CN109402133B

CN109402133B - 舞毒蛾FTZ-F1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用

Info

Publication number: CN109402133B
Application number: CN201811602610.3A
Authority: CN
Inventors: 王步勇; 问荣荣; 王娟; 李莹莹; 李秀伟
Original assignee: Heze University
Current assignee: Heze University
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: CN109402133A

Abstract

舞毒蛾FTZ‑F1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用，涉及分子生物学领域，尤其涉及舞毒蛾FTZ‑F1基因、其编码蛋白及其应用。发明是要解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题。该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。其编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。本发明利用分子生物学手段干扰基因FTZ‑F1，使其表达下调，延长幼虫蜕皮周期，减缓其发育，甚至引起死亡。本发明提供的能够表达舞毒蛾FTZ‑F1基因的dsRNA的转化84K杨植株能够显著阻碍舞毒蛾成虫翅的伸展，影响成虫翅的发育和飞行能力。本发明用于舞毒蛾害虫防治领域。

Description

舞毒蛾FTZ-F1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及舞毒蛾FTZ-F1基因、其编码蛋白及其应用。

背景技术

舞毒蛾是一种重要农林食叶害虫，在我国分布范围广泛、可危害杨、柳、苹果、樟子松、落叶松等500多种植物，大爆发时可造成巨大的经济损失。目前，在舞毒蛾害虫的防治中依旧是化学防治占据着主要的地位，生物防治及物理防治通常只作为辅助防治方法。化学农药的长时间、高频率、使用量不断的增加，导致害虫出现抗药性、再增猖撅，以及农药残留等环境污染问题。化学农药使用后弊端的产生推动了新一代害虫防治研究的展开。分子生物学技术的快速发展，并使其被广泛应用于害虫的生理机制研究及防治，其中RNA干扰技术凭借其高效沉默、特异性强、操作简便、节省时间及实验规模较小等特点成为植物保护者通过沉默功能基因来进行害虫防治的重要手段。RNA干扰初期是通过体外合成的靶标基因dsRNA后，进行微量注射或直接喂食的方法将dsRNA导入进入昆虫淋巴液实施干扰。通过转基因植物特异表达靶标基因的dsRNA来实现RNA干扰的手段，不仅能很好的解决注射dsRNA造成的械损伤、喂食dsRNA产生的使用量及成本问题，而且促进将RNAi技术运用于自然界农林业害虫防治，转基因植物表达dsRNA成为防治害虫的研究热点。

因此，为解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题，采用生物学手段进行病虫害防治的研究至关重要。

发明内容

本发明是要解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题，提供一种舞毒蛾FTZ-F1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用。

本发明舞毒蛾FTZ-F1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明舞毒蛾FTZ-F1基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO：3所示。

本发明舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

本发明以舞毒蛾FTZ-F1基因片段为模板，并设计特异dsRNA引物对，通过MEGAscript RNAi试剂盒(Ambion)合成FTZ-F1基因dsRNA。

本发明还提供一种用于构建能够表达基因dsRNA的重组质粒的构建方法。

构建干扰载体时，先将pHANNIBAL载体上的35S-PDK-OCS片段与pCAMBIA2300植物表达载体链接后形成能够表达基因dsRNA的pCAMBIA2300-PDK中间载体。

本发明还提供一种能够表达舞毒蛾FTZ-F1基因片段序列的dsRNA的重组质粒的构建方法。

将FTZ-F1目的片段分别正反向插入到pCAMBIA2300-PDK中间载体的PDK内含子的左右侧，形成以pCAMBIA2300载体为表达载体的干扰载体片段gene-PDK-gene，构建成能够表达FTZ-F1dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒。FTZ-F1目的片段和pCAMBIA2300-PDK中间载体均含有KpnI--KpnI和XbaI--BamHI两组内切酶酶切位点。重组子具有可用于筛选的氨苄青霉素和卡那抗性基因。

本发明还提供舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA在害虫防治中的应用。

其中应用方法之一在于，将舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内。所述注射剂量为12μg。

其中应用方法之二在于，将FTZ-F1目的片段插入到能够表达基因dsRNA的pCAMBIA2300-PDK中间载体中，形成干扰载体片段gene-PDK-gene，构建能够表达FTZ-F1dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒，将含有FTZ-F1目的片段的pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组载体进行植物遗传转化，获得表达FTZ-F1dsRNA的转化植株。

进一步的，所述植物为84K杨。

本发明提供的能够表达舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA的转化84K杨植株能够显著阻碍舞毒蛾成虫翅的伸展，影响成虫翅的发育和飞行能力。

本发明的有益效果：

在脊椎动物体内发现，SF1是类固醇生成的关键调节因子，SF1能够提高与类固醇合成有直接或间接关联的基因的表达水平。SF1是由FTZ-F1基因编码生成的。在昆虫中发现，FTZ-F1能通过激发昆虫多种组织中的多个基因的表达来响应20-羟基蜕皮酮(20E)滴度变化，进行蜕皮激素自身合成的反馈调节和幼虫-蛹变态发育过程中的蜕皮激素信号转导。

本发明利用分子生物学手段干扰舞毒蛾重要蜕皮发育相关基因FTZ-F1，使其表达下调，延长幼虫蜕皮周期，减缓其发育，甚至引起死亡。将FTZ-F1基因dsRNA注射入舞毒蛾3龄幼虫体内后，与对照处理相比，高效沉默了舞毒蛾的靶标基因FTZ-F1基因，致使舞毒蛾幼虫3龄蜕皮期延长，同时鲜重增长缓慢，累计死亡率达到76.67％，严重影响了舞毒蛾幼虫的正常生长发育。

本发明进一步构建FTZ-F1dsRNA植物表达载体，并通过农杆菌介导法将其导入84K杨，获得表达FTZ-F1dsRNA的84K杨转化植株。舞毒蛾幼虫取食能够表达FTZ-F1dsRNA的转基因植株叶片后，蛹羽化后，成虫翅出现皱缩无力的畸型，阻碍其正常飞行。转基因植物表达FTZ-F1dsRNA为防治农林重要害虫舞毒蛾提供新方法与新材料。

附图说明

图1为注射dsRNA后舞毒蛾3龄幼虫FTZ-F1基因表达水平；

图2为FTZ-F1基因沉默对舞毒蛾幼虫鲜重的影响；

图3为FTZ-F1基因沉默对舞毒蛾幼虫龄期的影响；

图4为FTZ-F1基因沉默对舞毒蛾幼虫存活率的影响；

图5为35S-PDK-OCS序列扩增结果；其中M:2000bp DNA Marker；1-2:35S-PDK-OCSfragments；

图6为载体pCAMBIA2300-PDK PCR序列扩增结果；其中M:2000bp DNA Marker；1-6:PCR fragments；

图7为分别带有KpnI和XbaI/BamHI FTZ-F1的目的片段PCR序列扩增结果；其中M:2000bp DNA Marker；1:目的片段(P1178KpnIF/R)；2:目的片段(P1178XbaI-F/BamHI-R)；

图8为用于合成FTZ-F1dsRNA的目的片段的正向插入PCR序列扩增结果；其中M:2000bp DNA Marker；1-5:PCR fragments(P1178-F/P1178-R)；

图9为用于合成FTZ-F1dsRNA的目的片段的反向插入PCR序列扩增结果；其中M:2000bp DNA Marker；1-5:PCR fragments(P1178Check-F/PPHAN-SEQ-R)；

图10为FTZ-F1dsRNA重组质粒酶切检测结果；其中M:2000bp DNA Marker；1:enzyme digestion by KpnI；2:enzyme digestion by XbaI—BamHI；

图11为具有抗性的转基因植株；

图12为PCR检测具有抗性的转化植株；其中M:2000bp DNA Marker；1～4:转化植株；

图13为转基因84K杨对舞毒蛾雌性成虫羽化的影响；其中左图为对照雌虫，右图为处理雌虫；

图14为转基因84K杨对舞毒蛾雄性成虫羽化的影响；其中左图为对照雄虫，右图为处理雄虫。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式舞毒蛾FTZ-F1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

具体实施方式二：本实施方式舞毒蛾FTZ-F1基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

具体实施方式三：本实施方式舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA序列如序列表中SEQ IDNO：4所示。

本实施方式以舞毒蛾FTZ-F1基因片段为模板，并设计特异dsRNA引物对，通过MEGAscript RNAi试剂盒(Ambion)合成FTZ-F1基因dsRNA。

具体实施方式四：本实施方式舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA在害虫防治中的应用。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内。所述注射剂量为12μg。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四不同的是：舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将FTZ-F1目的片段插入到能够表达基因dsRNA的pCAMBIA2300-PDK中间载体中，形成干扰载体片段gene-PDK-gene，构建能够表达FTZ-F1dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒，将含有FTZ-F1目的片段的pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组载体进行植物遗传转化，获得表达FTZ-F1dsRNA的转化植株。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述植物为84K杨。其它与具体实施方式六相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：舞毒蛾FTZ-F1基因全长克隆

按照Invitrogen公司TRIzol RNA动植物组织总RNA提取试剂操作说明进行舞毒蛾幼虫总RNA提取，对所提取的RNA进行DNA消化，紫外分光光度计及电泳检测RNA，选取质量合格的RNA按照TaKaRa公司PrimeScript^TM RT-PCR Kit(型号DRR014A)反转录试剂盒操作步骤进行cDNA第一链的合成。根据舞毒蛾幼虫转录组文库的注释基因FTZ-F1核酸序列，设计引物(正向引物：5’-ATAGTCTGTCGCCCAGTT-3’；反向引物：5’-CTTTGCGCTTGTGTTCTTC-3’)，以cDNA第一链为模板，采用RT-PCR方法，克隆FTZ-F1CDS序列，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。按照E.Z.N.A.胶回收试剂盒操作方法回收FTZ-F1基因片段，将回收得到的PCR产物与T-18(pMD18-T质粒连接克隆试剂盒)连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌液PCR检测将阳性克隆菌液送于上海生工进行测序，验证舞毒蛾FTZ-F1基因编码框。

舞毒蛾FTZ-F1基因核酸序列2724bp，如序列表中SEQ ID NO：1所示。编码区域CDS长为1656bp，如序列表中SEQ ID NO：2所示。编码551个氨基酸，如序列表中SEQ ID NO：3所示。编码蛋白质的分子量为61.6055kDa，pI(理论等电点)为6.39，为一酸性蛋白。

实施例2：舞毒蛾FTZ-F1基因dsRNA合成

根据实施例1中所克隆得到的舞毒蛾FTZ-F1基因全长，设计合成FTZ-F1基因dsRNA引物，在每条特异性引物的5′端均加上大小为20bp的T7启动子的序列，正向引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGGCAGAGCCAAACCTACAATCAG-3’)和反向引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGGTCACTAGCTTGCCGAATTTATC-3’)；以cDNA第一链为模板，通过PCR法扩增得到长度为505bp的片段序列，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并采用E.Z.N.A.胶回收试剂盒操作方法回收该505bp的目的片段。以回收的505bp目的片段为模板，通过体外dsRNA合成试剂盒(MEGAscript T7Kit试剂盒)获得FTZ-F1基因的dsRNA。紫外分光光度计及2％琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的浓度与质量。-80℃冰箱保存备用。

实施例3：舞毒蛾FTZ-F1基因沉默效果的检测

将实施例2合成的FTZ-F1基因的dsRNA(12μg)，微注射入舞毒蛾3龄幼虫，以RNase-free水处理组为对照，分别于12、24、36、48和72h选取活泼的幼虫提取总RNA，经DNase I(Promega)消化DNA，采用PrimeScriptTM RT试剂盒(TaKaRa)合成cDNA第一链，将合成cDNA稀释成100μL，用作实时荧光定量RT-PCR模板，设计荧光定量检测引物qFTZ-F1(正向引物：5’-GCTGCACTTCTCGACTATAC-3’；反向引物：5’-TTGCGTGTAACATTTCCATTAG-3’)用于检测注射dsRNA后FTZ-F1基因的表达量。注射dsRNA后舞毒蛾3龄幼虫FTZ-F1基因的表达水平如图1所示(图1中□表示CK，■表示注射FTZ-F1dsRNA)，结果表明：以RNase-free水处理组为对照，注射dsRNA后，FTZ-F1基因mRNA表达量在12、24、36、48和72h时被显著沉默，显示RNAi干扰效率分别为88.79％、60.13％、68.61％、25.41％和71.43％，其中在12h FTZ-F1表达量达到最低，沉默效果最好。

实时荧光定量PCR使用试剂盒SYBR Green Real-time PCR Master mix Plus(Toyobo)。内参基因为Actin、EF1α、TUB，引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应体系为：10μL2×SYBR premix ExTaq酶、正向和反向引物(10μmol/L)各1μL、2μL cDNA模板，加去离子水补足20μL；反应条件为：94℃30s，然后进行44个循环：94℃12s，59℃30s，72℃40s，最后81℃1s读板。每处理重复3次，用2^-△△Ct方法进行基因的表达量分析。

表1 RNAi相关引物序列

实施例4：舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA对舞毒蛾的生长、表型、存活率及龄期的抑制作用

将实施例2中体外合成的FTZ-F1dsRNA(12μg)微量注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内，每组处理30条幼虫，重复3次，以RNase-free水处理过的幼虫为对照，每天更换新鲜叶片，同时记录其对舞毒蛾幼虫的鲜重、死亡率、龄期的影响。

图2为FTZ-F1基因沉默对舞毒蛾幼虫鲜重的影响(图2中▲表示CK，●表示FTZ-F1dsRNA)，由图2可知，注射FTZ-F1基因dsRNA导致舞毒蛾幼虫鲜重增长缓慢，甚至在前5d的处理中幼虫鲜重出现负增长；在处理6-9d期间，FTZ-F1dsRNA处理组导致幼虫鲜重出现增长，与第5d鲜重相比，第9d幼虫鲜重增长量有42.91％，但与对照组相比，增长较为缓慢，RNase-free水处理组第9d幼虫鲜重约为第5d鲜重的1.78倍，干扰了舞毒蛾幼虫的正常生长。

图3为FTZ-F1基因沉默对舞毒蛾幼虫龄期的影响，由图3可知，注射FTZ-F1基因dsRNA导致舞毒蛾3龄幼虫龄期明显延长1.27d，RNase-free水处理过的幼虫龄期为5.81d，而FTZ-F1dsRNA处理后幼虫龄期为6.37d。这说明FTZ-F1基因沉默干扰了舞毒蛾幼虫的正常蜕皮发育。

图4为FTZ-F1基因沉默对舞毒蛾幼虫存活率的影响(图4中曲线1表示对照，曲线2表示注射FTZ-F1dsRNA)。由图4可见，经微量注射FTZ-F1dsRNA处理后，舞毒蛾幼虫出现显著死亡现象，FTZ-F1dsRNA处理7d后舞毒蛾幼虫死亡数超过总数一半，存活率约为46.67％，对照组存活率为100％，差异显著；FTZ-F1dsRNA处理9d后存活率仅剩23.33％，对照组约为83.33％，差异显著。

实施例5：表达FTZ-F1基因dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-FTZ-F1-PDK-FTZ-F1的重组构建

构建干扰载体时，先将pHANNIBAL载体上的35S-PDK-OCS片段与pCAMBIA2300植物表达载体链接后形成pCAMBIA2300-PDK中间载体，其次将目的基因分别正反向插入到PDK内含子的左右侧，形成以pCAMBIA2300载体为表达载体的干扰载体片段gene-PDK-gene，构建成pCAMBIA2300-gene-PDK-gene质粒。

具体实施方案如下，

(一)35S-PDK-OCS片段的PCR扩增

首先进行35S-PDK-OCS(2919bp)目的片段的PCR扩增，用于扩增的正向引物(P1129F 5’-CAATTTCACACAGGAAACAG-3’)和反向引物(P1129R 5’-CAGATTTAGGTGACACTATAG-3’)序列分别设计于pHANNIBAL载体SacI上游60bp和pHANNIBAL载体PstI下游60bp。PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测(图5)，用胶回收试剂盒(OMEGA)回收该目的片段。

(2)PCR反应程序：98℃预变性，5min；循环为98℃变性，10s；55℃退火，30s；68℃延伸，3min；共30个循环；68℃延伸5min。

(二)融合表达载体pCAMBIA2300-PDK的构建

将35S-PDK-OCS片段分别用SacI和PstI内切酶进行酶切后，与同样用SacI--PstI酶切的载体pCAMBIA2300进行体外连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物(P1129Check-F正向引物：5’-CTTCTAAATGGATTGAC-3’；P1129Check-R反向引物：5’-CAATCAGTAAATTGAACGGAG-3’)进行菌液PCR鉴定，序列大小约350bp，PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测(图6)。将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液进行测序和质粒抽提，备用。

连接体系见下：

(三)pCAMBIA2300-gene-PDK-gene载体的构建

(1)用于合成FTZ-F1dsRNA的目的片段的PCR扩增

首先进行用于合成FTZ-F1dsRNA的目的片段P1178的PCR扩增，用于扩增正向插入片段(PDK左侧)的引物两端需添加酶切位点KpnI，引物序列为正向引物P1178KpnI-F:5’-GGGGTACCCAGAGCCAAACCTACAATC-3’，反向引物P1178KpnI-R:5’-GGGGTACCTCACTAGCTTGCCGAATTTATC-3’；用于扩增反向插入片段(PDK右侧)的引物两端需添加酶切位点XbaI和BamHI，引物序列为正向引物P1178XbaI-F:5’-GCTCTAGACAGAGCCAAACCTACAATC-3’，反向引物P1178BamHI-R:5’-CGGGATCCTCACTAGCTTGCCGAATTTATC-3’。505bp的用于合成FTZ-F1dsRNA的目的片段PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测(图7)。

(2)用于合成FTZ-F1dsRNA的目的片段的正向插入，形成pCAMBIA2300-gene-PDK重组载体

将KpnI酶切的用于合成FTZ-F1dsRNA的目的片段与同样用KpnI酶切的中间载体pCAMBIA2300-PDK进行体外连接及转化。将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物(正向引物P1178-F：5’-CAGAGCCAAACCTACAATCAG-3’；反向引物P1178-R：5’-GATAAATTCGGCAAGCTAGTGA-3’)进行菌液PCR鉴定，2％琼脂糖凝胶电泳结果如图8所示。将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液送去上海生工进行PCR扩增测序，正向引物PHAN-Check-F35S：CACTATCCTTCGCAAGAC，反向引物PHAN-Check-R：CATACTAATTAACATCAC，和质粒抽提，备用。

(3)用于合成FTZ-F1dsRNA的目的片段的反向插入，形成pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组载体

将用XbaI--BamHI酶切的用于合成FTZ-F1dsRNA的目的基因与同样用XbaI--BamHI酶切的插入正向序列的pCAMBIA2300-gene-PDK载体进行体外连接，并转化。将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物(正向引物为P1178Check-F：5’-GTGCAAGGTAGTTTCATCGG-3’，反向引物PHAN-SEQ-R：5’-GTAAGGATCTGAGCTAC-3’)进行菌液PCR鉴定，检测序列大小约350bp，2％琼脂糖凝胶电泳结果如图9所示。将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液送去上海生工进行PCR扩增测序，正向引物P1129Check-F：5’-CTTCTAAATGGATTGAC-3’，反向引物PHAN-SEQ-R：5’-GTAAGGATCTGAGCTAC-3’，和质粒抽提，备用。

(4)pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒进行酶切检测

将从农杆菌中抽提出的pCAMBIA2300-gene-PDK-gene融合表达载体分别用KpnI和XbaI--BamHI两组内切酶进行酶切，并将产物进行凝胶电泳检测(图10)。

实施例6：pCAMBIA2300-gene-PDK-gene进行84K杨的遗传转化

通过含有重组质粒的EHA105菌液侵染84K杨叶片，进过共培养、选择培养、继代培养和生根培养获得具有抗性的转基因植株(图11)。选取具有抗性植株的叶片，提取基因组DNA。进一步设计特异性引物(正向引物PHAN-Check-F35S：CACTATCCTTCGCAAGAC；反向引物PHAN-Check–R：CATACTAATTAACATCAC)，通过PCR扩增特异性目的基因来鉴定阳性植株。获得大小为635bP的PCR产物，于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测(图12)。

实施例7：转基因84K杨对舞毒蛾防治的效果

转基因84K杨对舞毒蛾化蛹发育的影响

为了解舞毒蛾幼虫持续取食转基因杨树叶片是否可以加强其干扰效果，通过连续喂食舞毒蛾幼虫转基因84K杨进行了测定。选取长势一致、健康的6龄12h舞毒蛾幼虫放于直径为9cm，高为15cm的养虫瓶内，喂食F2代转基因杨树叶片，一个养虫瓶放入5条幼虫，以非转基因杨树叶片为对照，重复30次，观察成虫羽化情况。结果如图13和图14所示：6龄幼虫连续取食转基因植株叶片后，经过蛹期后，羽化出现畸型翅，翅皱缩柔弱不能伸展，影响其飞行，间接影响雌雄成虫交配及产卵。

序列表

<110> 菏泽学院

<120>舞毒蛾FTZ-F1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用

<160>30

<210> 1

<211> 2724

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾FTZ-F1基因全长

<400> 1

gcattgaacc tgagttatgt cggtcggaat atcagagtgt aagtgaagtg gcctagagac 60

ctatattttg gttttgaaac gaattataac ttttatgggt gatttcttaa ataaaacaga 120

tattgttgcg atttacctga tattaatttg attttgaggg cgacaatagt ctgtcgccca 180

gttcactttt tgtgtataat gcacgaagac gctccaaaaa tgagtgtatc acaaaatcta 240

gttgcttcta cgagtcaagc gaagagtgat atcgtaactg aaataccatc ggagtatgat 300

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tacaaaagag accgtgctcg taaattgcaa atgatgagac agcgacaaat tgccgtccaa 780

actttgcgcg gctcactcgg cgatagcgga ttagtgttgg gttttggttc tgcttacgcc 840

tccgttcccg taaaacaaga gatacagata cctcaggtat catcgctgac gtcttcgccc 900

gaatcgtccc ccgggcccgc tttactagct gcgcagccgc agccaccgca accgccgcct 960

ccgccagcac acaagtggga agcacattcg ccgcattctc cggatgcatt tgcatttgac 1020

gcgccagcca ccgctgcggc cacaccgtcg agcacaggcg agcctaccaa cactgaaagc 1080

ctgcccgtct cgcccatgat tcgcgaattc gtgcagacaa tcgatgaccg cgagtggcag 1140

aattctctct ttggactttt gcagagccaa acctacaatc agtgtgaggt cgatctcttt 1200

gaattaatgt gcaaagtact ggaccaaaac ttattttcac aagtggactg ggcgcgaaac 1260

accgtgttct ttaagtatct aaaggttgac gatcaaatga agctgttgca gcactcgtgg 1320

tccgacatgc tggtattgga tcaccttcat caaaggatgc acaacggact ccccgatgaa 1380

actaccttgc acaacggcca gaagtttgat cttctctgtc tcggactact tggtgtccca 1440

actctggctg atcactttaa cgagctccag aacaaactac tagatctgaa attcgatgtt 1500

ccagactaca tttgcgttaa atttttgctt ctgcttaatc ctgaagtgag aggcatcgtt 1560

aatgtgaagt gcgttcgaga tggttaccag acggtacaag ctgcacttct cgactataca 1620

ctgtcttgct atcctacgat acaggataaa ttcggcaagc tagtgatggt ggtacctgag 1680

attcacgctc tggcagctcg gggagaagaa catttatatc agcggcattg cgccggccag 1740

gcgcccacac agacccttct aatggaaatg ttacacgcaa agcgcaagcc gaacggaggt 1800

gaaatggtta accggaatgc cgagcacact tcgacccttg acagattatc ttgaagtccc 1860

agtttaaaga agaacacaag cgcaaagcgc tcatgcgaca ccacatcaga taagatatgc 1920

aacaaacttt acttatatat agttagtttt agtctgtaac ttggtgtgtg attatcaaat 1980

ttattaagtt attgcgccga gcgccggccg gcggtgccgc gcatgcctag tccgatacag 2040

ataaaacaaa tatttatcta cctttattgt ctgtaaaatg ttatacacca gttttgtgta 2100

gctatggtta atttatttag cagtctatat atcgtgttac ttcagaattg agtaagtaca 2160

tttaatctgt aggttctctt actccggtgc gtaagtaatg ggaaatatta caatacatat 2220

ttaggaaagt gtctgtgatt ataaacgaag aaatttgatg aaaacatttt gtgtaattgt 2280

tagttgtatt caatactata cgtaccatac gaaatatttt ggacgggctc gagtcgcgct 2340

aagcaacaac gcctgccttt cttcatttgg acgttacttc tttgtaagaa tataaaatca 2400

ctttgcaaaa agatgcaagc cgtcaatgaa ccaaattgta ttgcaaatgt gacttgattt 2460

ctagcggggg catgtttgac gtgtctgccg gactctcgtg tataacttat tgatacctat 2520

gaaattcatt gtaattataa tatgcttgat ggagatattg cagaaatttt attggaattt 2580

aaatcatcta tgtgtattat aatattgtat aaataaatac gtattcgcaa tttaatcatg 2640

tttaaaaaat atacagttgt tcttttaaaa aattttatct caatgttgta aatttaatca 2700

aatatgtttt attggccata ccag 2724

<210> 2

<211> 1656

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾FTZ-F1基因CDS序列

<400> 2

atgcacgaag acgctccaaa aatgagtgta tcacaaaatc tagttgcttc tacgagtcaa 60

gcgaagagtg atatcgtaac tgaaatacca tcggagtatg atattaatcc cactgaacca 120

aaacgcacac aaaatctcga catggagctg aaaattacat atatggatcc caacagtggc 180

ccaggaggtg aaccaggtgc ctatttacca gcagcaggca ctgtatgtga ccagaccgat 240

accaaggatg tgatcgaaga actttgtcca gtatgtggcg ataaagttag cggctaccac 300

tacgggttgc taacatgcga atcctgcaaa ggtttcttta agaggaccgt tcagaataag 360

aaggtttaca cgtgcgttgc tgaacgtgcc tgccacatag acaaaacaca acgaaaacgc 420

tgcccgtttt gtcgattcca aaaatgcctt gaagtcggaa tgaaattgga agccgtacga 480

gcggatcgca tgcgtggagg acgtaacaaa ttcggtccta tgtacaaaag agaccgtgct 540

cgtaaattgc aaatgatgag acagcgacaa attgccgtcc aaactttgcg cggctcactc 600

ggcgatagcg gattagtgtt gggttttggt tctgcttacg cctccgttcc cgtaaaacaa 660

gagatacaga tacctcaggt atcatcgctg acgtcttcgc ccgaatcgtc ccccgggccc 720

gctttactag ctgcgcagcc gcagccaccg caaccgccgc ctccgccagc acacaagtgg 780

gaagcacatt cgccgcattc tccggatgca tttgcatttg acgcgccagc caccgctgcg 840

gccacaccgt cgagcacagg cgagcctacc aacactgaaa gcctgcccgt ctcgcccatg 900

attcgcgaat tcgtgcagac aatcgatgac cgcgagtggc agaattctct ctttggactt 960

ttgcagagcc aaacctacaa tcagtgtgag gtcgatctct ttgaattaat gtgcaaagta 1020

ctggaccaaa acttattttc acaagtggac tgggcgcgaa acaccgtgtt ctttaagtat 1080

ctaaaggttg acgatcaaat gaagctgttg cagcactcgt ggtccgacat gctggtattg 1140

gatcaccttc atcaaaggat gcacaacgga ctccccgatg aaactacctt gcacaacggc 1200

cagaagtttg atcttctctg tctcggacta cttggtgtcc caactctggc tgatcacttt 1260

aacgagctcc agaacaaact actagatctg aaattcgatg ttccagacta catttgcgtt 1320

aaatttttgc ttctgcttaa tcctgaagtg agaggcatcg ttaatgtgaa gtgcgttcga 1380

gatggttacc agacggtaca agctgcactt ctcgactata cactgtcttg ctatcctacg 1440

atacaggata aattcggcaa gctagtgatg gtggtacctg agattcacgc tctggcagct 1500

cggggagaag aacatttata tcagcggcat tgcgccggcc aggcgcccac acagaccctt 1560

ctaatggaaa tgttacacgc aaagcgcaag ccgaacggag gtgaaatggt taaccggaat 1620

gccgagcaca cttcgaccct tgacagatta tcttga 1656

<210> 3

<211> 551

<212> PRT

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223> FTZ-F1基因编码蛋白

<400> 3

Met His Glu Asp Ala Pro Lys Met Ser Val Ser Gln Asn Leu Val

5 10 15

Ala Ser Thr Ser Gln Ala Lys Ser Asp Ile Val Thr Glu Ile Pro

20 25 30

Ser Glu Tyr Asp Ile Asn Pro Thr Glu Pro Lys Arg Thr Gln Asn

35 40 45

Leu Asp Met Glu Leu Lys Ile Thr Tyr Met Asp Pro Asn Ser Gly

50 55 60

Pro Gly Gly Glu Pro Gly Ala Tyr Leu Pro Ala Ala Gly Thr Val

65 70 75

Cys Asp Gln Thr Asp Thr Lys Asp Val Ile Glu Glu Leu Cys Pro

80 85 90

Val Cys Gly Asp Lys Val Ser Gly Tyr His Tyr Gly Leu Leu Thr

95 100 105

Cys Glu Ser Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val Gln Asn Lys

110 115 120

Lys Val Tyr Thr Cys Val Ala Glu Arg Ala Cys His Ile Asp Lys

125 130 135

Thr Gln Arg Lys Arg Cys Pro Phe Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu

140 145 150

Glu Val Gly Met Lys Leu Glu Ala Val Arg Ala Asp Arg Met Arg

155 160 165

Gly Gly Arg Asn Lys Phe Gly Pro Met Tyr Lys Arg Asp Arg Ala

170 175 180

Arg Lys Leu Gln Met Met Arg Gln Arg Gln Ile Ala Val Gln Thr

185 190 195

Leu Arg Gly Ser Leu Gly Asp Ser Gly Leu Val Leu Gly Phe Gly

200 205 210

Ser Ala Tyr Ala Ser Val Pro Val Lys Gln Glu Ile Gln Ile Pro

215 220 225

Gln Val Ser Ser Leu Thr Ser Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Pro

230 235 240

Ala Leu Leu Ala Ala Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro

245 250 255

Pro Ala His Lys Trp Glu Ala His Ser Pro His Ser Pro Asp Ala

260 265 270

Phe Ala Phe Asp Ala Pro Ala Thr Ala Ala Ala Thr Pro Ser Ser

275 280 285

Thr Gly Glu Pro Thr Asn Thr Glu Ser Leu Pro Val Ser Pro Met

290 295 300

Ile Arg Glu Phe Val Gln Thr Ile Asp Asp Arg Glu Trp Gln Asn

305 310 315

Ser Leu Phe Gly Leu Leu Gln Ser Gln Thr Tyr Asn Gln Cys Glu

320 325 330

Val Asp Leu Phe Glu Leu Met Cys Lys Val Leu Asp Gln Asn Leu

335 340 345

Phe Ser Gln Val Asp Trp Ala Arg Asn Thr Val Phe Phe Lys Tyr

350 355 360

Leu Lys Val Asp Asp Gln Met Lys Leu Leu Gln His Ser Trp Ser

365 370 375

Asp Met Leu Val Leu Asp His Leu His Gln Arg Met His Asn Gly

380 385 390

Leu Pro Asp Glu Thr Thr Leu His Asn Gly Gln Lys Phe Asp Leu

395 400 405

Leu Cys Leu Gly Leu Leu Gly Val Pro Thr Leu Ala Asp His Phe

410 415 420

Asn Glu Leu Gln Asn Lys Leu Leu Asp Leu Lys Phe Asp Val Pro

425 430 435

Asp Tyr Ile Cys Val Lys Phe Leu Leu Leu Leu Asn Pro Glu Val

440 445 450

Arg Gly Ile Val Asn Val Lys Cys Val Arg Asp Gly Tyr Gln Thr

455 460 465

Val Gln Ala Ala Leu Leu Asp Tyr Thr Leu Ser Cys Tyr Pro Thr

470 475 480

Ile Gln Asp Lys Phe Gly Lys Leu Val Met Val Val Pro Glu Ile

485 490 495

His Ala Leu Ala Ala Arg Gly Glu Glu His Leu Tyr Gln Arg His

500 505 510

Cys Ala Gly Gln Ala Pro Thr Gln Thr Leu Leu Met Glu Met Leu

515 520 525

His Ala Lys Arg Lys Pro Asn Gly Gly Glu Met Val Asn Arg Asn

530 535 540

Ala Glu His Thr Ser Thr Leu Asp Arg Leu Ser

545 551

<210>4

<211> 505

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾 FTZ-F1基因dsRNA序列

<400> 4

cagagccaaa cctacaatca gtgtgaggtc gatctctttg aattaatgtg caaagtactg 60

gaccaaaact tattttcaca agtggactgg gcgcgaaaca ccgtgttctt taagtatcta 120

aaggttgacg atcaaatgaa gctgttgcag cactcgtggt ccgacatgct ggtattggat 180

caccttcatc aaaggatgca caacggactc cccgatgaaa ctaccttgca caacggccag 240

aagtttgatc ttctctgtct cggactactt ggtgtcccaa ctctggctga tcactttaac 300

gagctccaga acaaactact agatctgaaa ttcgatgttc cagactacat ttgcgttaaa 360

tttttgcttc tgcttaatcc tgaagtgaga ggcatcgtta atgtgaagtg cgttcgagat 420

ggttaccaga cggtacaagc tgcacttctc gactatacac tgtcttgcta tcctacgata 480

caggataaat tcggcaagct agtga 505

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> FTZ-F1基因克隆正向引物

<400> 5

atagtctgtcgcccagtt 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> FTZ-F1基因克隆反向引物

<400> 6

ctttgcgcttgtgttcttc 19

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> FTZ-F1基因dsRNA正向引物

<400> 7

taatacgactcactatagggcagagccaaacctacaatcag 41

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> FTZ-F1基因dsRNA反向引物

<400> 8

taatacgactcactatagggtcactagcttgccgaatttatc 42

<210>9

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Actin正向引物

<400> 9

atgttagtatgatcgagcgtatcg 24

<210>10

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Actin反向引物

<400> 10

gcatgatctgaggagcatctt 21

<210>11

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF1α正向引物

<400> 11

tttgccttccttgcgctcaaca 22

<210>12

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF1α反向引物

<400> 12

tgtaaagcagctgatcgtgggt 22

<210>13

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> TUB正向引物

<400> 13

aatgcaagaaagccttgcgcct 22

<210>14

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> TUB反向引物

<400> 14

atgaaggaggtcgacgagcaaa 22

<210>15

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> qFTZ-F1正向引物

<400> 15

gctgcacttctcgactatac 20

<210>16

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> q FTZ-F1反向引物

<400> 16

ttgcgtgtaacatttccattag 22

<210>17

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 引物P1129F

<400> 17

caatttcacacaggaaacag 20

<210>18

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 引物P1129R

<400> 18

cagatttaggtgacactatag 21

<210>19

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> P1129 Check-F正向引物

<400>19

cttctaaatggattgac 17

<210>20

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> P1129 Check-R反向引物

<400> 20

caatcagtaaattgaacggag 21

<210>21

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物P1178KpnI-F

<400> 21

ggggtacccagagccaaacctacaatc 27

<210>22

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 反向引物P1178KpnI-R

<400> 22

ggggtacctcactagcttgccgaatttatc 30

<210>23

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物P1178XbaI-F

<400> 23

gctctagacagagccaaacctacaatc 27

<210>24

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 反向引物P1178BamHI-R

<400> 24

cgggatcctcactagcttgccgaatttatc 30

<210>25

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物P1178-F

<400> 25

cagagccaaacctacaatcag 21

<210>26

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物P1178-R

<400> 26

gataaattcggcaagctagtga 22

<210>27

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物PHAN-Check-F35S

<400> 27

cactatccttcgcaagac 18

<210>28

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物 PHAN-Check-R

<400>28

catactaattaacatcac 18

<210>29

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物为P1178Check-F

<400> 29

gtgcaaggtagtttcatcgg 20

<210>30

<211>17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物PHAN-SEQ-R

<400> 30

gtaaggatctgagctac 17

Claims

1.舞毒蛾FTZ-F1基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述舞毒蛾FTZ-F1基因的编码蛋白，其特征在于舞毒蛾FTZ-F1基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

3. 权利要求1所述舞毒蛾 FTZ-F1基因的dsRNA在害虫防治中的应用，具体为FTZ-F1基因的dsRNA注射入舞毒蛾3龄幼虫体内后，使舞毒蛾幼虫3龄蜕皮期延长，舞毒蛾幼虫取食能够表达FTZ-F1dsRNA的转基因植株叶片后，蛹羽化后，成虫翅出现皱缩无力的畸型；dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将舞毒蛾 FTZ-F1基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于注射剂量为12μg/条。

6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于舞毒蛾 FTZ-F1基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将FTZ-F1目的片段插入到能够表达基因dsRNA的pCAMBIA2300-PDK中间载体中，形成干扰载体片段gene-PDK-gene，构建能够表达FTZ-F1 dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒，将含有FTZ-F1目的片段的pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组载体进行植物遗传转化，获得表达FTZ-F1 dsRNA的转化植株，将表达FTZ-F1dsRNA的转化植株叶片喂食舞毒蛾幼虫，所述植物为84K杨。