CN108795933A - 一种改变家蚕食性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改变家蚕食性的方法及其应用。本发明通过定点靶向家蚕hestia基因，对其基因结构进行破坏、影响其正常取食行为，促使家蚕的食性从寡食性转变成杂食性。这一发明解决了蚕业生产单一依靠桑叶饲养的养殖模式，为规模化家蚕饲养提供了一种新思路。

Description

一种改变家蚕食性的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域及基因组编辑领域，涉及利用CRISPR/Cas9系统敲除家蚕hestia基因从而改变家蚕食性方法与应用。

背景技术

昆虫是动物界中种类最多并且数量最大的是生物种类。昆虫种类多样性与其食性的分化有着密切的联系。根据昆虫食物的范围，把它们分为多食性、寡食性和单食性。按照昆虫食物的性质，把它们分为植食性、肉食性、腐食性、杂食性等几个类别。植食性和肉食性昆虫一般分别取食活的植物和动物，腐食性昆虫则取食动植物的尸体或者分辨，杂食性昆虫既吃植物也吃动物。在长期的进化过程中，植食性昆虫与其寄主植物之间形成了特异的关系。

家蚕是一种具有很高经济价值的绢丝昆虫，同时也是鳞翅目的模式昆虫，在我国经济生产和历史文化上具有重要地位。家蚕是寡食性昆虫，除取食桑叶以外还能取食桑科的柘以及榆科的榆等植物叶片。蚕业生产是我国国民经济的重要组成部分。养蚕位于蚕业生产的最上游，同时也是整个蚕业生产链中劳动力最为密集的一个环节。导致上述现象的原因主要有两个：第一，在实际的养蚕生产中，蚕农们主要以桑叶作为蚕的主要食物，而桑叶采集消耗大量的人力以及物力；第二，家蚕饲养需要每天进行多次喂养，同样消耗较大的人力和物力。此外，本领域技术人员知道，家蚕食性决定基因对成功建立杂食性家蚕品系至关重要。然而，目前在家蚕中尚未有相关基因的报道。

因此，本领域急需找到家蚕杂食性决定基因，以改变家蚕食性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改变家蚕食性的方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种使家蚕的取食方式从寡食性转变成杂食性的方法，所述方法包括：下调家蚕的hestia基因的表达。

在一个优选例中，通过敲除hestia基因，从而下调家蚕的hestia基因的表达。

在另一优选例中，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除hestia基因。

在另一优选例中，以hestia基因中第3个外显子作为基因编辑的靶区域。

在另一优选例中，敲除hestia基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转入蚕卵中；催青；孵化；获得取食方式从寡食性转变成杂食性的家蚕；其中，所述的sgRNA的靶序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，通过将SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物序列经退火、延伸、PCR产物回收纯化，再转录成所述的sgRNA。

在另一优选例中，通过采用同源重组的方法，敲除家蚕的hestia基因，从而下调家蚕的hestia基因的表达。

在另一优选例中，通过采用特异性干扰hestia基因表达的干扰分子来沉默hestia基因，从而下调家蚕的hestia基因的表达；较佳地，所述的干扰分子是以hestia基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在另一优选例中，所述的家蚕的hestia基因选自：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的基因；

(b)核苷酸序列具有SEQ ID NO:9中第1～732位，1096～1176位，2280～2430位，3666～3841位的基因；

(c)核苷酸序列与(a)或(b)限定的序列有85％以上(较佳地90％以上；更佳地95％以上，进一步更佳地98％以上)相同性且具有(a)或(b)限定的序列功能的基因；

(3)核苷酸序列在严格条件下能够与(a)或(b)的多核苷酸序列杂交且具有(a)或(b)限定的序列功能的基因；或

(4)核苷酸序列与(a)或(b)的多核苷酸序列完全互补的基因。

在本发明的另一方面，提供sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸的用途，用于与Cas9mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转入蚕卵中，使家蚕的取食方式从寡食性转变成杂食性；其中，所述的sgRNA靶向于hestia基因中第3个外显子。

在一个优选例中，所述的sgRNA的靶序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供本发明所述的方法的用途，用于制备hestia基因被敲除、从而取食方式从寡食性转变成杂食性的家蚕。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其用于制备取食方式从寡食性转变成杂食性的家蚕，所述的试剂盒中包含：

sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸；所述的sgRNA的靶序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；以及

Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、家蚕hestia基因的结构示意图及其靶点(TS)序列。

图2、CRISPR/Cas9诱导的基因突变。

图3、hestia基因突变体幼虫取食苹果。

具体实施方式

本发明揭示了一种改变家蚕食性的方法，通过利用定点靶向家蚕hestia基因，对其基因功能进行破坏，影响其正常取食行为，促使家蚕的食性从寡食性转变成杂食性。这一发明解决了蚕业生产单一依靠桑叶饲养的养殖模式，为规模化家蚕饲养提供了一种新思路。

如本文所用，所述的“目标基因”是指动物基因组中需要进行敲除操作的感兴趣的基因，本发明中为hestia基因。

如本文所用，所述的目标基因上的“靶序列”是指“目标基因”中的一个片段，基于该目标基因上的“靶序列”设计的sgRNA可识别该“靶序列”，由此在该位置发生Cas9编码的蛋白的切割。所述的目标基因上的“靶位点”的长度为18-26个核苷酸。

如本文所用，所述的“sgRNA”即“单独导向RNA(Single-guide RNA，sgRNA)”或“单导向RNA”，其是基于“目标基因上的靶位点”设计，其包含的序列足以与内切核酸酶Cas9协同作用，引导发生Cas9介导的靶位点上DNA双链断裂。

本发明中，所述的家蚕的hestia基因选自：(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的基因；(b)核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的基因。本领域技术人员均了解，在不同的家蚕中，可能存在不同的hestia基因的变异形式，这些形式均应被包含在本发明中。因此，本发明中，所述的hestia基因还广义地包括了hestia基因的变异体、同源基因等，例如包括但不限于：(c)核苷酸序列与(a)或(b)限定的序列有85％以上，较佳地90％以上，更佳地95％以上，进一步更佳地98％以上相同性且具有(a)或(b)限定的序列功能的基因；(d)核苷酸序列在严格条件下能够与(a)或(b)的多核苷酸序列杂交且具有(a)或(b)限定的序列功能的基因；或(e)核苷酸序列与(a)或(b)的多核苷酸序列完全互补的基因。

基于本发明人的新发现，本发明提供了一种使家蚕的取食方式从寡食性转变成杂食性的方法，所述方法包括：下调家蚕的hestia基因的表达。

作为本发明的优选方式，通过敲除hestia基因，从而下调家蚕的hestia基因的表达。较佳地，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除hestia基因。更佳地，以hestia基因中第3个外显子作为基因编辑的靶区域。

合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到合适的靶位点至关重要。尽管sgRNA的制备是本领域已知的技术，目前也已有一些软件可用于sgRNA的辅助设计，但是选择合适的靶位点仍然是至关重要的，且是仅凭借软件分析难以做到的。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

作为本发明的优选方式，敲除hestia基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转入蚕卵中；催青；孵化；获得取食方式从寡食性转变成杂食性的家蚕；其中，所述的sgRNA的靶序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。

作为一种选择，所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9 mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9 mRNA。作为更优选的选择，可以体外转录获得携带有启动子的Cas9 mRNA以及携带有启动子的sgRNA，将它们注射入细胞内。

本发明所述的方法可用于制备基因敲除的家蚕，其中目标基因hestia的基因功能被敲除。

作为本发明的其它可选择方式，通过采用同源重组的方法，从而敲除hestia基因。在确定了基因敲除靶点后，针对该靶点两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到宿主细胞后外源的重组载体与宿主细胞中相同的片段会发生同源重组，从而在靶点引入外源基因片段或删除部分基因，实现基因敲除。

本发明还涉及hestia基因的下调剂(如基因敲除试剂，又如反义的hestia基因、miRNA、shRNA)及其用途。

任何可下调hestia基因所编码的蛋白的活性、下调hestia基因所编码的蛋白的稳定性、抑制hestia基因所编码的蛋白的表达、减少hestia基因所编码的蛋白的有效作用时间、或降低hestia基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于改变家蚕食性的有效物质。

小分子干扰的方式包括但不限于：miRNA调控的基因沉默，正义RNA引起的共抑制(Cosuppression)，反义RNA抑制，病毒介导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing，VIGS)，dsRNA，小干扰RNA，发卡式RNA(hairpinRNA，hpRNA)介导的基因沉默等，这些也可被应用于本发明中。

本发明还提供了用于制备hestia基因被敲除、从而取食方式从寡食性转变成杂食性的家蚕的试剂盒，所述的试剂盒中包含针对于hestia基因的、应用于进行C-CRISPR方法操作的sgRNA及Cas 9 mRNA或能够在体内或体外形成该sgRNA及Cas 9 mRNA的试剂。

其它常用于进行转基因操作的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用，例如显微注射用的试剂等。此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、hestia基因的克隆

靶标基因hestia的基因组序列如下(SEQ ID NO:9，其中，下划线序列为外显子序列，非下划线序列为内含子序列)：

ATGTCACCACCGCTAGTCCATATCAATACATTTGTTCAACCCCAAGCAAAGTACACTGTAGACAAAGTA TCAAAGTTTTTTATAATATGTAGTTTTCTTCTAGGCGTTAATAGGTTGCCTATTATATCATCGAAACATGTGTATAC AATTCCTTCTATAATTTATACTTTCGTACTAATGTGTGTACTAAATTTTTTCGGGTTTGATTCTGTCTCATTATCTA TCATGAGTTTGAACCTTGTATTACATATCTTATGTTCCTTCCTTGGTATGTTTTTTTGGAAGAGAATGCGCCTGTAT TATTCAGAGCTCTGTAAGTTTGATATTTGCATCGGATGCAGACCAATAACTGCACAAGGTTCCAGTAAACTTGTAAT TCAGACTTGCATTATAAATGTTTTGATAGCTTTGGTGTTTATTGTGCCGAATTCACTTCAGATTCTAATCAAACCAG TTATATATTTGCTTCCCATGCACGCCTTTGTGTCGTTCGAAGTGCATTATTATGGCCACCTTCTCAATTTACTTATC CCGCGTTTACATTTAATAAACTATTACATGGAATCCTCATTAACTACCACAAGCGATAAAAGGGAGTCGAGTGTACT GAAACATGTTATTTTATTTAAATATTATAATAAGGAATCGAACTGTCAAATGAAAAAATTTATGGATCTTTATTATA TTATCGTAGAATCTTACAGATATCTTATTGACGCTATTAAATGGCAGGTAAGAAAGGATTTTATTAAATTCCAAATAATATTCTGTTGTTAACAATATTTAAATCAAAATGAGAAAAATATATGTTTACTGGTGGTAGGACGTCTTGTGAGTCCGAATCACCCTGCCTATTTCTGCCGGAAGCAATAATGCGTTTCAGTTTGAAGGATGGGGCAGCCGTTGTACTCTTAAAAAAGTGAGACCTTAGAACTCATGTATTAAGGTGGGTGGCGGCGCTTACGTTTTAGATGTCTATGGGCTCCGGTAACCACTTAACACCAGGTGGGCCGTGAGCTCGCCATCTATGTAAGCAATAAAAAATAAGGTACTTTTAAAGCTTTTATGTGATGAAATTGTGAATTTTTATTTCAGTTATTGTTCATCATCATAGTTTCGTTTATATCTGTATTGGGCTTCTGCTATC ATTTTTCGCTGCACTTCTTACGTGGAAAAGTAAGTTTTTGTGTATTTACTCACGGCTAATTAATCCTCATGTTCTTGAATGTCTTATTGTATTGTTACCACACTAAGCATAACTACTAACAAGCTATTATGAAAATAAAAACGAAATCAAAGATGGAAAATATATTGTCAATTTATTTTCGTGATAAACAGAGGGCACATTGCTTAAGGTTTGTTAAAATTGTTCAAATTCGAAAAACAAATTTGATTCGTAAAAGAACAGAGCATCTCTACTCAATTCCTACCGAAAATATGGTTAGATTAAAACTCAGAACTTTCTTTGCAAGTCGATTTAAATTACTTCAATGGAATTTATTTTTTTAATTACGCTTCCTTTGTGATATAGGCTTAAATAAAAAAGACTTAGCGGGTAGCTATGGTAGAACACAAGATATTTGACAGATGCCTGAATCTCGTTAACGACATTTCAAAGATGAATTTGCATACCTAGCTACAAGTTCCGAACAATAATATTCGGACCGTCGGTCTACGAAGCAATTTAACTCGCTCGGTGATTTTCTCTTTGTCGTTAACCTCCAAGGACTAGAAAATGGATACAAATTTCATGAGAAAAATTAATGGCACTAACTAATAATAATTAATAATATTAAATATAATAATACATATTAAGGCCATTAACGGTGTAAGTAAAGAGCTGACATGTTATCAAACATGAAATATCTTAAACAAACATCGCATTATGGACTTTTCAGGAAAACACCATATATATTTTTTGCTTAGATGGGTGAATGAGCTCACAGCCCACCTGGTGTTAAGTGGTTACTGGAGCCCATAGACATATATGACGTAAATGCGCCACCTACCTTGAGATATAAGTTTCAAGGCCTCAAGTATATAGTTACAACGGCTGCCCCACCCTTCAAACCGAAACCCATTACTCCTTCACGGCAAAAATACGCAGGGTGGTGGTACCTACCCGCGTGGACTCACAAGAGGTCCTACCATCATATGTTACCACTATATGATCATTCTTGATCGTATGACTTTTTGTACGAGCGTTATGATACATTTCTGGGCCATGAGCACCATTACTTCAACATTACCTGTTTTTCTTTTTAATAATTATGTTGTAGAACATCGCTGATTGTTTGGTGAC TGATCTGGGTTTGGCGCTTGTAGTGATGATCCCATTGTTTGTACCTTGCGTCTTCGGCGATAAGGTCCACACTGAAG TGAAGCGACTCAGAGAACTTTTAGCTTCAAGGCTCTATGAAAACCAAATGGGTATGTAGTTATTTTCTTTTAAATGATGAGATGCGTTTAAAATAACTATATTCCTTTTATTTAATTTTAAATTATTGTTGATTTATAAAGAATCAATGAATTCAATTGGTGATAGATCGTAGATAAGCGCTTCGTGGATGCCGCTGATTACCTCAAGACATGCAGTTGACAATTTAATTGTCTTTCTAATACCATTCATAGTTCAAACACTCCTAAATGTCACAATAACTTTTAATTCTTAATTCACAAGCTTCTAATTTTAAATCGAAATTGATTAAGTATGCTTTAAAAGTTGAAATGTTGCGCATATTATAAAAAGTTAATTGATAATAAAATATATAAAAAAAAAGTGTGGCACTCAGAGACTGCCGCGGTAAAGCTATTGCATAGCATTTTTTATCAACTTATGCAATTATAATTAGACAATAATAATTTAATATTAAAACAATAACAAAATAAGACCACGCTATATTTATAAACATTAACGAAAGCAAAGCATTAATTGTCCCCTTCATACTCATAAGCTAGACCACGCGAGAGAGAGATGGGCAGATTTTTCATGATGCGCATGCAGTGCGACTTCACGCCGCGCGCTTATTCACAAACACTACACAAGCGCAACGCGTGAATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTGCTTAGATTGGTGGACGAGCTCACAGCCCACCTGGTGTTAAGTGGTTACTGGAGCCCATAGACATCTAGAACGTAAATGCGCCACCCACCTTGAGATATAAGTTCTAAGATCTCAGTATAGTTACAACGGCTACCCCACCCTTCGAACCGAAACGCATTACTGCTTCACGGCGGAAATAGGCGGGGTGGTGGTACCTACCCGTGCGGACTCCCAAGAGGTCCTACCACCAGTGATTACGCAAATTATAATTTTGCGGGTTTGTTTTTTATTACACGATGTTATTCCTTCACCGTGGAAGTCAATCGTGAACATTTGCTGAGTACGTATTTCATTGGAAAAATTGGTACCCGCCTGCGGGATTCGAACACCGGTGCATCGCTACATACGAATCGGACGTCTTATCCTTTAGGCCACGACGACTACAGTAAATGTGTTGAACGCGAGCTAAATCTTAGGCGGAGTGGGGGGTGTTAGGTTTTATTTGCGTTACGAAATTTCTTGATTCGGTCGCCGCGCTCAAAGCTCGCGACAAAAGCTATGCAATAACTTATATATGAAAATCTAACGTTTTCTTTATTATAGATAAGTCAAGTCGGAGTATAGCG AGAGCTCTTCTAGCCTTCACGGAGACCCGCGATTTGTCATTCTCGCTGCTGCGCATGTTGAACATCGATATTTCTCT GCCATTCAAGTTTGTTGGTCTACTCGTTACCTACCTTATCATTCTGTTGCAGTTTGAAAAAGTTATTAATCCGTAG

靶标基因hestia的cDNA序列如SEQ ID NO:10所示。根据hestia基因序列，设计并合成特异性扩增hestiaa的正向引物及反向引入，具体如下：

hestia-F：

5’-ATGTCACCACCGCTAGTCCA-3’(SEQ ID NO:2)；和

hestia-R：

5’-CTACGGATTAATAACTTTTTCAAACTGC-3’(SEQ ID NO:3)。

以五龄家蚕下颚的总RNA为模板进行反转录合成cDNA。反转录合成的cDNA为模板，以前述hestia-F及hestia-R为引物，用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，获得扩增产物。

获得的扩增产物克隆到pJET1.2-Blunt(购自Thermo science公司)上，经测序验证获得正确的表达质粒。

实施例2、sgRNA靶点(TS)的选择及sgRNA的合成

本发明利用CRISPR/Cas9系统敲除hestia基因，针对基因序列、经过大量的选择及试验，筛选出1个23bp的sgRNA识别靶点(TS)，位于1号外显子。家蚕hestia基因的结构示意图及其靶点(TS)序列如图1所示。

所述的sgRNA识别靶点的序列如下：

5’-GGATAAGTAAATTGAGAAGGTGG-3’(SEQ ID NO:1)。

sgRNA框架序列(SEQ ID NO:11)：

GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT

其中，下划线部分为sgRNA靶向序列。

根据筛选到的靶点(TS)，合成如下引物sgF和sgR：

sgF：

TAATACGACTCACTATAGGATAAGTAAATTGAGAAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAG(SEQ ID NO:4)；

sgR：

AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA(SEQ IDNO:5)。

用KOD-plus高保真聚合酶进行退火延伸，PCR产物回收纯化作为sgRNA合成的模板。

使用MAXIscript T7 kit体外转录合成sgRNA。

实施例3、Cas9 mRNA的获得

用于合成Cas9 mRNA的模板质粒为pTD1-Cas9(Yueqiang Wang,Zhiqian Li,JunXu,Baosheng Zeng,lin ling,Lang You,Yazhou Chen,Yongping Huang*,and Anjiang Tan*.The CRISPR/Cas System mediates efficient genome engineering in Bombyxmori.Cell Research 23(12):1414-6.2013)。该质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:8，首个ATG为起始密码子，末尾TAG为终止密码子。在终止密码子前有核定位信号。

pTD1载体包含T7启动子、5’-UTR和3’-UTR序列，Cas9基因的ORF被连接到5’-UTR和3’-UTR序列之间，因此pTD1-Cas9可作为体外转录Cas9 mRNA的模板。使用Not I限制性内切酶单酶切将pTD1-Cas9载体线性化，胶收纯化作为Cas9 mRNA合成的模板。使用mMESSAGEmMACHINE T7 kit进行体外转录mRNA，获得Cas9 mRNA。

实施例4、家蚕胚胎显微注射及筛选转基因家蚕

将sgRNA和Cas9 mRNA混合注射进蚕卵中，注射后的蚕卵使用无毒胶水封口防止污染，在25℃条件下，进行催青直到孵化。

使用酚-氯仿抽提其基因组DNA。使用sgRNA靶点(TS)外侧的引物hestiaTS-F及hestiaTS-R扩增相应的基因组区段。

hestiaTS-F：

ATGTCACCACCGCTAGTCCA(SEQ ID NO:6)；和

hestiaTS-R：

CATGAGGATTAATTAGCCGTGAGT(SEQ ID NO:7)。

将扩增获得的相应的基因组区段克隆到pET1.2-Blunt载体上，挑单克隆测序，通过序列比对检测是否存在变异并确定变异的类型。选择出hestia体细胞突变的家蚕。

CRISPR/Cas9诱导的基因突变如图2所示。

实施例5、转基因家蚕的食性确定

将注射过sgRNA和Cas9 mRNA混合物的家蚕用桑叶饲养至五龄起蚕(五龄第一天)，转用苹果和玉米进行饲养，观察家蚕对于苹果和玉米的食性，如图3。

结果发现，转基因家蚕的食性发生了变化，它们能够取食苹果和玉米，从而改变了其单一取食桑叶的食性特点。经鉴定，五龄起蚕在不取食桑叶的情况下，取食苹果的家蚕体重平均增加45mg。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种改变家蚕食性的方法及其应用

<130> 171404

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 家蚕

<400> 1

ggataagtaa attgagaagg tgg 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

atgtcaccac cgctagtcca 20

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

ctacggatta ataacttttt caaactgc 28

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

taatacgact cactatagga taagtaaatt gagaagggtt ttagagctag aaatagcaag 60

ttaaaataag gctag 75

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

atgtcaccac cgctagtcca 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 7

catgaggatt aattagccgt gagt 24

<210> 8

<211> 4140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 表达载体

<400> 8

atggacaaga agtactccat tgggctcgat atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 60

attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120

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gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320

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agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440

gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500

aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560

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gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740

agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800

attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860

ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920

catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 1980

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gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100

tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160

cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220

gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280

atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 2340

atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400

gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460

gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggatcat 2520

atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580

gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640

aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700

actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760

cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820

accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880

aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940

taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000

tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060

atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120

aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180

ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240

gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300

cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360

gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420

tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480

aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 3540

tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 3600

tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660

cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720

cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780

caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 3840

atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900

cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960

cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020

gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080

gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag gaaggtgtga 4140

<210> 9

<211> 3841

<212> DNA

<213> 家蚕

<400> 9

atgtcaccac cgctagtcca tatcaataca tttgttcaac cccaagcaaa gtacactgta 60

gacaaagtat caaagttttt tataatatgt agttttcttc taggcgttaa taggttgcct 120

attatatcat cgaaacatgt gtatacaatt ccttctataa tttatacttt cgtactaatg 180

tgtgtactaa attttttcgg gtttgattct gtctcattat ctatcatgag tttgaacctt 240

gtattacata tcttatgttc cttccttggt atgttttttt ggaagagaat gcgcctgtat 300

tattcagagc tctgtaagtt tgatatttgc atcggatgca gaccaataac tgcacaaggt 360

tccagtaaac ttgtaattca gacttgcatt ataaatgttt tgatagcttt ggtgtttatt 420

gtgccgaatt cacttcagat tctaatcaaa ccagttatat atttgcttcc catgcacgcc 480

tttgtgtcgt tcgaagtgca ttattatggc caccttctca atttacttat cccgcgttta 540

catttaataa actattacat ggaatcctca ttaactacca caagcgataa aagggagtcg 600

agtgtactga aacatgttat tttatttaaa tattataata aggaatcgaa ctgtcaaatg 660

aaaaaattta tggatcttta ttatattatc gtagaatctt acagatatct tattgacgct 720

attaaatggc aggtaagaaa ggattttatt aaattccaaa taatattctg ttgttaacaa 780

tatttaaatc aaaatgagaa aaatatatgt ttactggtgg taggacgtct tgtgagtccg 840

aatcaccctg cctatttctg ccggaagcaa taatgcgttt cagtttgaag gatggggcag 900

ccgttgtact cttaaaaaag tgagacctta gaactcatgt attaaggtgg gtggcggcgc 960

ttacgtttta gatgtctatg ggctccggta accacttaac accaggtggg ccgtgagctc 1020

gccatctatg taagcaataa aaaataaggt acttttaaag cttttatgtg atgaaattgt 1080

gaatttttat ttcagttatt gttcatcatc atagtttcgt ttatatctgt attgggcttc 1140

tgctatcatt tttcgctgca cttcttacgt ggaaaagtaa gtttttgtgt atttactcac 1200

ggctaattaa tcctcatgtt cttgaatgtc ttattgtatt gttaccacac taagcataac 1260

tactaacaag ctattatgaa aataaaaacg aaatcaaaga tggaaaatat attgtcaatt 1320

tattttcgtg ataaacagag ggcacattgc ttaaggtttg ttaaaattgt tcaaattcga 1380

aaaacaaatt tgattcgtaa aagaacagag catctctact caattcctac cgaaaatatg 1440

gttagattaa aactcagaac tttctttgca agtcgattta aattacttca atggaattta 1500

tttttttaat tacgcttcct ttgtgatata ggcttaaata aaaaagactt agcgggtagc 1560

tatggtagaa cacaagatat ttgacagatg cctgaatctc gttaacgaca tttcaaagat 1620

gaatttgcat acctagctac aagttccgaa caataatatt cggaccgtcg gtctacgaag 1680

caatttaact cgctcggtga ttttctcttt gtcgttaacc tccaaggact agaaaatgga 1740

tacaaatttc atgagaaaaa ttaatggcac taactaataa taattaataa tattaaatat 1800

aataatacat attaaggcca ttaacggtgt aagtaaagag ctgacatgtt atcaaacatg 1860

aaatatctta aacaaacatc gcattatgga cttttcagga aaacaccata tatatttttt 1920

gcttagatgg gtgaatgagc tcacagccca cctggtgtta agtggttact ggagcccata 1980

gacatatatg acgtaaatgc gccacctacc ttgagatata agtttcaagg cctcaagtat 2040

atagttacaa cggctgcccc acccttcaaa ccgaaaccca ttactccttc acggcaaaaa 2100

tacgcagggt ggtggtacct acccgcgtgg actcacaaga ggtcctacca tcatatgtta 2160

ccactatatg atcattcttg atcgtatgac tttttgtacg agcgttatga tacatttctg 2220

ggccatgagc accattactt caacattacc tgtttttctt tttaataatt atgttgtaga 2280

acatcgctga ttgtttggtg actgatctgg gtttggcgct tgtagtgatg atcccattgt 2340

ttgtaccttg cgtcttcggc gataaggtcc acactgaagt gaagcgactc agagaacttt 2400

tagcttcaag gctctatgaa aaccaaatgg gtatgtagtt attttctttt aaatgatgag 2460

atgcgtttaa aataactata ttccttttat ttaattttaa attattgttg atttataaag 2520

aatcaatgaa ttcaattggt gatagatcgt agataagcgc ttcgtggatg ccgctgatta 2580

cctcaagaca tgcagttgac aatttaattg tctttctaat accattcata gttcaaacac 2640

tcctaaatgt cacaataact tttaattctt aattcacaag cttctaattt taaatcgaaa 2700

ttgattaagt atgctttaaa agttgaaatg ttgcgcatat tataaaaagt taattgataa 2760

taaaatatat aaaaaaaaag tgtggcactc agagactgcc gcggtaaagc tattgcatag 2820

cattttttat caacttatgc aattataatt agacaataat aatttaatat taaaacaata 2880

acaaaataag accacgctat atttataaac attaacgaaa gcaaagcatt aattgtcccc 2940

ttcatactca taagctagac cacgcgagag agagatgggc agatttttca tgatgcgcat 3000

gcagtgcgac ttcacgccgc gcgcttattc acaaacacta cacaagcgca acgcgtgaat 3060

gttttttttt ttttttttta ttgcttagat tggtggacga gctcacagcc cacctggtgt 3120

taagtggtta ctggagccca tagacatcta gaacgtaaat gcgccaccca ccttgagata 3180

taagttctaa gatctcagta tagttacaac ggctacccca cccttcgaac cgaaacgcat 3240

tactgcttca cggcggaaat aggcggggtg gtggtaccta cccgtgcgga ctcccaagag 3300

gtcctaccac cagtgattac gcaaattata attttgcggg tttgtttttt attacacgat 3360

gttattcctt caccgtggaa gtcaatcgtg aacatttgct gagtacgtat ttcattggaa 3420

aaattggtac ccgcctgcgg gattcgaaca ccggtgcatc gctacatacg aatcggacgt 3480

cttatccttt aggccacgac gactacagta aatgtgttga acgcgagcta aatcttaggc 3540

ggagtggggg gtgttaggtt ttatttgcgt tacgaaattt cttgattcgg tcgccgcgct 3600

caaagctcgc gacaaaagct atgcaataac ttatatatga aaatctaacg ttttctttat 3660

tatagataag tcaagtcgga gtatagcgag agctcttcta gccttcacgg agacccgcga 3720

tttgtcattc tcgctgctgc gcatgttgaa catcgatatt tctctgccat tcaagtttgt 3780

tggtctactc gttacctacc ttatcattct gttgcagttt gaaaaagtta ttaatccgta 3840

g 3841

<210> 10

<211> 1140

<212> DNA

<213> 家蚕

<400> 10

atgtcaccac cgctagtcca tatcaataca tttgttcaac cccaagcaaa gtacactgta 60

gacaaagtat caaagttttt tataatatgt agttttcttc taggcgttaa taggttgcct 120

attatatcat cgaaacatgt gtatacaatt ccttctataa tttatacttt cgtactaatg 180

tgtgtactaa attttttcgg gtttgattct gtctcattat ctatcatgag tttgaacctt 240

gtattacata tcttatgttc cttccttggt atgttttttt ggaagagaat gcgcctgtat 300

tattcagagc tctgtaagtt tgatatttgc atcggatgca gaccaataac tgcacaaggt 360

tccagtaaac ttgtaattca gacttgcatt ataaatgttt tgatagcttt ggtgtttatt 420

gtgccgaatt cacttcagat tctaatcaaa ccagttatat atttgcttcc catgcacgcc 480

tttgtgtcgt tcgaagtgca ttattatggc caccttctca atttacttat cccgcgttta 540

catttaataa actattacat ggaatcctca ttaactacca caagcgataa aagggagtcg 600

agtgtactga aacatgttat tttatttaaa tattataata aggaatcgaa ctgtcaaatg 660

aaaaaattta tggatcttta ttatattatc gtagaatctt acagatatct tattgacgct 720

attaaatggc agttattgtt catcatcata gtttcgttta tatctgtatt gggcttctgc 780

tatcattttt cgctgcactt cttacgtgga aaaaacatcg ctgattgttt ggtgactgat 840

ctgggtttgg cgcttgtagt gatgatccca ttgtttgtac cttgcgtctt cggcgataag 900

gtccacactg aagtgaagcg actcagagaa cttttagctt caaggctcta tgaaaaccaa 960

atggataagt caagtcggag tatagcgaga gctcttctag ccttcacgga gacccgcgat 1020

ttgtcattct cgctgctgcg catgttgaac atcgatattt ctctgccatt caagtttgtt 1080

ggtctactcg ttacctacct tatcattctg ttgcagtttg aaaaagttat taatccgtag 1140

<210> 11

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> sgRNA框架序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 11

gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt 102

Claims (13)

1.一种使家蚕的取食方式从寡食性转变成杂食性的方法，其特征在于，所述方法包括：下调家蚕的hestia基因的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过敲除hestia基因，从而下调家蚕的hestia基因的表达。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除hestia基因。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，以hestia基因中第3个外显子作为基因编辑的靶区域。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，敲除hestia基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转入蚕卵中；催青；孵化；获得取食方式从寡食性转变成杂食性的家蚕。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过将SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物序列经退火、延伸、PCR产物回收纯化，再转录成所述的sgRNA。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过采用同源重组的方法，敲除家蚕的hestia基因，从而下调家蚕的hestia基因的表达。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过采用特异性干扰hestia基因表达的干扰分子来沉默hestia基因，从而下调家蚕的hestia基因的表达；较佳地，所述的干扰分子是以hestia基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家蚕的hestia基因选自：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的基因；

(b)核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的基因；

(c)核苷酸序列与(a)或(b)限定的序列有85％以上相同性且具有(a)或(b)限定的序列功能的基因；

(d)核苷酸序列在严格条件下能够与(a)或(b)的多核苷酸序列杂交且具有(a)或(b)限定的序列功能的基因；或

(e)核苷酸序列与(a)或(b)的多核苷酸序列完全互补的基因。

10.sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸的用途，其特征在于，其用于与Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转入蚕卵中，使家蚕的取食方式从寡食性转变成杂食性；其中，所述的sgRNA靶向于hestia基因中第3个外显子。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的sgRNA的靶序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

12.权利要求1～9任一所述的方法的用途，用于制备hestia基因被敲除、从而取食方式从寡食性转变成杂食性的家蚕。

13.一种试剂盒，其用于制备取食方式从寡食性转变成杂食性的家蚕，其特征在于，所述的试剂盒中包含：

sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸；所述的sgRNA的靶序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；以及

Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸。