CN109593767A - 舞毒蛾CYP306a1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用 - Google Patents

Abstract

舞毒蛾CYP306a1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用，涉及分子生物学领域，尤其涉及舞毒蛾CYP306a1基因、其编码蛋白及其应用。发明是要解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题。该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。其编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。本发明通过干扰舞毒蛾基因CYP306a1，基因沉默，能够延长幼虫蜕皮周期，减缓其发育，甚至引起死亡。本发明用于舞毒蛾害虫防治领域。

Description

舞毒蛾CYP306a1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的 应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及舞毒蛾CYP306a1基因、其编码蛋白及其应用。

背景技术

舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)是一种重要农林食叶害虫，具有分布范围较广、取食植物种类多、传播快、繁殖量大及周期性爆发等特点。据国内报道可舞毒蛾可危害约500多种植物，不仅给林业造成巨大的经济损失，而且使其生态效益受损。目前，尽管天敌性微生物、昆虫或是物理方法被应用于舞毒蛾害虫防治中，但是对于这种爆发性害虫防治效果不显著，化学农药凭借其高效、快速灭虫特性使其在舞毒蛾害虫的防治中依旧是占据着主要的防治手段。化学农药的长时间、高频率、使用量不断的增加，导致害虫出现抗药性、再增猖撅，以及农药残留等环境污染问题。化学农药使用后弊端的产生推动了新一代害虫防治研究的展开。分子生物学技术的快速发展，并使其被广泛应用于害虫的生理机制研究及防治，其中RNA干扰通过转基因植物特异表达靶标基因的dsRNA来阻碍昆虫的正常生理机制运行的特点成为植物保护者进行害虫防治的研究热点。

因此，为解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题，采用生物学手段进行病虫害防治的研究至关重要。

发明内容

本发明是要解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题，提供一种舞毒蛾CYP306a1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用。

本发明舞毒蛾CYP306a1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明舞毒蛾CYP306a1基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQID NO：3所示。

本发明舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

本发明以舞毒蛾CYP306a1基因片段为模板，并设计特异dsRNA引物对，通过MEGAscript RNAi试剂盒(Ambion)合成CYP306a1基因dsRNA。

本发明还提供一种用于构建能够表达基因dsRNA的重组质粒的构建方法。

构建干扰载体时，先将pHANNIBAL载体上的35S-PDK-OCS片段与pCAMBIA2300植物表达载体链接后形成能够表达基因dsRNA的pCAMBIA2300-PDK中间载体。

本发明还提供一种能够表达舞毒蛾CYP306a1基因片段序列的dsRNA的重组质粒的构建方法。

将CYP306a1目的片段分别正反向插入到pCAMBIA2300-PDK中间载体的PDK内含子的左右侧，形成以pCAMBIA2300载体为表达载体的干扰载体片段gene-PDK-gene，构建成能够表达CYP306a1dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒。CYP306a1目的片段和pCAMBIA2300-PDK中间载体均含有KpnI--KpnI和XbaI--BamHI两组内切酶酶切位点。重组子具有可用于筛选的氨苄青霉素和卡那抗性基因。

本发明还提供舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA在害虫防治中的应用。

其中应用方法之一在于，将舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内。所述注射剂量为12μg。

其中应用方法之二在于，将CYP306a1目的片段插入到能够表达基因dsRNA的pCAMBIA2300-PDK中间载体中，形成干扰载体片段gene-PDK-gene，构建能够表达CYP306a1dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒，将含有CYP306a1目的片段的pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组载体进行植物遗传转化，获得表达CYP306a1 dsRNA的转化植株。

进一步的，所述植物为84K杨。

本发明的有益效果：

CYP306a1基因属于细胞色素P450家族成员，能够编码蜕皮激素生物合成相关催化酶，该类单加氧酶的转运水平对前胸腺的活性具有决定性作用，CYP306a1基因作为关键的蜕皮激素生物合成调节因子，在昆虫的生长发育过程中具有重要作用。

本发明利用分子生物学手段干扰舞毒蛾重要生理相关基因CYP306a1，舞毒蛾CYP306a1基因沉默，能够延长幼虫蜕皮周期，减缓其发育，甚至引起死亡。将CYP306a1基因dsRNA注射入舞毒蛾3龄幼虫体内后，与对照处理相比，高效沉默了舞毒蛾的靶标基因CYP306a1基因，致使舞毒蛾幼虫3龄蜕皮期延长，同时鲜重几乎不增长，累计死亡率达到73.33％，严重影响了舞毒蛾幼虫的正常生长发育。

本发明进一步构建CYP306a1 dsRNA植物表达载体，并通过农杆菌介导法将其导入84K杨，获得表达CYP306a1 dsRNA的84K杨转化植株。舞毒蛾幼虫取食能够表达CYP306a1dsRNA的转基因植株叶片后，在化蛹过程中腹部蜕皮受阻，出现蛹腹部残留幼虫表皮的畸形蛹态，并且阻碍其正常羽化。转基因植物表达CYP306a1 dsRNA为防治农林重要害虫舞毒蛾提供新方法与新材料。

附图说明

图1为注射dsRNA后舞毒蛾3龄幼虫CYP306a1基因表达水平；

图2为CYP306a1基因沉默对舞毒蛾幼虫鲜重的影响；

图3为CYP306a1基因沉默对舞毒蛾幼虫龄期的影响；

图4为35S-PDK-OCS序列扩增结果；其中M：2000bp DNA Marker，1-2：35S-PDK-OCSfragments；

图5为载体pCAMBIA2300-PDK PCR序列扩增结果；其中M：2000bp DNA Marker，1-6：PCR fragments；

图6为分别带有KpnI和XbaI/BamHI酶切位点的CYP306a1目的片段的PCR序列扩增结果；其中M：2000bp DNA Marker，1：PCR序列扩增(P1176KpnIF/R，2：PCR序列扩(P1176XbaI-F/BamHI-R)；

图7为用于合成CYP306a1dsRNA的目的片段的正向插入PCR序列扩增结果；其中M：2000bp DNA Marker，1-5：PCR fragments(P1176-F/P1176-R)；

图8为用于合成CYP306a1dsRNA的目的片段的反向插入PCR序列扩增结果；其中M：2000bp DNA Marke，1-5：PCR fragments(P1177Check-F/PPHAN-SEQ-R)；

图9为CYP306a1 dsRNA重组质粒酶切检测结果；其中M：2000bp DNA Marker，1：enzyme digestion by KpnI，2：enzyme digestion by XbaI-BamHI；

图10为具有抗性的转基因植株；

图11为PCR检测具有抗性的转化植株；其中M：2000bp DNA Marker，1～3：转化植株；

图12为转基因84K杨对舞毒蛾化蛹发育的影响，其中左图为对照蛹，中间和右图为处理蛹。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式舞毒蛾CYP306a1基因的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：1所示。其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

具体实施方式二：本实施方式舞毒蛾CYP306a1基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

具体实施方式三：本实施方式舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA序列如序列表中SEQID NO：4所示。

本实施方式以舞毒蛾CYP306a1基因片段为模板，并设计特异dsRNA引物对，通过MEGAscript RNAi试剂盒(Ambion)合成CYP306a1基因dsRNA。

具体实施方式四：本实施方式舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA在害虫防治中的应用。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内。所述注射剂量为12μg。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四不同的是：舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将CYP306a1目的片段插入到能够表达基因dsRNA的pCAMBIA2300-PDK中间载体中，形成干扰载体片段gene-PDK-gene，构建能够表达CYP306a1dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒，将含有CYP306a1目的片段的pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组载体进行植物遗传转化，获得表达CYP306a1 dsRNA的转化植株。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述植物为84K杨。其它与具体实施方式六相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：舞毒蛾CYP306a1基因全长克隆

按照Invitrogen公司TRIzol RNA动植物组织总RNA提取试剂操作说明进行舞毒蛾幼虫总RNA提取，对所提取的RNA进行DNA消化，紫外分光光度计及电泳检测RNA，选取质量合格的RNA按照TaKaRa公司PrimeScript^TMRT-PCR Kit(型号DRR014A)反转录试剂盒操作步骤进行cDNA第一链的合成。根据舞毒蛾幼虫转录组文库的注释基因CYP306a1核酸序列，设计引物(正向引物：5’-CACATTCGTCAGCGGATATT-3’；反向引物：5’-GTGGCGGAGTAAGTGTAAC-3’)，以cDNA第一链为模板，采用RT-PCR方法，克隆CYP306a1CDS序列，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。按照E.Z.N.A.胶回收试剂盒操作方法回收CYP306a1基因片段，将回收得到的PCR产物与T-18(pMD18-T质粒连接克隆试剂盒)连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌液PCR检测将阳性克隆菌液送于上海生工进行测序，验证舞毒蛾CYP306a1基因编码框。

舞毒蛾CYP306a1基因核酸序列为1813bp，如序列表中SEQ ID NO：1所示。编码区域CDS长为1629bp，如序列表中SEQ ID NO：2所示。编码542个氨基酸，如序列表中SEQ ID NO：3所示。编码蛋白质的分子量为61.9807kDa，pI(理论等电点)为6.61，为一酸性蛋白。

实施例2：舞毒蛾CYP306a1基因dsRNA合成

根据实施例1中所克隆得到的舞毒蛾CYP306a1基因全长，设计合成CYP306a1基因dsRNA引物，在每条特异性引物的5′端均加上大小为20bp的T7启动子的序列，正向引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGGGCTTGCCGATCTTAGGTTATT-3’)和反向引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGGCAACCCTCCTCTTGAATTTGT-3’)；以cDNA第一链为模板，通过PCR法扩增得到长度为520bp的片段序列，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并采用E.Z.N.A.胶回收试剂盒操作方法回收该520bp的目的片段。以回收的520bp目的片段为模板，通过体外dsRNA合成试剂盒(MEGAscript T7 Kit试剂盒)获得CYP306a1基因的dsRNA。紫外分光光度计及2％琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的浓度与质量。-80℃冰箱保存备用。

实施例3：舞毒蛾CYP306a1基因沉默效果的检测

将实施例2合成的CYP306a1基因的dsRNA(12μg)，微注射入舞毒蛾3龄幼虫，以RNase-free水处理组为对照，分别于12、24、36、48h选取活泼的幼虫提取总RNA，经DNase I(Promega)消化DNA，采用PrimeScriptTM RT试剂盒(TaKaRa)合成cDNA第一链，将合成cDNA稀释成100μL，用作实时荧光定量RT-PCR模板，设计荧光定量检测引物qCYP306a1(正向引物：5’-GGGTCTGCTCGATATACTACT-3’；反向引物：5’-CGAACCATCAACCTCATCTT-3’)用于检测注射dsRNA后CYP306a1基因的表达量。注射dsRNA后舞毒蛾3龄幼虫CYP306a1基因的表达水平如图1所示(图1中□表示CK，■表示注射CYP306a1 dsRNA)，结果表明：以RNase-free水处理组为对照，注射dsRNA后，CYP306a1基因mRNA表达量在12、24、36、48时被显著沉默，显示RNAi干扰效率分别高达91.10％、81.34％、93.85％和60.47％，其中在36h CYP306a1表达量达到最低，沉默效果最好。

实时荧光定量PCR使用试剂盒SYBR Green Real-time PCR Master mix Plus(Toyobo)。内参基因为Actin、EF1α、TUB，引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应体系为：10μL 2×SYBR premix ExTaq酶、正向和反向引物(10μmol/L)各1μL、2μL cDNA模板，加去离子水补足20μL；反应条件为：94℃30s，然后进行44个循环：94℃12s，59℃30s，72℃40s，最后81℃1s读板。每处理重复3次，用2^-△△Ct方法进行基因的表达量分析。

表1 RNAi相关引物序列

实施例4：舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA抑制舞毒蛾的生长发育、死亡率、龄期

将实施例2中体外合成的dsRNA(12μg)微量注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内，每组处理30条幼虫，重复3次，以RNase-free水处理过的幼虫为对照，每天更换新鲜叶片，同时记录其对舞毒蛾幼虫的鲜重、死亡率、龄期的影响。

图2为CYP306a1基因沉默对舞毒蛾幼虫鲜重的影响(图2中▲表示CK，●表示CYP306a1 dsRNA)，由图2可知，注射CYP306a1基因dsRNA导致舞毒蛾幼虫鲜重，增长缓慢，甚至不增长，5d前各处理对幼虫鲜重影响较小，且差异不大，但是在6-9d，CYP306a1 dsRNA处理组导致幼虫鲜重几乎不增长，与第5d鲜重相比，第9d幼虫鲜重增长量仅有2.61％；而对照组幼虫鲜重增长较快，与第5d鲜重相比，第9d幼虫鲜重增长了约78.36％，证明其干扰了舞毒蛾幼虫的正常生理发育。

图3为CYP306a1基因沉默对舞毒蛾幼虫龄期的影响，由图3可知，注射CYP306a1基因dsRNA导致舞毒蛾3龄幼虫龄期明显延长2.83d，RNase-free水处理过的幼虫龄期为5.81d，而CYP306a1 dsRNA处理后幼虫龄期为8.64d。这说明CYP306a1基因沉默干扰了舞毒蛾幼虫的正常蜕皮发育，该结果与CYP306a1 dsRNA处理后幼虫的鲜重几乎不增长有密切关系(鲜重影响见图2)。

由表2可见，经微量注射CYP306a1 dsRNA处理后，舞毒蛾幼虫出现死亡现象，处理9d后累计死亡率为73.33％，对照组仅为16.67％，差异显著。

表2 CYP306a1基因沉默对舞毒蛾幼虫累计死亡率的影响

注射dsRNA后时间/d

1

2

3

4

5

6

7

8

9

CK

0％

6.67％

6.67％

10％

16.67％

43.33％

56.67％

70％

73.33％

CYP306a1 dsRNA

0％

0％

0％

0％

0％

0％

0％

0％

16.67％

实施例5：表达CYP306a1基因dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-CYP306a1-PDK-CYP306a1的重组构建

构建干扰载体时，先将pHANNIBAL载体上的35S-PDK-OCS片段与pCAMBIA2300植物表达载体链接后形成pCAMBIA2300-PDK中间载体，其次将目的基因分别正反向插入到PDK内含子的左右侧，形成以pCAMBIA2300载体为表达载体的干扰载体片段gene-PDK-gene，构建成pCAMBIA2300-gene-PDK-gene质粒。

具体实施方案如下，

(一)35S-PDK-OCS片段的PCR扩增

首先进行35S-PDK-OCS(2919bp)目的片段的PCR扩增，用于扩增的正向引物(P1129F 5’-CAATTTCACACAGGAAACAG-3’)和反向引物(P1129R 5’-CAGATTTAGGTGACACTATAG-3’)序列分别设计于pHANNIBAL载体SacI上游60bp和pHANNIBAL载体PstI下游60bp。PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测(如图4)，用胶回收试剂盒(OMEGA)回收该目的片段。

(2)PCR反应程序：98℃预变性，5min；循环为98℃变性，10s；55℃退火，30s；68℃延伸，3min；共30个循环；68℃延伸5min。

(二)融合表达载体pCAMBIA2300-PDK的构建

将35S-PDK-OCS片段分别用SacI和PstI内切酶进行酶切后，与同样用SacI--PstI酶切的载体pCAMBIA2300进行体外连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物(P1129 Check-F正向引物：5’-CTTCTAAATGGATTGAC-3’；P1129 Check-R反向引物：5’-CAATCAGTAAATTGAACGGAG-3’)进行菌液PCR鉴定，序列大小约350bp，PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测(如图5)。将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液进行测序和质粒抽提，备用。

连接体系见下：

(三)pCAMBIA2300-gene-PDK-gene载体的构建

(1)用于合成CYP306a1 dsRNA的目的片段的PCR扩增

首先进行用于合成CYP306a1 dsRNA的目的片段的PCR扩增，用于扩增正向插入片段(PDK左侧)的引物两端需添加酶切位点KpnI，引物序列为正向引物P1176KpnI-F：5’-GGGGTACCGCTTGCCGATCTTAGGTTATTTAC-3’，反向引物P1176KpnI-R：5’-GGGGTACCCAACCCTCCTCTTGAATTTG-3’；用于扩增反向插入片段(PDK右侧)的引物两端需添加酶切位点XbaI和BamHI，引物序列为正向引物P1176XbaI-F：5’-GCTCTAGAGCTTGCCGATCTTAGGTTATTTAC-3’，反向引物P1176BamHI-R：5’-CGGGATCCCAACCCTCCTCTTGAATTTG-3’。520bp的用于合成CYP306a1dsRNA的目的片段PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测(如图6)。

(2)用于合成CYP306a1dsRNA的目的片段的正向插入，形成pCAMBIA2300-gene-PDK重组载体

将KpnI酶切的用于合成CYP306a1dsRNA的目的片段与同样用KpnI酶切的中间载体pCAMBIA2300-PDK进行体外连接及转化。将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物(正向引物P1176-F：5’-GCTTGCCGATCTTAGGTTATT-3’；反向引物P1176-R：5’-ACAAATTCAAGAGGAGGGTTG-3’)进行菌液PCR鉴定，2％琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示，片段大小为520bp。将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液送去上海生工进行PCR扩增测序，正向引物PHAN-Check-F35S：CACTATCCTTCGCAAGAC，反向引物PHAN-Check-R：CATACTAATTAACATCAC，和质粒抽提，备用。

(3)用于合成CYP306a1dsRNA的目的片段的反向插入，形成pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组载体

将用XbaI--BamHI酶切的用于合成CYP306a1dsRNA的目的片段与同样用XbaI--BamHI酶切的插入正向序列的pCAMBIA2300-gene-PDK载体进行体外连接，并转化。将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物(正向引物为P1176Check-F：5’-CAGCGCTCCCTCAGCACAAATT-3’，反向引物PHAN-SEQ-R：5’-GTAAGGATCTGAGCTAC-3’)进行菌液PCR鉴定，检测序列大小约350bp，2％琼脂糖凝胶电泳结果如图8所示。将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液送去上海生工进行PCR扩增测序，正向引物P1129 Check-F：5’-CTTCTAAATGGATTGAC-3’，反向引物PHAN-SEQ-R：5’-GTAAGGATCTGAGCTAC-3’，和质粒抽提，备用。

(4)pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒进行酶切检测

将从农杆菌中抽提出的pCAMBIA2300-gene-PDK-gene融合表达载体分别用KpnI和XbaI--BamHI两组内切酶进行酶切，并将产物进行凝胶电泳检测(如图9)。

实施例6：pCAMBIA2300-gene-PDK-gene进行84K杨的遗传转化

通过含有重组质粒的EHA105菌液侵染84K杨叶片，进过共培养、选择培养、继代培养和生根培养获得具有抗性的转基因植株(如图10)。选取具有抗性植株的叶片，提取基因组DNA。进一步设计特异性引物(正向引物PHAN-Check-F35S：CACTATCCTTCGCAAGAC；反向引物PHAN-Check-R：CATACTAATTAACATCAC)，通过PCR扩增特异性目的基因来鉴定阳性植株。获得大小为635bP的PCR产物，于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测(如图11)。

实施例7：转基因84K杨对舞毒蛾防治的效果

转基因84K杨对舞毒蛾化蛹发育的影响

为了解舞毒蛾幼虫持续取食转基因杨树叶片是否可以加强其干扰效果，通过连续喂食舞毒蛾幼虫转基因84K杨进行了测定。选取长势一致、健康的6龄12h舞毒蛾幼虫放于直径为9cm，高为15cm的养虫瓶内，喂食F2代转基因杨树叶片，一个养虫瓶放入5条幼虫，以非转基因杨树叶片为对照，重复30次，观察幼虫化蛹发育情况。结果如图12所示：6龄幼虫连续取食转基因植株叶片后，化蛹过程中头胸部可以正常蜕皮，腹部蜕皮过程受阻，出现畸型态的蛹，由于无法正常完全蜕皮，畸型蛹不能羽化。

序 列 表

<110> 菏泽学院

<120>舞毒蛾CYP306a1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用

<160>30

<210> 1

<211> 1813

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾CYP306a1基因全长

<400> 1

aggtggttat ctattaattt caaacgattt gcgataatag attaggtaac ttatcgcaaa 60

atattgaact aacaggatag tagttatcat tttcattacc aaatattttt ctacaatgtt 120

ccaaatggat cttttgtttt tatttttctg cacattcgtc agcggatatt ggatttttaa 180

aaaactaaag gaatggcaga atttaccgcc cggtccttgg ggcttgccga tcttaggtta 240

tttacctttc cttgatcgcc accaacctca ccttacactg acaaagttgt cgaaagaatt 300

tggacctata tatggcattg gaatgggtag tatttatgct gtggtgttgt ctgatcataa 360

attgataaga gatgcttttt ctaaagacag tttttctggc agagctccat tgtacttgac 420

tcatggaatt atgaaaggaa acggtataat ttgtgctgag ggagcgctgt ggaaagatca 480

aaggaaatta ataacatctt ggttgaaaag ttttggaatg agtaagcaca gtgtgtctcg 540

tgaaaagttg gagaaaagaa tagcatcagg tgtatacgaa cttttggaaa atatcgagaa 600

ggctagcggc tcaccgatgg atctccctca catgctcaca aattcgctag gaaacgttgt 660

aaacgaaatt atatttggat tcaaatttcc ttctgatgac aaaacgtgga attggtttag 720

acaaattcaa gaggagggtt gccatgaaat gggtgtcgcc ggtgtcgtta actttttacc 780

tttcgttaga ttcttttcat catcgatccg taaaactata gaagtattaa cacgcggaca 840

agcacaaacg cacagattgt atgcaagtat aatagaaatg agaagaaaaa tgattggaat 900

ggaaatgcct gaaggtgcag catatcactt gcatgacaac ctttttactg aacacccaga 960

gggtcatatt aagtgtatta catacagtaa acattctcca aataacgaag aacattattt 1020

tgatccgaaa actttaatac caactgacgg cgaatgcatt cttgataact tcctcactga 1080

acaaaaaaag cgatttgaaa atggcgatgg gtctgctcga tatactactg atgaacaaat 1140

gctctattta ttagctgata tgtttggagc aggtcttgat actacttctg tgacattatc 1200

ctggttcctt ttatatatgg cgctttatcc acaagaacaa gagcttgtgc gtaaggaaat 1260

cctttcaata tatccgaatg aagatgaggt tgatggttcg aagctgcctt atttaatggc 1320

agctatttgt gagacacaaa gaattcgatc gattgtgcca gtgggtattc cccatggatg 1380

tctagaggat acttatttgg gtgactatag aatccccaaa ggtagtatgg tgatacctct 1440

acaatgggct cttcacatgg atcccaacgt ttgggaagag ccaactgaat tcaaaccaag 1500

cagattcttg gcaccagata gctctttgct gaaaccccag gaattcatac cgtttcaaac 1560

aggtaaacgc atgtgccctg gtgatgaatt atctcgtatg atatcatgcg gattagtcgc 1620

gcgtttattc cgtcgtagac gcgtgcgact ggcgtcgaat ccaccatcac ctaaagaaat 1680

gcaaggaaca gttggagtta cacttactcc gccacgtgta gacttttatt gtgatcctct 1740

gtgaaaataa acatacatct attcaataat aaatgtgata tattatggaa ttgaatatat 1800

atcagatttg tcg 1813

<210> 2

<211> 1629

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾 CYP306a1基因CDS序列

<400> 2

atgttccaaa tggatctttt gtttttattt ttctgcacat tcgtcagcgg atattggatt 60

tttaaaaaac taaaggaatg gcagaattta ccgcccggtc cttggggctt gccgatctta 120

ggttatttac ctttccttga tcgccaccaa cctcacctta cactgacaaa gttgtcgaaa 180

gaatttggac ctatatatgg cattggaatg ggtagtattt atgctgtggt gttgtctgat 240

cataaattga taagagatgc tttttctaaa gacagttttt ctggcagagc tccattgtac 300

ttgactcatg gaattatgaa aggaaacggt ataatttgtg ctgagggagc gctgtggaaa 360

gatcaaagga aattaataac atcttggttg aaaagttttg gaatgagtaa gcacagtgtg 420

tctcgtgaaa agttggagaa aagaatagca tcaggtgtat acgaactttt ggaaaatatc 480

gagaaggcta gcggctcacc gatggatctc cctcacatgc tcacaaattc gctaggaaac 540

gttgtaaacg aaattatatt tggattcaaa tttccttctg atgacaaaac gtggaattgg 600

tttagacaaa ttcaagagga gggttgccat gaaatgggtg tcgccggtgt cgttaacttt 660

ttacctttcg ttagattctt ttcatcatcg atccgtaaaa ctatagaagt attaacacgc 720

ggacaagcac aaacgcacag attgtatgca agtataatag aaatgagaag aaaaatgatt 780

ggaatggaaa tgcctgaagg tgcagcatat cacttgcatg acaacctttt tactgaacac 840

ccagagggtc atattaagtg tattacatac agtaaacatt ctccaaataa cgaagaacat 900

tattttgatc cgaaaacttt aataccaact gacggcgaat gcattcttga taacttcctc 960

actgaacaaa aaaagcgatt tgaaaatggc gatgggtctg ctcgatatac tactgatgaa 1020

caaatgctct atttattagc tgatatgttt ggagcaggtc ttgatactac ttctgtgaca 1080

ttatcctggt tccttttata tatggcgctt tatccacaag aacaagagct tgtgcgtaag 1140

gaaatccttt caatatatcc gaatgaagat gaggttgatg gttcgaagct gccttattta 1200

atggcagcta tttgtgagac acaaagaatt cgatcgattg tgccagtggg tattccccat 1260

ggatgtctag aggatactta tttgggtgac tatagaatcc ccaaaggtag tatggtgata 1320

cctctacaat gggctcttca catggatccc aacgtttggg aagagccaac tgaattcaaa 1380

ccaagcagat tcttggcacc agatagctct ttgctgaaac cccaggaatt cataccgttt 1440

caaacaggta aacgcatgtg ccctggtgat gaattatctc gtatgatatc atgcggatta 1500

gtcgcgcgtt tattccgtcg tagacgcgtg cgactggcgt cgaatccacc atcacctaaa 1560

gaaatgcaag gaacagttgg agttacactt actccgccac gtgtagactt ttattgtgat 1620

cctctgtga 1629

<210> 3

<211> 542

<212> PRT

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223> CYP306a1基因编码蛋白

<400> 3

Met Phe Gln Met Asp Leu Leu Phe Leu Phe Phe Cys Tyr Phe Val

5 10 15

Ser Gly Tyr Trp Ile Phe Lys Lys Leu Lys Glu Trp Gln Asn Leu

20 25 30

Pro Pro Gly Pro Trp Gly Leu Pro Ile Leu Gly Tyr Leu Pro Phe

35 40 45

Leu Asp Arg His Gln Pro His Leu Thr Leu Thr Lys Leu Ser Lys

50 55 60

Glu Phe Gly Pro Ile Tyr Gly Ile Gly Met Gly Ser Ile Tyr Ala

65 70 75

Val Val Leu Ser Asp His Lys Leu Ile Arg Asp Ala Phe Ser Lys

80 85 90

Asp Ser Phe Ser Gly Arg Ala Pro Leu Tyr Leu Thr His Gly Ile

95 100 105

Met Lys Gly Asn Gly Ile Ile Cys Ala Glu Gly Ala Leu Trp Lys

110 115 120

Asp Gln Arg Lys Leu Ile Thr Ser Trp Leu Lys Ser Phe Gly Met

125 130 135

Ser Lys His Ser Val Ser Arg Glu Lys Leu Glu Lys Arg Ile Ala

140 145 150

Ser Gly Val Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Ile Glu Lys Ala Ser Gly

155 160 165

Ser Pro Met Asp Leu Pro His Met Leu Thr Asn Ser Leu Gly Asn

170 175 180

Val Val Asn Glu Ile Ile Phe Gly Phe Lys Phe Pro Ser Asp Asp

185 190 195

Lys Thr Trp Asn Trp Phe Arg Gln Ile Gln Glu Glu Gly Cys His

200 205 210

Glu Met Gly Val Ala Gly Val Val Asn Phe Leu Pro Phe Val Arg

215 220 225

Phe Phe Ser Ser Ser Ile Arg Lys Thr Ile Glu Val Leu Thr Arg

230 235 240

Gly Gln Ala Gln Thr His Arg Leu Tyr Ala Ser Ile Ile Glu Met

245 250 255

Arg Arg Lys Met Ile Gly Met Glu Met Pro Glu Gly Ala Ala Tyr

260 265 270

His Leu His Asp Asn Leu Phe Thr Glu His Pro Glu Gly His Ile

275 280 285

Lys Cys Ile Thr Tyr Ser Lys His Ser Pro Asn Asn Glu Glu His

290 295 300

Tyr Phe Asp Pro Lys Thr Leu Ile Pro Thr Asp Gly Glu Cys Ile

305 310 315

Leu Asp Asn Phe Leu Thr Glu Gln Lys Lys Arg Phe Glu Asn Gly

320 325 330

Asp Gly Ser Ala Arg Tyr Thr Thr Asp Glu Gln Met Leu Tyr Leu

335 340 345

Leu Ala Asp Met Phe Gly Ala Gly Leu Asp Thr Thr Ser Val Thr

350 355 360

Leu Ser Trp Phe Leu Leu Tyr Met Ala Leu Tyr Pro Gln Glu Gln

365 370 375

Glu Leu Val Arg Lys Glu Ile Leu Ser Ile Tyr Pro Asn Glu Asp

380 385 390

Glu Val Asp Gly Ser Lys Leu Pro Tyr Leu Met Ala Ala Ile Cys

395 400 405

Glu Thr Gln Arg Ile Arg Ser Ile Val Pro Val Gly Ile Pro His

410 415 420

Gly Cys Leu Glu Asp Thr Tyr Leu Gly Asp Tyr Arg Ile Pro Lys

425 430 435

Gly Ser Met Val Ile Pro Leu Gln Trp Ala Leu His Met Asp Pro

440 445 450

Asn Val Trp Glu Glu Pro Thr Glu Phe Lys Pro Ser Arg Phe Leu

455 460 465

Ala Pro Asp Ser Ser Leu Leu Lys Pro Gln Glu Phe Ile Pro Phe

470 475 480

Gln Thr Gly Lys Arg Met Cys Pro Gly Asp Glu Leu Ser Arg Met

485 490 495

Ile Ser Cys Gly Leu Val Ala Arg Lys Phe Arg Arg Arg Arg Val

500 505 510

Arg Leu Ala Ser Asn Pro Pro Ser Pro Lys Glu Met Gln Gly Thr

515 520 525

Val Gly Val Thr Leu Thr Pro Pro Arg Val Asp Phe Tyr Cys Asp

530 535 540

Pro Leu

542

<210>4

<211> 520

<212> DNA

<213>舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）

<220>

<223>舞毒蛾 CYP306a1基因dsRNA序列

<400> 4

gcttgccgat cttaggttat ttacctttcc ttgatcgcca ccaacctcac cttacactga 60

caaagttgtc gaaagaattt ggacctatat atggcattgg aatgggtagt atttatgctg 120

tggtgttgtc tgatcataaa ttgataagag atgctttttc taaagacagt ttttctggca 180

gagctccatt gtacttgact catggaatta tgaaaggaaa cggtataatt tgtgctgagg 240

gagcgctgtg gaaagatcaa aggaaattaa taacatcttg gttgaaaagt tttggaatga 300

gtaagcacag tgtgtctcgt gaaaagttgg agaaaagaat agcatcaggt gtatacgaac 360

ttttggaaaa tatcgagaag gctagcggct caccgatgga tctccctcac atgctcacaa 420

attcgctagg aaacgttgta aacgaaatta tatttggatt caaatttcct tctgatgaca 480

aaacgtggaa ttggtttaga caaattcaag aggagggttg 520

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> CYP306a1基因克隆正向引物

<400> 5

cacattcgtcagcggatatt 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> CYP306a1基因克隆反向引物

<400> 6

gtggcggagtaagtgtaac 19

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> CYP306a1基因dsRNA正向引物

<400> 7

taatacgactcactataggggcttgccgatcttaggttatt 41

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> CYP306a1基因dsRNA反向引物

<400> 8

taatacgactcactatagggcaaccctcctcttgaatttgt 41

<210>9

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Actin正向引物

<400> 9

atgttagtatgatcgagcgtatcg 24

<210>10

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Actin反向引物

<400> 10

gcatgatctgaggagcatctt 21

<210>11

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF1α正向引物

<400> 11

tttgccttccttgcgctcaaca 22

<210>12

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF1α反向引物

<400> 12

tgtaaagcagctgatcgtgggt 22

<210>13

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> TUB正向引物

<400> 13

aatgcaagaaagccttgcgcct 22

<210>14

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> TUB反向引物

<400> 14

atgaaggaggtcgacgagcaaa 22

<210>15

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> q CYP306a1正向引物

<400> 15

gggtctgctcgatatactact 21

<210>16

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> q CYP306a1反向引物

<400> 16

cgaaccatcaacctcatctt 20

<210>17

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 引物P1129F

<400> 17

caatttcacacaggaaacag 20

<210>18

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 引物P1129R

<400> 18

cagatttaggtgacactatag 21

<210>19

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> P1129 Check-F正向引物

<400> 19

cttctaaatggattgac 17

<210>20

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> P1129 Check-R反向引物

<400> 20

caatcagtaaattgaacggag 21

<210>21

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物P1176KpnI-F

<400> 21

ggggtaccgcttgccgatcttaggttatttac 32

<210>22

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 反向引物P1176KpnI-R

<400> 22

ggggtacccaaccctcctcttgaatttg 28

<210>23

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物P1176XbaI-F

<400> 23

gctctagagcttgccgatcttaggttatttac 32

<210>24

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 反向引物P1176BamHI-R

<400> 24

cgggatcccaaccctcctcttgaatttg 28

<210>25

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物P1176-F

<400> 25

gcttgccgatcttaggttatt 21

<210>26

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物P1176-R

<400> 26

acaaattcaagaggagggttg 21

<210>27

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物PHAN-Check-F35S

<400> 27

cactatccttcgcaagac 18

<210>28

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物 PHAN-Check-R

<400> 28

catactaattaacatcac 18

<210>29

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物为P1176Check-F

<400>29

cagcgctccctcagcacaaatt 22

<210>30

<211>17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物PHAN-SEQ-R

<400> 30

gtaaggatctgagctac 17

Claims (8)

1.舞毒蛾CYP306a1基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述舞毒蛾CYP306a1基因的编码蛋白，其特征在于舞毒蛾CYP306a1基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

3.权利要求1所述舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA序列，其特征在于dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

4.舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA在害虫防治中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述注射剂量为12μg。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于舞毒蛾CYP306a1基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将CYP306a1目的片段插入到能够表达基因dsRNA的pCAMBIA2300-PDK中间载体中，形成干扰载体片段gene-PDK-gene，构建能够表达CYP306a1dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒，将含有CYP306a1目的片段的pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组载体进行植物遗传转化，获得表达CYP306a1dsRNA的转化植株。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物为84K杨。