小时。注入后，在水中漂洗这些片三次以去除表面脱水蛋白并在纸巾上吸干。然后将注入的片放置在空气辅助风扇烘箱以干燥至恒重，以40摄氏度开始1小时，随后60摄氏度5小时。如上所述从这些片提取蛋白。

将2 μL总蛋白提取物上样于两块4-12％双-(2-羟基-乙基)-氨基-三(羟甲基)-甲烷SDS-PAGE凝胶。将非注入的红辣椒的提取物上样作为对照。10μL纯脱水蛋白的三个标准品(Invitrogen)在不同的浓度(0.5，0.1和0.05 mg/ml)并排上样。还使分子标记(来自Bio-Rad的All Blue Precision Plus Protein Standards)跑胶。在200 V跑胶30分钟以通过有效分子量分离蛋白。将蛋白从一个凝胶转移至PVDF膜，并如上所述使用蛋白质印迹以抗脱水蛋白抗体探测以验证在注入的组织提取液中在约37 kDa观察到的蛋白是脱水蛋白。其它凝胶染色1小时(用来自Invitrogen的Simply Blue Safe Stain)然后脱色过夜，然后成像。使用凝胶成像系统(来自Gel Logic的Gel Logic 200成像系统)对在染料染色的SDS-PAGE凝胶上的蛋白成像，用亮度、对比度和反转调整图像以去除背景和强烈蛋白浓度的高亮区域以允许估计注入红辣椒组织的脱水蛋白的量。将凝胶上脱水蛋白的浓度的估计值回复计算以估计每克干燥的红辣椒组织的存在的量。

注入的红辣椒提取物显示了在约37 kDa的强烈的蛋白条带，其大小等于注入组织并被用于浓度梯度的纯的脱水蛋白的大小，该条带对于未注入的对照是不存在的。条带的强度在1和5μg上样至凝胶的纯的脱水蛋白标准品的强度之间，因此每2μL提取物超过1μg，但低于5μg。由于提取物为10mL/克干燥组织，注入的脱水蛋白的量为每g干燥组织约5 mg脱水蛋白，但不超过25 mg/g(每干燥重量的0.5-2.5％脱水蛋白)。

实施例9：脱水蛋白注入对洋葱单层的影响

使用洋葱(洋葱)表皮作为模式植物细胞单层系统。制备表皮细胞(1 cm x 2 cm)并完全浸泡在具有0.25M海藻糖的50mM Bis-Tris缓冲液(BTT缓冲液)中的0.1 mg/mL全长野茶树脱水蛋白(从实施例2获得)溶液中。在室温将脱水蛋白真空注入洋葱组织2小时。还制备水、BTT缓冲液中0.1 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和仅仅BTT缓冲液注入的皮作为对照。在50℃将0.75 g注入的洋葱组织干燥过夜并通过在25 mL水中室温浸泡2小时而进行再水化。

将再水化的组织放置在显微镜玻片上，并用0.04％(w/v)台盼蓝原位染色。用去离子水漂洗后，应用盖玻片并用10倍放大的光学显微镜(Leica DMRB)观察玻片。使用数字彩色摄像机(JVC KY-F75U)来捕捉图像(JVC KY-LINK软件)。

台盼蓝是用于观察细胞活力的重要染料。图15a显示了在新鲜组织对照样品中具有完整细胞膜的活细胞或组织，如高亮所示该完整细胞膜排除染料。该染料可以进入具有损伤的细胞膜的细胞，例如在热烫组织(热烫2分钟，沸水)中，这使核清楚可见，膜似乎从细胞壁分离，如图15b中所示。

图16a显示，在干燥和再水化后，脱水蛋白注入的洋葱表皮显示了很少的组织损伤的迹象，细胞核不可见。与没有脱水蛋白的对照相比，细胞还表现出膨胀(图16b-d)，表明更高的再水化。尤其地，没有脱水蛋白的对照显示出组织损伤的迹象并且细胞核是可见的。与脱水蛋白注入的样品相比，在水(图16b)和缓冲液(图16c)对照中细胞膨胀的程度较低，表明在再水化后有限的水的摄取。

BSA注入的对照的膨胀(图16d)在脱水蛋白注入的组织(图16a)和水/缓冲液对照(图16b和c)之间，表明细胞内水的保留。然而，膜没有受到保护，允许细胞内活体染料的通过，如核染色所证明的。

序列表

<110> Unilever PLC

<120> 可再水化的食品

<130> T3238(C)

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 201

<212> PRT

<213> 野茶树

<400> 1

Met Ala His Asn Ser Asn Gln Tyr Gly Asn Pro Pro Arg Gln Thr Asp

1 5 10 15

Glu Tyr Gly Asn Pro Pro Arg Lys Thr Asp Glu Phe Gly Asp Pro Val

20 25 30

Arg Gln Ile Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Val His His Thr Gly Thr Met

35 40 45

Gly Asp Tyr Gly Thr Thr Thr Gly Thr Thr Gly Val His Gly Thr His

50 55 60

Thr Gly Thr Thr Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Thr Thr Gly Thr Tyr Gly

65 70 75 80

Thr Gly Met Asp Thr Thr Gly Thr Thr Gly Thr His Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Gly Thr Gly Gly His His Gln Gln His Ala Asp Gly Gly Val Leu His

100 105 110

Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Asp Gly Gln Gly Gly

115 120 125

Arg Arg Lys Lys Lys Gly Leu Thr Gln Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro

130 135 140

Gly Gly His Lys Asp Gln Thr Pro Gln Tyr Asp Asn Thr Thr Thr Thr

145 150 155 160

Pro Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Gly Glu Asp Gln

165 170 175

Gln Gln Tyr Pro Glu Lys Lys Gly Met Met Glu Lys Ile Lys Glu Lys

180 185 190

Leu Pro Gly His Thr Thr Thr Asn Lys

195 200

<210> 2

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> Seq ID 1的截短体122-201

<400> 2

Glu Asp Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys Lys Gly Leu Thr Gln

1 5 10 15

Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly His Lys Asp Gln Thr Pro Gln

20 25 30

Tyr Asp Asn Thr Thr Thr Thr Pro Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Tyr

35 40 45

Gly Tyr Gly Gly Glu Asp Gln Gln Gln Tyr Pro Glu Lys Lys Gly Met

50 55 60

Met Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly His Thr Thr Thr Asn Lys

65 70 75 80

<210> 3

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> Seq ID 1的截短体163-201

<400> 3

Ala Ala Thr Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Gly Glu Asp Gln Gln Gln

1 5 10 15

Tyr Pro Glu Lys Lys Gly Met Met Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro

20 25 30

Gly His Thr Thr Thr Asn Lys

35

<210> 4

<211> 128

<212> PRT

<213> 连翘

<400> 4

Met Glu Gln Tyr Gly Asp Gln His Gly Asn Gln Ile Arg Lys Thr Asp

1 5 10 15

Glu Tyr Gly Asn Pro Val Gln His Thr Gly Lys Gln Gly Thr Gly Gln

20 25 30

Gly Gly Ile Ala Pro Gly Thr Leu Asp Ala Gly Leu Ala Gly Gln Gln

35 40 45

His Gly Gln Leu Arg Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Asp Asp Gly

50 55 60

Leu Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Met Lys Asp Lys Ile Lys Glu Lys

65 70 75 80

Leu Pro Gly Gly His Lys Asp Glu Gln Asn Tyr Gly Thr Gln Thr Thr

85 90 95

Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Gly Cys Gly Gly Gly Glu His Gln Glu Lys

100 105 110

Lys Gly Val Val Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly Gly His

115 120 125

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 用于连翘属DNA的引物。'i'表示肌苷，并且在第3和15位已经被'n'替代。

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (3)..(3)

<223> I

<220>

<221> misc_特征

<222> (3)..(3)

<223> n 是a, c, g, 或 t

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (15)..(15)

<223> I

<220>

<221> misc_特征

<222> (15)..(15)

<223> n 是a, c, g, 或 t

<400> 5

acngaygart ayggnaaycc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (3)..(3)

<223> I

<220>

<221> misc_特征

<222> (3)..(3)

<223> n 是a, c, g, 或 t

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (15)..(15)

<223> I

<220>

<221> misc_特征

<222> (15)..(15)

<223> n 是a, c, g, 或 t

<400> 6

gtngaygart ayggnaaycc 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 用于连翘属DNA的反义引物。

<400> 7

aryttytcyt tdatyttrtc cat 23

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 全长茶脱水蛋白引物。

<400> 8

aaaaagcagg cttcatggca cataacagca ac 32

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 全长茶脱水蛋白引物。

<400> 9

agaaagctgg gttttattta ttagtggtgg tgtg 34

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 用于Seq ID 1的截短的茶脱水蛋白(122-201)的引物

<400> 10

aaaaagcagg cttcatggag gatgatggtc aag 33

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 用于Seq ID 1的截短的茶脱水蛋白(163-201)的引物

<400> 11

aaaaagcagg cttcatggca gccaccaccg gt 32

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 用于连翘脱水蛋白的引物。

<400> 12

aaaaagcagg cttcctgcac tactgaacaa acttag 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 用于连翘脱水蛋白的引物。

<400> 13

agaaagctgg gttcataaac tcgactcaga cgcatg 36

Claims

1.干燥的可再水化的食品，所述食品包含少于10％w/w水和至少0.02％w/w的脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白，所述脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白包含选自以下三类氨基酸序列的氨基酸序列：（1）K,I,K,E,K,L,P,G、（2）K,I,K,E/D,K,L/I,P,G和（3）K,I,K,E/D,K,L/I/T/V,P/H/S,G，其中所述干燥的可再水化的食品是蔬菜或其部分和/或水果或其部分的未破损的组织，并且不是种子，其中所述未破损的组织具有至少0.5毫米的最短线性尺寸。

2.权利要求1的干燥的可再水化的食品，包含0.02-20％w/w的脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白。

3.权利要求1或2的干燥的可再水化的食品，其中所述脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白具有1-150kD的分子量。

4.权利要求1或2的干燥的可再水化的食品，其中所述脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白是源自野茶树、连翘属和卷柏属的脱水蛋白。

5.权利要求1或2的干燥的可再水化的食品，其中所述可再水化的食品额外包括选自海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、棉子糖、酶抗氧化剂或非酶活性氧种类清除剂的化合物。

6.权利要求5的干燥的可再水化的食品，其中所述酶抗氧化剂选自过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶。

7.权利要求5的干燥的可再水化的食品，其中所述非酶活性氧种类清除剂选自抗坏血酸、谷胱甘肽和类胡萝卜素。

8.权利要求1或2的干燥的可再水化的食品，其中所述蔬菜选自菠菜、西兰花、洋葱、茄子、小胡瓜、土豆、南瓜、蘑菇、胡萝卜、茶、芦笋、萝卜、韭菜、甜菜、花椰菜、块根芹、朝鲜蓟、薄荷、百里香、牛至、迷迭香、欧芹、鼠尾草、细香葱、马郁兰、罗勒、月桂叶、龙蒿、旱芹和大蒜，所述水果选自柠檬、覆盆子、红醋栗、黑莓、悬钩子、蓝莓、草莓、菠萝、香蕉、桃、杏、荔枝、苹果、梨、番茄、辣椒、黄瓜和芒果。

9.食品产品，包含权利要求1-8中任一项的干燥的可再水化的食品。

10.权利要求9的食品产品，其选自干燥的汤、干燥的饮料、早餐谷物、酸奶和干燥的调味汁。

11.用于制备权利要求1-8中任一项的干燥的可再水化的食品的方法，所述方法包括步骤：

（a）用脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白注入不包括种子的蔬菜或其部分或水果或其部分以产生注入的食品，所述脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白包括选自以下三类氨基酸序列的氨基酸序列：（1）K,I,K,E,K,L,P,G；（2）K,I,K,E/D,K,L/I,P,G；和（3）K,I,K,E/D,K,L/I/T/V,P/H/S,G；和

（b）干燥注入的食品从而产生权利要求1-8中任一项的干燥的可再水化的食品。

12.权利要求11的用于制备干燥的可再水化的食品的方法，其中权利要求11的步骤(a)在真空下进行。

13.权利要求11的用于制备干燥的可再水化的食品的方法，其中权利要求11的步骤(a)在3-70℃的温度进行。

14.用于制备权利要求1-8中任一项的干燥的可再水化的食品的方法，所述方法包括步骤：

（a）将基因克隆进植物表达载体从而产生修饰的植物表达载体，其中所述基因编码脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白，其中，所述脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白包括选自以下三类氨基酸序列的氨基酸序列：（1）K,I,K,E,K,L,P,G；（2）K,I,K,E/D,K,L/I,P,G；和（3）K,I,K,E/D,K,L/I/T/V,P/H/S,G；

（c）生长所述转基因的目标作物从而表达脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白；并且然后

（d）干燥所述转基因的目标作物从而产生权利要求1-8中任一项的干燥的可再水化的食品。

15.具有与SEQ.ID NO.2相同的氨基酸序列的脱水蛋白及糖基化的脱水蛋白和截短的脱水蛋白。