CN111218451B

CN111218451B - 一种提高猪肌肉量的方法

Info

Publication number: CN111218451B
Application number: CN202010080993.3A
Authority: CN
Inventors: 左波; 靳建军; 徐在言; 张佳丽; 吕威
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-02-05
Filing date: 2020-02-05
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2040-02-05
Also published as: CN111218451A

Abstract

本发明属于猪分子标记筛选与应用技术领域，具体涉及一种提高猪肌肉量的方法。本发明利用干扰和超表达MN864465基因提高猪肌肉量和肌纤维密度。所述的MN864465基因是从大白猪基因组中扩增得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列位于猪8号染色体中104,826,111‑104,827,563区域。构建得到两种载体，在猪骨骼肌卫星细胞中分别超表达和干涉该基因，发现该基因可促进猪骨骼肌卫星细胞增殖，抑制猪骨骼肌卫星细胞分化，即可以提高猪肌肉量和肌纤维密度。利用该基因的超表达慢病毒注射猪和小鼠腿肌，可抑制肌肉的生长发育。本发明为猪的肌肉改良提供了新的资源。

Description

一种提高猪肌肉量的方法

技术领域

本发明属于猪分子标记筛选与应用技术领域，具体涉及一种利用干扰和超表达MN864465基因，培育能够提高动物尤其是猪的肌肉量和肌纤维密度的应用。利用慢病毒介导的干扰和超表达分别减少和过表达 MN864465检测骨骼肌细胞增殖和分化的能力。利用慢病毒介导的超表达MN864465载体注射小鼠和猪骨骼肌，检测对肌肉生长发育的影响，提供一种提高动物肌肉量的方法与应用。

背景技术

肌肉是动物机体重要的组成部分，在人和动物中发挥着重要的作用。肌肉的生长发育直接影响着人类的生命活动和动物的经济价值。肌肉中含有18～20％蛋白质，是人类必须氨基酸的重要来源。同时，肌肉中含有丰富的无机盐和多种维生素，对于人类的饮食和健康具有重要的影响。在畜牧业发展中，动物的肌肉生长具有重要的经济价值。在畜牧业生产中，提高动物肌肉量和肌纤维密度，能够获得更多的产出，显著提高经济效益。随着人民生活水平的提高，未来对于肉类的需求和消费将有很大增加，因此，增加动物肌肉的产量是目前畜牧业发展的重要目标。然而由于传统育种技术的局限，选育肌肉生长性状较快的品种需要花费大量的时间和精力。近年来转基因技术和基因敲除技术在提高动物育种速度和效率上展现了很好的优势。

基因敲除技术是在20世纪80年代后发展起来的分子生物学技术，通常意义上的基因敲除又称为基因打靶，是指将机体内某个特定基因删除或者使该基因失活。利用基因敲除技术，进行基因功能的研究已经广泛应用在生物学和医学研究中。目前为止，人类已获得基因敲除鼠、猪、鱼、兔、羊和牛等基因敲除动物。利用基因敲除技术提高动物的生长和经济形状，在动物种质资源遗传改良中具有巨大的应用前景和价值。Szabo G等利用基因敲除技术将小鼠MSTN基因敲除，导致小鼠肌纤维增生和肥大，肌肉量显著增加，其体重是野生小鼠的2.6倍。同样，通过基因敲除技术敲除MSTN基因可导致牛，羊和猪等家畜表现出双肌臀表型，显著增加肌肉量和生长速度，例如2015年Lilin Qian等人将猪的myostatin基因敲除可以显著增加肌肉量，同时减少脂肪含量。转基因技术转是指运用生物工程的方法将构建好的外源目的基因片段导入并稳定整合到受体染色体基因组内，从而制备的可稳定遗传给下一代的动物。1982年Palmiter等人运用显微注射方法将大鼠的生长激素基因显微注射进入小鼠受精卵中，获得所谓的“超级大鼠”。到目前为止，人类已获得转基因鼠、鱼、兔、羊、牛和猪等转基因动物。例如Bo Gao等发现mIGF-1转基因猪可以显著增加体重和肌肉量。此外，Ying F等人利用转基因技术制备了PGC1α转基因猪，结果发现PGC1α转基因猪可以显著增加氧化型肌纤维(type I肌纤维)，减少酵解型肌纤维(type IIb肌纤维)。尽管转基因技术和基因敲除技术能够有助于提高动物育种速度，然而由于转基因技术和基因敲除技术能够改变生物的基因组DNA，因此其存在一定的的安全性和脱靶率，而且这些技术存在效率低和时间长等缺点。同时，转基因技术和基因敲除技术制备的畜产品由于生物安全性问题被禁止进入市场，民众对于转基因生物具有很高的抵抗性和恐惧感。因此，目前利用转基因技术和基因敲除技术改良和制备优良性状的畜产品具有很大的困难。

近年来，以慢病毒为载体介导的基因超表达和干涉技术逐渐进入临床治疗和研究。其具有很好的优点，例如不改变基因组DNA、具有很高的靶向效率、花费时间短和很好的安全性。例如利用慢病毒介导的基因疗法对β地中海贫血症具有很好的效果。此外，最近的研究也利用慢病毒超表达IL2RG基因对X-连锁严重联合免疫缺陷症(X-SCID)的婴儿具有很好的疗效。因此，利用慢病毒介导的干涉和超表达技术在提高动物生长发育方面具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种长链非编码RNA-MN864465在提高动物肌肉生长发育和肌纤维密度中应用。与本发明密切相关的猪长链非编码RNA-MN864465基因是本申请人所在的农业农村部猪遗传育种重点实验室首次鉴定，并对其功能进行了研究。本发明中MN864465基因位于猪的8 号染色体104,826,111-104,827,563区域，组织表达谱显示MN864465基因在猪的肌肉组织中高表达，同时随着骨骼肌细胞分化和肌肉生长发育呈现显著的上调表达。利用5’和3’RACE试验发现MN864465序列长度为1462bp。功能研究揭示MN864465基因可以促进猪骨骼肌卫星细胞增殖，抑制骨骼肌卫星细胞的分化，是一个肌肉发育的负调节因子。利用慢病毒介导的MN864465超表达载体注射猪和小鼠腿肌，结果显示超表达MN864465可以显著抑制猪和小鼠肌肉的生长发育，减少肌纤维横截面积。

本发明的技术方案如下所述：

MN864465基因在提高猪肌肉量和肌纤维密度中的应用，所述的MN864465基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其构建方法为：分离出生0天的猪骨骼肌卫星细胞，提取细胞总RNA，利用3’和5’末端快速扩增 (RACE)得到MN864465基因的全长序列。扩增MN864465基因的全长序列，构建得到MN864465慢病毒超表达载体，利用在线软件设计MN864465的干扰siRNA，构建得到MN864465慢病毒干扰载体。利用 MN864465基因的干扰和超表达慢病毒转染猪肌卫星细胞，检测MN864465对猪肌卫星细胞增殖和分化的影响。利用MN864465超表达病毒注射小鼠和猪的腿肌，通过实时定量PCR、Western blot和组织切片染色等方法检测肌纤维大小和肌纤维密度。

申请人提供了一种干扰MN864465基因siRNA oligo序列，该序列如下所示：

siRNA-F：GGCAAGGACTGGAGACATTTT，

siRNA-R：AATGTCTCCAGTCCTTGCCTT。

申请人提供一种适用于MN864465基因的慢病毒干涉载体，该载体的构建步骤包括：

根据干扰MN864465基因所述核酸序列的siRNA oligo序列，设计带有Ecorl和Agel酶切位点的shRNA 引物，该引物的核酸序列如下所示：

shRNA-F：CCGGAATGGCAAGGACTGGAGACATTCTCGAGAATGTCTCCAGTCCTTGCCATTTTTTTG，

shRNA-R：ATTCAAAAAAATGGCAAGGACTGGAGACATTCTCGAGAATGTCTCCAGTCCTTGCCATT。

申请人提供了一种提高猪肌肉量和肌纤维密度的方法，将构建的慢病毒干涉载体进行病毒包装，将包装好的慢病毒载体注射猪的肌肉组织，每7天注射1次。

本发明的干扰序列可在提高猪肌肉量和肌纤维密度中应用。

本发明制备的慢病毒干涉载体可在提高猪肌肉量和肌纤维密度中应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、利用慢病毒介导的超表达和干涉，目的基因具有很高的超表达和干涉效率。

2、不会改变基因组DNA序列，具有很高的安全性。

3、所用时间更短，花费更低。

附图说明

图1：MN864465基因的RACE结果。

图2：MN864465在猪组织中表达模式。

图3：MN864465在猪骨骼肌卫星细胞分化期间的表达水平。

图4：MN864465在不同发育阶段的猪腿肌和背最长肌中的表达水平。图4中A图是MN864465在不同月龄猪背最长肌中的表达水平；图4中B图是MN864465在不同月龄猪腿肌中的表达水平。

图5：超表达MN864465检测猪骨骼肌卫星细胞EdU染色结果。图5中的A图是超表达MN864465检测猪骨骼肌卫星细胞EdU染色；图5中B是EdU染色量化结合。

图6：干扰MN864465检测猪骨骼肌卫星细胞EdU染色结果。图6中A图是干扰MN864465检测猪骨骼肌卫星细胞EdU染色；图6中B图是EdU染色量化结合。

图7：干扰MN864465猪骨骼肌卫星细胞流式细胞周期检测结果。图7中A图是干扰MN864465检测猪骨骼肌卫星细胞细胞周期流式结果；图7中B图是细胞周期流式结果量化结果。

图8：超表达MN864465猪骨骼肌卫星细胞流式细胞周期检测结果。图8中A图是超表达MN864465检测猪骨骼肌卫星细胞细胞周期流式结果；图8中B是细胞周期流式结果量化结果。

图9：qRT-PCR检测干扰MN864465猪骨骼肌卫星细胞增殖基因的表达。

图10：qRT-PCR检测超表达MN864465猪骨骼肌卫星细胞增殖基因的表达。

图11：qRT-PCR检测干扰MN864465猪骨骼肌卫星细胞分化基因的表达。

图12：qRT-PCR检测超表达MN864465猪骨骼肌卫星细胞分化基因的表达。

图13：western blot检测干涉MN864465猪骨骼肌卫星细胞分化基因的表达。图13中A是干涉MN864465 猪骨骼肌卫星细胞分化基因的表达水平western blot结果；图13中B是western blot量化结果。

图14：western blot检测超表达MN864465猪骨骼肌卫星细胞分化基因的表达。图14中的A图是超表达 MN864465猪骨骼肌卫星细胞分化基因的表达水平western blot胶图；图14中的B图是western blot量化结果。

图15：细胞免疫荧光染色检测干涉MN864465猪骨骼肌卫星细胞分化能力。图15中A是干涉MN864465 细胞免疫荧光染色检测分化基因MyHC的表达水平；图15中B是MyHC免疫荧光染色量化结果。

图16为细胞免疫荧光染色检测超表达MN864465猪骨骼肌卫星细胞分化能力。图16中A是超表达 MN864465细胞免疫荧光染色检测分化基因MyHC的表达水平；图16中B是MyHC免疫荧光染色量化结果。

图17：MN864465超表达慢病毒注射猪腓肠肌(Gas)和股二头肌(Sol)的H&E染色。

图18：MN864465超表达慢病毒注射猪腓肠肌(Gas)和股二头肌(Sol)的H&E染色肌纤维横截面积统计结果。图18中A是腓肠肌(Gas)肌纤维横截面积统计结果；图18中B是股二头肌(Sol)肌纤维横截面积统计结果。

图19：MN864465超表达慢病毒注射猪腓肠肌(Gas)和股二头肌(Sol)的H&E染色肌纤维数量统计结果。

图20：qRT-PCR检测MN864465超表达慢病毒注射小鼠腿肌对肌肉发育相关基因的表达的影响。

图21：western blot检测MN864465超表达慢病毒注射小鼠腿肌对肌肉发育相关基因的表达的影响。图21 中A是超表达MN864465小鼠肌肉发育相关基因表达的western blot结果；图21中B是western blot量化结果。

图22：MN864465超表达慢病毒注射小鼠腿肌代表性图片。

图23：MN864465超表达慢病毒注射小鼠腿肌不同肌肉组织代表性图片。

图24：MN864465超表达慢病毒注射小鼠腿肌不同肌肉组织重量统计结果。图24中A是腓肠肌(Gas)重量统计结果；图24中B是股四头肌Qu)重量统计结果；图24中C是胫骨前肌(TA)重量统计结果。

图25：MN864465超表达慢病毒注射小鼠腿肌不同肌肉组织H&E染色结果。

图26：MN864465超表达慢病毒注射小鼠腿肌不同肌肉组织肌纤维横截面积统计结果。图26中A是股四头肌(Qu)肌纤维横截面积统计结果；图26中B是腓肠肌(Gas)肌纤维横截面积统计结果；图26中C 是胫骨前肌(TA)肌纤维横截面积统计结果；

图27：慢病毒超表达载体(PCDH-CMV-MSC-EF1-copGFP)图谱。

图28：慢病毒干涉载体(pLKO.1)图谱。

图29：慢病毒包装辅助载体(psPAX2)图谱。

图30：慢病毒包装辅助载体(pMD2.G)图谱。

具体实施方式

对序列表的说明

SEQ ID NO:1是本发明克隆的MN864465基因片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3是干扰MN864465基因的siRNA oligo序列。

SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5干扰MN864465基因siRNA oligo序列的引物序列。

本发明的技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：猪MN864465基因序列分析及表达

1.1猪MN864465基因序列

利用5’和3’RACE试验方法扩增获得猪的MN864465的全长序列(图1)，序列长度为1462nt。

猪MN864465基因全长序列：

GTGTTTAACATCCAGAGAATGGAAACTTACATACATGTGACCATCTATTCCATGTAACGGCCCTTCCTTTGATTTTATGGAGGCAATGGAGTTGGTCCTGTGTAAGCTCAAGCTAAAAATAAGCCCATGGGGATCAT AACATAAAGTAGGTGACACGTTTGGGTGTGTGGGAGGGGGAAAGCCTGGGAGAAAGGGAGAAGTCT TTTCCTCAGCCTTGTCTGGGGACAACCTTTCACTCCAACAGAGGGAGAGTAGGTTGACAGCAGCAGG AATTGTTTTTTGTGAAACTCAGGGCATTTGCTGTGCCAGCATCCAGGTGGTAATGTATGACACTGCTGT GGAGAAGTGGGCTCTGGCCCTTCCTTCTCATACGTAGGAGGGAATGGCAAGGACTGGAGACATTGCA GTTTTACCTCTTGAAGGTCTTACAGCTCTCCAGCTTTGTACACAGGAACCTCAATGCTCTTAACAGAG AGGCAGTCATGGAGACATAGGGAAAGAGTGGTTGACAGGGGCAGACGTGGATGGATTGTGAGCACA CCCATCCTCAGGAAGGCTGCCGCAGAAGGATGTGAGTGAGCTTGTCCCTGAGCGTGGAGGAGGAGCT AACAAGCTTCCAATTATTAGTGTTCCTGGGGCACTGTGATTATACTTATATCTGTGTGATTTCCAGAGAG CACAGCCTGGGTGTATCTCTGACTCTTTCTAGAAGTTGATATCCACCTACTAAAACTATCTGTAAAATA AAATAATTACAAATGAGATGATTCACAGTTGCACAAAGGCACTTACTGATCACCCACAGTGTGCTCCA GGTCTTTCCTATTTGTTTAAGACAGATAACCTGAACGTGATTCCCTGTTCTTCCCCACCCCGCCTTGTT TTTTTGGTTTTTTGTTTCCAGAGTCTGTGCTCTGTAATGACCCCCAAATGATTAATCTAGCAAAAGTGC TGAAAGTTCTCTGATTCCAGTGTTGCTGCTTTTCATCTTAGATTCTGTCTTTGTAGCAACATATGTTGCT GTTTCTCATCGTTTTTGCTCTAAAAGTTGCAGAGAGAAACCCTAACTTTGTAGATCCAAATGCTTCCTT TGAACTCCTACCGCCTTATGATAGGATGGTCTGTAGCACAGGAAGCAGTGGAGAATGCAGATGCCATC ACTCAGTTTGGCTTGTCCTTTTCTGTGCTGGAACTTTGTTTTTCCTTTTATCCTTTAATTTGCTCTTGAC CTTGCAGAACATGCCTCTGCTCATATCTAAAAGAGGAGTTTGGCACTGGGGATTTCCATTTTCGTAGCA TTCAAAATCACTTAATCTTCATGAGCACAAATGCTTAGAAATGACTTGTTTAATTTTGTGAATGTGTGTA TTTATGGGAAATATGGTGTTTTTAAGTATTGCCAGTTTCCGCTAATTGATAGGATAGAAAAGGGAATCT GCTATACTCC

MN864465RACE引物如下：

5’RACE:GTGCCTTTGTGCAACTGTGAATCATCT

3’RACE:CCCCAAATGCTTCCTTTGAACTCCT

1.2猪MN864465表达模式

分离刚出生小猪(大白猪，实施本发明不限于该品种)骨骼肌卫星细胞，在20％增殖培养基(125ml FBS， Gibico；500ml DMEM-1640，thermo fisher；链霉素-青霉素双抗，GIBICO)中培养，待细胞密度达到80％时加入2％分化培养基(10ml马血清，GIBICO；500mlDMEM-1640，thermo fisher；链霉素-青霉素双抗， GIBICO)诱导分化2天、4天和6天。提取骨骼肌卫星细胞RNA，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 检测MN864465的表达变化，结果发现MN864465随着猪骨骼肌卫星细胞分化表达水平显著增加(图2)。分离3月龄猪不同组织，提取RNA，利用qRT-PCR检测MN864465在猪不同组织中的表达水平，结果显示MN864465在猪腿肌和背最长肌中高表达(图3)。同时利用qRT-PCR分析发现在腿肌和背最长肌中， MN864465的表达水平随着猪的生长发育显著升高(图4)。

MN864465基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物如下：

Sense：ATTCCCTGTTCTTCCCCACC，

Antisense：GCATTCTCCACTGCTTCCTG。

PCR扩展产物296bp，退火温度62℃。

实施例2：猪MN864465基因可以促进猪骨骼肌卫星细胞增殖，抑制骨骼肌卫星细胞分化

2.1猪MN864465基因干扰和超表达慢病毒载体构建及包装

根据猪MN864465基因核苷酸序列，利用siRNA设计软件(BLOCK-iT^TMRNAiDesigner)设计MN864465的干扰片段，将MN864465干扰siRNA构建到慢病毒干扰载体(pLKO.1)上，利用293T细胞 (购买自中科院上海细胞库)进行MN864465干扰载体慢病毒的包装。MN864465siRNA序列如下：

siRNA-F：GGCAAGGACUGGAGACAUUTT，

siRNA-R：AAUGUCUCCAGUCCUUGCCTT。

根据MN864465核苷酸序列设计MN864465引物扩增全长序列，将MN864465全长序列构建到慢病毒超表达载体(PCDH-CMV-MSC-EF1-copGFP，购买自addgene)上，利用293T细胞进行MN864465超表达载体慢病毒包装。MN864465全长序列扩增引物如下：

MN864465-F：GTGTTTAAACATCCAGAGAAT

MN864465-R：GGAGTATAGCAGATTCCCTT

2.2猪MN864465基因促进猪骨骼肌卫星细胞增殖

利用猪MN864465基因的干涉慢病毒和超表达慢病毒分别侵染猪骨骼肌卫星细胞，利用EdU染色检测发现干扰MN864465抑制猪骨骼肌卫星细胞的增殖(图5)，超表达MN864465可以促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖(图6)。利用流式细胞仪检测发现干扰MN864465后可以抑制细胞周期的进程(图7)，超表达MN864465可以促进细胞周期进程(图8)。qRT-PCR检测猪骨骼肌卫星细胞增殖相关基因的表达，结果显示干扰猪MN864465基因显著抑制细胞增殖基因的表达(图9)，超表达MN864465可以促进增殖基因的表达(图10)。

2.3猪MN864465抑制猪肌卫星细胞的分化

利用猪MN864465基因的干涉慢病毒和超表达慢病毒分别侵染猪骨骼肌卫星细胞，诱导细胞分化。利用qRT-PCR检测骨骼肌卫星细胞分化基因的表达，结果显示干扰MN864465可以显著增加细胞分化基因 MyoG和MyHC的表达(图11)，超表达MN864465可以显著抑制MyoG和MyHC基因的表达(图12)。 Western blot结果也显示干扰MN864465可以显著增加MyoG和MyHC的表达(图13)，超表达MN864465 可以抑制MyoG和MyHC的表达(图14)。利用细胞免疫荧光染色检测猪骨骼肌卫星细胞分化基因MyHC 的表达发现干扰MN864465可以显著促进细胞分化(图15)，超表达MN864465可以显著抑制细胞的分化(图16)。

实施例3：MN864465可以抑制猪骨骼肌的生长发育

利用MN864465超表达慢病毒注射出生15天小猪的左腿腿肌，超表达空载体慢病毒作为对照注射猪右腿腿肌。连续注射2次，每次相隔7天。注射完成后将小猪处死，分别分离腓肠肌和股二头肌，进行 H&E染色，检测超表达MN864465对猪肌纤维横截面积和肌纤维数量的影响。采集的图片用Image J软件，统计肌纤维的密度和肌纤维横截面积。结果表明，超表达MN864465的腓肠肌和股二头肌相对于对照组肌肉，肌纤维的密度显著增加，同时肌纤维的横截面积减少(图17-19)。这就表明MN864465超表达可以显著抑制猪骨骼肌的生长和发育。

实施例4：MN864465可以抑制小鼠肌肉的生长发育

4.1MN864465可以抑制小鼠肌肉生长发育相关基因表达

利用MN864465超表达慢病毒注射出生1月龄小鼠的左腿腿肌，右腿注射空载体的慢病毒。连续注射4次，每次相隔7天。注射完成后将小鼠处死，分别分离腓肠肌、胫骨前肌和股四头肌，提取组织RNA和蛋白，分别检测肌肉发育相关基因的表达变化。qRT-PCR结果显示超表达MN864465可以显著抑制猪骨骼肌发育相关基因MyoG和MyHC基因的表达(图20)。同样，western blot结果显示超表达MN864465可以抑制 MyoG和MyHC蛋白的表达水平(图21)。

3.2MN864465可以显著减少小鼠肌肉的重量。

将小鼠处死后，然后分离后肢腿部肌肉，分别分离股四头肌、胫骨前肌和腓肠肌。接下来对分离的肌肉组织分别称重。统计结果表明MN864465超表达肌肉组织与对照组小鼠相比，腿肌重量显著减少(图22)。此外，相比对照组，腓肠肌，股四头肌和胫骨前肌的重量也显著减少，且都达到显著水平(p<0.05)(图 23)。MN864465超表达的胫骨前肌，股四头肌和腓肠肌相对于对照组分别减少了21.5％，19.3％和9.3％(图 24)。这就表明超表达MN864465基因可以显著减少小鼠肌肉量。

3.3MN864465可以显著减少小鼠肌纤维数量和肌纤维横截面积。

分离分离小鼠股四头肌、腓肠肌和胫骨前肌用于组织切片染色。组织H&E染色结果利用Image J软件进行分析，统计肌纤维的密度和肌纤维横截面积。统计结果表明，MN864465超表达肌肉相对于对照组肌肉组织肌纤维横截面积减小(图25和26)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种提高猪肌肉量的方法

<141> 2020-02-05

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1447

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1447)

<400> 1

gtgtttaaca tccagagaat ggaaacttac atacatgtga ccatctattc catgtaacgg 60

cccttccttt gattttatgg aggcaatgga gttggtcctg tgtaagctca agctaaaaat 120

aagcccatgg ggatcataac ataaagtagg tgacacgttt gggtgtgtgg gagggggaaa 180

gcctgggaga aagggagaag tcttttcctc agccttgtct ggggacaacc tttcactcca 240

acagagggag agtaggttga cagcagcagg aattgttttt tgtgaaactc agggcatttg 300

ctgtgccagc atccaggtgg taatgtatga cactgctgtg gagaagtggg ctctggccct 360

tccttctcat acgtaggagg gaatggcaag gactggagac attgcagttt tacctcttga 420

aggtcttaca gctctccagc tttgtacaca ggaacctcaa tgctcttaac agagaggcag 480

tcatggagac atagggaaag agtggttgac aggggcagac gtggatggat tgtgagcaca 540

cccatcctca ggaaggctgc cgcagaagga tgtgagtgag cttgtccctg agcgtggagg 600

aggagctaac aagcttccaa ttattagtgt tcctggggca ctgtgattat acttatatct 660

gtgtgatttc cagagagcac agcctgggtg tatctctgac tctttctaga agttgatatc 720

cacctactaa aactatctgt aaaataaaat aattacaaat gagatgattc acagttgcac 780

aaaggcactt actgatcacc cacagtgtgc tccaggtctt tcctatttgt ttaagacaga 840

taacctgaac gtgattccct gttcttcccc accccgcctt gtttttttgg ttttttgttt 900

ccagagtctg tgctctgtaa tgacccccaa atgattaatc tagcaaaagt gctgaaagtt 960

ctctgattcc agtgttgctg cttttcatct tagattctgt ctttgtagca acatatgttg 1020

ctgtttctca tcgtttttgc tctaaaagtt gcagagagaa accctaactt tgtagatcca 1080

aatgcttcct ttgaactcct accgccttat gataggatgg tctgtagcac aggaagcagt 1140

ggagaatgca gatgccatca ctcagtttgg cttgtccttt tctgtgctgg aactttgttt 1200

ttccttttat cctttaattt gctcttgacc ttgcagaaca tgcctctgct catatctaaa 1260

agaggagttt ggcactgggg atttccattt tcgtagcatt caaaatcact taatcttcat 1320

gagcacaaat gcttagaaat gacttgttta attttgtgaa tgtgtgtatt tatgggaaat 1380

atggtgtttt taagtattgc cagtttccgc taattgatag gatagaaaag ggaatctgct 1440

atactcc 1447

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<400> 2

ggcaaggact ggagacattt t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

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<222> (1)..(21)

<400> 3

aatgtctcca gtccttgcct t 21

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(60)

<400> 4

ccggaatggc aaggactgga gacattctcg agaatgtctc cagtccttgc catttttttg 60

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(59)

<400> 5

attcaaaaaa atggcaagga ctggagacat tctcgagaat gtctccagtc cttgccatt 59

Claims

1.MN864465基因在提高猪肌肉量中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

2.一种干扰权利要求1所述核酸序列的siRNA oligo序列，其特征在于，所述的siRNAoligo序列如下所示：

siRNA-F：GGCAAGGACUGGAGACAUTT，

siRNA-R：AAUGUCUCCAGUCCUUGCCTT。

3.一种适用于权利要求1中所述核酸序列的构建慢病毒干涉载体的shRNA引物序列，其特征在于，

该引物的核酸序列如下所示：

shRNA-F：CGGAATGGCAAGGACTGGAGACATTCTCGAGAATGTCTCCAGTCCTTGCCATTTTTTTG，

shRNA-R：ATTCAAAAAAATGGCAAGGACTGGAGACATTCTCGAGAATGTCTCCAGTCC

TTGCCATT。

4.一种提高猪肌肉量的方法，其特征在于，将权利要求3中所构建的慢病毒干涉载体进行病毒包装，将包装好的慢病毒载体注射猪的肌肉组织，每7天注射1次。

5.权利要求2所述的siRNA oligo序列或权利要求3所述的shRNA引物序列在提高猪肌肉量中的应用。