CN111304240A - 基于烟草瞬时表达体系快速鉴定葡萄基因功能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及涉及生物技术领域，具体涉及一种基于烟草瞬时表达体系快速鉴定葡萄基因功能的方法。本发明通过使用病毒诱导烟草的基因沉默(virus‑induced gene silencing，VIGS)方法能够有效地反映葡萄基因的功能。操作简单，为探究葡萄未知基因的功能提供初步信息，也为其他难以遗传转化的植物物种中开展基因功能研究提供参考方法。

Description

基于烟草瞬时表达体系快速鉴定葡萄基因功能的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于烟草瞬时表达体系快速鉴定葡萄基因功能的方法。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)属于转录后基因沉默，VIGS技术凭借高效、快速的特点成为鉴定基因功能的有力工具。其中，烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)具备沉默效率高、长持久性、病毒感染症状轻等优点，在烟草、番茄和草莓等果蔬基因功能鉴定中得到了广泛的应用。TRV属于一种RNA病毒，病毒粒体呈直杆形状极其稳定，其基因组包含两条RNA链：RNA1和RNA2。RNA1可以编码形成RNA依赖的RNA聚合酶、运动蛋白和富含半胱氨酸的蛋白质，RNA2可以编码衣壳蛋白和插入目的基因片段的酶切位点。因此，TRV介导的基因沉默需要RNA1和RNA2两者同时发挥作用。在实际应用过程中，将两个载体分别转入到农杆菌中，侵染前将两者混合后对植物进行共注射。侵染后短期就可以抑制基因表达，抑制效果具有持续性，由于操作简单便捷，可以实现目的基因的高通量功能分析。

葡萄(Vitis vinifera L.)属于葡萄科，葡萄属。作为多年生落叶藤本植物，葡萄具有超过7000年的栽培历史，具有较高的经济价值，是目前我国最重要的经济果树之一。葡萄基因组于2007年被公布，是第一种被测序的果树。但葡萄基因的功能研究工作远远落后于模式植物拟南芥以及杨树等，尚有许多葡萄基因的功能未被明确，究其原因就是遗传转化周期长，操作复杂并且转化效率低。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于烟草瞬时表达体系快速鉴定葡萄基因功能的方法，并且利用该方法明确了两个未研究的葡萄基因的功能。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供如下1)-3)任一项所述的基因片段在构建基于烟草脆裂病毒的病毒诱导基因沉默载体中的应用；

1)葡萄PDS基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)葡萄UAP56a基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3)葡萄MOS3基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二方面，提供一种病毒诱导基因沉默载体，包括：pTRV1载体和连接有目的基因片段的pTRV2载体。

优选的，所述目的基因片段为如下1)-3)任一项所述：

1)葡萄PDS基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)葡萄UAP56a基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3)葡萄MOS3基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述目的基因片段插入到pTRV2载体的Pst I酶切位点之间。

本发明的第三方面，提供上述病毒诱导基因沉默载体在快速鉴定葡萄基因功能中的应用。

本发明的第四方面，提供一种快速鉴定葡萄基因功能的方法，包括以下步骤：

将pTRV1载体和携带葡萄糖目的基因片段的pTRV2载体侵染烟草，根据侵染后的烟草表型变化，对葡萄基因的功能进行鉴定。

本发明的第五方面，提供葡萄UAP56a基因作为植株生存的关键基因在调控植株基本生命活动中的应用；所述葡萄UAP56a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明的第六方面，提供葡萄MOS3基因在调控植株的株高、株幅、叶长和叶宽中的应用；所述葡萄MOS3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明的有益效果：

本发明通过使用病毒诱导烟草的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)方法能够有效地反映葡萄基因的功能。操作简单，为探究葡萄未知基因的功能提供初步信息，也为其他难以遗传转化的植物物种中开展基因功能研究提供参考方法。

附图说明

图1：将TRV1和携带葡萄PDS基因片段的TRV2病毒载体共侵染烟草效果图；左侧注射pTRV1和pTRV2，右侧注射pTRV1和pTRV2-VvPDS。

图2：将TRV1和携带葡萄UAP56a基因片段的TRV2载体共侵染烟草效果图；左侧注射pTRV1和pTRV2，右侧注射pTRV1和pTRV2-VvUAP56a。

图3：将TRV1和携带葡萄MOS3基因片段的TRV2载体共侵染烟草效果图；左侧注射pTRV1和pTRV2，右侧注射pTRV1和pTRV2-VvMOS3。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，由于葡萄的遗传转化周期长，操作复杂并且转化效率低，尚有许多葡萄基因的功能未被明确。

基于此，本发明的目的是提供一种基于烟草瞬时表达体系快速鉴定葡萄基因功能的方法。本发明利用转化周期短、操作简单且转化效率高的烟草作为试验材料来对葡萄基因的功能进行验证。本发明首先将葡萄八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因片段连接到pTRV2病毒载体中，然后和pTRV1载体共混合后侵染烟草叶片，烟草叶片出现白化症状，说明方法可行。推测原因是葡萄PDS基因(VIT_209s0002g00100，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)和烟草PDS同源性高，注射后将烟草PDS基因沉默，可以同时反映葡萄PDS及其烟草中同源基因PDS的功能。

在此基础上，本发明进一步验证了2个未研究葡萄基因的功能，分别为葡萄基因UAP56a(VIT_204s0008g05330，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)和葡萄基因MOS3(VIT_209s0002g08940，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)。

为实现利用烟草来对葡萄基因功能的验证，本发明从葡萄基因UAP56a和MOS3内部选取片段，构建基于烟草脆裂病毒的病毒诱导基因沉默载体。对于片段的选取而言，本发明一方面考虑了片段的扩增难度以及将片段连接到沉默载体上的难易程度，另一方面还考虑了所选择的片段与烟草中同源基因的一致性。最终选取的葡萄基因UAP56a的内部片段如SEQ ID NO.2所示，选取的葡萄基因MOS3的内部片段如SEQ ID NO.3所示。

通过上述方法，本发明首次发现，葡萄UAP56a基因是植株生存必不可少的关键基因，能够调控植株的基本生命活动。葡萄MOS3基因参与调控葡萄的正常生长发育，如果此基因功能缺失，植株会出现明显矮化。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：葡萄基因片段连接到TRV2载体的构建方法

分别将葡萄PDS、UAP56a和MOS3基因的片段连接到TRV2沉默载体。具体实施方案如下：

从葡萄基因PDS、UAP56a和MOS3内部选取片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，长度分别为390bp、299bp和348bp。

设计扩增引物(下划线为内切酶PstⅠ与载体接头序列)：

提取葡萄总RNA，利用微量分光光度计法测定其浓度，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，将1μg的RNA反转录合成cDNA第一链，作为模板，对目的片段进行平末端PCR扩增。使用高保真酶(Pfu)进行PCR反应(30μl反应体系中，15μl 2×Super pfu Mix，10μmol/L的上下游引物各0.6μl，模板1μl，用水补齐至30μl)，程序如下：94℃90s；94℃20s，55℃20s，72℃20s 34个循环；72℃延伸5min。通过2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。对凝胶电泳分离的DNA片段进行回收，然后插入沉默载体pTRV2中，转化大肠杆菌DH5α。通过菌落PCR筛选阳性单克隆，送至生工公司进行测序。对测序正确的单菌落进行过夜摇菌，提取质粒。通过冻融法转入农杆菌GV3101。

实施例2：葡萄TRV载体通过农杆菌介导方法侵染烟草过程

烟草(Nicotiana bentamiana)培养条件为22℃、16h光照/8h黑暗光周期，光照强度600μmol/m²/s。待第4-5叶片完全展平，挑选长势一致的植株用于实验。

参考前人研究方法(Bio-protocol,2014,4:e1057)制备侵染菌液，主要步骤如下：分别挑取pTRV1、pTRV2、pTRV2-VvPDS、pTRV2-VvUAP56a和pTRV2-VvMOS3的农杆菌单菌落，接种到2ml LB液体培养基(含50μg/m卡那霉素，50μg/mL利福平)中，温度在28℃下，200r/min培养6h；再次接入50mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素，50μg/mL利福平)中培养过夜；将含有pTRV1的菌液分别与含有pTRV2空载、pTRV2-VvPDS、pTRV2-VvUAP56a和pTRV2-VvMOS3的菌液按体积比1∶1混匀，6000r/min离心3min，收集菌体；用重悬液(10mmol/L MgCl₂，10mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，150mmol/L乙酰丁香酮)重悬菌体至终浓度的OD600等于1.0。重悬后的侵染菌液放置于28℃、2h，之后通过注射方法侵染烟草叶片。

先用注射器针头轻轻划破烟草叶片背面，然后用去针头的注射器从划口处注入重悬菌液，以注射含有pTRV1与pTRV2混合载体的侵染菌液作为对照。注射后黑暗处理一天，之后将烟草置于22℃，光/暗周期16/8h的培养箱内继续培养侵染后的烟草植株。

实施例3：本发明葡萄基因沉默后的效果测试

侵染12天后，发现接种重组病毒载体pTRV2-VvPDS试验组烟草新生叶片出现明显白化症状(图1)；而对照组烟草叶片无任何变化，未出现白化现象(图1)。说明选取的葡萄PDS基因确实是决定叶片白化的关键基因，也就是说基于烟草瞬时表达体系可以对葡萄基因的功能进行快速有效的预验证。

进一步选取两个葡萄中未报道相关功能的基因VvUAP56a和VvMOS3。发现与pTRV2对照相比，侵染pTRV2-VvUAP56a后16天，烟草植株茎端生长点坏死，不能生存(图2)，暗示VvUAP56a基因在葡萄基本生命活动中发挥重要作用，是植株生存必不可少的关键基因。与空白对照相比，侵染pTRV2-VvMOS3后54天，植株的株高、株幅、叶长和叶宽4个性状均显著变小(图3)，暗示VvMOS3参与调控葡萄的正常生长发育，如果此基因功能缺失，植株会出现明显矮化。本研究结果为VvUAP56a和VvMOS3基因的深入研究提供依据，为进一步解析VvUAP56a和VvMOS3基因的功能奠定基础。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 基于烟草瞬时表达体系快速鉴定葡萄基因功能的方法

<130> 2020

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctcgtcccag taaaccatta gaggttgtaa ttgctggtgc aggtttggct ggtttgtcta 60

ctgcaaaata tttggcagat gcaggtcaca agcctatatt gttggaagca agagatgttt 120

taggtggaaa ggtggctgca tggaaagatg aggatggaga ctggtatgag acaggcctac 180

atatattctt tggggcttac ccaaatgtgc agaacctgtt tggagaactt ggtattaatg 240

atcggttgca gtggaaggaa cattctatga tatttgcaaa gccaagcaag ccaggggaat 300

tcagccgatt tgatttccct gaagtccttc ctgcaccctt aaatgggata tgggccatcc 360

tgaggaataa tgaaatgctg acttggccgg 390

<210> 2

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aatataaaaa ttcacaagga tcttttaaaa aatgaatgcc ctcatattgt tgttggaaca 60

cctggaagga tactggcact tgctagagac aaggaccttg ctttaaagaa tgtgagacac 120

tttatccttg atgaatgtga caagatgctt gaatcacttg acatgaggag ggatgttcaa 180

gagatcttca agatgactcc tcatgataag caggttatga tgttttcagc aaccctcagc 240

aaggaaatcc gccctgtttg caagaaattt atgcaagatc ctatggaaat ttatgttga 299

<210> 3

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagttcagct attggttgca agagagtgtt tgccatcggg tacaggatga agtaagctcc 60

ttaaatgagt ccagtgattt ggaacagata ttattactgc tgacagggcg acagctggat 120

gcagctgtgg aactggccgc ttctagagga gatgtgaggc tagcttgttt gctgagtcag 180

gctggtggtt ccacaataaa tcgtgctgat gttgctcagc agcttgatct ttggagaacc 240

aatgggctgg acttcaattt cattgagaag gacaggataa ggctctttga gttgcttgct 300

ggtaatatac atggtgcatt gcatggcaaa aacattgact ggaaaagg 348

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgacgacaag accctctcgt cccagtaaac cattagaggt tg 42

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaggagaaga gccctccggc caagtcagca tttcattatt c 41

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgacgacaag accctaatat aaaaattcac aaggatcttt taaaa 45

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaggagaaga gcccttcaac ataaatttcc ataggatctt gc 42

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgacgacaag accctgagtt cagctattgg ttgcaagag 39

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaggagaaga gccctccttt tccagtcaat gtttttgc 38

<210> 10

<211> 1605

<212> DNA

<213> PDS基因

<400> 10

atgggtctca agttgagaat tccaaataag cattctattg gaacaaggcg gaggaaggat 60

ttctgcccct tgcaggttgt ttgcatggat tatccaagac cagaacttga gaatactgtg 120

aatttcttag aagctgcata cttatcctca tcctttcata cttctcctcg tcccagtaaa 180

ccattagagg ttgtaattgc tggtgcaggt ttggctggtt tgtctactgc aaaatatttg 240

gcagatgcag gtcacaagcc tatattgttg gaagcaagag atgttttagg tggaaaggtg 300

gctgcatgga aagatgagga tggagactgg tatgagacag gcctacatat attctttggg 360

gcttacccaa atgtgcagaa cctgtttgga gaacttggta ttaatgatcg gttgcagtgg 420

aaggaacatt ctatgatatt tgcaaagcca agcaagccag gggaattcag ccgatttgat 480

ttccctgaag tccttcctgc acccttaaat gggatatggg ccatcctgag gaataatgaa 540

atgctgactt ggccggagaa aatcaagttt gctattggac ttgtgccagc aatgctcgga 600

ggacaggctt atgttgaagc acaggatggt ttaactgtta aagactggat gagaaaacaa 660

ggtattcctg atcgagtaac agatgaggtt ttcattgcca tgtccaaggc actgaacttc 720

ataaatccgg atgaactttc gatgcagtgt atattgattg ctttgaaccg atttcttcag 780

gagaagaatg gctccaagat ggctttctta gatggtaatc ctccagagag actctgcatg 840

cccattgttg accatattca gtcactaggt ggtcaagtcc aacttaattc acgaatacaa 900

aagattgagc tgaacaaaga cggaactgtg aagagttttg tgctaaataa tgggaatgta 960

attaaaggag atgcttatgt aattgcaact ccagttgata tcctgaagct tcttttgccg 1020

ggagactgga aagagattcc atacttcagg agattggata aattagttgg agttccagtg 1080

atcaatgttc atatatggtt tgacaggaaa ctgaagaaca catacgatca tcttcttttc 1140

agcagaagtc cccttctgag tgtgtatgct gacatgtccg taacatgtaa ggaatattac 1200

aacccaaatc aatctatgct ggagttggtt tttgcacctg ctgaagaatg ggtctcacgc 1260

agtgactcag aaatcattga agctacaatg aaggaacttg ccaaactctt tcctgatgaa 1320

atttcagaag atcagagcaa agcgaaagtt ttgaaatacc atgttgttaa aacaccaaga 1380

tctgtttaca aaactgtccc aaattgtgaa ccttgccgtc ccttacaaag atctcctata 1440

gagggctttt atttagctgg ggactacaca aaacaaaaat acttagcttc aatggaaggt 1500

gctgttctgt cagggaagct ttgtgcacag gctattgtaa aggactatga attgcttgtt 1560

gctcagggag aacaaaagtt ggccgaggtc agcattctca gttaa 1605

<210> 11

<211> 1287

<212> DNA

<213> UAP56a基因

<400> 11

atgggagaaa caagggacaa cgatgcttac gaggaagagc ttctcgacta cgaggaagaa 60

gaagacaaag cccccgactc cgtcaccgga aaagtcaacg gcgaagccgc caagaagggc 120

tatgttggaa ttcacagttc aggattcaga gacttccttt tgaagccaga acttcttcgg 180

gcaattgtgg actcggggtt tgagcatcct tctgaagtgc aacatgagtg tatccctcaa 240

gctatcttgg gcatggatgt tatttgtcaa gctaaatcgg ggatgggaaa aactgctgtg 300

tttgttctgt caaccctgca acaaattgag cctgtcacag gtcaagtcgc agctctcgtt 360

ctatgccata caagggagtt agcttaccag atctgccacg agttcgagag attcagtact 420

tatttacctg atatcaaggt tgctgttttc tatggtggcg tcaatataaa aattcacaag 480

gatcttttaa aaaatgaatg ccctcatatt gttgttggaa cacctggaag gatactggca 540

cttgctagag acaaggacct tgctttaaag aatgtgagac actttatcct tgatgaatgt 600

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cctcatgata agcaggttat gatgttttca gcaaccctca gcaaggaaat ccgccctgtt 720

tgcaagaaat ttatgcaaga tcctatggaa atttatgttg atgacgaggc caagttgacc 780

cttcatggtc ttgtacagca ctacatcaaa ctgagtgagc ttgagaaaaa tcgcaagttg 840

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gttataaact atgacatgcc agattctgca gacacttatc tgcacagggt tggtagagct 1140

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gatacctcta catacatgcc atcgtaa 1287

<210> 12

<211> 3210

<212> DNA

<213> MOS3基因

<400> 12

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caaattgcac tgcatcaata caagagaaga aaaatttctc agaagaatgt ttcttctttg 180

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actgatgtta gatggttgga cttagatcaa ataatcaggt ttgggaggca tgaagtggtt 420

gtatatggag atgaaggtgc aaagcctgag gttggtcagg gccttaacaa ggctgctgaa 480

gtaactttgg tgctacagat aagatcatca agttttgaag agggacgact aaatgatatt 540

gtggagaaat tgaggctttg tacaaagaga cagggagcag atttcatttc atttaaccca 600

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gatgaagagg atattgcgat ggatgatgtg actgtagttc aacatccact ggaaacaaat 720

gctcatgagg tttctgatat tgatgaagcc acactagtgg aacccaatgg agctgtactt 780

tctcattctc ttcctgctca tcttgggctt gatcctatca agatgaaaga aatgagaatg 840

gtgatgtttc ctgttgatga agaggaggat catgatttca gtggggaatt taaacagcgg 900

gaacaatctt tcaataagga atatatacga cctcctttgc attattccgc tcggaggatg 960

agccataaat ctggttcatc tgtggcacgg aaaactccac tagctttgct tgagtacaat 1020

cctggtagtg ttgactccag ctcttctgga accattctta tggcccaaca aaataaggga 1080

atgcctttga agactacaaa agtagaagga tttaagctgg acctcaagca tgagacacca 1140

ataacagaaa gccattccca caacatagtt gatgcagcat tgttcatggg caggtccttt 1200

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gattctcaga gggttttatc ttctgtaatc aatttagaaa aggttgcaat tgataaagtg 1320

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ataggaatta ttgagaggca gctggaggtc cctgaggtgt cttcctccgc tcgtgtggtg 1560

ttgatgcacc aagtaatggt atgggaattg ataaaagttc ttttttcggc tagggaaatc 1620

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tccacaataa atcgtgctga tgttgctcag cagcttgatc tttggagaac caatgggctg 1980

gacttcaatt tcattgagaa ggacaggata aggctctttg agttgcttgc tggtaatata 2040

catggtgcat tgcatggcaa aaacattgac tggaaaaggt tcctaggttt attgatgtgg 2100

tatcaactac caccagacac ttcattgccc tttgtttttc gcaattacca gcagcttctt 2160

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catgatccac tggactacca tatgatctgg catcagcgtg cagtgttgga agcagttggt 2400

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ctagggcaat gtcactgggc catctatgtg gttcttcata tgccctttcg tgatgatttt 2520

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agattaccag ttgatgcaag agtggcatat tcaaaaatgg cggaggagat ctgtggtttg 3060

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Claims (8)

1.如下1)-3)任一项所述的基因片段在构建基于烟草脆裂病毒的病毒诱导基因沉默载体中的应用；

1)葡萄PDS基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)葡萄UAP56a基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3)葡萄MOS3基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种病毒诱导基因沉默载体，其特征在于，包括：pTRV1载体和连接有目的基因片段的pTRV2载体。

3.根据权利要求2所述的病毒诱导基因沉默载体，其特征在于，所述目的基因片段为如下1)-3)任一项所述：

1)葡萄PDS基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)葡萄UAP56a基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3)葡萄MOS3基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述的病毒诱导基因沉默载体，其特征在于，所述目的基因片段插入到pTRV2载体的Pst I酶切位点之间。

5.权利要求2-4任一项所述的病毒诱导基因沉默载体在快速鉴定葡萄基因功能中的应用。

6.一种快速鉴定葡萄基因功能的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将pTRV1载体和携带葡萄糖目的基因片段的pTRV2载体侵染烟草，根据侵染后的烟草表型变化，对葡萄基因的功能进行鉴定。

7.葡萄UAP56a基因作为植株生存的关键基因在调控植株基本生命活动中的应用；所述葡萄UAP56a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

8.葡萄MOS3基因在调控植株的株高、株幅、叶长和叶宽中的应用；所述葡萄MOS3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

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