CN101798576B

CN101798576B - 麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白编码序列及其在植物中的应用

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Publication number: CN101798576B
Application number: CN2010101061555A
Authority: CN
Inventors: 林娟; 周明琦; 金元杰
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2009-01-22
Filing date: 2010-01-19
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2030-01-19
Also published as: CN101798576A

Abstract

本发明属分子生物学、基因工程技术领域，涉及一种在麻疯树中表达的新的晚期胚胎丰富蛋白(Late Embryogenesis Abundant protein，简称为“LEA蛋白”)、编码序列及其在改良植物对干旱的耐受上的应用。涉及包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，及转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。将本发明的基因导入植物宿主，可得到抗干旱胁迫能力增强的转基因植物(作物)，对于培育抗旱性提高的作物新品种具有重要的理论及实际意义，可应用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

Description

麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白编码序列及其在植物中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在麻疯树中表达的LEA蛋白(胚胎发育后期丰富蛋白，late embryogenesis abundant protein，LEA)及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。

背景技术

干旱胁迫是植物尤其是经济作物种植栽培的主要限制因子之一。在植物的各种干旱应答机制中，策略之一是在缺水期间植物细胞积累一系列的蛋白质来减少细胞的脱水(孙立平，李德全.LEA蛋白的分子生物学研究进展，生物技术通报，2003，6：5-13)。尽管已有文献报道从植物中分离了大量抗逆相关基因(Thomashow等，Plant coldacclimation：Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.1999，50：571-599；Shinozaki等，Molecularresponses to dehydration and low temperature：differences and cross-talkbetween two stress signaling pathways.Curr.Opin.Plant Biol.2000，3(3)：217-223)。但这些基因远远不能满足植物抗逆遗传工程的应用。胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA)是一类胚胎发生晚期丰富表达蛋白并且受逆境诱导(Hundertmark等，LEA(late embryogenesis abundant)proteins and their encoding genes in Arabidopsis thaliana.BMC Genomics.2008，9：118).在植物耐寒、耐盐碱、耐干旱性方面起重要作用。LEA蛋白相对分子质量较小，约10,000-30,000D，具有很强的亲水性和热稳定性，即使在煮沸条件下也能保持水溶状态。这种高度亲水性有利于LEA蛋白在植物受到干旱失水时把足够的水分捕获到细胞内，从而保护细胞免受水分胁迫的伤害。LEA基因已从一些植物如小麦中被分离出来并且用于植物抗逆遗传的改良(Xu等，Expression of a late embryogenesisabundant protein gene，HVAI，from barley confers tolerance to water deficitand salt stress in transgenic rice.Plant Physiol.1996，110：249-257)。LEA的种类繁多，根据氨基酸序列的同源性和一些特殊的基元序列，将LEA蛋白分为6组：第一组是LEAD19，具有多拷贝串联的20个氨基酸残基组成的保守序列；第二组是LEA D11，也称为脱水素；第三组是LEA D7，包含保守的酪氨酸磷酸化位点和11氨基酸的重复序列；第四组是LEA D113，这类蛋白含有一个比较保守的N末端区域；第五组是LEA D29，该组蛋白与第三组类似，但缺乏高度的残基专一性；第六组是LEA D95。不同类型的LEA蛋白的功能存在差异。以前的研究仅限于以第三组LEA为研究体系获得的结果。因此从现有的耐旱性强的植物中筛选新的抗旱相关基因并且应用于植物抗逆遗传的改良仍是现代农林业发展的迫切需要。

麻疯树又称小桐子、臭油桐，属于大戟科麻疯树属，是一种落叶灌木或小乔木。麻疯树耐旱性强，是干旱地区理想的造林树种。野生麻疯树主要分布干热的亚热带和潮湿的热带雨林，可在年降水量480-2380mm，年均温18.0-28.5℃的环境下生存，通常生于海拔700-1600m的平地、丘陵、坡地及河谷荒山坡地。在我国主要分布在四川、云南、广东、广西、贵州、福建、台湾和海南等地。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的麻疯树LEA蛋白序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的麻疯树LEA基因(属于第五组LEA基因)，该基因是一个麻疯树LEA蛋白基因。

本发明的第二目的是提供一种新的麻疯树蛋白LEA。

本发明的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述新的麻疯树LEA蛋白和核酸序列的方法。

本发明的进一步目的是提供该麻疯树LEA蛋白多肽和编码序列在利用转基因技术控制植物干旱耐受上的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有麻疯树LEA蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第59-820位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第59-820位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第59-820位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离出的麻疯树LEA蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肤、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。

在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。

在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是酵母细胞、拟南芥和和其它植物细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有麻疯树LEA蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下：

(1)将编码具有麻疯树LEA蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成麻疯树LEA蛋白表达载体，所述的核昔酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第59-820位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成麻疯树LEA蛋白的重组细胞；

(3)在适合表达麻疯树LEA蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有麻疯树LEA蛋白活性的基本纯的多肽。

较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.1中第59-820位的序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有麻疯树LEA蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物对干旱的耐受性的方法，其步骤如下：

(1)将编码具有麻疯树LEA蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含麻疯树LEA蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第59-820位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有麻疯树LEA蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含有麻疯树LEA蛋白基因的转基因植株对植物干旱耐受特性具有增强的作用。

较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID No.1中第59-820位的序列。本发明还提供了与LEA蛋白多肽特异性结合的抗体，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基木纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA.或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第59-820位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第59-820位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第59-820位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第59-820位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第59-820位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的麻疯树LEA蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“麻疯树LEA蛋白或多肽”指具有麻疯树LEA蛋白活性的SEQ IDNO.1序列的多肽。该术语还包括具有与天然麻疯树LEA蛋白相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括麻疯树LEA蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的麻疯树LEA蛋白多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与麻疯树LEA蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用麻疯树LEA蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“麻疯树LEA蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.1的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

发明还包括麻疯树LEA蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然LEA蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的麻疯树LEA蛋白多肽时，可以将麻疯树LEA蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成麻疯树LEA蛋白表达载体。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile

Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、拟南芥细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析麻疯树LEA蛋白基因产物的表达，即分析麻疯树LEA蛋白的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

麻疯树LEA RNA的Northern印迹分析和麻疯树LEA特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实麻疯树LEA在生物样本中的表达。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有麻疯树LEA蛋白核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码麻疯树LEA蛋白的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在麻疯树LEA蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于麻疯树LEA蛋白核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的麻疯树LEA蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选麻疯树LEA蛋白同源基因或同源蛋白。

为了得到与麻疯树LEA蛋白基因相关的麻疯树cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选麻疯树cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用³²P对麻疯树LEA蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自麻疯树的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与麻疯树LEA蛋白的基因家族的核苷酸序列。

本发明的麻疯树LEA蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明麻疯树LEA蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的麻疯树LEA蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与麻疯树LEA蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明的麻疯树LEA蛋白基因可通过基因工程技术用来提高经济植物的抗旱性能，在全球水资源日趋紧缺的情况下，本发明具有很大的应用前景。

表2为本发明的麻疯树LEA与拟南芥(Arabidopsis thaliana)LEA的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。

表3为本发明的麻疯树LEA蛋白的氨基酸序列与拟南芥(A.thaliana)LEA的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

表2

麻疯树LEA蛋白的核酸序列与拟南芥LEA蛋白的核酸序列的同源比较图

67％ identity in 331 nt over Iap

Query 483 CCGCAGGAGACAAACCAATTGATCAAAGCGACGCCGCTGCTATAAAAGCTGCAGAGGTGA 542

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Sbjct 548 CCGCTGGAAACAAACCGGTGGATCAAAGCGACGCAGCAGCGATTCAAGCGGCAGAGGTTA 607

Query 543 GAGCTCTTCGCAGTACTCAAACCCCGGCGGGTGGAATAGGCGCAGAAGCACAGTCGGCAG 602

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Sbjct 608 GAGCTTGTGGCACTAATGTGATTGCTCCTGGTGGAATCGCCGCTTCTGCTCAATCAGCAG 667

Query 603 CTGATCGTAA---TACCAGAGTTATGCTCGACGAAGATAAGACTACCCTCTCTGATGTTT 659

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Sbjct 668 CAAATCACAACGCTACCATAGAC---CGTGATGAGGATAAAATCAAGCTCATTGATGTTT 724

Query 660 TAGCGGACGCGACTGCCAAGTTGCCTAGAGACAAGACGGTAACTCGGGATGATGCTGAAG 719

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Sbjct 725 TGGCGGGTGCGACCGGGAAGTTAGCCGCAGATAAAGCTGTGACCAGGCAGGACGCAGAGG 784

Query 720 GTGTGATTGGAGCGGAAATAAGAAACAAACCTAATATGAGGACTACGCCTGGTGGAGTTG 779

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Sbjct 785 GAGTGGTGAGCGCTGAGCTGAGGAACAATCCTAATTTGTCTACTCACCCTGGTGGTGTAG 844

Query 780 CTGCTTCTGTGGCTGCAGCTGCTAGGCTTAA 810

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Sbjct 845 CGGCTTCTATTACTGCCGCCGCTAGGCTTAA 875

Query：麻疯树LEA的核酸序列

Sbjct：拟南芥LEA的核酸序列(NM_113148)

表3

麻疯树LEA蛋白的氨基酸序列与拟南芥LEA蛋白的氨基酸序列的同源比较图Identities＝149/262(56％)，Positives＝182/262(69％)，Gaps＝14/262(5％)

Query 1 MSQG-QPRRTQYDQEPIKYGDVFNVGGDVASQPIAPVDAANMQSAESQVLGEPQRGGPAS 59

MSQ QP+R Q EP+ YGDVF V G++A +PIAP DA MQ+AE++V G Q+GG A+

Sbjct 1 MSQEEQPKRPQ---EPVTYGDVFEVSGELADKPIAPEDANMMQAAETRVFGHTQKGGAAA 57

Query 60 VMQSAANVNVRTGAVERDDVSDVVREQGINVAEIDIGGTRVITEKVGGEVVGQYVQPRVP 119

VMQSAA N R G V D +D+ E+G+ VA+ D+ G RV TE VGG+VVGQYV+PR

Sbjct 58 VMQSAATANKRGGFVHPGDTTDLAAERGVTVAQTDVPGARVTTEFVGGQVVGQYVEPRPV 117

Query 120 ATYP-----MPGMD----ITMGEALEATAYSAAGDKPIDGSDAAAIKAAEVRALRSTQTP 170

AT + G+ IT+GEALEAT +A G+KP+DQSDAAAI+AAEVRA +

Sbjct 118 ATAAAMEAEVVGLSLQSAIIGEALEATVQTA-GNKPVDQSDAAAIQAAEVRACGTNVIA 176

Query 171 AGGIGAEAQSAADRNTRVMLDEDKTTLSDVLADATAKLPRDKTVTRDDAEGVIGAEIRNK 230

GGI A AQSAA+ N + DEDK L DVLA AT KL DK VTR DAEGV+ AE+RN

Sbjct 177 PGGIAASAQSAANHNATIDRDEDKIKLIDVLAGATGKLAADKAVTRQDAEGVVSAELRNN 236

Query 231 PNMRTTPGGVAASVAAAARLNQ 252

PN+ T PGGVAAS+ AAARLN+

Sbjct 237 PNLSTHPGGVAASITAAARLNE 258

Query：麻疯树LEA氨基酸序列

Sbjct：拟南芥LEA氨基酸序列(GenBank Accession No.NP_188888)

附图说明

图1是麻疯树LEA蛋白的结构域图。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 麻疯树LEA蛋白基因的克隆

1.组织分离(isolation)

麻疯树种子来源于四川省攀枝花地区，麻疯树种子采集后，放在实验室保存。

2.RNA的分离(RNA isolation)

将麻疯树种子的种皮剥掉，取出种仁，用研钵研碎，加入液氮后，研磨成粉后，取100mg移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(两步裂解法)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据一些植物LEA的氨基酸保守序列，设计兼并引物，利用同源性基因克隆原理，SMARTTM RACE cDNA扩增方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行：

(1)核心序列的克隆

PCR(JcLEAF+JcLEAR)得到LEA-1(383bp)，回收，连接到pMD-18T载体上，用M13F或M13R作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的模式植物拟南芥等的LEA基因的同源性很高，故初步认为它是一个LEA基因。

(2)3’-RACE

根据核心序列的扩增的结果，设计两个正向特异引物(JcLEAF1和JcLEAF2)。采用二次PCR扩增方法进行。第一次PCR(JcLEAF1+AP)得到PCR产物，稀释100倍后，用其做模板，进行第二次PCR(JcLEAF2+AP)，得到JcLEA-3(361bp)，回收，连接，测序过程同(1))。

(3)5’-RACE

根据核心序列的扩增的结果，设计两个反向特异引物(JcLEAR1和JcLEAR2)。采用二次PCR扩增方法进行。第一次PCR(JcLEAR1+UPM)得到PCR产物，稀释100倍后，用其做模板，进行第二次PCR(JcLEAR2+NUP)，得到JcLEA-5(716bp)，回收，连接，测序(过程同(1))。

(4)编码序列的克隆

将5’RACE测序结果与3’RACE测序结果比对并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行JcLEA编码区(JcLEAfull-F+JcLEAfull-R)PCR扩增，得到JcLEA编码区(762bp)(过程同(1))。

通过组合使用上述4种方法，获得了候选的麻疯树LEA蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物JcLEAfull-F：5’-ATGAGCCAGGGGC AACCACGAAGAA-3’(SEQ ID NO.3)为正向引物，寡核苷酸JcLEAfull-R：5’-TTATGGGTTCTGATTA AGCCTAGCAGCTGC-3’(SEQ ID NO.4)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、58℃1分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为762bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。

实施例2麻疯树LEA蛋白基因的序列信息与同源性分析

本发明新的麻疯树LEA蛋白全长cDNA的长度为1070bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于59-820位核苷酸。根据全长cDNA推导出麻疯树LEA蛋白的氨基酸序列，共254个氨基酸残基，分子量26454.62，pI为4.64。详细序列见SEQ ID NO.2。

将麻疯树LEA蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥LEA蛋白(NM_113148)在核苷酸水平上具有67％的同源性(见表2)；在氨基酸水平上，它与拟南芥LEA(NP_188888)有56％的相同性和69％的相似性(见表3)。由此可见，麻疯树LEA蛋白与拟南芥LEA蛋白无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为麻疯树LEA蛋白在功能上也相似。

实施例3麻疯树LEA蛋白的结构和类型预测

1.麻疯树LEA蛋白的结构域分析

将麻疯树LEA蛋白的氨基酸序列在NCBI数据库(网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中检索结构域，结果如附图1所示。

(1)在氨基酸序列中，存在以下结构域区：加框区(即序列表中SEQ ID.1自氨基端(N端)第14-72位氨基酸残基，129-190，第193-254位氨基酸残基)。该加框区组成SMP成熟蛋白功能模块(Seed maturation protein，SMP)。

(2)功能分析在该基因氨基酸序列中存在种子成熟蛋白功能模块，因而可预见其的确具有相应功能。

2.麻疯树LEA蛋白的分类预测

将麻疯树LEA蛋白的氨基酸序列在NCBI数据库进行同源性比对，所推断的麻疯树JcLEA蛋白序列与其它植物的第五组LEA蛋白序列的有较高的相似性。与陆地棉LEAD-34(Gossypium hirsutum)(GenBank登录号为：P09444)，拟南芥ATECP31(Arabidopsis thaliana)(NP_188889)，胡萝卜ECP31(Daucus carota)(BAD86645)，苜蓿LEA(Medicago truncatula)(ABB16353)，大豆PM24(Glycine max)(AAF21310)，玉米D-34(Zea mays)(ACG48700)基因的氨基酸序列的一致性(或相似性)分别为61％(76％)、59％(68％)、57％(72％)、57％(71％)、57％(68％)和54％(69％)。棉花中的D34、胡萝卜的ECP31和拟南芥的AtEC31均属于第五组LEA蛋白序列，因此推测麻疯树LEA蛋白也为第五组LEA蛋白序列。

实施例4麻疯树LEA蛋白在酵母中进行真核表达及功能评价

在该实施例中，将全长的麻疯树LEA蛋白编码序列或片段构建入商品化的酵母表达载体之中，通过其在酵母中过量表达，对其抗旱性作出功能评价。

酵母表达载体的构建，以及酵母的转化。

根据麻疯树LEA蛋白的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pYES2载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将麻疯树LEA蛋白基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pYES2载体(Invitrogen)。鉴定好的表达载体利用醋酸锂法转入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303(ura3-1，can-1-100，leu2-3，112trp1-1，his3-11，15)，筛选鉴定得到含有pYES2-LEA蛋白表达载体的工程菌W303-pYES2-LEA。

野生酵母W303的培养，继代用YPD培养基(1％酵母浸提液，2％蛋白胨，2％葡萄糖，pH5.8)。转化了pYES2-LEA及空载pYES2的W303的培养，继代用SD-ura培养基(Difco，尿嘧啶缺陷型培养基)。

各种胁迫处理时的培养基用YPGAL(1％酵母浸提液，2％蛋白胨，2％半乳糖，pH 5.8)加相应的胁迫剂。

酵母RNA提取及Northern杂交分析

a)W303-pYES2-LEA在SD-ura培养基中培养直到OD₆₀₀达到0.7，部分培养物转到YPD或YPGAL培养基中培养。

b)24h后，OD₆₀₀达到2.0，8000rpm离心5min，收集菌体。将细胞悬浮于400μl AE缓冲液(50mM Sodium Acetate，10mM EDTA调整pH值至5.2)。

c)加入1/10体积的10％SDS，充分混合。加入等体积在65℃预热的酸性酚(pH4.5)，混合后65℃加热5min，冰上放置10min。

d)在室温下8000rpm离心10min。

e)取水相，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，10000rpm离心8min。

f)取水相，加入等体积氯仿/异戊醇(49∶1)10000rpm离心8min。

g)加入1/10体积3M pH5.2的醋酸钠，2.5倍体积的纯乙醇，-20℃过夜沉淀。

h)沉淀样品于4℃离心5min，去除液体。

i)在冰上干燥RNA(放置15min)，最后用适量DEPC水溶解RNA。

j)30μg总RNA经112％琼脂糖变性胶电泳后转到Hybond-N⁺尼龙膜用于Northern杂交分析。全长LEA cDNA用α-³²P-dCTP标记后做探针进行杂交。杂交膜第1次在含2×SSC，0.1％SDS洗膜液中45℃，漂洗15min；然后转入1×SSC，0.1％SDS的洗膜液45℃漂洗5min。杂交膜上残液用滤纸吸干后，用保鲜膜包裹。将膜置于磷屏中进行放射自显影(Amersham Pharmacia)。

k)Northern杂交表明麻风树LEA蛋白在酵母中可被诱导表达。含半乳糖的YPGal培养基诱导蛋白的表达量比不含半乳糖的YPD培养基诱导表达量高，而野生转空载pYES2的酵母则在两种培养基中均检测不到杂交信号，表明构建的pYES2-LEA表达载体可在酵母中很好表达麻疯树LEA蛋白，且不会有酵母自身的LEA类似蛋白的干扰。

NaCl、KCl、山梨醇处理及酵母生长量测定

W303-pYES2-LEA在SD-ura培养基中培养生长1d，OD₆₀₀达到0.2，20μL培养物接种到2mL YPGAL+NaCl(0-1.4mol/L)系列浓度，YPGAL+KCl(0-1.4mol/L)系列浓度，YPGAL+山梨醇(0-2.2mol/L)系列浓度培养基中，30℃，250rpm，培养48h后测定600nm吸光值。每项实验都设3个重复。

以转空载pYES2的酵母为对照，用NaCl、KCl、山梨醇系列浓度梯度分析了转pYES2-LEA酵母的生长状况。结果表明，转pYES2-LEA的酵母能显著改进细胞的耐逆性，表现为高于0.8mol/L NaCl，0.8mol/L KCl，1.4mol/L山梨醇胁迫时，转pYES2-LEA酵母生长量的下降程度明显滞后于对照(转空载pYES2)。说明麻疯树LEA在酵母中过量表达，改善了酵母在离子和渗透胁迫下的生长状态或提高了存活率。

实施例5麻疯树LEA蛋白在拟南芥中进行表达及转基因植物抗旱性检测

含目的基因(麻疯树LEA蛋白基因)的表达载体的构建。

根据麻疯树LEA蛋白的全长序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将麻疯树LEA蛋白基因cDNA克隆至中间载体(如pMD18-T)，进一步克隆到双元表达载体(如pHB)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好表达载体，再将其转入农杆菌中，利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥。

利用浸花法转化拟南芥

拟南芥无菌培养

a)拟南芥无菌培养：超净台上将种子在20％漂水洗涤10min，无菌水冲洗4次。然后用0.1％Triton灭菌，颠倒混匀18min，无菌水冲洗4次；

b)MS培养基先倒平板下层，吹干后，把消毒后的种子分装后用40-50℃的MS培养基混匀，倒入平板中，均匀地铺满一层(小培养皿大约需要4-5ml培养基)；

c)平皿封口，4℃冰箱内春化3-5d，放入到人工气候室中开始萌发生长。植物生长环境为相对湿度60％；恒温20-22℃；光照周期24h；光照强度为80-220μmol/m²/sec。

拟南芥土壤种植

a)浸土：把土装入到种植盆中至距盆口约2cm处，用花无缺复合肥(N、P、K＝20％、20％、20％)，完全浸透；

b)移栽：选取MS固体培养基上萌发生长7-10d，健壮、生长一致的苗移栽到事先用花无缺浸过的培养土中，其上覆盖保鲜膜，转入22℃，24h连续光照的人工气候室中培养，到苗生长正常后揭去。

农杆菌介导的浸花法对拟南芥的转化

a)培养在土壤中的拟南芥在蛭石培养基中(1/3×MS培养液浇灌)以(22±2)℃，相对湿度70％，光照16h的生长条件培养至茎高3-10cm时，去其顶生花序，刺激腋生花序的生长。

b)继续生长7-9d后，将农杆菌按密度1×10⁴/mL接种于1L LB液体培养基中(含50μg/mL的利福平和卡那霉素)；28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为1.2-1.8；收集菌体，重悬于1L转化液(50mL MS营养液；5％蔗糖；1×V_b5有机培养基1mL；0.044mol/L 6-BA；50μL Silwet-77；用0.4mol/L NaOH调pH至5.8)中。

c)将准备好的植株倒置于含转化缓冲液的玻璃瓶中，抽真空，维持0.05M Pa压力5min。

d)取出种植盆，避光侧放24h，然后将种植盆直立。

e)按常规的方法培育植株至结实，收获成熟种子(T₀代)。

转基因拟南芥微量DNA提取及阳性植株的筛选

a)将种子置于75％乙醇中消毒5min，15％漂白剂中消毒10min，无菌水冲洗3-5遍，均匀散布于含50μg/mL卡那霉素和250μg/mL头孢霉素的MS选择培养基(1×MS大量；1×V_B5微量元素培养基；1×铁盐；1×V_B5有机培养基；100mg肌醇；3％蔗糖；琼脂粉7.8g，pH 5.8)上(平均1000-2000粒种子/皿)。置22℃光照16h培养。

b)生长一周后挑选绿色阳性植株转至正常的MS培养基中，10d后转入蛭石中培养。

c)取少量转基因植株叶片，剪碎，置研钵中，加入1mL提取缓冲液(100mmol/LTris·Cl(pH 8.0)，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)，研磨成浆。

d)吸入1.5mL EP管中，剧烈摇动混匀。

e)60℃水浴保温30-60min，不时颠倒混匀。

f)室温下10000rpm离心5min。

g)小心吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈震动。

h)室温下10000rpm离心5min。

i)小心将上清吸入新的离心管中。

j)加入1倍体积异丙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。8000rpm离心5min，弃掉上清；75％酒精洗一次，晾干沉淀。

k)加入5μL RNaseA(10μg/μL)，37℃10min，除去RNA。

l)加50-100μl水融解，-20℃贮存。

m)提取出的DNA为模板，以表达载体自带HYG基因引物及LEA基因特异性引物分别进行PCR反应，鉴定目的基因在转基因拟南芥基因组中的表达状况。

含麻疯树LEA基因的转基因拟南芥的抗旱性鉴定

将含有50μg/mL卡那霉素的MS培养基上筛选出的阳性转基因植株(5-6片叶)以及对照植株幼苗分别转到含有0、10％、15％浓度的PEG4000和含0、0.8％、1.5％浓度的NaCl的MS培养基上，(22±2)℃，相对湿度70％，光照16h的条件下培养，15d后观察植株的生长情况K并进行统计学分析。

结果显示，在1.5％浓度的NaCl胁迫下，野生和转基因拟南芥分化和生长情况没有区别，均死亡。但在0.8％浓度的NaCl胁迫下，它们的分化和生长情况差异明显，野生拟南芥均呈萎蔫态，而转基因拟南芥长势良好(3次重复均有一致结果)。同样，在含10％、15％的PEG4000的培养基上，转基因拟南芥的长势明显优于对照种K两者的分化和生长情况差异明显。提示麻疯树LEA基因编码的蛋白可能在植物水分调节方面有重要作用。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

<110>复旦大学

<120>麻疯树LEA蛋白编码序列

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1070

<212>DNA

<213>麻疯树(Jatropha carcas L.)

<220>

<221>CDS

<222>(59)..(820)

<223>

<400>1

ACGCGGGAAC AGAGGTGGCC ACTGCAATCA CCGCTTGAGT TTTGAGAAGA AGTAAAAA

ATG AGC CAG GGG CAA CCA CGA AGA ACT CAA TAC GAC CAG GAG CCA ATC

Met Ser Gln Gly Gln Pro Arg Arg Thr Gln Tyr Asp Gln Glu Pro Ile

1 5 10 15

AAA TAC GGC GAT GTG TTT AAT GTC GGA GGC GAT GTC GCC TCC CAG CCG

Lys Tyr Gly Asp Val Phe Asn Val Gly Gly Asp Val Ala Ser Gln Pro

20 25 30

ATT GCA CCA GTA GAC GCT GCT AAC ATG CAG TCT GCT GAG AGC CAA GTC

Ile Ala Pro Val Asp Ala Ala Asn Met Gln Ser Ala Glu Ser Gln Val

35 40 45

CTT GGA GAG CCT CAG AGA GGC GGC CCT GCC TCA GTC ATG CAA TCT GCG

Leu Gly Glu Pro Gln Arg Gly Gly Pro Ala Ser Val Met Gln Ser Ala

50 55 60

GCA AAC GTC AAC GTT AGG ACT GGT GCC GTC GAG CGG GAT GAT GTG AGT

Ala Asn Val Asn Val Arg Thr Gly Ala Val Glu Arg Asp Asp Val Ser

65 70 75 80

GAT GTT GTT AGA GAA CAG GGC ATT AAC GTT GCT GAA ATA GAT ATC GGC

Asp Val Val Arg Glu Gln Gly Ile Asn Val Ala Glu Ile Asp Ile Gly

85 90 95

GGC ACT CGC GTT ATC ACA GAG AAA GTC GGT GGA GAG GTT GTG GGA CAA

Gly Thr Arg Val Ile Thr Glu Lys Val Gly Gly Glu Val Val Gly Gln

100 105 110

TAT GTT CAG CCA AGA GTT CCA GCG ACA TAT CCA ATG CCA GGT ATG GAT

Tyr Val Gln Pro Arg Val Pro Ala Thr Tyr Pro Met Pro Gly Met Asp

115 120 125

ATT ACA ATG GGT GAA GCT TTA GAG GCA ACT GCT TAT TCT GCC GCA GGA

Ile Thr Met Gly Glu Ala Leu Glu Ala Thr Ala Tyr Ser Ala Ala Gly

130 135 140

GAC AAA CCA ATT GAT CAA AGC GAC GCC GCT GCT ATA AAA GCT GCA GAG

Asp Lys Pro Ile Asp Gln Ser Asp Ala Ala Ala Ile Lys Ala Ala Glu

145 150 155 160

GTG AGA GCT CTT CGC AGT ACT CAA ACC CCG GCG GGT GGA ATA GGC GCA

Val Arg Ala Leu Arg Ser Thr Gln Thr Pro Ala Gly Gly Ile Gly Ala

165 170 175

GAA GCA CAG TCG GCA GCT GAT CGT AAT ACC AGA GTT ATG CTC GAC GAA

Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Arg Asn Thr Arg Val Met Leu Asp Glu

180 185 190

GAT AAG ACT ACC CTC TCT GAT GTT TTA GCG GAC GCG ACT GCC AAG TTG

Asp Lys Thr Thr Leu Ser Asp Val Leu Ala Asp Ala Thr Ala Lys Leu

195 200 205

CCT AGA GAC AAG ACG GTA ACT CGG GAT GAT GCT GAA GGT GTG ATT GGA

Pro Arg Asp Lys Thr Val Thr Arg Asp Asp Ala Glu Gly Val Ile Gly

210 215 220

GCG GAA ATA AGA AAC AAA CCT AAT ATG AGG ACT ACG CCT GGT GGA GTT

Ala Glu Ile Arg Asn Lys Pro Asn Met Arg Thr Thr Pro Gly Gly Val

225 230 235 240

GCT GCT TCT GTG GCT GCA GCT GCT AGG CTT AAT CAG AAC CCA TAATACC

Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Ala Arg Leu Asn Gln Asn Pro

245 250

ATTCACGTTC TGTTTTCTTT TTCTTTCTTT TTATAGAGAA GTTGCCTTCG TTTTATATAA

TTGCTGCACT GTCGCTTGCT ATATGAACCG TTCCCCTGTT TTGCTAGTTA CGAATGATGG

TGGCCAAAGT GATACACTTT TTGTCGTGTC CTTTCGAGAA TGTATAAACT TTGAATCTCT

ATGTAAATAG ACTTTTACTT GGTTTCCTGC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA

<210>2

<211>324

<212>PRT

<213>麻疯树(Jatropha carcas L.)

<400>2

Met Ser Gln Gly Gln Pro Arg Arg Thr Gln Tyr Asp Gln Glu Pro Ile

1 5 10 15

Lys Tyr Gly Asp Val Phe Asn Val Gly Gly Asp Val Ala Ser Gln Pro

20 25 30

Ile Ala Pro Val Asp Ala Ala Asn Met Gln Ser Ala Glu Ser Gln Val

35 40 45

Leu Gly Glu Pro Gln Arg Gly Gly Pro Ala Ser Val Met Gln Ser Ala

50 55 60

Ala Asn Val Asn Val Arg Thr Gly Ala Val Glu Arg Asp Asp Val Ser

65 70 75 80

Asp Val Val Arg Glu Gln Gly Ile Asn Val Ala Glu Ile Asp Ile Gly

85 90 95

Gly Thr Arg Val Ile Thr Glu Lys Val Gly Gly Glu Val Val Gly Gln

100 105 110

Tyr Val Gln Pro Arg Val Pro Ala Thr Tyr Pro Met Pro Gly Met Asp

115 120 125

Ile Thr Met Gly Glu Ala Leu Glu Ala Thr Ala Tyr Ser Ala Ala Gly

130 135 140

Asp Lys Pro Ile Asp Gln Ser Asp Ala Ala Ala Ile Lys Ala Ala Glu

145 150 155 160

Val Arg Ala Leu Arg Ser Thr Gln Thr Pro Ala Gly Gly Ile Gly Ala

165 170 175

Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Arg Asn Thr Arg Val Met Leu Asp Glu

180 185 190

Asp Lys Thr Thr Leu Ser Asp Val Leu Ala Asp Ala Thr Ala Lys Leu

195 200 205

Pro Arg Asp Lys Thr Val Thr Arg Asp Asp Ala Glu Gly Val Ile Gly

210 215 220

Ala Glu Ile Arg Asn Lys Pro Asn Met Arg Thr Thr Pro Gly Gly Val

225 230 235 240

Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Ala Arg Leu Asn Gln Asn Pro

245 250

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>麻疯树(Jartropha curcas)

<400>3

ATGAGCCAGGGGCAACCACGAAGAA

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>麻疯树(Jatropha curcas)

<400>4

TTATGGGTTCTGATTAAGCCTAGCAGCTGC

Claims

1.一种麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白，其特征在于所述蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1中的核苷酸序列，用于构建所述载体的出发载体为p3301-BI121、pBll21、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。

4.一种产生具有麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白活性的多肽的方法，特征在于其步骤如下：

(1)将编码具有麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白基因表达载体，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白的重组细胞；

(3)在适合表达麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白活性的多肽。

5.一种利用转基因技术将编码具有麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物对干旱耐受性增强的方法，其特征在于其步骤如下：

(1)将编码具有麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含麻疯树胚胎发育后期丰富蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入植物宿主细胞，所述植物宿主为拟南芥；

(3)通过抗生素筛选，获得转化细胞并最终再生转基因植株及其后代。