CN109082381B - 裂壶藻及其制剂在提高反刍动物乳汁中dha含量中的应用 - Google Patents

裂壶藻及其制剂在提高反刍动物乳汁中dha含量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了裂壶藻及其制剂在提高反刍动物乳汁中DHA含量中的应用。本发明中的裂壶藻在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13746。利用本发明的裂壶藻制备的裂壶藻粉，可以提高反刍动物乳汁中DHA的含量。这种天然来源的高DHA含量乳汁，有机、安全、稳定、易吸收，可以作为人们摄取天然DHA的更安全有效途径，更能迎合和满足消费者需求，进而使本发明的裂壶藻及裂壶藻粉在普通食品、畜牧养殖领域具有广泛的应用。

Description

裂壶藻及其制剂在提高反刍动物乳汁中DHA含量中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，裂壶藻及其制剂在提高反刍动物乳汁中DHA含量中的应用。
背景技术
DHA(二十二碳六烯酸)属于ω-3系列多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)，是人体细胞膜和神经组织的重要组成物质，具有健脑益智、促进视神经的发育、防治老年痴呆等重要生理功能，在促进婴幼儿生长发育，预防心血管疾病，抑制和治疗某些癌症，保证神经系统正常工作等方面起到重要作用。
随着生活水平和消费水平的提高以及DHA生理功能研究的不断深入，对于不同人群的DHA摄入量问题越来越受到关注。根据中国食品协会完成的《中国人DHA食用情况调查》显示，中国大众每日从食物中直接DHA摄入量仅为约40mg，处于DHA严重“饥饿”状态。从饮食中获取DHA已成为人们的共识，其中以乳制品尤为普遍，富含高品质DHA的牛奶、羊奶等奶制品每年的需求量不断上升，从奶制品中摄取高品质DHA，已经成为一种趋势。
普通牛奶中的DHA含量极低，难以满足人们日常需求，而乳制品外源添加DHA则存在所需材料多，较大消耗企业生产成本，添加过程易造成DHA降价、分解或产生异味等问题。通过适当增加反刍动物日粮中的DHA等多不饱和脂肪酸摄入量，可提高乳汁、肌肉组织中DHA含量，但反刍动物特殊的消化结构使DHA等多不饱和脂肪酸在进入瘤胃后被大部分转化成饱和脂肪酸，极大降低了DHA等多不饱和脂肪酸利用率。市面上的脂肪酸过瘤胃保护技术主要有包被、氢化、钙化等，不仅处理技术难度大，生产成本很高，且存在日粮采食量降低、消化吸收率下降，产生乳脂下降综合征，甚至造成毒副作用等缺陷。因此，如何提高哺乳动物尤其是反刍动物乳汁中DHA的含量以及进一步利用反刍动物机体转化化生产富含DHA天然有机奶是目前急需解决的问题。
另外，通过提高鸡蛋中DHA的含量，不仅可以丰富DHA来源，也极大扩展了DHA的应用领域和消费范围。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高动物产品DHA含量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了裂壶藻(Schizochytrium limacinum)或其制剂在提高动物产品DHA含量中的应用；
所述动物为反刍动物。
所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)可为裂壶藻(Schizochytriumlimacinum)HS01，所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)HS01在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13746。
所述制剂的活性成分可为所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)。
所述动物可为牛。所述牛可为奶牛。所述奶牛可为荷斯坦奶牛。
所述动物产品可为所述动物的乳汁，如牛奶。
所述制剂可为裂壶藻粉。
所述制剂可按照包括如下步骤的方法(将该方法记为裂壶藻制剂的制备方法)制备：培养所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)，得到发酵液；利用所述发酵液制备得到所述制剂。
上述应用中，培养所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)可利用发酵培养基进行，所述发酵培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为葡萄糖60～150g/L、酵母膏8～25g/L、酵母粉3～8g/L、Na2SO4 5～20g/L、KCl 0.5～1.5g/L、MgSO41.0～3.0g/L、K2SO4 0.5～2.5g/L、KH2PO4 1.0～2.0g/L、(NH4)2SO4 2.0～5.0g/L、CaCl2 0.5～2.5g/L、CuSO4 0.001～0.02g/L、ZnSO4 0.001～0.02g/L、生物素0.001～0.06g/L、淀粉0.1～10g/L和蛋白粉0～20g/L，pH为4.5～6.5。
所述淀粉可为玉米淀粉或辛烯基琥珀酸淀粉钠，所述蛋白粉可为豌豆蛋白粉或乳清蛋白粉。所述发酵培养基的pH具体可为6。
所述发酵培养基的溶质及其浓度具体可为如下n1)或n2)或n3)或n4)：
n1)葡萄糖60g/L、酵母膏8g/L、酵母粉3g/L、Na2SO4 5g/L、KCl 0.5g/L、MgSO41.0g/L、K2SO4 0.5g/L、KH2PO4 1.0g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、CaCl2 0.5g/L、CuSO4 0.001g/L、ZnSO4 0.001g/L、生物素0.001g/L和玉米淀粉0.1g/L；
n2)葡萄糖150g/L、酵母膏25g/L、酵母粉8g/L、Na2SO4 20g/L、KCl 1.5g/L、MgSO43.0g/L、K2SO4 2.5g/L、KH2PO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 5.0g/L、CaCl2 2.5g/L、CuSO4 0.02g/L、ZnSO4 0.02g/L、生物素0.06g/L、玉米淀粉10g/L和豌豆蛋白粉20g/L；
n3)葡萄糖60g/L、酵母膏8g/L、酵母粉3g/L、Na2SO4 5g/L、KCl 0.5g/L、MgSO41.0g/L、K2SO4 0.5g/L、KH2PO4 1.0g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、CaCl2 0.5g/L、CuSO4 0.001g/L、ZnSO4 0.001g/L、生物素0.001g/L和辛烯基琥珀酸淀粉钠0.1g/L；
n4)葡萄糖150g/L、酵母膏25g/L、酵母粉8g/L、Na2SO4 20g/L、KCl 1.5g/L、MgSO43.0g/L、K2SO4 2.5g/L、KH2PO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 5.0g/L、CaCl2 2.5g/L、CuSO4 0.02g/L、ZnSO4 0.02g/L、生物素0.06g/L、辛烯基琥珀酸淀粉钠10g/L和乳清蛋白粉20g/L。
上述应用中，所述利用所述发酵液制备得到所述制剂可包括：干燥所述发酵液，得到所述制剂。
上述方法还可包括在得到所述发酵液后向所述发酵液中添加抗氧化剂后再进行干燥得到所述裂壶藻粉。
所述抗氧化剂可为油溶抗氧化剂和/或水溶抗氧化剂。所述油溶抗氧化剂可为迷迭香、天然混合生育酚、茶多酚和/或抗坏血酸棕榈酸酯。所述水溶抗氧化剂可为植酸、抗坏血酸和/或异抗坏血酸。
所述抗氧化剂在由几种不同的具体抗氧化剂组成时，各成分间的配比无要求，可根据具体需要调整。
所述抗氧化剂具体可为由天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸组成的混合抗氧化剂。所述混合抗氧化剂中各物质间的配比可为下述p1)、p2)、p3)或p4)：
p1)天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量比为20:2:10:10:2；
p2)天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量比为40:3:20:20:4；
p3)天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量比为60:2:40:30:6；
p4)天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量比为80:2:40:40:8。
所述干燥可为喷雾干燥或滚筒干燥或冷冻干燥。
上述方法还可包括将所述发酵液中的所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)进行洗涤。上述方法进一步还可包括向洗涤后的裂壶藻(Schizochytrium limacinum)中添加所述抗氧化剂后再进行干燥。
所述培养的溶氧量可为0～80％(如10～80％)。所述培养的温度可为20～30℃。所述培养的时间可为72～120h。
为解决上述技术问题，本发明还提供了提高动物产品DHA含量的方法，所述方法包括：饲喂动物裂壶藻(Schizochytrium limacinum)或其制剂实现提高所述动物产品DHA含量。
所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)可为裂壶藻(Schizochytriumlimacinum)HS01，所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)HS01在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13746。
所述制剂的活性成分可为所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)。
所述动物可为反刍动物。
进一步，所述动物可为牛。所述牛可为奶牛。所述奶牛可为荷斯坦奶牛。
所述动物产品可为所述动物的乳汁，如牛奶。
利用本发明的裂壶藻(Schizochytrium limacinum)制备的裂壶藻粉，可以提高反刍动物乳汁中DHA的含量。这种天然来源的高DHA含量乳汁，有机、安全、稳定、易吸收，可以作为人们摄取天然DHA的更安全有效途径，更能迎合和满足消费者需求，进而使本发明的裂壶藻及裂壶藻粉在普通食品、畜牧养殖领域具有广泛的应用。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：Schizochytrium limacinum
生物材料的菌株编号：HS01
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2017年3月10日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13746
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
筛选液体培养基：将葡萄糖50g和酵母粉15g溶于1L混合液(由1体积份天然海水和1体积蒸馏水混合而成)，pH值自然。
筛选平板：将约55℃的筛选固体培养基倒入培养皿，冷却后得到的固体平板。
发酵培养基：将葡萄糖60g、谷氨酸或谷氨酸钠10g、玉米浆干粉10g、NaSO4 14g、KCl 0.5g、MgSO4 2.0g、K2SO4 1.0g、KH2PO4 1.0g、(NH4)2SO4 1.0g和CaCl2 0.5g溶于1L蒸馏水，调节pH值至6.0。
麦芽汁琼脂培养基：将150g麦芽浸粉溶于1L混合液(由1体积份天然海水和1体积蒸馏水混合而成)，pH值自然；然后加入琼脂粉至其浓度为15g/100mL，得到的培养基。
天然混合生育酚为ADM公司产品，货号为MTS-90；迷迭香为科耐欧贸易(上海)有限公司广州分公司产品，货号为ROSEMARY 41-19-58；茶多酚为福建利康源生物工程有限公司产品，货号为TP-98；异抗坏血酸为郑州拓洋实验有限公司产品，货号为含量≥98％；植酸为莱阳市万基威生物工程有限公司产品。
实施例1、裂殖壶HS01的分离鉴定
一、裂殖壶HS01的分离
1、本申请的发明人从福建省漳州市云霄县红树林多处采集裂殖壶，混合，得到混合液；将0.5mL混合液接种至5mL筛选液体培养基，然后25℃、200rpm/min培养2d，得到培养菌液。
2、将步骤1得到的培养菌液均匀涂布于筛选平板上，25℃静置培养2d，产生单菌落。
3、完成步骤2后，分别挑取单菌落接种至5mL发酵培养基，然后25℃、200rpm/min培养2d，得到培养菌液。
4、取步骤3得到的培养菌液，4℃、2000rpm离心5min，收集菌体。
5、取菌体1.0～2.0g至具塞量筒(规格为100mL)中，先加入15mL浓度为8.3mol/L的HCl水溶液，盖好盖子，置于70～80℃水浴中水解50～60min(期间每10min置于漩涡混合器上振荡具塞量筒1次)；待冷却到室温后，先加入10mL 95％(v/v)乙醇水溶液，充分振摇均匀后，再加入20mL无水乙醚充分振摇萃取1～2min，最后加入20mL石油醚，充分振摇萃取1～2min，静置分层，将上层有机相置于玻璃称量皿(已烘干称过空重)，将该玻璃称量皿置于通风橱中的沸水浴上使有机相充分蒸发干净(务必充分挥发干净)，液相即为油脂。
6、取步骤5提取的油脂，按照GB 26400-2011食品安全国家标准检测DHA含量，按照AOAC996.06的方法检测脂肪酸的组成及含量。
挑选DHA含量较高的菌株，反复纯化24次。将筛选到的一株裂殖壶菌株命名为裂殖壶HS01。
将裂殖壶HS01单克隆接种至发酵培养基连续传代12代并按照上述步骤检测DHA含量。结果表明，裂殖壶HS01生产DHA的稳定性良好。
二、裂殖壶HS01的鉴定
1、形态学鉴定
将裂殖壶HS01接种至麦芽汁琼脂培养基上，25℃暗培养，5d后观察菌落的形态并通过高分辨率透射电镜分析观察菌体的形态特征。
结果表明，裂殖壶HS01的菌落直径为2～4.3mm，白色(后期浅橙色)，边缘不整齐；菌体以裂殖方式进行增殖，细胞壁薄，球形，无色或浅橙色，透明，大小为4.5～15.5μm，游动孢子及外质网未见。
2、18s rDNA序列同源性分析
裂殖壶HS01的18s rDNA的部分序列如序列表中的序列1所示。
裂殖壶HS01的18s rDNA的部分序列如序列表中的序列2所示。
综合上述各个鉴定结果，裂殖壶HS01为裂殖壶(Schizoochytrium limacinum)。
三、裂殖壶HS01的保藏
裂殖壶(Schizoochytrium limacinum)HS01已于2017年03月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13746。
实施例2、裂壶藻粉的制备
利用实施例1的裂壶藻HS01制备裂壶藻粉的步骤如下，实验重复三次，结果取平均值：
一、培养基的制备
摇瓶培养基1由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为60g/L葡萄糖、酵母膏5g/L；摇瓶培养基2由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为150g/L葡萄糖、酵母膏25g/L。
种子培养基1由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为葡萄糖60g/L、酵母膏8g/L、酵母粉3g/L、Na2SO4 5g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4 1.0g/L、K2SO4 0.5g/L、KH2PO41.0g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、CaCl2 0.5g/L、CuSO4 0.001g/L、ZnSO4 0.001g/L，配置完成后利用碱(氢氧化钠溶液或是氨水)调节初始pH6.0；种子培养基2由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为葡萄糖150g/L、酵母膏25g/L、酵母粉8g/L、Na2SO4 20g/L、KCl 1.5g/L、MgSO4 3.0g/L、K2SO4 2.5g/L、KH2PO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 5.0g/L、CaCl2 2.5g/L、CuSO40.02g/L、ZnSO4 0.02g/L，配置完成后利用碱(氢氧化钠溶液或是氨水)调节初始pH6.0。
发酵培养基1由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为葡萄糖60g/L、酵母膏8g/L、酵母粉3g/L、Na2SO4 5g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4 1.0g/L、K2SO4 0.5g/L、KH2PO41.0g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、CaCl2 0.5g/L、CuSO4 0.001g/L、ZnSO4 0.001g/L、生物素0.001g/L、玉米淀粉0.1g/L，配置完成后利用碱(氢氧化钠溶液或是氨水)调节初始pH6.0；发酵培养基2由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为葡萄糖150g/L、酵母膏25g/L、酵母粉8g/L、Na2SO4 20g/L、KCl 1.5g/L、MgSO4 3.0g/L、K2SO4 2.5g/L、KH2PO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 5.0g/L、CaCl2 2.5g/L、CuSO4 0.02g/L、ZnSO4 0.02g/L、生物素0.06g/L、玉米淀粉10g/L、豌豆蛋白粉20g/L，配置完成后利用碱(氢氧化钠溶液或是氨水)调节初始pH6.0；发酵培养基3由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为葡萄糖60g/L、酵母膏8g/L、酵母粉3g/L、Na2SO4 5g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4 1.0g/L、K2SO4 0.5g/L、KH2PO4 1.0g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、CaCl2 0.5g/L、CuSO4 0.001g/L、ZnSO4 0.001g/L、生物素0.001g/L、辛烯基琥珀酸淀粉钠0.1g/L，配置完成后利用碱(氢氧化钠溶液或是氨水)调节初始pH6.0；发酵培养基4由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为葡萄糖150g/L、酵母膏25g/L、酵母粉8g/L、Na2SO4 20g/L、KCl 1.5g/L、MgSO4 3.0g/L、K2SO4 2.5g/L、KH2PO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 5.0g/L、CaCl2 2.5g/L、CuSO4 0.02g/L、ZnSO4 0.02g/L、生物素0.06g/L、辛烯基琥珀酸淀粉钠10g/L、乳清蛋白粉20g/L，配置完成后利用碱(氢氧化钠溶液或是氨水)调节初始pH6.0。
二、裂壶藻粉的制备及指标检测
1、制备
将裂壶藻HS01接种至摇瓶培养基1中，在转速200rpm、温度20℃的条件下培养24h，得到摇瓶培养液1；将摇瓶培养液1接种至种子培养基1中，在溶氧为10～80％(生长过程溶解氧是一个动态过程)、温度20℃的条件下培养48h，在培养过程中保持培养液的pH为4.5～6.5之间，发酵过程pH会下降，通过氨水或是氢氧化钠溶液进行调节，得到种子培养液1；将种子培养液1按照10％的接种量接种至发酵培养基1中，在溶氧10～80％(生长过程溶解氧是一个动态的过程)、温度20℃的条件下培养120h，得到发酵液，将该发酵液记为发酵液1，在培养过程中保持培养液的pH为4.5～6.5之间，发酵过程pH会下降，通过氨水或是氢氧化钠溶液进行调节。
将裂壶藻HS01接种至摇瓶培养基2中，在转速400rpm、温度30℃的条件下培养48h，得到摇瓶培养液2；将摇瓶培养液2接种至种子培养基2中，在溶氧为10～80％、温度30℃的条件下培养24h，在培养过程中保持培养液的pH为4.5～6.5之间，发酵过程pH会下降，通过氨水或是氢氧化钠溶液进行调节，得到种子培养液2；将种子培养液2按照20％的接种量接种至发酵培养基2中，在溶氧10～80％、温度30℃的条件下培养72h，得到发酵液，将该发酵液记为发酵液2，在培养过程中保持培养液的pH为4.5～6.5之间，发酵过程pH会下降，通过氨水或是氢氧化钠溶液进行调节。
将裂壶藻HS01接种至摇瓶培养基1中，在转速200rpm、温度20℃的条件下培养24h，得到摇瓶培养液1；将摇瓶培养液1接种至种子培养基1中，在溶氧为10～80％、温度20℃的条件下培养48h，在培养过程中保持培养液的pH为4.5～6.5之间，发酵过程pH会下降，通过氨水或是氢氧化钠溶液进行调节，得到种子培养液1；将种子培养液1按照10％的接种量接种至发酵培养基3中，在溶氧0～80％、温度20℃的条件下培养120h，得到发酵液，将该发酵液记为发酵液3，在培养过程中保持培养液的pH4.5～6.5之间，发酵过程pH会下降，通过氨水或是氢氧化钠溶液进行调节。
将裂壶藻HS01接种至摇瓶培养基2中，在转速400rpm、温度30℃的条件下培养24h，得到摇瓶培养液2；将摇瓶培养液2接种至种子培养基2中，在溶氧为10～80％、温度30℃的条件下培养24h，在培养过程中保持培养液的pH4.5～6.5之间，发酵过程pH会下降，通过氨水或是氢氧化钠溶液进行调节，得到种子培养液2；将种子培养液2按照20％的接种量接种至发酵培养基4中，在溶氧10～80％、温度30℃的条件下培养72h，得到发酵液，将该发酵液记为发酵液4，在培养过程中保持培养液的pH4.5～6.5之间，发酵过程pH会下降，通过氨水或是氢氧化钠溶液进行调节。
发酵结束后，向发酵液1中添加抗氧化剂1(抗氧化剂1由天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸组成，其中，天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量比为20:2:10:10:2)得到混合液，该混合液中天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量百分比含量分别为0.2％、0.02％、0.1％、0.1％和0.02％，将该混合液经过乳化混匀，获得稳定的发酵液1；将稳定的发酵液1进行巴氏灭菌，然后进行喷雾、滚筒或是冷冻干燥制备获得裂壶藻粉1。
向发酵液2中添加抗氧化剂2(抗氧化剂2由天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸组成，其中，天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量比为40:3:20:20:4)得到混合液，该混合液中天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量百分比含量分别为0.4％、0.03％、0.2％、0.2％和0.04％，将该混合液经过乳化混匀，获得稳定的发酵液2；将稳定的发酵液2进行巴氏灭菌，然后进行喷雾、滚筒或是冷冻干燥制备获得裂壶藻粉2。
将发酵液3经过离心收集裂壶藻细胞泥，按照裂壶藻细胞泥体积加入相同体积的无菌去离子水混匀，然后进行离心，重复清洗2～3次，获得裂壶藻细胞泥；向该裂壶藻细胞泥中添加抗氧化剂3(抗氧化剂3由天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸组成，其中，天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量比为60:2:40:30:6)得到混合物，该混合物中天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量百分比含量分别为0.6％、0.02％、0.4％、0.3％和0.06％，将该混合物经过乳化混匀，获得稳定的细胞泥；将该稳定的细胞泥经过巴氏灭菌，然后进行干燥(喷雾、滚筒或是冷冻干燥，三者选一)制备获得裂壶藻粉，将该裂壶藻粉记为裂壶藻粉3。
将发酵液4经过离心收集裂壶藻细胞泥，按照裂壶藻细胞泥体积加入相同体积的无菌去离子水混匀，然后进行离心，重复清洗2～3次，获得裂壶藻细胞泥；向该裂壶藻细胞泥中添加抗氧化剂4(抗氧化剂4由天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸组成，其中，天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量比为80:2:40:40:8)得到混合物，该混合物中天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量百分比含量分别为0.8％、0.02％、0.4％、0.4％和0.08％，将该混合物经过乳化混匀，获得稳定的细胞泥；将该稳定的细胞泥经过巴氏灭菌，然后进行干燥(喷雾、滚筒或是冷冻干燥，三者选一)制备获得裂壶藻粉，将该裂壶藻粉记为裂壶藻粉4。
2、指标检测
分别检测步骤1得到的裂壶藻粉1-4的蛋白质、水分、脂肪酸、灰分、DHA的含量，具体检测方法如下：
蛋白质的检测：按照GB 5009.9《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行。
水分的检测：按照GB 5009.3《食品安全国家标准食品中水分的测定》进行。
灰分的检测：按照GB 5009.4《食品安全国家标准食品中灰分的测定》进行。
脂肪酸的检测：按照GB 5009.168《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》进行。
DHA的检测：按照GB 26400《食品安全国家标准食品添加剂二十二碳六烯酸油脂(发酵法)》进行。
结果显示，上述步骤中得到的裂壶藻粉中蛋白质的质量含量为10～60％，水分的质量含量为0.5～3.0％，灰分的质量含量为3～12％，脂肪酸的质量含量为25～50％。在脂肪酸中，不饱和脂肪酸DHA的质量含量为10～24％，DPA的质量含量为2.0～6.0％，EPA的质量含量为0.1～0.5％。
表1、裂壶藻粉的指标检测结果
Figure BDA0001618925780000091
注：表1中各指标的含量是指各物质占干粉的质量百分比；其他脂肪酸是指除C8:0辛酸、C10:0葵酸、C16:0棕榈酸、C18:0硬脂酸、C22:5DPA、C20:5EPA和C22:6DHA外的脂肪酸。
三、裂壶藻粉的瘘管实验测试
采用尼龙袋法进行裂壶藻粉1和2的过奶牛瘤胃瘘管实验。其操作步骤如下：
1、试验动物与日粮
装有永久性胃瘘管的奶牛(荷斯坦奶牛)。预饲期7天，在此期间进行驱虫，以1％的敌百虫药液驱除体外寄生虫，口服0.8mg/kg体重的盐酸左旋咪唑驱除体内寄生虫。在营养水平为1.3倍维持需要的条件下饲养，每天两次等量饲喂，07：00和16：00各喂一次，饲后自由饮水。
2、试样的制备
裂壶藻粉采用“四分法”随机采集样本，65℃烘至恒重后，装入磨口瓶备用。
3、尼龙袋的制作
用300目尼龙布，裁成170mm×130mm的长方形，对折后用涤纶线缝双道，制成大小为120mm×80mm的尼龙袋，散边用烙铁烫平。试验前将尼龙袋放入瘤胃平衡72h取出洗净烘干，检查无破损方可使用。
4、试验设计与测定方法
尼龙袋法瘤胃降解按奶牛饲养标准科研协作组等提出的方案进行，试验采用随机单位组设计，每只牛每一时间点设两个重复。
每个尼龙袋装入裂壶藻粉10g左右，试样方差分析差异不显著(P＞0.05)。每2袋牢系在一根30cm长的半聚乙烯管上，于早晨饲后2h将尼龙袋放置在瘤胃腹囊部，管的另一端挂在瘘管盖上。每只牛瘤胃内同时放6根管，共12袋。分别于放袋后0h、2h、4h、6h、12h、24h、36h及48h 8个时间点从每头牛的瘤胃中各取出一根管，用清水洗净，放入洗衣机中漂洗7分钟，至水澄清，然后在65℃下烘至恒重，并称重。
干物质(DM)的测定按GB6435－86方法进行，DHA的测定由厦门汇盛生物有限公司负责。样品某时间点(t)的某养分降解率/％＝(1－残留的某养分质量/放入袋内的某养分总质量)×100％。
结果如表2所示，结果显示裂壶藻粉过奶牛瘤胃的最高降解率为54.7％。
表2、裂壶藻粉的瘘管实验结果
Figure BDA0001618925780000101
Figure BDA0001618925780000111
实施例3、实施例2的裂壶藻粉可以提高牛奶中DHA含量
本实施例通过对奶牛饲喂实施例2的裂壶藻粉，检测牛奶中的DHA含量，确定裂壶藻粉对牛奶中DHA含量的影响，实验重复三次。
一、饲养方法：
选取体重、月龄均无显著差异的健康荷斯坦奶牛60头，随机分为六组，每组10头，即散养实验组1、散养实验组2、散养空白对照组、圈养实验组1、圈养实验组2和圈养空白对照组。
首先对各实验组奶牛进行预饲期养殖(预饲期为15天，根据奶牛的适应情况逐步加大量裂壶藻粉喂养量)；之后的正式喂养期将裂壶藻粉按照一定的添加比例投入饲料中进行搅拌混合，每隔8小时饲喂一次。
散养实验组1和散养实验组2的饲料中添加的裂壶藻粉分别为实施例1的裂壶藻粉1和2，圈养实验组1和圈养实验组2的饲料中添加的裂壶藻粉分别为实施例1的裂壶藻粉1和2，具体饲喂方法如下：
预饲期：实验组饲喂裂壶藻粉的量逐渐增加，具体如下：
预饲期第1和2天裂壶藻粉的饲喂量为50mg/天/头；
预饲期第3和4天裂壶藻粉的饲喂量为75mg/天/头；
预饲期第5和6天裂壶藻粉的饲喂量为100mg/天/头；
预饲期第7和8天裂壶藻粉的饲喂量为125mg/天/头；
预饲期第9和10天裂壶藻粉的饲喂量为150mg/天/头；
预饲期第11和12天裂壶藻粉的饲喂量为200mg/天/头；
预饲期第13、14和15天裂壶藻粉的饲喂量为250mg/天/头。
正式喂养期为裂壶藻粉250mg/天/头。
空白对照组奶牛饲喂的饲料中不添加裂壶藻粉，其余成分与实验组相同，饲喂时间和饲喂量均同实验组。
散养实验组1、散养实验组2和散养空白对照组的奶牛进行散养，散养场地中无奶牛其他可食食物；圈养实验组1、圈养实验组2和圈养空白对照组的奶牛进行圈养，圈中无其他可食食物。
二、牛奶数据检测
DHA奶样采集：采集早中晚三次所有饲喂牛的奶样，混合抽样送检；并根据国标GB5413.27-2010婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定；检测牛奶中的乳脂、乳蛋白、DHA含量指标。
结果(表3)显示，无论是散养还是圈养，实验组牛奶中的乳脂和乳蛋白的含量均同空白对照组无显著差异。而饲料中添加实施例1的裂壶藻粉后，随着饲喂时间的增加，牛奶中的DHA含量逐渐增加，且各实验组牛奶中DHA含量均显著高于对照组，两个对照组牛奶中DHA含量无显著差异。
表3、牛奶DHA含量检测结果(mg/100g牛奶)
Figure BDA0001618925780000121
注：预饲期结束是预饲期第15天，正式期第7、15、30、45、60和75天分别为正式喂养期的第7、15、30、45、60和75天，正式期75天后是指第100天。
实施例4、实施例2的裂壶藻粉可以提高鸡蛋品质及蛋鸡的产蛋性能
本实施例通过对蛋鸡饲喂实施例2的裂壶藻粉，检测裂壶藻粉对蛋鸡产蛋性能及鸡蛋品质的影响。
1、试验动物
随机选取健康体重无显著差异的处于产蛋期的蛋鸡(海兰白鸡)360只，各蛋鸡间的月龄无显著差异，将蛋鸡随机分为4组(对照组，0.5％实验组，1.0％实验组和1.5％实验组)，每组6个平行，每个平行15只。
2、饲养管理
采用3层笼养，持续光照。试验日粮以干粉料形式饲喂，日喂3次，自由采食和饮水，按笼记录每日采食量。实验组蛋鸡基础日粮为玉米-豆粕型日粮，各实验组饲喂添加了实施例2的裂壶藻粉的基础日粮，0.5％实验组的食物中裂壶藻粉1的质量含量为0.5％，1.0％实验组的食物中裂壶藻粉1的质量含量为1.0％，1.5％实验组的食物中裂壶藻粉1的质量含量为1.5％；对照组饲喂基础日粮。将实验组饲喂含有裂壶藻粉的当天记为第1天。每天统计产蛋率，分别在第15天和第25天检测鸡蛋的胆固醇含量(第25天的结果如表4所示)，并计算产蛋率、鸡蛋胆固醇和DHA含量的变化，结果如表5所示。
表4、裂壶藻粉1饲养第25天产蛋率、胆固醇和DHA含量的测定结果
Figure BDA0001618925780000131
Figure BDA0001618925780000141
表5、饲养第15天和第25天产蛋率及鸡蛋营养成分的变化
Figure BDA0001618925780000142
注：表5中，“产蛋率增减”是指与对照组同时期蛋鸡的产蛋率相比的变化量，“胆固醇增减”是指与对照组同时期鸡蛋的胆固醇含量相比的变化量，“+”表示增加，“-”表示减少。
统计第25天的产蛋率、蛋重、采食量、蛋料比，检测鸡蛋脂质含量以及胆固醇含量，结果如表6所示。
表6、饲养不同量裂壶藻粉第25天对蛋鸡生产性能和脂质的影响
Figure BDA0001618925780000143
对各组间各项目(指标)进行显著性分析，其中产蛋率的显著性分析如下：
0.5％组统计量
组别 N 均值 标准差 均值的标准差
对照组 6 91.600 3.4774 1.4196
0.5％组 6 87.617 4.4441 1.8143
0.5％组独立样本检验
Figure BDA0001618925780000151
10％组统计量
组别 N 均值 标准差 均值的标准差
对照 6 91.600 3.4774 1.4196
1.0％组 6 95.600 1.8580 .7585
1.0％组独立样本检验
Figure BDA0001618925780000152
1.5％组统计量
组别 N 均值 标准差 均值的标准差
对照 6 91.600 3.4774 1.4196
1.5％组 6 93.500 2.1392 .8733
1.5％组独立样本检验
Figure BDA0001618925780000153
从显著性分析可以看出，对于产蛋率，第25天0.5％组和1.5％组其产蛋率相对于对照组差异不显著(P＞0.05)，但是1.0％组能够显著提高蛋鸡的产蛋率(P＜0.05)，表明饲喂特定量的裂壶藻粉1可以提高蛋鸡的产蛋率。
蛋鸡饲喂裂壶藻粉1，饲喂第15天DHA含量相对对照组，0.5％组可以提高317.71％，达到150mg/100g；1.0％组可以提高579.48％，达到244mg/100g；而1.5％组可以提高885.79％，达到354mg/100g。饲喂25天后，0.5％组和1.0％组基本维持不变，而1.5％组有稍许下降，但与对照组相比，仍显著增加。表明，饲喂裂壶藻粉1可以提高蛋鸡鸡蛋中DHA含量，且食物中裂壶藻粉1添加量越多，鸡蛋中DHA含量越高。
蛋鸡饲喂裂壶藻粉1，鸡蛋中胆固醇含量均明显下降；鸡蛋胆固醇的含量的下降量与食物中裂壶藻粉1的含量无明显关系，但随饲喂是时间的增加，鸡蛋中胆固醇含量有进一步下降的趋势。表明，饲喂裂壶藻粉1可以降低蛋鸡鸡蛋中胆固醇的含量。
按照上述方法，将上述步骤中的裂壶藻粉1替换为裂壶藻粉2，其他步骤均不变，得到了相同变化趋势的结果，表明，实施例1的裂壶藻粉1和2均具有相同的功能。
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 1
agccatgcat gtgtaagtat aagcgattgt actgtgagac tgcgaacggc tcattatatc 60
agtaataatt tcttcggtag tttcttttat atggatacct gcagtaattc tggaaataat 120
acatgctgta agagccctgt atggggctgc acttattaga ttgaagccga ttttattggt 180
gaatcatgat aattgagcag attgact 207
<210> 2
<211> 239
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
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gagttctgcc tctgtccaaa aattaatcca aacagaaaca tcccatggtt tcatcggacc 60
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ctgatgactt gcgtttacta ggaattcctc gttggagatt aataattgca aaaatctagc 180
cccagcacga tgagcgttcc aaggattagc caggccttcc gaccaagcac tcaattcca 239

Claims (3)

1.裂壶藻(Schizochytrium limacinum)制剂在提高牛乳汁DHA含量中的应用；
所述制剂为裂壶藻粉；所述制剂按照包括如下步骤的方法制备：培养裂壶藻(Schizochytrium limacinum)，得到发酵液，向所述发酵液中添加抗氧化剂后再进行干燥得到所述制剂；
所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)为裂壶藻(Schizochytrium limacinum)HS01，所述裂壶藻(Schizochytrium limacinum)HS01在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13746；
所述抗氧化剂为天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸；所述混合抗氧化剂中各物质间的配比为下述p1)或p2)：
p1)天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量比为20:2:10:10:2；
p2)天然混合生育酚、迷迭香、茶多酚、异抗坏血酸和植酸的质量比为40:3:20:20:4。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：培养裂壶藻(Schizochytrium limacinum)利用发酵培养基进行，所述发酵培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为葡萄糖60～150g/L、酵母膏8～25g/L、酵母粉3～8g/L、Na2SO4 5～20g/L、KCl 0.5～1.5g/L、MgSO4 1.0～3.0g/L、K2SO4 0.5～2.5g/L、KH2PO41.0～2.0g/L、(NH4)2SO4 2.0～5.0g/L、CaCl2 0.5～2.5g/L、CuSO4 0.001～0.02g/L、ZnSO4 0.001～0.02g/L、生物素0.001～0.06g/L、淀粉0.1～10g/L和蛋白粉0～20g/L，pH为4.5～6.5。
3.提高牛乳汁DHA含量的方法，包括：饲喂牛权利要求1中所述裂壶藻(Schizochytriumlimacinum)制剂实现提高所述牛乳汁DHA含量。
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