CN104561018A - 舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA在无公害防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA在无公害防治中的应用。所述Hsp23基因的核苷酸序列和编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，由该基因部分序列片段合成dsRNA，其序列如SEQ ID No.2所示。Hsp23基因dsRNA可应用在防治舞毒蛾生长发育中。实验结果表明：当舞毒蛾幼虫注射Hsp23基因dsRNA后，与对照（注射ddH₂O和GFP基因dsRNA）相比均有较强的沉默效果，致使舞毒蛾幼虫生长发育受到抑制。因此发明提出可利用Hsp23的沉默技术来防治林木重要害虫舞毒蛾及具有相似结构域的鳞翅目害虫，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。

Description

舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA在无公害防治中的应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种亚洲型舞毒蛾的热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA以及基于该基因RNAi技术在亚洲型舞毒蛾防治中的应用。

背景技术

舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）是世界性的害虫，分布广，食性杂，据国外报道可危害300多种植物，国内报道可危害杨、柳、苹果、樟子松、落叶松等500余种植物。舞毒蛾传播快，繁殖量和取食量大，给林业生产造成重大经济损失，如：1974年舞毒蛾在辽宁省南部大发生，将许多蚕场的栎叶食尽，杨、柳、榆、山楂、苹果叶等也受到严重危害。目前对亚洲型舞毒蛾的防治，仍然是以高效氯氰菊酯、溴氰菊酯等化学杀虫剂为主，但这些化合物容易引起害虫抗药性的形成和环境污染问题。尽管一些害虫天敌、致病微生物等生物防治在舞毒蛾防治上起到一定的作用，但这些防治技术存在受气候环境影响大、见效慢、效果不明显等弊病，严重制约了舞毒蛾防治的发展。然而，随着生物技术的迅猛发展，利用RNAi技术控制害虫的危害已成为植物保护工作者研究的重点和热点。Napoli等（1990）首次发现RNAi现象，将外源基因引入矮牵牛内会引起内源基因的沉默，当时把这种现象称为“共抑制”。Fire等（1998）阐述了基因沉默现象的本质，将由dsRNA引发生物体同源序列mRNA降解而最终导致特异性基因转录后沉默的效应命名为RNA干扰。RNAi技术已经在农林害虫防治中得到应用。一方面通过基因工程手段将害虫靶标基因dsRNA转入植物体内，当有害生物取食转基因植物时，引发害虫体内发生基因沉默失去功能，降低害虫的取食能力；例如：Mao等（2007）将含有细胞色素P450相应序列的dsRNA转基因棉花饲喂棉铃虫，导致棉铃虫体内P450基因的表达显著降低，最终使棉铃虫解毒能力下降而死亡。Zha等（2011）将褐飞虱中肠中高表达的己糖转运基因（NlHT1），羧肽酶基因（Nlcar），类胰丝氨酸蛋白酶（Nltry）dsRNA转入水稻中，当褐飞虱取食携带这些基因的dsRNA转基因水稻时，未出现致死现象，但靶标基因的转录水平明显下降。另一方面，通过筛选具有致死效应的siRNA（一般来源于生物体内参与重要生物化学途径的候选基因），并用化学方法合成，可应用于新型的杀虫剂生物农药。基于RNAi技术具有对人畜安全，对防治靶标对象专一，对非靶标生物安全、无害虫抗药性等特点，解决了化学农药长期施用导致“3R”这一难题。

昆虫在杀虫剂胁迫下，通过高表达热激蛋白、细胞色素P450等方式来进行自身的保护。热激蛋白是在应激条件下产生的，具有分子伴侣功能和耐受性功能，是一类生物体内广泛存在且高度保守的超基因家族。依据其编码蛋白相对分子量大小对其进行命名，其中Hsp70和Hsp90家族基因研究广泛而深入。smHsp是一类低分子量蛋白，广泛存在于原核和真核生物体中的一大类分子伴侣家族，已有研究证实参与细胞的生长、发育、分化及增强机体的抗氧化作用。由于smHsp家族基因具有这些重要的生理功能，smHsp研究成为当今细胞生物学、生物化学中一个重要的研究领域。

目前，有关通过抑制小分子热激蛋白基因转录水平来防治林木重要害虫舞毒蛾未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA在无公害防治中的应用。本发明利用分子生物学手段干扰舞毒蛾潜在的防御基因Hsp23，不仅降低了昆虫的生存能力，在舞毒蛾无公害防治中的应用具有广阔的前景并为其他鳞翅目害虫防治提供了理论依据，而且能使舞毒蛾热激蛋白基因Hsp23有效的沉默，显著影响舞毒蛾幼虫的生长发育和生理代谢，为无公害、可持续防治舞毒蛾提供了新思路和新材料。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种亚洲型舞毒蛾热激蛋白基因Hsp23，其核苷酸序列和编码氨基酸的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明以亚洲型舞毒蛾Hsp23基因片段为模板，通过MEGAscript RNAi试剂盒（Ambion）合成Hsp23基因dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述dsRNA在防治舞毒蛾中的应用，主要表现为调控舞毒蛾生长发育。将该dsRNA微量注射入舞毒蛾3龄幼虫体内，结果表明：Hsp23基因沉默舞毒蛾幼虫8d内体重增加量小于对照ddH₂O，且在3d内体重增加量也小于dsRNAGFP；同时显著影响舞毒蛾营养利用指标，导致相对取食量、食物利用率、近似消化率较对照显著下降（P < 0.05）。dsRNA可以高效特异的沉默昆虫体内Hsp23基因的mRNA表达。

克隆本发明中所述的舞毒蛾热激蛋白基因Hsp23的方法是本领域中所常采用的方法。本发明中所述的提取舞毒蛾幼虫总RNA、合成cDNA第一条链、合成dsRNA、实时荧光定量RT-PCR等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒Qiagen、PrimeScript^TMRT、MEGAscript RNAi Kit、SYBR Green Real-time PCR Master Mix (Toyobo) 等都可以从生产商家购买。

本发明的优点在于：

1、本发明是国内外首次公开亚洲型舞毒蛾小分子量热激蛋白基因Hsp23全长核酸序列，目前关于其抑制表达可显著影响舞毒蛾生长发育的功能未见相关报道。

2、将dsRNA注入舞毒蛾3龄幼虫体腔内，高效的沉默了舞毒蛾的靶标基因Hsp23，能够导致舞毒蛾幼虫生长发育缓慢，显著影响其正常的生理代谢，从而达到弱化舞毒蛾生命力的目的，最终达到防治的效果，为此本发明为无公害、可持续防治舞毒蛾提供了新的有效途径，且Hsp23基因dsRNA具有广阔的应用前景。

3、实验结果表明：当舞毒蛾幼虫注射Hsp23基因dsRNA后，与对照（注射ddH₂O和GFP基因dsRNA）相比均有较强的沉默效果，致使舞毒蛾幼虫生长发育受到抑制。因此本发明提出可利用Hsp23的沉默技术来防治林木重要害虫舞毒蛾及具有相似结构域的鳞翅目害虫，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。

附图说明

图1为注射dsRNA舞毒蛾3龄幼虫症状；

图2为注射dsRNA舞毒蛾3龄幼虫 Hsp23基因表达水平；

图3为舞毒蛾Hsp23基因电泳图；

图4为舞毒蛾Hsp23基因沉默对舞毒蛾幼虫鲜重的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例 1 ：舞毒蛾热激蛋白 Hsp23 基因全长克隆

舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因核酸序列750 bp，开放阅读框600 bp，编码199个氨基酸，分子量大小为22.84 kDa，理论等电点PI为5.50，为一酸性蛋白。

提取舞毒蛾总RNA，使用反转录试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit（TaKaRa）合成cDNA第一条链，再以cDNA第一链为模板，根据舞毒蛾幼虫转录组序列在基因非编码区序列的两侧设计引物（正向引物：5’-CAGTAAACAGTATTCGAAG-3’；反向引物：5’- AGGCGAAAGAAACAAGCACT-3’。

反应体系:5×PrimeScript buffer 2 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL、Oligo d(T) primer (50μM) 0.5μL、Random 6 mers(100μM) 0.5 μL、 Total RNA 0.5 μg RNase Free ddH₂O 补足10 μL。，PCR扩增程序如下：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 延伸10 min。将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收750 bp的条带，见图3。将回收得到的条带与pMD18-T载体连接过夜，将连接产物转化DH5α感受态细胞。通过菌液PCR检测的阳性克隆菌液，送至北京华大生物技术有限公司测序以验证读码框。

实施例 2 ：舞毒蛾 Hsp23 基因 dsRNA 的合成

根据实施例1中所克隆的舞毒蛾Hsp23基因全长，设计合成Hsp23基因dsRNA正向引物（5’-ATGTCGTTAATTCCTTACATGTA-3’）和反向引物（5’- CTAATTAGATTCTTCAATTGTCG-3’），扩增得到片段长度为516bp的序列，通过体外dsRNA合成试剂盒获得Hsp23基因的dsRNA。

具体地合成过程是，在每条特异性引物的5′端加有一段20 bp左右的T7启动子序列，用GFP作为对照组。通过PCR法扩增目的条带，反应程序为: 94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35 个循环；72℃ 7 min，扩增产物经电泳检测确认后作为模板合成dsRNA（参照MEGAscript RNAi Kit试剂盒说明书），于紫外分光光度计检测dsRNA浓度，并取0.5 µL dsRNA于1%琼脂糖凝胶电泳检测确认，- 80℃保存备用。

实施例 3 ：舞毒蛾 Hsp23 基因沉默效果的检测

将实施例2合成的Hsp23基因和GFP 基因的dsRNA（1 μg），微注射入舞毒蛾3龄幼虫，分别于6、24、48、96、144 h选取活泼的3龄幼虫，采用RNeasy Mini动物组织总RNA提取试剂盒（Qiagen）提取总RNA，采用PrimeScript^TMRT 试剂盒（TaKaRa）合成cDNA第一条链，以此为模板，运用荧光定量RT-PCR检测注射后Hsp23基因的表达量。注射dsRNA舞毒蛾3龄幼虫 Hsp23基因表达水平如图2所示。结果表明，外源对照基因GFP的dsRNA注入舞毒蛾幼虫体内会影响Hsp23基因的表达。与对照GFP基因相比，Hsp23基因沉默效果高于对照。注射6h时，dsRNAHsp23的沉默效果是dsRNAGFP沉默的1.82倍，随着时间的增加， dsRNAHsp23的沉默效果有所下降，处理4d时，沉默效果最差，为对照的76.08%，在处理第5d时，沉默效应最佳，为对照组的6.78倍（内参基因为Actin、EF1α、TUB，引物见表1)。

表 1 RNAi 干扰中的相关引物

实施例 4 ： Hsp23 基因的 dsRNA 抑制舞毒蛾的生长发育及表型的观察

将实施例2中体外合成的dsRNA微量注射入舞毒蛾3龄幼虫体内，同时记录其对舞毒蛾幼虫的营养利用影响。更具体的地说，是将舞毒蛾3龄幼虫经饥饿处理12 h后，将1μg的ddH₂O、dsRNAHsp23、dsRNA GFP分别注入到上述饥饿处理的舞毒蛾3龄幼虫体内，每组处理20头，正常饲喂8d，每天按时称量幼虫鲜重。参照Waldbauer（2011）的方法计算其各营养指标：相对生长率（RGR）=（D-C）/[(C+D)/2]×100%；相对取食量（RCR）=（A-B）/[(C+D)/2]×100%;食物利用率（ECI）=（D-C）/(A-B-E) ×100%；近似消化率（AD）=（A-B-E）/（A-B）×100%。其中A为试验前饲料干重；B为试验后饲料干重；C为试验前幼虫干重；D为试验后幼虫干重；E为幼虫粪便干重；体重累计增长率（%）=（注射后的体重-注射前的体重）×100/注射前的体重。

由表2可知：经微量注射dsRNAHsp23实验组与对照组dsRNA GFP和ddH₂O相比，经过8d正常饲喂后，在取食、体型变化及体重增长上两者差异显著（P < 0.05），而外源基因dsRNAGFP与ddH₂O差异不显著（P > 0.05）。其中，微注射Hsp23基因dsRNA处理组的相对生长率和食物转化率均显著高于dsRNAGFP照组，分别增长33.7%和8.99%；而相对取食量、食物利用率、近似消化率均显著低于对照组（dsRNAGFP、ddH₂O），表明舞毒蛾幼虫生长发育受到影响，干扰了正常的生理功能，表型见图1。

Hsp23基因沉默导致舞毒蛾幼虫体重增长缓慢，3 d前均低于对照ddH₂O和GFP基因，而在第4 d~8d，幼虫体重高于GFP基因，但低于对照ddH₂O（图4）。

表 2 舞毒蛾 Hsp23 基因沉默对舞毒蛾幼虫营养利用的影响

序列表

<110>东北林业大学

<120>舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA在无公害防治中的应用

<160>2

<210> 1　

<211> 750

<212> DNA

<213> Hsp23基因核苷酸及编码氨基酸序列

<220>

<221> CDS

<222> (46)...(651)

<400> 1

1 CAG TAA ACA GTA TTC GAA GTG AAG TAC GAA GAA GCA AGT TGT TAC 45

46 TAT AAA ATG TCG TTA ATT CCT TAC ATG TAC GAC TTA GAG ATA CCT 90

M S L I P Y M Y D L E I P 13

91 TTT CGC CAT ATG GAG AGA GAA TTC TTA AGG CCT GAG GAG TTC TTT 135

14 F R H M E R E F L R P E E F F 28

136 GGT TAT TCT CCG TAC AAT CAG CTG ACG CCG AAA GAT TTC TTC CGA 180

29 G Y S P Y N Q L T P K D F F R 43

181 CCA ATA TTC CAC AAA CCT TGG GAG AAC GTC TTC AGA TCA CTA GAG 225

44 P I F H K P W E N V F R S L E 58

226 AAT ATT ATG AGT CCT GTT CAA CAA ATG TCA GCT GCA ATG AAC CGG 270

59 N I M S P V Q Q M S A A M N R 73

271 CTC GCG CTC AAT GAT ATT GGG CAA ATA AGT AGC GAT AAC GAA AAA 315

74 L A L N D I G Q I S S D N E K 88

316 TTC CAA GTC AAC GTC GAC GTT CAA CAC TTT TCG CCT GAA GAA ATT 360

89 F Q V N V D V Q H F S P E E I 103

361 GAT GTT AAA GTC ATT GAT GGT CAT GTA GTT GTT AAA GGG AAG CAT 405

104 D V K V I D G H V V V K G K H 118

406 GAA GAA AAA CAG GAC CAG CAT GGT TAT GTA TCT AGG CAG TTT GTG 450

119 E E K Q D Q H G Y V S R Q F V 133

451 AGA CGC TAT GCT CTT CCT CAA GGA TGT TTA CCG GAC ACA GTG GAG 495

134 R R Y A L P Q G C L P D T V E 148

496 TCA AAC TTG TCT TCG GAT GGT GTT TTA ACC GTC ACG GCG CCT AAA 540

149 S N L S S D G V L T V T A P K 163

541 GTC CTT GCC ATG CCT TCT ACA GGT GAA CGT ATT ATA CCA ATA ACA 585

164 V L A M P S T G E R I I P I T 178

586 CAC ACA GGC CCT GTG AAA AAA CAG TTT TGT TCT CCA GAA TCT TCG 630

179 H T G P V K K Q F C S P E S S 193

631 ACA ATT GAA GAA TCT AAT TAG TGT TGT AAT TAT ATA ATT TTA TTT 675

194 T I E E S N *

676 TAA AGA CTG ATT TCA AAT AGT GCT TGT TTC TTT CGC CTA TTT TGT 720

721 ATT TGA AAT GTA AAA TAT AAG TAC CCG CCC 750

<210> 2　

<211> 516

<212> DNA

<213>合成dsRNA序列

<220>

<223> 合成dsRNA序列

<400> 2

AGGCCTGAGG AGTTCTTTGG TTATTCTCCG TACAATCAGC TGACGCCGAA AGATTTCTTC 60 CGACCAATAT TCCACAAACC TTGGGAGAAC GTCTTCAGAT CACTAGAGAA TATTATGAGT 120 CCTGTTCAAC AAATGTCAGC TGCAATGAAC CGGCTCGCGC TCAATGATAT TGGGCAAATA 180 AGTAGCGATA ACGAAAAATT CCAAGTCAAC GTCGACGTTC AACACTTTTC GCCTGAAGAA 240 ATTGATGTTA AAGTCATTGA TGGTCATGTA GTTGTTAAAG GGAAGCATGA AGAAAAACAG 300 GACCAGCATG GTTATGTATC TAGGCAGTTT GTGAGACGCT ATGCTCTTCC TCAAGGATGT 360 TTACCGGACA CAGTGGAGTC AAACTTGTCT TCGGATGGTG TTTTAACCGT CACGGCGCCT 420 AAAGTCCTTG CCATGCCTTC TACAGGTGAA CGTATTATAC CAATAACACA CACAGGCCCT 480

GTGAAAAAAC AGTTTTGTTC TCCAGAATCT TCGACA516

Claims (7)

1.舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因，其特征在于所述Hsp23基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因，其特征在于所述Hsp23基因编码氨基酸的序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因，其特征在于所述Hsp23编码氨基酸序列的引物对为：

正向引物LdHsp23F:5’-ATGTCGTTAATTCCTTACATGTA-3’；

反向引物LdHsp23R:5’- CTAATTAGATTCTTCAATTGTCG-3’。

4.权利要求1所述舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因dsRNA，其特征在于所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.权利要求4所述舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因dsRNA在防治舞毒蛾生长发育中的应用。

6.根据权利要求5所述的舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因dsRNA在防治舞毒蛾生长发育中的应用，其特征在于所述舞毒蛾为亚洲型舞毒蛾。

7.根据权利要求5所述的舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因dsRNA在防治舞毒蛾生长发育中的应用，其特征在于所述Hsp23基因dsRNA的注射剂量为1 μg。