CN110195049B - 褐飞虱眼色基因NlGCHI及其编码蛋白、应用 - Google Patents

Abstract

褐飞虱眼色基因NlGCHI及其编码蛋白、应用，属于生物技术领域。本发明一方面公开了褐飞虱眼色基因NlGCHI；另一方面公开了该褐飞虱眼色基因NlGCHI的用途。本发明公开的基因及其编码蛋白为未来褐飞虱RNAi介导的害虫防治策略提供了候选基因，为新型杀虫剂的研发提供了新的方向；同时也为作物育种，特别是基于RNAi原理的水稻抗虫育种提供了新的思路。

Description

褐飞虱眼色基因NlGCHI及其编码蛋白、应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及褐飞虱眼色基因NlGCHI及其编码蛋白、应用。

背景技术

水稻（Oryza sativa）不仅是世界上一半以上人口的主粮，而且是贫困地区7.5亿多人民的主要营养来源（Zeigler 2009）。然而，水稻的质量和产量易受各种病虫害的威胁（Zeigler 2009）。褐飞虱（BPH, Nilaparvata lugens），属半翅目飞虱科（Hemiptera：Delphacidae），是我国及许多亚洲国家水稻上的首要害虫。褐飞虱为单食性害虫，即可刺吸韧皮部汁液为害，也可传播病毒病为害，如草状丛矮病和齿叶矮缩病（Huang and Huang,2001; Wen et al., 2009, Xue et al., 2014）。褐飞虱为害可引起水稻穗数减少、谷粒数减少和千粒重减轻。褐飞虱为害严重时，会造成水稻大面积死亡，出现“虱烧”现象，从而颗粒无收。据统计2005至2007年间，我国每年均有超过2500万公顷水稻田爆发褐飞虱灾害，每年大约造成10到15亿公斤的水稻产量减少，相当于数十亿元的经济损失（Qiu et al.,2012）。

目前，化学防治仍然是控制褐飞虱危害的主要手段。然而随着杀虫剂长期大量的不合理使用，杀虫剂的一些负面影响逐渐凸显。主要表现：(1) 抗药性问题突出。田间监测表明，褐飞虱已对多种药剂产生了不同水平的抗性或交互抗性，包括有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、新烟碱类等（赵兴华, 2010）。（2）环境污染严重。调查表明，2017 年中国农药利用率仅为38.8% （http://www.moa.gov.cn）。未起作用的杀虫剂通过地表径流、渗透进入水体，严重影响了水环境和生态环境。除化肥外，农药是当前农业面源污染的重要组成部分。国家还为此专门设立了国家重点研发计划“化学肥料和农药减施增效综合技术研发”。（3）对某些非靶标生物高毒。多种曾经主要的褐飞虱防治药剂，最后被证明可影响蜜蜂的传粉行为及水生生物的存活率，严重破坏了生态链。曾经的一些明星产品，如吡虫啉和氟虫腈，先后被禁止并退出了历史舞台。随着褐飞虱抗药性及环境污染问题的日益突出，人们对新的防控手段的需求也越来越迫切。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是真核细胞中存在的一种天然的基因调控和抗病毒防御机制。研究发现，dsRNA的正义链和负义链都能特异的降解同源的RNA，具有基因转录后调控功能。RNAi因其靶标基因选择灵活、专一性强、对人畜无任何毒害、不易使昆虫产生抗性、对昆虫天敌和其它微生物无副作用等优点，逐渐成为害虫防治的一个可行性工具（Zhang et al., 2017）。RNAi防治策略与多种因素相关，其中最关键的成败点就是靶标基因的选择。因此，挖掘和鉴定新型褐飞虱有功能的特异基因及其dsRNA，利用转基因技术培育抗褐飞虱新品种或开发新型siRNA农药，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要的意义。

针对褐飞虱，国内外也已对RNAi水稻育种进行了多次尝试，靶标基因主要有蜕皮激素受体基因（EcR）、V-ATPase D和海藻糖合成酶（TPS）、阳离子氨基酸转运蛋白基因（CAT）、核糖体蛋白基因（RP）、己糖转运蛋白基因（HT1）、蔗糖酶基因（Suc）和蔗糖转运子基因（SuT）等（于慧，2013；张凤珍，2013；杨永义，2014）。尽管取食这些转基因水稻品系，可以一定程度上降低相关基因的转录水平，但对褐飞虱生长发育和致死效果不明显（于慧，2013；张凤珍，2013；杨永义，2014）。截至目前，只有浙江大学娄永根团队以唾液腺蛋白编码基因建立的三种RNAi转基因水稻对褐飞虱具有显著的致死效果（娄永根等，2013；2014a；2014b），分别为类凝集素分泌蛋白基因（secreted Lectin-like protein, Nl19243）、内切-β-1,4-葡聚糖酶基因（endo-β-1,4-glucanases, Nl1860）和多重凝结因子缺陷蛋白基因（multiple coagulation factor deficiency protein, Nl4777）。其中，褐飞虱若虫取食转Nl19243水稻6天后校正死亡率约为80%，取食转Nl1860和Nl4777水稻9天后校正死亡率分别为70%和40%左右（娄永根等，2013；2014a；2014b）。因此，有必要扩大褐飞虱的RNAi防治靶标基因库，从而对绿色有效的控制褐飞虱提供支持

三磷酸鸟苷环化水解酶（guanosine triphosphate cyclohydrolase I, GCH I）是昆虫蝶啶类眼色素合成的第一个酶，也是关键限速酶。本发明发现，沉默褐飞虱NlGCHI具有显著的致死效果。本发明为基于RNAi原理的褐飞虱及其相近昆虫防治提供了一个新的核苷酸序列。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供褐飞虱眼色基因NlGCHI及其编码蛋白、应用的技术方案。

所述的褐飞虱眼色基因NlGCHI，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

所述的褐飞虱眼色基因NlGCHI的编码蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

所述的褐飞虱眼色基因NlGCHI的dsRNA，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

所述的褐飞虱眼色基因NlGCHI在防治褐飞虱危害中的应用。

所述的褐飞虱眼色基因NlGCHI在构建抗褐飞虱转基因水稻中的应用。

所述的应用，其特征在基于褐飞虱眼色基因NlGCHI合成dsRNA，将dsRNA导入褐飞虱中实现防治褐飞虱危害。

所述的褐飞虱眼色基因NlGCHI的编码蛋白在新型化学杀虫剂研发中的应用。

所述的应用，其特征在于以褐飞虱眼色基因NlGCHI的编码蛋白为靶标的新型化学合成杀虫剂的研发。

本发明中所述的RNA提取、cDNA合成、凝胶回收、载体构建、质粒小提、Real-timePCR、dsRNA合成等试剂盒、人工饲料所需的氨基酸、维生素和微量元素、抑制剂等都可在生产商家购买。

本发明的有益效果有：

（1）本发明是国内外第一个研究不完全变态昆虫NlGCHI基因及其功能，并首次明确了其对半翅目昆虫眼色、体色及生命力都具有显著影响，是褐飞虱生长发育的一个关键基因。

（2）采用显微注射dsRNA的 RNAi技术，抑制NlGCHI基因的表达，使褐飞虱复眼眼色部分变为黑色，体色变为白色甚至透明，死亡率显著上升，羽化率低于10%，且在羽化后的24小时内全部死亡。用含有抑制剂DAHP的人工饲喂方法，抑制NlGCHI基因编码蛋白的活性，试虫死亡率也显著上升，饲喂第10的存活率仅为20.7%；体长和体重显著小于对照个体，全部试虫不能正常羽化。

（3）该基因及其编码蛋白为未来褐飞虱RNAi介导的害虫防治策略提供了候选基因，为新型杀虫剂的研发提供了新的方向；同时也为作物育种，特别是基于RNAi原理的水稻抗虫育种提供了新的思路。

附图说明

图1是显微注射dsRNA后对NlGCHI相对表达量的影响；

图2是显微注射dsRNA后对3龄若虫存活率的影响动态图；

图3是显微注射dsRNA后对眼色表型的影响；

图4是显微注射dsRNA后对体色表型的影响；

图5是显微注射4龄初若虫对生长发育关键参数的影响；

图6是显微注射dsGCHI后大部分试虫死亡表型图；

图7是取食抑制剂DAHP对3龄若虫存活率的影响动态图；

图8是取食抑制剂DAHP后大部分试虫死亡表型图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

下述实例中所用褐飞虱，均用分蘖期水稻饲养于光照培养箱，品种为TN1，饲养温度26±1℃，相对湿度 70±5%。

实施例1 褐飞虱NlGCHI基因的克隆

首先通过生物信息学方法，以黑腹果蝇GCHI蛋白氨基酸序列作为搜索原在褐飞虱基因组和转录组数据库中搜索同源序列，获得了两条高同源序列（p<0.1）。其次，设计引物验证序列。再次，用RACE法验证5’-和3’-端非翻译区序列。最后，设计引物，扩增了NlGCHI两个转录本的共有开放阅读框（ORF）序列，克隆并构建质粒用于后续实验，重组质粒含有SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列；或重组质粒含有 SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的共同序列。

ORF序列扩增引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

GCHI-F（SEQ ID NO.5）：ATGGAGCTGGACCACAGACCAC

GCHI-R（SEQ ID NO.6）：CAAGAATTCCTCGCGTGTCTTGG。

克隆得到的褐飞虱NlGCHI有两个不同转录本，其完整cDNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该褐飞虱眼色基因NlGCHI的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

实施例2 褐飞虱NlGCHI及其对照荧光蛋白基因GFP的dsRNA合成

1. 含T7启动子的NlGCHI和绿色荧光蛋白基因GFP dsDNA的合成

以实施例1中所构建的NlGCHI重组质粒和本实验室保有的已含有GFP的质粒为模板为模板，进行dsDNA扩增并纯化回收，dsGCHI长306bp，dsGFP长360bp，其中dsGCHI合成所对应DNA序列如SEQ ID NO.11所示。

dsRNA合成引物

dsGCHI-F（SEQ ID NO.7）：taatacgactcactatagggagaGCATCACTTGGTCCCATTC

dsGCHI-R（SEQ ID NO.8）：taatacgactcactatagggagaAATTCCTCGCGTGTCTTGG

dsGFP-F（SEQ ID NO.9）：taatacgactcactatagggagaATGCCACCTACGGCAAGCT

dsGFP-R（SEQ ID NO.10）：taatacgactcactatagggagaTCGGCCATGATATAGACGTT

小写碱基为T7 RNA聚合酶启动子序列。

PCR扩增条件：95℃ 2min；（98℃ 10s, 74℃ 50s）× 5循环；（98℃ 10s, 72℃40s）× 5循环；（98℃ 10s, 70℃ 40s）× 5循环；（98℃ 10s, 68℃ 40s）× 20循环；68℃7 min。

2. dsRNA的合成与纯化

采用MEGA script RNAi Kit（Life technology, German），按照说明步骤合成dsRNA，分别包括dsRNA的合成；ssRNA和DNA的去除，dsRNA的过柱纯化三个步骤。

（1）dsRNA的合成模板约1.5-2µg, 2.0µL 10×T7 buffer 2µL, ATP 2µL, GTP 2µL, CTP 2µL, UTP 2µL, T7 enzyme 2µL, 用Nuclease free水补足20µL。37℃保温3小时。

（2）ssRNA和DNA的去除在合成的dsRNA 20.0µL中加入21.0µL Nuclease-free水，5.0µL l0×digestion buffer, 2. 0µL DNase I, 2. 0µL RNase。37℃保温1小时。

（3）dsRNA的过柱纯化在上述50.0µL dsRNA 产物中加入150.0µL Nuclease-free水，50.0µL 10×binding buffer, 250.0 µL100%乙醇，混匀后转移过滤柱中，室温放置2min, 12000 rpm 离心2min, 弃滤液；加入500 µL washing buffer, 12000rpm离心2min,弃滤液，并重复一次；不加液体，12000rpm离心2min 后，将过滤柱转移到1.5ml离心管中，加入50µL预热到95℃的Elution buffer，室温放置2 min，12000rpm离心2min，收集得到纯化的dsRNA。用1.5%琼脂糖凝胶和Nandrop检测浓度和完整度，保存与-80℃备用。

实施例3 dsGCHI和dsGFP对3龄若虫的注射及效果检测

1. 试虫收集 将多头抱卵雌虫转移至分蘖期TN1（Taichung Native l）水稻苗上产卵，24小时后移除。待其有若虫孵化后，每12小时将初孵若虫轻轻拍到新的水稻苗上饲养，从而获得龄期一致的试虫。

2. 试虫注射 配制质量浓度为1.5-2.0%的琼脂糖凝胶，将溶化后的琼脂糖胶倒入培养皿中，琼脂糖凝胶的高度略高于培养皿，培养皿上方放置2-3根直径0.5-0.8mm的毛细管。待琼脂糖凝胶冷却后，抽掉毛细管，即得到有凹槽的琼脂糖胶。将3龄中期若虫转入玻璃试管中，用CO₂麻醉2分钟，将试虫整齐的摆放在上述琼脂糖凝胶的凹槽中。利用Eppendorf显微注射仪（型号TransferManNK2, 上海艾本德公司），在试虫胸部后足基部中间柔软的地方注射0.05µL dsRNA （1500ng/µL，由实施例2制得）。注射后的试虫饲养于新鲜稻苗上。

3. 效果检测

（1）表达量检测 试虫在注射后的第4天取样，每样10头，4次重复。提取RNA并合成cDNA，以RPS15和TUB基因为内参。检测注射dsRNA对NlGCHI表达水平的影响，NlGCHI、RPS15和TUB基因扩增片段分别为118bp、150bp和174bp。

荧光定量引物

qGCHI-F（SEQ ID NO.12）：CACTTGGTCCCATTCTACGG

qGCHI-R（SEQ ID NO.13）：CTTGAACTTGAAGCCTCCTG

qRPS15-F（SEQ ID NO.14）：CCGATCGTGTGGCGTTGAAGGG

qRPS15-R（SEQ ID NO.15）：ATGGCCGACATTCTTCCAGGTCC

qTUB-F（SEQ ID NO.16）：ACTCGTTCGGAGGAGGCACC

qTUB-R（SEQ ID NO.17）：GTTCCAGGGTGGTGTGGGTGGT

结果如附图1所示，相对于注射dsGFP的对照组，注射dsGCHI的实验组褐飞虱体内NlGCHI基因的相对表达量显著降低，达10％以下 (P<0 .01)。结果表明，通过显微注射dsGCHI能够引起褐飞虱体内NlGCHI基因的RNAi效应。

实施例4 dsGCHI注射对褐飞虱3龄若虫存活率和表型的影响

（1）存活率检测 注射试虫在注射48h后剔除因机械损伤造成的死虫。将活虫转移至透明塑料杯中，每杯有3根分蘖期TN1水稻苗，根部用脱脂棉包裹保湿，每两天更换一次。每杯20头，4次重复，每24小时记录活虫数。

结果如附图2所示，注射dsGCHI试虫的存活率始终显著低于注射dsGFP的试虫，且在注射后的第4天死亡率显著上升。多次试验结果都表明，注射后第4天是试虫死亡高峰。在第9天时注射dsGCHI试虫的死亡率达95.1%，而对照试虫的死亡率仅为17.5%。观察发现，dsGCHI试虫的生命活力显著低于对照。

（2）显微注射后褐飞虱表型检测 将注射后试虫单头饲养，每2h观察。分别收集0.5h、4h和24h的5龄试虫拍照。如图3所示，dsGCHI注射褐飞虱的单眼变为了黑色，复眼部分变为黑色，而dsGFP注射试虫眼色无明显变化。如图4所示，dsGFP试虫随着时间的推移，体色逐渐加深，一般在4h内基本完成体壁的色素沉着。而dsGCHI试虫随着时间的推移，体色虽稍有加深，但变化幅度不大。即使是在蜕皮后24h，触角上的感觉圈仍无法分辨。注射dsGCHI后，试虫的眼色也发生了显著变化。

实施例5 dsGCHI注射4龄初若虫（3-15h）对蜕皮率、羽化率及寿命的影响

（1）4龄初试虫的收集 为了得到一致的4龄初若虫，将3龄中后期试虫单头分养在双通玻璃试管中，每12小时观察蜕皮情况。将初蜕皮的试虫按照实施例3中的显微注射方法进行dsGFP和dsGCHI注射。试虫注射24h后，单头饲养，每12h记录蜕皮及死亡情况直至试虫死亡。共进行了3次试验，每基因每次注射试虫30头多头，保证24h后可成活20头以上。

（2）结果如5图所示，dsGFP和dsGCHI注射的4龄试虫成功蜕皮率差异不显著，分别为72.0±5.29%和66.4±3.05%；而5龄若虫的羽化率存在显著性差异，dsGFP和dsGCHI试虫成功羽化率分别为80.10±3.62%和15.95±2.09%。观察发现，dsGCHI注射试虫在羽化过程中死亡率极高，存在羽化困难，绝大部分的虫蜕还残留在虫体上（图6）。统计结果还表明，dsGCHI试虫在5龄若虫期和成虫变态初期（<12h）死亡率也显著高于dsGFP注射试虫。通过对dsGCHI试虫死亡高峰时间节点的分析表明，NlGCHI沉默致死的主要原因可能是与试虫的蜕皮或/和新表皮形成有关。

实施例6 饲喂DAHP对试虫死亡率的影响

（1）参照褐飞虱人工饲料配方配置人工饲料（Fu et al., 2001），所用氨基酸、维生素、微量元素等都可在商家购买。为了更好的分析褐飞虱NlGCHI的功能，同时还配制含10mg/ml DAHP的人工饲料，DAHP是GCHI的抑制剂。DAHP需先用1M的NaOH溶解后再添加至营养液，最后调节pH 值。参照已成熟的人工饲喂法（Fu et al., 2001），对3龄若虫进行连续饲喂试验。每处理7个重复，每重复20头，连续饲喂10天，每天更换饲料并记录活虫数。

（2）结果如7图所示，取食GCHI抑制剂的第3天，试虫的死亡率就开始显著高于对照，直至饲喂10天后的实验结束。在第10天，取食DAHP试虫的存活率仅为20.7%，显著低于对照的768.21%。虽然对体色影响不大，但显著抑制了试虫的生长发育，体长和体重都显著小于对照个体。且大部分试虫死于蜕皮障碍（图8）。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 褐飞虱眼色基因NlGCHI及其编码蛋白、应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2537

<212> DNA

<213> 褐飞虱(Nilaparvata lugens(Stal))

<400> 1

agcagtcgtg cgctgaggta gctgctgcgc aggtgatcgc tcgctctctc acctaacctc 60

tctttcacaa actcacgtcc tctctcgcac tcctccactt ccttccggaa cacactgtct 120

agttttccag attttgtccc aagaacatag ctggatttct cagtttcctg tcagacacaa 180

taacagattt ccgagtttcc tcacagactc aattccgaat ttatcgcttt cctcacatac 240

ctacaagttt ttgagttctc tatcaaaaat acttcgaaat ttctcactta cattacaaac 300

atacgaattg agtttcttct caaactcact tcccaacttc tatcaaacac acttacaaat 360

tttcaacttt tctctcaaac tctcttcaaa atttcgcact tacctctcaa acactgttac 420

gagagagtct tttcaactta cccactctcc acattcctct cacacatacg ttcgagtttt 480

cacaactttc ctctcgcttt tccaactttc ttcactttcg gttcccatta ccatgagcgc 540

caccgctgaa gtttctagtg ctgccggtca agacgttaag aagtgtccgc cggtcagact 600

gcgatcggtc tcatggcagg aaaacattga agacgatatc gaagtgcccg gaactccacg 660

tactccgcgc acatctacaa caccaggtca cgagaaatgc actttccatc acgacatgga 720

gctggaccac agaccaccaa ccagagaagc gcttctgccc gacatggcgc gttcatacag 780

aatgctgctc acgtcgctgg gagagaaccc cgagcgagag ggtctcctca aaactcccga 840

gcgcgccgct aaggccatgc ttttcttcac caaaggctac gaccagtgcc tagaagatgt 900

tctgaatgac gccgtatttg acgaggatca cgatgagatg gtggtcgtca aggacattga 960

aatgttctcc atgtgcgagc atcacttggt cccattctac ggaaaagttt ctattggata 1020

cctcccaaac aagaagatcc taggattgag caaacttgca agaatcgttg agatctactg 1080

caggaggctt caagttcaag aacgtctgac aaagcagatc gccattgctg tcaccaaagc 1140

agttcagccc gctggagttg cagtagtcgt cgaagcagct cacatgtgca tggtgatgag 1200

aggagtgcag aaaataaaca gcaagacgac cacatctacg atgctggggg tgttcagaga 1260

tgaccccaag acacgcgagg aattcttgaa tctggtcaag agcaagtaaa tccaaagtgg 1320

gttttaaaac gttgattgaa aatcattatt atatcattat aactgcctat aatttacaat 1380

gtattaaaac ttttataatc ttatcaatta ggaaacaatt cctcaaaatt atttaattaa 1440

caatcatgag aaaatacatt aactttattt ctttgattga tatttacatg ttctcacaca 1500

atgacccaaa tatggtatca ataattggaa ttattagaat tggataaata taaatgaata 1560

ttatgcttca aatatcacta tactgctgtg taggctatct attaataacc aataaacaag 1620

aataataata ttatgttctg ggaacaacgc ttcatgaaga ctgcggctgc ttgagtgttc 1680

aaatttattg aaacaaatga tataaagata aaaccattga tctcaaatag atttttctgg 1740

ttctagtgtt atgtattgca atgttgttta aacgtcataa aattttatat aaaactgttg 1800

ttttgttaca aatatttaat gcattcaact tgttaacatt aaaaatgttt gttgttacaa 1860

aatttatatt gctataccag catctttatg gagatttcac tcatattttt atgtgtagca 1920

ttgaaaagaa atatcattct tctgaatatt gagaatacta atgtacttag tataattact 1980

attattattc attacatgac agtaatgatt tatttcgtgg atgaacagag tatttggatg 2040

aaaagatata aatctatcaa tatttttcta aaaatctcta aattttgtct tgacaataaa 2100

tacatatttt agtattatga taaatattat aaatctggat atatttcact gttttgtagc 2160

atccaacttg caaaagtttc tgtgaacaag tattgcattt ttccattata cttagtgctc 2220

ttatgtagtt cattttaaaa tcataataga atcaactctt atcaatgaaa atttttatct 2280

ttaaacaatt ttagtggtat atttatatga aaataagggt gtgcttaacg taacatgaat 2340

ttcttagatg attttgtgaa tttgaagttt tgtagtttta cagttttata ttagagttat 2400

atttatatta attgaaaaac accatgccaa tctaaataag tcagttttcg tttatggaaa 2460

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gttatgttcg aatacga 2537

<210> 2

<211> 2022

<212> DNA

<213> 褐飞虱(Nilaparvata lugens(Stal))

<400> 2

caccgcattt gctggttcac ttatctttcc attcaaatca ctctccagct gttcatccac 60

tctttctctc tctctcactc tcgcagcaca ccatgaagcc cgaaattcag atcaagacca 120

ccgtacccac ccctgccacc accaagagca agaatggaga ctccgagaat ggtcacgaga 180

aatgcacttt ccatcacgac atggagctgg accacagacc accaaccaga gaagcgcttc 240

tgcccgacat ggcgcgttca tacagaatgc tgctcacgtc gctgggagag aaccccgagc 300

gagagggtct cctcaaaact cccgagcgcg ccgctaaggc catgcttttc ttcaccaaag 360

gctacgacca gtgcctagaa gatgttctga atgacgccgt atttgacgag gatcacgatg 420

agatggtggt cgtcaaggac attgaaatgt tctccatgtg cgagcatcac ttggtcccat 480

tctacggaaa agtttctatt ggatacctcc caaacaagaa gatcctagga ttgagcaaac 540

ttgcaagaat cgttgagatc tactgcagga ggcttcaagt tcaagaacgt ctgacaaagc 600

agatcgccat tgctgtcacc aaagcagttc agcccgctgg agttgcagta gtcgtcgaag 660

cagctcacat gtgcatggtg atgagaggag tgcagaaaat aaacagcaag acgaccacat 720

ctacgatgct gggggtgttc agagatgacc ccaagacacg cgaggaattc ttgaatctgg 780

tcaagagcaa gtaaatccaa agtgggtttt aaaacgttga ttgaaaatca ttattatatc 840

attataactg cctataattt acaatgtatt aaaactttta taatcttatc aattaggaaa 900

caattcctca aaattattta attaacaatc atgagaaaat acattaactt tatttctttg 960

attgatattt acatgttctc acacaatgac ccaaatatgg tatcaataat tggaattatt 1020

agaattggat aaatataaat gaatattatg cttcaaatat cactatactg ctgtgtaggc 1080

tatctattaa taaccaataa acaagaataa taatattatg ttctgggaac aacgcttcat 1140

gaagactgcg gctgcttgag tgttcaaatt tattgaaaca aatgatataa agataaaacc 1200

attgatctca aatagatttt tctggttcta gtgttatgta ttgcaatgtt gtttaaacgt 1260

cataaaattt tatataaaac tgttgttttg ttacaaatat ttaatgcatt caacttgtta 1320

acattaaaaa tgtttgttgt tacaaaattt atattgctat accagcatct ttatggagat 1380

ttcactcata tttttatgtg tagcattgaa aagaaatatc attcttctga atattgagaa 1440

tactaatgta cttagtataa ttactattat tattcattac atgacagtaa tgatttattt 1500

cgtggatgaa cagagtattt ggatgaaaag atataaatct atcaatattt ttctaaaaat 1560

ctctaaattt tgtcttgaca ataaatacat attttagtat tatgataaat attataaatc 1620

tggatatatt tcactgtttt gtagcatcca acttgcaaaa gtttctgtga acaagtattg 1680

catttttcca ttatacttag tgctcttatg tagttcattt taaaatcata atagaatcaa 1740

ctcttatcaa tgaaaatttt tatctttaaa caattttagt ggtatattta tatgaaaata 1800

agggtgtgct taacgtaaca tgaatttctt agatgatttt gtgaatttga agttttgtag 1860

ttttacagtt ttatattaga gttatattta tattaattga aaaacaccat gccaatctaa 1920

ataagtcagt tttcgtttat ggaaaagtgg accaaactat gatgaaattt atttttggaa 1980

tttgtatgtt tgaatattaa attctgttat gttcgaatac ga 2022

<210> 3

<211> 258

<212> PRT

<213> 褐飞虱(Nilaparvata lugens(Stal))

<400> 3

Met Ser Ala Thr Ala Glu Val Ser Ser Ala Ala Gly Gln Asp Val Lys

1 5 10 15

Lys Cys Pro Pro Val Arg Leu Arg Ser Val Ser Trp Gln Glu Asn Ile

20 25 30

Glu Asp Asp Ile Glu Val Pro Gly Thr Pro Arg Thr Pro Arg Thr Ser

35 40 45

Thr Thr Pro Gly His Glu Lys Cys Thr Phe His His Asp Met Glu Leu

50 55 60

Asp His Arg Pro Pro Thr Arg Glu Ala Leu Leu Pro Asp Met Ala Arg

65 70 75 80

Ser Tyr Arg Met Leu Leu Thr Ser Leu Gly Glu Asn Pro Glu Arg Glu

85 90 95

Gly Leu Leu Lys Thr Pro Glu Arg Ala Ala Lys Ala Met Leu Phe Phe

100 105 110

Thr Lys Gly Tyr Asp Gln Cys Leu Glu Asp Val Leu Asn Asp Ala Val

115 120 125

Phe Asp Glu Asp His Asp Glu Met Val Val Val Lys Asp Ile Glu Met

130 135 140

Phe Ser Met Cys Glu His His Leu Val Pro Phe Tyr Gly Lys Val Ser

145 150 155 160

Ile Gly Tyr Leu Pro Asn Lys Lys Ile Leu Gly Leu Ser Lys Leu Ala

165 170 175

Arg Ile Val Glu Ile Tyr Cys Arg Arg Leu Gln Val Gln Glu Arg Leu

180 185 190

Thr Lys Gln Ile Ala Ile Ala Val Thr Lys Ala Val Gln Pro Ala Gly

195 200 205

Val Ala Val Val Val Glu Ala Ala His Met Cys Met Val Met Arg Gly

210 215 220

Val Gln Lys Ile Asn Ser Lys Thr Thr Thr Ser Thr Met Leu Gly Val

225 230 235 240

Phe Arg Asp Asp Pro Lys Thr Arg Glu Glu Phe Leu Asn Leu Val Lys

245 250 255

Ser Lys

<210> 4

<211> 233

<212> PRT

<213> 褐飞虱(Nilaparvata lugens(Stal))

<400> 4

Met Lys Pro Glu Ile Gln Ile Lys Thr Thr Val Pro Thr Pro Ala Thr

1 5 10 15

Thr Lys Ser Lys Asn Gly Asp Ser Glu Asn Gly His Glu Lys Cys Thr

20 25 30

Phe His His Asp Met Glu Leu Asp His Arg Pro Pro Thr Arg Glu Ala

35 40 45

Leu Leu Pro Asp Met Ala Arg Ser Tyr Arg Met Leu Leu Thr Ser Leu

50 55 60

Gly Glu Asn Pro Glu Arg Glu Gly Leu Leu Lys Thr Pro Glu Arg Ala

65 70 75 80

Ala Lys Ala Met Leu Phe Phe Thr Lys Gly Tyr Asp Gln Cys Leu Glu

85 90 95

Asp Val Leu Asn Asp Ala Val Phe Asp Glu Asp His Asp Glu Met Val

100 105 110

Val Val Lys Asp Ile Glu Met Phe Ser Met Cys Glu His His Leu Val

115 120 125

Pro Phe Tyr Gly Lys Val Ser Ile Gly Tyr Leu Pro Asn Lys Lys Ile

130 135 140

Leu Gly Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ile Val Glu Ile Tyr Cys Arg Arg

145 150 155 160

Leu Gln Val Gln Glu Arg Leu Thr Lys Gln Ile Ala Ile Ala Val Thr

165 170 175

Lys Ala Val Gln Pro Ala Gly Val Ala Val Val Val Glu Ala Ala His

180 185 190

Met Cys Met Val Met Arg Gly Val Gln Lys Ile Asn Ser Lys Thr Thr

195 200 205

Thr Ser Thr Met Leu Gly Val Phe Arg Asp Asp Pro Lys Thr Arg Glu

210 215 220

Glu Phe Leu Asn Leu Val Lys Ser Lys

225 230

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 5

atggagctgg accacagacc ac 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 6

caagaattcc tcgcgtgtct tgg 23

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 7

taatacgact cactataggg agagcatcac ttggtcccat tc 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 8

taatacgact cactataggg agaaattcct cgcgtgtctt gg 42

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 9

taatacgact cactataggg agaatgccac ctacggcaag ct 42

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 10

taatacgact cactataggg agatcggcca tgatatagac gtt 43

<210> 11

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 11

gcatcacttg gtcccattct acggaaaagt ttctattgga tacctcccaa acaagaagat 60

cctaggattg agcaaacttg caagaatcgt tgagatctac tgcaggaggc ttcaagttca 120

agaacgtctg acaaagcaga tcgccattgc tgtcaccaaa gcagttcagc ccgctggagt 180

tgcagtagtc gtcgaagcag ctcacatgtg catggtgatg agaggagtgc agaaaataaa 240

cagcaagacg accacatcta cgatgctggg ggtgttcaga gatgacccca agacacgcga 300

ggaatt 306

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 12

cacttggtcc cattctacgg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 13

cttgaacttg aagcctcctg 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 14

ccgatcgtgt ggcgttgaag gg 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 15

atggccgaca ttcttccagg tcc 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 16

actcgttcgg aggaggcacc 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 17

gttccagggt ggtgtgggtg gt 22

Claims (2)

1.dsGCHI在防治褐飞虱危害中的应用，所述dsGCHI核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.dsGCHI在构建抗褐飞虱转基因水稻中的应用，所述dsGCHI核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。

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