CN113455588A

CN113455588A - Dha作为饲料添加剂在调控肌纤维类型中的新用途

Info

Publication number: CN113455588A
Application number: CN202110662660.6A
Authority: CN
Inventors: 王新霞; 陈炜; 陈雨诗; 汪以真
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2021-10-01

Abstract

本发明公开了DHA作为饲料添加剂在调控肌纤维类型中的新用途。DHA作为饲料添加剂的新用途，在高脂饮食中添加DHA增加小鼠骨骼肌组织中mRNA m⁶A去甲基化酶FTO蛋白表达，从而降低小鼠骨骼肌中总mRNA m⁶A修饰水平。在高脂饮食情况下增加小鼠骨骼肌中线粒体数量，促进小鼠骨骼肌氧化磷酸化基因表达，减少糖酵解基因表达，促进骨骼肌肌纤维类型向慢肌纤维转换，增加小鼠的运动耐力。DHA在高脂饮食中的添加量为500 mg/kg体重/天。DHA促进C2C12细胞系中m⁶A去甲基化酶FTO表达并降低m⁶A水平。DHA不含对动物或人体有害的物质，添加量较少，可以直接加入动物饲料、食品或药品中，具有安全、有效、不会引起毒副作用等优点，在作为饲料添加剂改善动物肉品质的应用具有良好的推广应用前景。

Description

DHA作为饲料添加剂在调控肌纤维类型中的新用途

技术领域

本发明属于饲料添加剂和骨骼肌运动领域。更具体地，涉及二十二碳六烯酸作为一种饲料添加剂在增加动物慢肌纤维比例，改善动物运动耐力和肉品质方面的分子机制研究和应用。

背景技术

骨骼肌占成年动物体重的50％左右，其是由无数具有收缩能力的肌纤维所组成。根据肌纤维不同的代谢特性可将肌纤维分成不同类型，主要分为以氧化磷酸化代谢模式为主的慢肌纤维和以糖酵解代谢模式为主的快肌纤维。在日常生活中，肌纤维类型与机体运动能力和代谢水平密切相关；而在动物生产过程中，肌纤维类型的组成和差异是影响肉品质的重要因素之一。一般而言，慢肌纤维比例越高，骨骼肌的运动耐力越好，畜产品的肉色越符合消费者需求，肉品质因此也越佳。随着畜牧养殖规模的不断扩大，人们生活水平和消费需求日益提高，使人们在选择肉类消费品时对市场提出了越来越高的要求。因此，如何调控肌纤维类型，改善肉品质并提高运动耐力，对于动物生产及人体运动均具有重要的意义。

骨骼肌肌在生长过程中会对动物机体内在以及外在的诸多因素产生调整与应答，从而发生纤维类型之间的转化。在畜牧生产上，影响肌纤维类型转化的因素主要包括品种、年龄、性别、部位、遗传、营养、饲养方式等等。一些营养物质可以通过改变肌肉代谢进而改变肌纤维类型和骨骼肌运动能力，但是其内在机制尚不清楚，对分子机制和应用量的报道较少。因此，开发研究新的饲料添加剂具有十分重要的市场价值，以保证能有效提高畜产品品质来满足国民肉质消费需求。

二十二碳六烯酸——DHA，是一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸脂肪酸，已有研究报道DHA的生物活性，如改善脑功能、抗肿瘤活性、调节脂质代谢、调节葡萄糖代谢、抗炎作用以及改善运动训练和表现。越来越多的证据也支持DHA对骨骼肌的有益作用，如减轻肌肉萎缩，改善运动员运动表现，有助于运动后恢复等。然而，目前有关DHA对动物骨骼肌肌纤维类型影响的相关研究尚属空白，无相关技术和分子机制报道。

对分子机制的研究表明，DHA及其代谢物广泛参与调控表观遗传修饰，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和小的非编码microRNAs。然而，表观遗传修饰如何介导DHA在骨骼肌上的调控仍不清楚。n6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m⁶A)是真核生物中最丰富的mRNA修饰，最近作为一种重要的转录后调控因子逐渐被深入研究。m⁶A甲基化在介导许多重要的生物过程中起着至关重要的作用，如发育、代谢和疾病。鉴于已有多项研究发现m⁶A可调节骨骼肌功能，如肌生成、脂质沉积和肌肉再生，而尚未有研究表明DHA可通过影响m⁶A修饰调控骨骼肌功能。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前有关二十二碳六烯酸调控肌纤维类型转化的分子机制等方面的研究尚属空白，无相关技术报道。

解决以上问题及缺陷的难度为：要从动物活体、骨骼肌组织、细胞等不同层次研究二十二碳六烯酸对骨骼肌纤维类型转换、骨骼肌细胞代谢特征等多方面的影响，从而阐明二十二碳六烯酸调控肌纤维类型的作用和分子机制，为其应用提供充分的科学依据。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种DHA作为饲料添加剂在调控肌纤维类型中的新用途，尤其涉及二十二碳六烯酸在改变mRNA m⁶A修饰水平，增加骨骼肌线粒体生成，从而增加骨骼肌慢肌纤维比例的应用。

一种DHA作为饲料添加剂的新用途，在高脂饮食中添加DHA增加小鼠骨骼肌组织中mRNA m⁶A去甲基化酶FTO蛋白表达，从而降低小鼠骨骼肌中总mRNA m⁶A修饰水平。

所述的新用途，在高脂饮食情况下增加小鼠骨骼肌中线粒体数量，促进小鼠骨骼肌氧化磷酸化基因表达，减少糖酵解基因表达，促进骨骼肌肌纤维类型向慢肌纤维转换，增加小鼠的运动耐力。

所述DHA在高脂饮食中的添加量为500 mg/kg体重/天。

一种DHA在细胞培养中的新用途，促进C2C12细胞系中m⁶A去甲基化酶FTO表达并降低m⁶A水平。

所述的新用途，增加C2C12细胞中线粒体合成相关基因PGC1α表达和线粒体数量。

所述的新用途，用于促进C2C12细胞中慢肌纤维生成和慢肌纤维基因表达。

所述的新用途， DHA在C2C12细胞培养基中的添加量为5-10 μM。

结合上述的所有技术方案，本发明有益效果为：

二十二碳六烯酸通过下调骨骼肌中的mRNA m⁶A修饰水平，增强动物骨骼肌的线粒体生成，增加线粒体数量，同时促进骨骼肌向慢肌纤维转化。而且，本发明中二十二碳六烯酸不含对动物或人体有害的物质，添加量较少，可以直接加入动物饲料、食品或药品中，具有安全、有效、不会引起毒副作用等优点，在增强骨骼肌运动耐力方面的应用具有良好的推广应用前景。

本发明能够改善动物骨骼肌肉品质，增加其运动能力以及二十二碳六烯酸的应用不足，提供二十二碳六烯酸在改善动物胴体品质上的应用，拓宽二十二碳六烯酸的应用范围的同时，使动物的生产性能显著改善，是一种通过营养调控手段改善动物骨骼肌运动耐力和肉品质的技术，对于动物生产及人体运动健康均具有重要的意义，为二十二碳六烯酸在改善运动能力和动物生产性能方面的应用提供有力的技术理论基础。

研究表明，添加二十二碳六烯酸可以显著提高小鼠运动耐力、骨骼肌线粒体生成，促进骨骼肌肌纤维类型向慢肌纤维转换，具有作为饲料添加剂改善肉品质的应用潜力。

附图说明

图1是DHA对小鼠运动功能的影响。

图2是DHA对小鼠骨骼肌中不同肌纤维类型标志基因表达的影响。

图3是DHA对小鼠骨骼肌中慢肌纤维数量的影响。

图4是DHA对小鼠骨骼肌中线粒体数量的影响。

图5是DHA对小鼠骨骼肌中m⁶A修饰水平的影响。

图6是DHA对小鼠骨骼肌中m⁶A相关蛋白表达的影响。

图7是DHA对C2C12细胞中不同类型肌纤维基因表达的影响。

图8是DHA对C2C12细胞中m⁶A相关蛋白表的影响。

图9是干扰FTO后对成肌细胞中线粒体生成关键转录因子PGC1α蛋白表达的影响。

图10是干扰FTO后对成肌细胞中线粒体数量的影响。

图11是回补DHA对干扰FTO成肌细胞中PGC1α表达的影响。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种二十二碳六烯酸在增强骨骼肌运动耐力中的应用，下面结合实施例和附图对本发明作详细的描述。

本发明提供了二十二碳六烯酸的新用途，二十二碳六烯酸的灌胃量为500 mg/kg体重/天；二十二碳六烯酸可以显著提高骨骼肌中线粒体生成，促进骨骼肌肌纤维类型向慢肌纤维转化，提高骨骼肌的氧化代谢能力，进而增强骨骼肌的运动耐力。肥胖模型（highfat diet，HFD）显示高脂饮食会导致小鼠骨骼肌纤维向快肌纤维转化，在本实验中，肥胖模型和正常饮食模型（normal fat diet，NFD）都用于作为二十二碳六烯酸处理组对照。

实施例1：小鼠每日灌胃500 mg/kg体重的二十二碳六烯酸能增加小鼠运动耐力。

1、为研究二十二碳六烯酸对小鼠骨骼肌运动耐力的影响，试验以8周龄的雄性C57BL/6小鼠为研究对象。

2、实验方法

(1)动物饲养方法：2只/笼；饲养温度与湿度：温度为24±1℃，湿度为40％～70％；采用12h：12h昼夜间断照明；饲养条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。饲养期间动物自由进食饮用水，维持饲料（NFD）和高脂饲料（HFD）皆由江苏省协同生物有限公司提供。对购入的SPF级C57BL/6小鼠预饲1周适应环境。

2)动物分组及处理：将8周龄的小鼠随机分为正常饮食组（NFD）、高脂组（HFD）、高脂+二十二碳六烯酸组（HFD+DHA）共3组，每组8只小鼠。正常饮食组小鼠饲喂正常饲粮，高脂组饲喂60%脂肪供能的高脂饲料用于模拟肌纤维类型向快肌纤维转换模型，高脂+二十二碳六烯酸组在高脂基础下每天灌胃500 mg/kg体重的二十二碳六烯酸，DHA（鱼油提取物，纯度大于80%）由西安拓丰生物科技有限公司提供，实验共进行8周。

3)取样及检测：在步骤(2)实验结束后，采用小鼠跑步机检测小鼠耐力运动能力。然后休息3天，采样之前麻醉小鼠，分离腓肠肌等骨骼肌组织，检测不同组小鼠骨骼肌的代谢基因表达、肌纤维类型和线粒体数量等。

3、结果如图1-4所示：

图1是DHA灌胃对小鼠运动功能的影响：

结果如图1所示，与正常组相比，高脂饲喂能降低小鼠的运动耐力水平，而灌胃DHA能在高脂饮食情况下增加小鼠的运动耐力。

图 2是DHA灌胃对小鼠骨骼肌中不同肌纤维类型标志基因表达的影响：

结果如图2所示，与正常组相比，高脂饲喂能减少小鼠骨骼肌氧化磷酸化基因表达，促进糖酵解基因表达，而灌胃DHA则能在高脂饮食情况下促进小鼠骨骼肌氧化磷酸化基因表达，减少糖酵解基因表达。

图3是DHA灌胃对小鼠骨骼肌肌纤维类型的影响：

结果如图3所示，与正常组相比，高脂饲喂能减少小鼠骨骼肌中慢肌纤维（染色结果未黑色的肌纤维）比例，而灌胃DHA则能在高脂饮食情况下增加小鼠骨骼肌中慢肌纤维比例。

图4是DHA灌胃对小鼠骨骼肌中线粒体数量的影响：

结果如图4所示，与正常组相比，高脂饲喂能减少小鼠骨骼肌中线粒体数量，而灌胃DHA则能增加小鼠骨骼肌中线粒体数量。

实施例2：小鼠每日灌胃500mg/kg体重的DHA对小鼠骨骼肌mRNA m⁶A修饰的影响。

1、为研究DHA对小鼠骨骼肌肌纤维类型的影响，试验以8周龄的雄性C57BL/6小鼠为研究对象。

2、实验方法

(1)动物饲养方法：同实施例1。

(2)动物分组及处理：同实施例1。

(3)取样及检测：步骤(2)试验结束当天，颈椎脱臼人道处死小鼠，采集所有小鼠的腓肠肌，提取总mRNA用于质谱检测mRNA m⁶A水平，提取蛋白进行Western Blot检测m⁶A相关蛋白表达。

3、结果如图5-6所示：

图5是DHA灌胃对小鼠骨骼肌中m⁶A修饰水平的影响。

结果如图5所示，与正常组相比，高脂饲喂能增加小鼠骨骼肌中mRNA m⁶A修饰水平，而灌胃DHA能在高脂饮食情况下降低小鼠骨骼肌中mRNA m⁶A修饰水平。

图6是DHA灌胃对小鼠骨骼肌中m⁶A相关蛋白表达的影响。

结果如图6所示，灌胃DHA能在高脂饮食情况下增加小鼠骨骼肌组织中mRNA m⁶A去甲基化酶FTO蛋白表达。

实施例3：成肌细胞层面验证DHA是否通过mRNA m⁶A修饰调控肌纤维类型转换和线粒体生成。

1、为研究DHA对小鼠骨骼肌肌纤维类型转化的机制，试验以C2C12细胞系为研究对象。

2、实验方法

（1）细胞培养及诱导分化：C2C12成肌细胞由添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的高糖DMEM完全培养基扩增，当细胞密度达到90%密度时，更换培养基为添加2%马牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的高糖DMEM诱导培养基进行诱导分化，DHA添加量是5-10 μM。

（2）细胞转染：使用脂质体转染方法，将合成的siFto的小分子干扰序列导入成肌细胞内。

（3）线粒体染色：将Mito-Tracker Green以0.5μM比例添加进培养基中，37℃孵育30分钟后随后在荧光显微镜下观察线粒体染色。

3、结果如图7-11所示：

图7是DHA对C2C12细胞中不同类型肌纤维基因表达的影响。

结果如图7所示，DHA添加后能促进C2C12细胞中慢肌纤维生成。

图8是DHA对C2C12细胞中m⁶A相关蛋白表达的的影响。

结果如图8所示，DHA添加后能促进m⁶A去甲基化酶FTO表达。

结果如图9所示，干扰FTO后线粒体生成关键转录因子PGC1α蛋白表达显著降低。

图10是干扰FTO后对成肌细胞中线粒体数量的影响。

结果如图10所示，干扰FTO后线粒体数量显著减少。

图11是回补DHA对干扰FTO成肌细胞中PGC1α表达的影响。

结果如图11所示，成肌细胞分化过程中添加5 μM的DHA能促进线粒体生成关键转录因子PGC1α蛋白表达，而同时干扰Fto后，DHA则不能促进线粒体生成关键转录因子PGC1α蛋白表达。

Claims

1.一种DHA作为饲料添加剂的新用途，其特征在于，在高脂饮食中添加DHA增加小鼠骨骼肌组织中mRNA m⁶A去甲基化酶FTO蛋白表达，从而降低小鼠骨骼肌中总mRNA m⁶A修饰水平。

2.根据权利要求1所述的新用途，其特征在于，在高脂饮食情况下增加小鼠骨骼肌中线粒体数量，促进小鼠骨骼肌氧化磷酸化基因表达，减少糖酵解基因表达，促进骨骼肌肌纤维类型向慢肌纤维转换，增加小鼠的运动耐力。

3.根据权利要求1所述的新用途，其特征在于，所述DHA在高脂饮食中的添加量为500mg/kg体重/天。

4.一种DHA在细胞培养中的新用途，其特征在于，促进C2C12细胞系中m⁶A去甲基化酶FTO表达并降低m⁶A修饰水平。

5.根据权利要求4所述的新用途，其特征在于，增加C2C12细胞中线粒体合成关键基因PGC1α表达和线粒体数量。

6.根据权利要求4所述的新用途，其特征在于，用于促进C2C12细胞中慢肌纤维生成和慢肌纤维基因表达。

7.根据权利要求4所述的新用途，其特征在于，DHA在C2C12细胞培养基中的添加量为5-10 μM。