CN102719449A - 苹果抗逆相关基因MdSIMYB1的克隆及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种苹果抗逆相关基因MdSIMYB1的克隆及其应用，具体公开了一种如SEQ.ID.NO:1所示的苹果MdSIMYB1基因的克隆方法及其应用；本发明从苹果中分离到了MdSIMYB1基因，该基因在烟草中过量表达能提高转基因烟草的抗旱、抗盐和抗冷等逆境能力；MdSIMYB1基因在苹果中过量表达能提高转基因苹果株系的抗旱、抗盐和抗冷等逆境能力；而抑制该基因的表达，可导致转基因苹果植株的抗旱、抗盐和抗冷等逆境能力的下降；将MdSIMYB1基因转入苹果提高其表达水平，能提高苹果的抗逆能力。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种苹果抗逆相关基因MdSIMYB1的克隆及其应用，具体涉及一种苹果抗逆基因MdSIMYB1的克隆、重组，及其转基因苹果、烟草在抗旱、抗盐和抗冷等逆境方面的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。
二、背景技术
苹果作为世界四大果树之一，是温带地区的主要栽培树种。在苹果的生长发育过程中，许多非生物胁迫是影响苹果地理分布和产量提高的主要限制因子，尤其是高盐、干旱和低温等，世界苹果生产国都把选育抗盐、抗旱、抗寒等优质苹果新品种作为主要育种目标。由于苹果是多年生木本植物，遗传背景复杂、杂和度高、童期长、自交亲和性差等诸多问题给遗传育种带来了很大障碍，常规育种进展缓慢。近年来，苹果基因组的测序（Velasco等，2010）的完成、以及迅速发展的现代生物技术为解决这些问题开辟了新途径，通过基因工程技术有目的提高果树抗盐、抗旱、抗寒能力，成为果树遗传改良的重要研究方向，大量植物抗逆功能基因的分离和鉴定则为基因工程遗传改良提供了目的基因。
MYB类家族是指含有MYB结构域的一类转录因子，它是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及植物叶片的形态建成具有重要的调节作用（Martin等，1997）。目前对MYB的研究主要集中在拟南芥、水稻上等少数模式植物上，而在果树方面研究甚少。由于诸多方面的原因，可耕土地面积越来越少，再加上世界范围内气候的异常变化，导致果树的种植面积和范围受到严重影响。挖掘苹果MYB基因并进行功能研究，为果树抗逆转基因育种提供潜在的有效候选基因，不但具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。苹果转基因育种多在苹果砧木上进行，而苹果砧木主要生活在地下，不开花坐果，减少了基因工程在果树应用上的争议。
三、发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种苹果抗逆相关基因MdSIMYB1的克隆方法及核苷酸序列，同时提供了该基因在获得抗逆，尤其是在抗旱、抗盐、抗低温的转基因烟草和苹果中的应用，并可应用于生产其它具有明显抵抗干旱、盐碱和低温的转基因植物。
本发明中提供的核苷酸序列来自苹果。
本发明利用同源克隆和RACE技术获得了苹果新型抗逆境相关基因MdSIMYB1，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。具体方法如下：
从经200mM NaCl盐处理24小时的嘎啦苹果组培苗中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库中已发布的拟南芥中MYB基因家族的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）。将合适大小的PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，并进行测序分析确认；然后通过5′和3′末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术分别获得5′和3′端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3′和5′端序列设计特异引物，以经200mM NaCl盐处理24小时的嘎啦苹果组培苗的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列。
该基因的全长cDNA为999bp，其中包括711bp的开放阅读框(open reading frame,ORF）。由此推得，该基因编码237个氨基酸，预测分子量约为26.93kDa，等电点PI为8.03。将其氨基酸序列在国际基因库中检索，发现与已公布的MYB家族成员AtMYB63（拟南芥，AK175344.1）、AtMYB72（拟南芥，NM_104495.1）、AtMYB10（拟南芥，NM_112118.2）、VvMYB4（葡萄，XM_002281466.2）有较高的同源性，其氨基酸同源性分别为69.23%、66.35%、65.38%、64.42%。由此表明，经过上述克隆步骤得到了一个苹果中MYB基因，又因该基因与盐胁迫有关，所以将该基因命名为MdSIMYB1。
该基因序列如下：
序列表：
（1）SEQ.ID.NO.1的信息
（a）序列特征
长度：999bp
类型：核酸
拓扑结构：线性
（b）分析类型：cDNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：苹果（Malus domestica）
（f）序列描述：SEQ.ID.NO.1
atgagcacac tcgctaacag tctgcccgga gcgacaccgt atgtacattg ggtacggagg 60 cggcagagaactcactgaat cggagataga ag
gcgaa aaggactcag cggtgtgaga 120 agacggtagc tgtgaagaagggtccatgga gtcctgagga ggatcacaag ttggtagctt 180 acattcaaag atatggaatt tggaattggagtcggatgcc taaaccagct ggtctggcta 240 ggtccgggaa gagttgtaga cttcgttggg tgaattacttaaggccggat attaagcgtg 300 ggaacttcgg caaagacgaa gaggaaacca tacttgagtt gcatcaagcaataggaaacc 360 gatggtctgc tattgcagca aggcttcccg gaagaacgga caatgagatt aagaattact 420ggcacaccca catgaaaaaa cgcttcaagg cggggattga atcagtacac gaagaagcaa 480 aagggtccggtgacaaggaa gccagcaaga acaagttatc tgaagctgga caactctttc 540 ttgttgatga agctacgaaggtagcatcat taaagtcgga ggcaacttgt tcagcttcat 600 cgagcgtata ctttcccgtt tgggaattcgacgatcaaaa aggccagatt gcagagcaaa 660 gtgtttgtgc atctgatgtc acatttggtg agcttcaaagtttggattct caagtgtggc 720 agcaagagcc tatatttcca tgtgattcct acattaatca tgtcaccagtgattactggg 780 tcagtttaat cgataaaaca gga
gtta gattaattaa aagtgtttga actttgaata 840agcggaaatc gtaatgtctt gtgtatttgg atgtttaagt acaaccgtca actgtttgtt 900 cttctactctgactgtatta attgtgtcat gcatatgtgt gagtaaaagt taaataatca 960 ccaagctcga atccaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaa 999
说明：透明方框中的表示起始密码子，而灰色方框内的
表示终止密码子。
（2）SEQ.ID.NO.2的信息
（a）序列特征
长度：237个氨基酸
类型：氨基酸
拓扑结构：线性
（b）分析类型：蛋白质
（c）序列描述：SEQ.ID.NO.2
MET Ala Lys Arg Thr Gln Arg Cys Glu Lys Thr Val Ala Val Lys
1 5 10 15
Lys Gly Pro Trp Ser Pro Glu Glu Asp His Lys Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Ile Gln Arg Tyr Gly Ile Trp Asn Trp Ser Arg MET Pro Lys Pro
35 40 45
Ala Gly Leu Ala Arg Ser Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Val
50 55 60
Asn Tyr Leu Arg Pro Asp Ile Lys Arg Gly Asn Phe Gly Lys Asp
65 70 75
Glu Glu Glu Thr Ile Leu Glu Leu His Gln Ala Ile Gly Asn Arg
80 85 90
Trp Ser Ala Ile Ala Ala Arg Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu
95 100 105
Ile Lys Asn Tyr Trp His Thr His MET Lys Lys Arg Phe Lys Ala
110 115 120
Gly Ile Glu Ser Val His Glu Glu Ala Lys Gly Ser Gly Asp Lys
125 130 135
Glu Ala Ser Lys Asn Lys Leu Ser Glu Ala Gly Gln Leu Phe Leu
140 145 150
Val Asp Glu Ala Thr Lys Val Ala Ser Leu Lys Ser Glu Ala Thr
155 160 165
Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Phe Pro Val Trp Glu Phe Asp
170 175 180
Asp Gln Lys Gly Gln Ile Ala Glu Gln Ser Val Cys Ala Ser Asp
185 190 195
Val Thr Phe Gly Glu Leu Gln Ser Leu Asp Ser Gln Val Trp Gln
200 205 210
Gln Glu Pro Ile Phe Pro Cys Asp Ser Tyr Ile Asn His Val Thr
215 220 225
Ser Asp Tyr Trp Val Ser Leu Ile Asp Lys Thr Gly
230 235
本发明提供了苹果逆境抗性相关基因MdSIMYB1在烟草、苹果和其它植物中应用的方法，可提高转基因植物抵抗干旱、低温和盐碱等逆境的能力。步骤为：
（a）利用如上所述的MdSIMYB1基因，将cDNA序列置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体。
（b）采用本领域熟知的方法，如农杆菌介导的方法将构建的表达载体导入植物细胞，得到转基因植株。
本发明涉及一种植物表达载体，包含核苷酸序列SEQ.ID.NO.1，用于提高植物抗逆境能力，尤其是抗干旱、低温和盐碱的能力。
本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，导入方法是本领域人员熟知的农杆菌介导转化法，得到抗干旱、低温和盐碱的转基因植物。
基于草本植物烟草Nc89生长速度快、生活周期短、离体培养再生能力强、遗传转化效率高，而木本植物苹果生活周期长，遗传转化效率低等特点，在下述实例中以烟草Nc89和苹果两种植物为例对本发明进行了详细的说明，但本发明中MdSIMYB1基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它提高抗逆境能力的转基因植物。
苹果为多年生木本植物，通过常规育种选育抗性品种周期长。本发明从苹果中分离到了一个R2R3类型的MYB家族基因MdSIMYB1，通过在烟草和苹果中转基因功能验证表明：它在抵抗外界干旱、低温和高盐中有明显作用。而转基因烟草、苹果抗逆性的提高，提供了一种新的、快速的育种途径，尤其是在转基因苹果砧木中，MdSIMYB1基因的发掘不仅能为苹果抗逆基因工程提供新的基因源，丰富植物抗逆基因工程理论体系，而且对于培育其它植物的抗逆种质材料（包括一年生植物和多年生木本植物）也具有重要的现实意义。
本发明采用离体叶片接种法对获得的T3代转基因烟草和苹果进行抗逆能力分析发现，转基因烟草和苹果中MdSIMYB1的过量表达能显著提高其抗干旱、低温和盐碱的能力。植物一生都生活在各种各样的逆境条件中，可将该基因转化苹果、梨、杨树等木本植物，或小麦、玉米等农作物（草本植物），提高转基因植株的抗逆境能力，提高其产量和品质，具有重大的经济效益和社会价值。
四、附图说明
图1：苹果中MdSIMYB1蛋白结构保守域示意图及不同R2R3类型的MYB家族植物的氨基酸序列的同源性比较。
A.苹果的MdSIMYB1蛋白结构保守域示意图；B.不同R2R3类型的MYB家族植物的氨基酸序列的同源性比较。其中，atMYB10（拟南芥NM_112118.2）、atMYB63（拟南芥AK175344.1）、atMYB72（拟南芥NM_104495.1）、VvMYB4（葡萄XM_002281466.2），R2、R3分别表示MYB家族基因的特征结构域。
图2：苹果中MdSIMYB1蛋白的进化树分析。
其中，atMYB10（拟南芥NM_112118.2）、atMYB72（拟南芥NM_104495.1）、atMYB63（拟南芥AK175344.1）、atMYB6（拟南芥NM_117014.2）、atMYB94(拟南芥NM_114628.3）、atMYB112(拟南芥NM_103696.2）、atMYB13(拟南芥NM_100499.1）、VvMYB4（葡萄XM_002281466.2）、GmMYB88（大豆DQ822902.1）、GmMYB4(大豆NM_001254089.1)、OsMYB4（水稻D88620.1），MdMYB23(苹果DQ074471.1）、NtLBM4（烟草AB028652.1）、NtMYB1（烟草U72762.1），Rr-MYB17（玫瑰FR828550.1）。
图3：MdSIMYB1基因在苹果不同组织中的相对表达量，及在不同逆境处理条件下该基因的相对表达量。
A．MdSIMYB1基因在嘎啦苹果不同组织（根、叶、茎、花、幼果）中的相对表达量；B1～B3．分别经200mM NaCl、4℃低温（chilling）、干旱(dehydration)处理0h、6h、12h、24h、48h、72h嘎啦苹果组培苗，MdSIMYB1基因的相对表达量。其中，根（root）、叶（leave）、茎（stem）、花（flower）、幼果（fruit）；h表示小时。
图4：野生型和过量表达MdSIMYB1的转基因烟草5周苗经不同逆境处理后的生长情况。
A、野生型烟草和转基因烟草株系的半定量RT-PCR检测；B1、正常管理条件下培养5周烟草生长情况；B2.生长量一致的5周烟草苗，经200mM NaCl处理12天，正常浇水管理8天后的生长情况；B3.生长量一致的5周烟草苗，连续15天不浇水做干旱处理，浇水3天后的生长恢复情况；B4.生长量一致的5周烟草苗，4℃低温处理6天，25℃正常温度培养3天后的生长情况。其中，WT：对照；M1～M8：过量表达的转基因株系。
图5：培养2周的生长量一致的嘎啦苹果组培苗和转基因组培苗（MdSIMYB1基因过量表达或抑制表达），经不同逆境处理后的生长情况。
A、野生型苹果和转基因苹果株系（抑制表达或过量表达）的半定量RT-PCR检测；B1.在添加200mM NaCl的MS培养基上生长2周的情况；B2.在添加6%PEG MS培养基上生长2周的情况；B3.在4℃低温条件培养7天，22℃正常温度恢复4天的生长情况。其中，WT：对照；RT1-RT2:抑制表达的转基因株系；T1～T12：过量表达的转基因株系。
图6：生长2个月且长势一致的嘎啦苹果生根苗和转基因生根苗（MdSIMYB1基因过量表达或抑制表达），经不同逆境处理后的生长情况。
A、经200mM NaCl处理3次（3天处理1次），正常管理至20天的生长恢复情况；B.连续15天不浇水做干旱处理，正常浇水管理6天后生长恢复情况；C.4℃低温条件培养7天后，22℃正常温度培养10天的生长恢复情况。其中，WT：对照；RT2:抑制表达的转基因株系；T1、T2、T12：过量表达的转基因株系。
五、具体实例方式
以下结合具体实例，对本发明进行详细说明。
实例1：苹果MdSIMYB1基因的克隆。
一）利用CTAB法提取总RNA，具体方法如下：
1)取1.5g经200mM NaCl盐处理24小时的嘎啦苹果组培苗，放入预冷的研钵，加液氮磨碎，转入预冷的50ml离心管中；
2)迅速加入10ml预热到65℃的提取缓冲液（其中PVP和巯基乙醇现用现加），轻轻混匀，65℃水浴中0.5小时；
提取缓冲液：
| CTAB | 20%（w/v） |
| Tris-HCI | 0.1mol/l |
| EDTA | 25mmol/l |
| NaCI | 2mol/l |
| 巯基乙醇 | 2%（w/v） |
| PVP | 2%（w/v） |
| RNase free ddH2O | 定容到100ml |
3)加入与上步离心管液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混合物，冰浴振荡0.5小时，4℃、12,000rpm离心20分钟；将上清液转移到新的50ml离心管中；
4)加入1/3上清液体积的10mol/L预冷LiCl，-20℃放置3小时，12,000rpm离心30分钟，弃上清液；
5)加入500μl SSTE缓冲液充分悬浮沉淀后，平均分装到2支1.5ml离心管中；
SSTE缓冲液：
| NaCI | 1mol/l |
| SDS | 0.5%（w/v） |
| EDTA | 10mmol/l |
| RNase free ddH2O | 定容到10ml |
6)分别加入与悬浮液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混合物，冰浴振荡10分钟，4℃、12,000rpm离心10分钟；将上清液转移到新的1.5ml离心管，
7)分别加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合物，冰浴振荡10分钟，4℃、12,000rpm离心10分钟；将上清液转移到新的1.5ml离心管；
8)加入2.5倍上清液体积的预冷无水乙醇，-20℃放置1-2小时；
9)于4℃、12,000rpm离心20分钟，70%乙醇洗2次；
10)于4℃、14,000rpm离心10分钟，超净台上风干沉淀；加入20μl DEPC水溶解RNA。
11)置-80℃储藏，备用,或立即进行以下反转录实验。
二）反转录cDNA第一链的合成
1）在0.2ml的微量离心管中配制下列混合液（其中RNA为实例1步骤一）提取获得的；如果用的是-80℃储藏RNA，必须让其在冰上缓慢融解）：
| RNA | 2μg |
| Oligo(dT) Primer(50μM) | 1μl |
| dNTP Mixture(10mM each) | 1μl |
| RNase free ddH2O | Up to 10μl |
2）用枪头轻轻混匀，将微量离心管放在PCR仪上（65℃5分钟）进行变性、退火反应，然后冰上急冷；
3）在上述微量离心管中继续配制下列反转录反应液。
| 上述变性、退火后反应液 | 10μl |
| 5×PrimeScriptTM Buffer | 4μl |
| RNase Inhibitor(40U/μl) | 0.5μl |
| PrimeScriptTM RTase(200U/μl) | 1μl |
| RNase free ddH2O | 4.5μl |
| Total | 20μl |
4）在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：30℃10分钟，42℃60分钟，70℃15分钟，4℃保存。合成的反转录产物cDNA，用于进行后面的相关实验。
三）cDNA末端加尾
利用TdT末端转移酶，在实例1步骤二）反转录合成的cDNA 3’末端加上Poly(C)尾巴，以此为模板进行5’RACE扩增。
在1.5ml离心管中依次加入下列试剂，终体积为50μl。
| 纯化cDNA产物 | 25μl |
| 5×TdT Buffer | 10μl |
| 0.1%BSA | 5μl |
| 10mM dCTP(终浓度0.5mM) | 2.5μl |
| TdT | 15U |
| ddH2O | Up to 50μl |
1)37℃反应30分钟；
2)加入50μl（等体积）的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀；离心，取上层（水层）至另一新的1.5ml离心管中；
3)加入50μl（等体积）的氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀；离心，取上层（水层）至另一新的1.5ml离心管中；
4)加入5μl（1/10体积）3M NaAC（pH5.2），再加入125μl（2.5倍体积）预冷的无水乙醇，-20℃放置30-60分钟；
5)4℃、12,000rpm离心15分钟，70%乙醇洗2次；
6)4℃、12,000rpm离心10分钟，超净台上风干沉淀；用20μl无菌水溶解DNA，4℃保存。获得的加尾cDNA作为模板用于后面的5′RACE扩增。
四）cDNA全长序列的获得
1）MdSIMYB1同源序列的扩增
根据NCBI查到的拟南芥中MYB基因家族的保守氨基酸序列，设计兼并引物（5P1和3P1），以实例1步骤二）反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。
5P1：5’-AGGWSNSKNAAGAGTTGTAGACTT-3’其序列如SEQ.ID.NO.3所示；
3P1：5’-TGCVMNSRNGCTTCCCGGAAGAAYG-3’其序列如SEQ.ID.NO.4所示；
PCR扩增体系（以下进行的双引物PCR反应均用此体系）
| 10×PCR buffer（含Mg2+） | 2.5μl |
| dNTP（2.5mM/l） | 2.0μl |
| 引物1（10μM/l） | 1.0μl |
| 引物2（10μM/l） | 1.0μl |
| cDNA或基因组DNA模板 | 1.0μl |
| Taq酶 | 0.2μl |
| ddH2O | Up to 25.0μl |
PCR反应程序：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性30秒、56℃退火45秒、72℃延伸90秒，进行32个循环；72℃充分延伸10分钟。
PCR反应结束后，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳以检测是否有适当大小的条带，并将PCR产物回收（回收根据Takara公司“Agarose Gel DNA Purification Kit”操作）、载体连接（取3.0μlPCR回收产物与pMD18-T载体连接，操作步骤按pMD18-T Vector说明书进行）、转化（连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在表面涂有IPTG/X-Gal的LB平板培养基上，37℃倒置培养12-20小时；挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜）、序列测定（将摇好的菌取1ml放到1.5ml离心管中，密封，送到北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序）。得到MdSIMYB1基因的中间片段序列。
2）MdSIMYB15’RACE扩增
根据实例1步骤四）中1）获得的中间片段序列，设计嵌套PCR引物（3P2和3P3）进行5’RACE扩增。第一轮PCR扩增以实例1步骤三）获得的加尾cDNA为模板，利用通用引物AAP和基因引物3P2进行PCR扩增。第二轮PCR扩增以第一轮的PCR产物为模板，以通用引物AUAP和基因引物3P3进行新一轮PCR扩增。第一轮PCR扩增反应程序为：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒，进行35个循环；72℃充分延伸10分钟。第二轮PCR扩增反应程序与第一轮相同。
AAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3’其序列如SEQ.ID.NO.5所示；
3P2：5’-CTACAACTCTTCCCGGACCT-3’其序列如SEQ.ID.NO.6所示；
AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’其序列如SEQ.ID.NO.7所示；
3P3：5’-ACCATCGGTTTCCTATTGCT-3’其序列如SEQ.ID.NO.8所示；
PCR反应结束后，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳、PCR产物回收、载体连接、转化、测序，具体步骤同实例1步骤四）中的1）。得到MdSIMYB1基因的5′序列。
3）MdSIMYB13’RACE扩增
根据实例1步骤四）中1）获得的中间片段序列，设计嵌套PCR引物（5P2和5P3）进行3’RACE扩增。第一轮PCR反应以实例1步骤二）反转录合成的cDNA为模板，以基因引物5P2和通用引物B26，进行PCR扩增。第二轮PCR反应以第一次的PCR产物为模板，利用引物5P2和B25进行新一轮PCR扩增。第一轮PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒，进行35个循环；72℃充分延伸10分钟。第二轮PCR反应程序与第一轮相同。
5P2：5’-AGTTGTAGACTTCGTTGGGT-3’其序列如SEQ.ID.NO.9所示；
B26：5’-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’其序列如SEQ.ID.NO.10所示；
5P3：5’-ATGGTCTGCTATTGCAGCAAG-3’其序列如SEQ.ID.NO.11所示；
B25：5’-GACTCGAGTCGACATCGA-3’其序列如SEQ.ID.NO.12所示；
PCR反应结束后，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳、PCR产物回收、载体连接、转化、测序，具体步骤同实例1步骤四）中的1）。得到MdSIMYB1基因的3′序列。
4）cDNA全长序列的获得
运用DNAMAN软件，根据实例1步骤四）中1）、2）、3）所得的测序序列及其重叠区域，拼接出目的基因的全长cDNA，据此拼接序列设计引物5P4和3P4，以实例1步骤二）反转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增全长序列，从而得到完整的cDNA全长。PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性60秒、56℃退火60秒、72℃延伸90秒，进行35个循环；72℃充分延伸10分钟。
5P4：5’-ATGGCGAAAAGGACTCAG-3’其序列如SEQ.ID.NO.13所示；
3P4：5’-GAAGAACAAACAGTTGACGG-3’其序列如SEQ.ID.NO.14所示；
PCR反应结束后，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳、PCR产物回收、载体连接、转化、测序，具体步骤同实例1步骤四）中的1），得到苹果逆境相关基因MdSIMYB1，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。挑取测序正确的pMD18-T-MdSIMYB1单克隆，碱法提取其质粒DNA，-20℃保存，用于后续功能验证实验。
实例2：苹果MdSIMYB1氨基酸序列分析
一）MdSIMYB1与atMYB10、atMYB63、atMYB72、VvMYB4氨基酸序列比对
1）MdSIMYB1基因全长cDNA为999bp，其中编码区含有711bp的核苷酸，利用DNASTAR等软件进行序列分析，苹果MdSIMYB1基因编码237个氨基酸，推导其编码蛋白大小为26.93kD，pI为8.04。利用NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的数据库和expasy网站（http://www.expasy.org/）的分析软件，对MdSIMYB1蛋白预测序列的功能结构域和保守域进行比较分析，结果发现：MdSIMYB1预测蛋白包含MYB家族特有的两个保守功能域R2R3(其中R2包括15-65位氨基酸，R3包括68-116位氨基酸)，结果见附图1A。
2)从NCBI数据库中搜索出atMYB10(NM_112118.2)、atMYB63(AK175344.1)、atMYB72（NM_104495.1）、VvMYB4（XM_002281466.2）的氨基酸序列。
3）运用DNAMAN软件，将MdSIMYB1（SEQ.ID.NO:2）与atMYB63、atMYB72、atMYB10、VvMYB4的氨基酸序列进行比对。结果发现：MdSIMYB1与atMYB10（NM_112118.2）、atMYB63（AK175344.1）、atMYB72（NM_104495.1）、VvMYB4（XM_002281466.2）具有较高的同源性，尤其在N端具有典型MYB家族的R2R3结构域（附图1B），属于MYB家族，为苹果中调控逆境的基因。
二）与不同物种中MYB家族的蛋白聚类分析
1）NCBI数据库中搜索出拟南芥atMYB10（NM_112118.2）、atMYB72（NM_104495.1）、atMYB63（AK175344.1）、atMYB6（NM_117014.2）、atMYB94(NM_114628.3）、atMYB112(NM_103696.2）、atMYB13(NM_100499.1），葡萄VvMYB4（XM_002281466.2），大豆GmMYB88（DQ822902.1）、GmMYB4(NM_001254089.1)，水稻OsMYB4（D88620.1），苹果MdMYB23(DQ074471.1），烟草NtLBM4（AB028652.1）、NtMYB1（U72762.1），玫瑰Rr-MYB17（FR828550.1）的氨基酸序列。
2）利用CLUSTALX ver.1.8(http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/)软件构建系统进化树，对不同物种中MYB家族的蛋白进行聚类分析，发现苹果MdSIMYB1与拟南芥atMYB10的亲缘关系最近（附图2）。
实例3：MdSIMYB1基因的组织特异性表达和对逆境的响应
（1）取嘎啦苹果不同组织：根、叶、茎、花、幼果，液氮中迅速固定。
（2）分别提取上述各组织总RNA，并反转录为cDNA，方法同实例1中的步骤一）及二)。
（3）在MdSIMYB1基因的非保守区设计特异引物5P5和3P5和苹果的内参引物Md18S-F和Md18S-R。
Md18S-F：5’-AAACGGCTACCACATCCA-3’其序列如SEQ.ID.NO.15所示；
Md18S-R：5’-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’其序列如SEQ.ID.NO.16所示；
5P5：5’-GAATTCGACGATCAAAAAGGCC-3其序列如SEQ.ID.NO.17所示；
3P5：5’-GGATTCGAGCTTGGTGATTAT-3’其序列如SEQ.ID.NO.18所示；
（4）以实例3步骤（2）中所得的cDNA为模板，用苹果内参引物Md18S-F和Md18S-R进行PCR反应，调整这些cDNA模板的浓度，使各cDNA模板浓度一致。
PCR反应程序为：94℃预变性3分钟；循环参数为94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行20-25个循环；72℃后延伸l 0分钟。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上做电泳分析，用Lab Assistant TM Gel 3000Series凝胶成像分析仪检测条带亮度，据条带亮度结果将cDNA稀释至适当倍数，使其浓度一致。
（5）用浓度一致的cDNA模板进行半定量RT-PCR，检测MdSIMYB1基因经逆境处理后的表达差异。
PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸45秒，运行30个循环；72℃后延伸10分钟。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测分析。结果显示，MdSIMYB1基因在所研究的各个组织和器官中均有不同程度的表达，其中叶中的表达量较高（附图3A）；表明该基因在嘎啦苹果中呈组成性表达，仅表达量有组织差异性。
（6）将生长状况一致的苹果嘎啦组培苗，分别用200mM NaCl、4℃低温、干旱（自然风干）处理苹果组培苗0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时，用未处理的状态一致的材料做对照。材料取好后液氮中迅速固定，后续试验过程同实例3中步骤(2)-(5)。结果显示MdSIMYB1基因经盐、低温、干旱胁迫处理后表达上调，表明该基因受盐、低温和干旱胁迫诱导（附图3B1～B3）。
实例4：MdSIMYB1基因载体的构建
一）MdSIMYB1基因过量表达载体的构建
为研究MdSIMYB1基因的功能，将包含有MdSIMYB1基因编码区在内的共812bp片段正确插入表达载体PBI121上。
（1）利用DNAMAN等软件，根据分离出的MdSIMYB1基因的核苷酸序列（SEQ.ID.NO:1），设计带酶切位点的引物5P6和3P6，以实例1步骤四）中4）所保存的pMD18-T-MdSIMYB1的质粒DNA为模板，进行PCR反应。
5P6：5’-GCTCTAGAATGGCGAAAAGGACTCAG-3’其序列如SEQ.ID.NO.19所示；
划横线部分为Xba Ⅰ酶切位点;
3P6：5’-GCGTCGACGAAGAACAAACAGTTGACGG-3’其序列如SEQ.ID.NO.20所示；
划横线部分为Sal Ⅰ酶切位点;
（2）PCR反应结束后，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳、PCR产物回收、载体连接、转化、测序，具体步骤同实例1步骤四）中的1）。碱法提取其质粒DNA，用Xba Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，鉴定正确后用于后面的实验。
（3）用Xba Ⅰ和Sal Ⅰ两个内切酶，同时双酶切实例4步骤一）中的（2）所得质粒DNA与p BI121质粒，回收MdSIMYB1的片段和pBI121载体片段，用T4连接酶将二者连接起来。筛选阳性克隆进行测序，从中选择正确的重组子pBI121-MdSIMYB1。
（4）用构建好的重组子pBI121-MdSIMYB1转化农杆菌LB4404感受态细胞。进行PCR鉴定，挑取阳性菌落进行测序。测序正确的重组子pBI121-MdSIMYB1单克隆用于后面烟草和苹果的转化。
二）MdSIMYB1基因反义表达载体的构建
根据同源性比较，MdSIMYB1的C端是非保守区。为进一步研究MdSIMYB1基因的功能，将MdSIMYB1C端部分非保守区的330bp序列片段反向插入到表达载体PBI121上。
（1）利用DNAMAN等软件，在MdSIMYB1的C端非保守区设计带酶切位点的引物5P7和3P7，以实例1步骤四）中4）所保存的pMD18-T-MdSIMYB1的质粒DNA为模板，进行PCR扩增。
5P7：5’-GCGTCGACGTCGGAGGCAACTTGGGCAG-3’其序列如SEQ.ID.NO.21所示；
划横线部分为Sal Ⅰ酶切位点；
3P7：5’-GCTCTAGAGAAGAACAAACAGTTGACGG-3’其序列如SEQ.ID.NO.22所示；
划横线部分为Xba Ⅰ酶切位点；
（2）将扩增片段连接到克隆载体pMD18-T载体上，并用基因下游引物3P7与载体引物M13-47筛选反向连接的阳性克隆、测序确定。测序正确的单克隆，碱法提取pMD18-T-anti-MdSIMYB1的质粒DNA。
M13-47：5’-CCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATT-3’其序列如SEQ.ID.NO.23所示；
（3）将构建好的pMD18-T-anti-MdSIMYB1质粒和p BI121同时进行SalI/XbaI双酶切，并连接、转化，筛选得到序列正确的重组子pBI121-anti-MdSIMYB1。
（4）用pBI121-anti-MdSIMYB1重组子转化农杆菌感受态LB4404，并进行PCR鉴定，挑取阳性菌落进行测序。测序正确的重组子pBI121-anti-MdSIMYB1单克隆用于后面苹果的转化。
实例5：转基因烟草的获得
1）移栽成活的烟草Nc89苗长至5～6片真叶时即可用于叶片侵染转化。
2）挑取正确的农杆菌单克隆菌落接种于5mL YEP液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为06-0.8(约48小时)；取其中lmL菌液加入20mL新鲜YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为06-0.8（约5小时）。离心收集菌体，用MS液体培养基悬浮稀释20倍，备用；
3）取健壮的烟草叶片消毒：70%乙醇30秒，4%次氯酸钠8分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。无菌叶片剪成小块（1×1cm），置于分化培养基上，28℃，光照时间16小时/天，光照强度2000Lux，预培养2天。
4）将经预培养的烟草叶片浸入菌液10分钟(期间摇晃几次)，用无菌滤纸吸干多余菌液，转移至MS基本培养基上，封口，28℃暗培养2天。
5）共培养后的烟草叶用含羧苄青霉素(250mg/l)的无菌水洗涤3次，再用含羧苄青霉素(250mg/l)的MS液体培养基洗1次，用灭菌滤纸吸干，移至分化培养基（含100mg/l卡那霉素和250mg/l羧苄青霉素）上培养(条件：28℃，光照时间16小时/天，光照强度2000Lux）。每15天更换一次培养基。
6）待芽长至1cm左右时，切下，部分继续继代培养，部分移入MS生根培养基(含100mg/l卡那霉素和250mg/l羧苄青霉素）上进行生根。根系发育好后（即5～6片真叶时期），炼苗后移入盛有基质的营养钵中，温室常规管理。
烟草分化培养基：MS+6-BA 3mg/l+NAA 0.2mg/l
烟草生根培养基：1/2MS或MS+IAA 0.1mg/l
注：材料消毒处理、侵染、接种等都在超净工作台上进行。
实例6：转基因苹果的获得
1）预培养
选取培养25-35d嘎啦组培苗顶部3-4片展开的嫩叶（称为外植体），用手术剪在垂直于叶中脉方向轻划1-2道。叶片正面朝上接种在预培养基上，暗培养2天；同时活化好转化用的农杆菌菌液（具体步骤同实例5中的2））。
2）侵染
用无菌MS液体培养基将活化好的农杆菌稀释20倍，侵染外植体20分钟(期间摇晃几次)。用无菌滤纸将菌液吸干，移至MS基本培养基上，暗培养两天。
3）洗菌
共培养后的苹果叶片用含羧苄青霉素(250mg/l)的无菌水洗涤3次，再用含羧苄青霉素(250mg/l)的MS液体培养基洗1次。
4）分化培养
将清洗过的苹果叶片移到含羧苄青霉素(250mg/l)和卡那青霉素100mg/l的分化培养基上，28℃暗培养3周。更换新的分化培养基，并转移到28℃光下（2000Lux，光照时间16小时/天）培养。抗性再生芽分化出后，选取抗卡那霉素的新梢，在增殖培养基上扩繁；每2-3周继代1次。
注：材料消毒处理、侵染、接种等都在超净工作台上进行。
嘎啦苹果组培苗增殖培养基：MS+6-BA 0.5mg/l+NAA 0.15mg/l
嘎啦苹果再生培养基：MS+TDZ 2.0mg/l+IAA 0.2mg/l
实例7：转基因烟草和苹果植株的基因组DNA分子鉴定
CTAB法提取转基因植株不同株系及野生型植株基因组DNA，以此为模板，用CaMV35S启动子序列上的引物35S与基因MdSIMYB1的下游引物3P4进行PCR扩增，能够扩增得到清晰条带的为转基因植株。
35S：5'-CGCACAATCCCACTATCCTT-3'其序列如SEQ.ID.NO.24所示；
实例8：转基因烟草抗干旱、低温和盐碱能力分析
为了确定转基因植株的功能，我们对T3代转基因烟草株系进行抗逆境能力分析。
（1）MdSIMYB1基因在T3代转基因烟草不同株系的相对表达量。
通过抗生素（含100mg/l卡那霉素）筛选后的烟草转化株系，根据实例7中的方法进行基因组DNA分子鉴定，从获得的转基因烟草株系中随机挑选8个T2代株系，提取相应的RNA，进行半定量RT-PCR检测（具体方法见实例3，烟草的内参引物为：NtACTIN-F和NtACTIN-R），以确定这些转基因株系中MdSIMYB1基因的表达水平。结果显示，MdSIMYB1基因在不同株系中的表达量不同，其中M7表达量最高（附图4A），选取表达量较高的3个株系M2、M7、M8，单株收取种子，从而得到相应的T3代种子，进行后续转基因功能验证实验。
NtACTIN-F:5'-TACCTAGGAGTCGTTCGC-3'其序列如SEQ.ID.NO.25所示；
NtACTIN-R:5'-ATGGCAACTTAATTACGG-3'其序列如SEQ.ID.NO.26所示；
（2）T3代生长5周的烟草大苗经不同逆境处理后生长情况：
将T3代转基因烟草种子M2、M7、M8和野生型对照WT，种在装有无菌土的花盆中，正常管理生长5周。取不同株系状态良好且均一的转基因烟草和非转基因烟草，分别进行以下逆境处理：生长量一致的5周烟草苗，用200mM NaCl处理12天，正常浇水管理8天后观察生长状况；生长量一致的5周烟草苗，连续15天不浇水做干旱处理，恢复正常浇水3天后观察生长状况；生长量一致的5周烟草苗，4℃低温处理6天，25℃正常温度培养3天后观察生长状况。结果显示：200mM NaCl逆境处理12天、8天恢复生长后，野生型烟草几乎萎蔫死亡，不能恢复正常生长，而转基因植株已经恢复正常生长，长势良好；同样经过15天的干旱处理及3天恢复生长后，野生型烟草萎蔫未能恢复正常生长，而转基因植株基本恢复正常生长，且该基因的表达量越高，植株正常恢复情况越好；4℃低温处理后也表现出了相似的表型（附图4B1～B4）。以上结果说明：MdSIMYB1基因转入烟草中，提高了转基因烟草植株的抗盐、抗旱及抗低温能力。
实例9：转基因嘎啦苹果组培苗抗干旱、低温和盐碱能力分析
为了进一步确定转基因植株的功能，我们对转基因嘎啦苹果组培苗进行抗逆境能力分析。
（1）MdSIMYB1基因在转基因苹果不同株系的相对表达量。
利用筛选培养基（含100mg/l卡那霉素）筛选抗卡那霉素阳性的候选转基因株系，共获得2个35S：anti-MdSIMYB1阳性株系（RT1和RT2）和12个35S：MdSIMYB1阳性株系(T1-T12)；为进一步鉴定转基因株系，在进行继代培养时，每株系各取0.1g左右的组培苗，提取相应的RNA，进行半定量RT-PCR检测（具体方法见实例3），以确定这些株系中MdSIMYB1基因的表达水平。结果显示，MdSIMYB1基因在RT2中的表达水平明显受到抑制，而在T1、T2、T10和T12中过量表达（附图5A）。从中选取RT2为抑制表达株系，T1、T2和T12为过量表达株系，进行继代扩繁，为MdSIMYB1基因的功能鉴定准备材料。
（2）逆境处理：取不同株系（RT2、T1、T2、T12和野生型）继代培养生长2周、状态良好且均一的嘎啦苹果组培苗，分别进行以下逆境处理：转移到添加200mM NaCl的MS培养基上生长2周；转移到添加6%PEG MS培养基上生长2周；或在4℃低温条件培养7天，22℃正常温度恢复4天的生长情况。
（3）结果观察：在添加盐的培养基上进行2周的逆境处理后，野生型嘎啦苹果组培苗WT的长势比过量表达株系T1、T2、T12差，但是比转反义基因（抑制了该基因的表达）的株系RT2长势好；用6%PEG模拟干旱处理2周，或4℃低温处理7天，恢复生长4天后都出现类似表型，即野生型嘎啦苹果组培苗WT长势不如过量表达的株系(T1、T2、T12)，但比转反义的株系RT2好（附图5B1～B3）。这些结果表明：促进MdSIMYB1基因的表达，即该基因的表达量高可以提高植株的抗盐、抗旱和抗低温等抗逆能力；而抑制该基因的表达，即基因的表达量低的株系抗盐、抗旱和抗低温等抗逆能力大大下降，说明MdSIMYB1基因是一个与植物抗逆相关的基因。
实例10：转基因嘎啦苹果幼苗抗干旱、低温和盐碱能力分析
为更进一步确定转基因植株的功能，我们对转基因嘎啦苹果幼苗进行抗逆境能力分析，以确认该基因在苹果幼苗中的功能。
（1）生根培养：取不同株系（RT2、T1、T2和T12）继代培养生长2周、状态良好且均一的转基因嘎啦苹果组培苗和野生型嘎啦苹果组培苗，转至生根培养基上进行生根培养。
嘎啦苹果生根培养基：1/2MS或MS+IAA 0.2mg/l
（2）幼苗移栽：3周后根系长出，进行土壤移栽：把生根苗组培瓶盖子打开，培养基上浇水1周（防止苗子萎蔫）后，将生根苗上的培养基用清水冲洗干净（注意不要伤害幼根），幼苗栽种到装有无菌土的花盆中，同时进行覆膜喷水防止幼苗萎蔫。一个月后幼苗移栽成活后，备用。
（3）逆境处理：选择生长状态良好且均一的4个转基因株系（RT2、T1、T2、T12）和野生型WT的嘎啦苹果幼苗，进行以下不同的逆境处理：用200mM NaCl处理3次（3天处理1次）后，正常管理至20天，生长恢复的情况；连续15天不浇水（干旱处理）后，正常浇水管理6天后的生长恢复情况；4℃低温条件培养7天后，在22℃正常温度培养10天的生长恢复情况。
（4）结果观察：在盐处理后，野生型株系WT和转反义基因的株系RT2萎蔫，几乎不能恢复正常生长，而过量表达的3个株系T1、T2、T12都恢复了正常生长。同样地，经过干旱处理和低温处理的生根幼苗也表现出了类似的结果（附图6A、B、C）。这些结果充分说明了MdSIMYB1基因是一个抗逆相关的基因，该基因的过量表达可以提高转基因植株的抗逆性。
根据上述技术，从苹果中分离到了一个R2R3类型的MYB基因MdSIMYB1，通过在烟草和苹果中转基因功能分析看出：它在抵抗外界干旱、低温和高盐中有明显作用。可将该基因转化小麦、玉米、棉花等一年生农作物，或苹果、梨等多年生木本植物，提高其抗逆境能力，尤其是抗盐、干旱和低温的能力，提高其产量和品质，具有重要的经济效益和社会效益。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
Claims (4)
1.一种苹果MdSIMYB1基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种苹果MdSIMYB1基因，其特征在于该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.如权利要求1所述的一种苹果MdSIMYB1基因在烟草中的应用，能提高转基因烟草抗干旱、抗盐和抗低温能力。
4.如权利要求1所述的苹果MdSIMYB1基因在转基因苹果中的应用，能提高转基因苹果抗干旱、抗盐和抗低温的能力。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121010 |