CN107549456A - 一种改善鹅肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改善鹅肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法，包括混合菌液和复合载体，所述混合菌液为贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌的混合菌液，所述复合载体为沸石粉与砻糠粉的混合物；制备方法包括：将混合菌液先与膨化玉米粉混合，再与复合载体混合。与现有技术相比，该复合益生菌剂应用在鹅饲料添加剂中，具有助消化、软化粪便等功效，可提高鹅的免疫性能和生长性能，尤其适用于肠道功能发育尚不完全的小鹅的喂养，提高雏鹅的健雏率。

Description

一种改善鹅肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种微生物制剂，尤其涉及的是一种改善鹅肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法。

背景技术

近年来，我国畜牧行业水平高速增长，禽畜养殖在我国经济产业中起到重要支撑作用并在国民经济中的占比日益增加。然而一直有一个巨大问题正在困扰着养殖者，如畜禽疾病多，产品质量低下等；与此同时，肉蛋奶食品药物残留引起的食品安全问题威胁着人类健康。随着食品安全问题日益突出，不含抗生素、激素类等添加剂的畜禽肉蛋奶产品逐渐代替了之前的产品，成为人们优先选择的对象。而益生菌恰巧可以解决这些问题，成为研究的热点。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物的统称，具有促进动物肠道和消化系统健康和增强动物免疫力等功效。它们生存在于动物肠道、生殖系统内，能产生有益健康的功效，从而改善宿主的微生态平衡、发挥有益作用。

益生菌的代谢产物能促进动物生长，抑制病害发生。可以提高动物对于饲料的利用水平，提高利用率，从而降低购买饲料的成本；益生菌可以除臭，改善饲养环境；还能够增进动物健康，有效控制预防细菌和寄生虫以及呼吸系统疾病的预防；促进动物快速生长，从而缩短饲养的时间；减少使用抗生素，提高禽肉蛋、绿色禽畜产品的质量。

芽孢杆菌(Bacillus)，细菌的一科，能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌(bacillus)杆菌科的一属细菌。

贝莱斯芽孢杆菌是2005年由Ruiz-Garcia等新命名的芽孢杆菌菌种，是一种革兰氏阳性杆状菌，其内生孢子是椭圆形的，位于非肿胀孢子囊的中间或下位。贝莱斯芽孢杆菌具有十种不同的抗生素合成能力，包括一些聚酮类化合物、脂肽类化合物、多肽类化合物等，是一种具有高效生防性能和植物促生活性的土壤细菌。目前，国内外对贝莱斯芽孢杆菌在生物防治等方面的应用进行了大量的研究，国内也有学者将贝莱斯芽孢杆菌添加进动物饲料中，实验证明贝莱斯芽孢杆菌对动物腹泻起到显著的降低作用。

肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰氏阳性球菌，无芽孢，无鞭毛，是一种需氧或兼性厌氧菌。肠球菌是人类和动物肠道正常菌群的一部分，作为新选育出的菌种，其具有优良的生物学特性，可以在肠道中迅速形成优势菌群，通过生物夺氧、生物拮抗，增加有益菌数量，抑制有害微生物的繁殖，增强机体免疫功能，促进营养物质的消化吸收，达到提高生长性能，促进动物健康生长的目的。肠杆菌除了能够加速奶酪的发酵过程，还具有水解蛋白和脂类产生特殊口感和芳香味的能力，成为奶酪制作的重要菌种。在动物饲料中添加肠杆菌，能明显降低仔猪腹泻率，增加动物生产性能，提高血清总蛋白、钙、血红蛋白、红细胞浓度及颗粒细胞吞噬指数，降低仔猪粪便中大肠杆菌的数量等，且效果优于抗生素。此外，肠球菌作为微生物制剂的应用主要集中在粪肠球菌和屎肠球菌，可用于治疗腹泻、肠炎等多种肠道疾病。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种改善鹅肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法，以提供一种新的鹅饲料添加剂，改善鹅生长发育状况。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种改善鹅肠道功能的复合益生菌剂，所述复合益生菌剂由混合菌液和复合载体组成，其中，所述混合菌液为由5.5-7.6×10¹³CFU/m L贝莱斯芽孢杆菌和6.1-8.6×10¹³CFU/m L肠球菌按照体积比2-3：1混合所得，所述复合载体为由沸石粉与砻糠粉按照质量比4：1混合所得。

本发明还提供了上述改善鹅肠道功能的复合益生菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别将贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌种子菌液接种在LB液体培养基中，在37℃、120r/min条件下进行扩大培养并调节至贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌的浓度分别为5.5-7.6×10¹³CFU/m L、6.1-8.6×10¹³CFU/m L；将经过扩大培养的贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌菌液按照体积比2-3：1混合制成混合菌液；

(2)将沸石粉和砻糠粉按照质量比为4：1混合，获得复合载体；

(3)先将步骤(1)的混合菌液与膨化玉米粉混合，再将含菌的膨化玉米粉与复合载体混合，获得所述复合益生菌剂。

进一步地，所述步骤(3)中，每1.0kg的膨化玉米粉中加入100ml混合菌液。

进一步地，所述步骤(3)中，含菌的膨化玉米粉与复合载体的用量的质量比为1：100。

本发明的原理为：本发明首次发现贝莱斯芽孢杆菌作为鹅饲料添加剂时能够提高鹅的抗病性、改善鹅肠道消化功能，尤其对肠道功能尚未发育完全的雏鹅效果显著。但是，单独添加贝莱斯芽孢杆菌时，会引起鹅粪便固化。本发明将贝莱斯芽孢杆菌与肠球菌配合使用，利用肠球菌软化粪便的功能，将两者有机结合，同时，配合载体保持益生菌菌体活性，制备获得改善鹅肠道功能的复合益生菌剂，以提高鹅生产性能。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种改善鹅肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法，该复合益生菌剂应用在鹅饲料添加剂中，具有助消化、软化粪便等功效，可提高鹅的免疫性能和生长性能，尤其适用于肠道功能发育尚不完全的小鹅的喂养，提高雏鹅的健雏率。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1制备混合菌液

称取25克LB培养基，溶解1000m L自来水中，充分混匀，均分两份，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，接种5m L贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌种子菌液，在37℃、120r/min条件下进行扩大培养,调节至贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌的浓度分别为5.5-7.6×10¹³CFU/m L、6.1-8.6×10¹³CFU/m L。

LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g。

将经过扩大培养的贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌菌液按照体积比2-3：1混合制成混合菌液。

2.2制备复合载体

将沸石粉和砻糠粉按照质量比为4：1混合，获得复合载体。

2.3制备复合益生菌剂

取100ml混合菌液，加入1.0kg的膨化玉米粉中，搅拌混合均匀，再将所有的混有菌液的膨化玉米粉加入100kg的复合载体中，搅拌混合均匀，获得所述复合益生菌剂。

2.4益生菌剂耐受性鉴定

2.4.1人工胃液耐受性

将步骤2.1的混合菌液和步骤2.3的复合益生菌剂分别接入pH为2、3、4的人工胃液中，37℃、140r/min摇床摇动，在0h、2h、4h、6h时分别取样，测量活菌数，计算存活率。

人工胃液：取质量分数为10％的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为2、3、4，每100mL溶液中加1g胃蛋白酶，充分溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

2.4.2胆盐耐受性

将步骤2.1的混合菌液和步骤2.3的复合益生菌剂分别接入到含禽胆盐分别为0.1％、0.3％、0.5％的人工肠液中，37℃,140r/min摇床摇动,在0h、2h、4h、8h时分别取样,测量活菌数,计算存活率。

人工肠液:取KH₂PO₄ 6.8g，加蒸馏水500mL溶解，用0.4％(w/v)的NaOH溶液调节pH值至6.8，加水至1000mL，每100mL溶液中加入1g胰蛋白酶，充分溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。用时每100mL加入质量浓度为10％的禽胆盐溶液1mL、3mL、5mL即为含禽胆盐0.1％、0.3％、0.5％的人工肠液。

2.4.3耐受性检测结果及结论

结果如下表1-2所示

表1：人工胃液耐受性鉴定结果

表2：胆盐耐受性鉴定结果

表1-2可以看出，利用本发明制备获得的复合益生菌剂因为有载体和膨化玉米粉的保护，其耐受性大大提高，说明载体可保持益生菌菌体活性，提高了益生菌的有效利用效率。

2.5益生菌剂对鹅营养物质代谢的影响

2.5.1饲养管理

试验开始前对圈舍进行消毒并进行隔离分区，饲养种鹅采取平养方式，选取1日龄的雏鹅，随机分为4组，不分公母，每组各20只，进行为期42天的饲养试验。试验期间让种鹅自由活动、自由取食、自由饮水，其他方式均以种鹅饲养基地日常习惯保持不变。保持日常光照时间，按常规程序进行防疫及消毒措施。饲喂期间每日观察鹅群健康情况、吃料、饮水、运动及病亡率。

CK组：空白对照组，不添加任何菌剂，只饲喂全价饲料；

Ⅰ组：添加贝莱斯芽孢杆菌，使饲料中的活菌含量为1×10⁷CFU/g；

Ⅱ组：添加肠球菌，使饲料中的活菌含量为1×10⁷CFU/g；

Ⅲ组：添加复合益生菌剂，使饲料中的活菌含量为1×10⁷CFU/g。

2.5.2益生菌对鹅粪便及其营养物质残留量的影响

试验期每晚清除剩余饲料，在每个试验组的笼下放置洁净的瓷盘，在第3、7、14、21、28、35、42天清晨收集粪便，按组混合均匀，每组取二份，其中：一份50g/组鲜粪，置于烧杯中，加入5mL质量浓度为10％的硫酸搅拌均匀(进行固氮)，放于65～70℃的烘箱中烘干，供用于粗蛋白含量测定；另一份200g/组鲜粪置于65～70℃烘箱中烘干用于测定粪样中的钙、磷的百分含量。

粗蛋白含量测定依据GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白测定方法进行检测；

磷含量的测定依据GB/T 6437-2002饲料中总磷的测定(分光光度法)；

钙含量的测定依据GB/T 6436-2002饲料中钙的测定。

在试验的第3、7、14、21、28、35、42天全天观察鹅的排便状态，标记方法为：10％及以上大便发生干结的记为“++”，正常记为“+”，10％以上大便过稀(腹泻)记为“-”。

2.5.4结果与结论

结果如下表3所示

表3：益生菌对鹅粪便及其营养物质残留量的影响结果

表3中可以看出，无论是贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌单独添加，还是添加所述复合益生菌剂，各类营养物质在粪便中的残留相比对照都有一定减少，说明贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌均有促进营养物质分解、促进吸收的作用。但单独添加贝莱斯芽孢杆菌时，鹅粪便出现干结固化的情况，这对肠道功能尚未发育完全的雏鹅的肠道带来了一定的不利影响。而贝莱斯芽孢杆菌与肠球菌和阴沟肠杆菌配合后，该现象被显著缓解，且相比较单独添加，其营养物质在粪便中的残留更少，说明两者结合，可进一步促进营养物质的分解和吸收。

2.6益生菌剂对鹅免疫性能的影响

家禽免疫器官中评价家禽免疫力的重要指标是法氏囊、脾和胸腺等的重量，家禽机体内产生抗体的主要器官为脾脏；机体中用来诱导B细胞分化和成熟的场所则是法氏囊，经法氏囊诱导分化和成熟后的B细胞经过淋巴血液循环到外周淋巴器官并参与体液免疫；而胸腺则是对T细胞的成熟和分化起着决定性的作用，它对诱导T细胞成熟起着决定性的作用。而免疫器官指数的提高就意味着机体的免疫系统成熟速度较快。

2.6.1饲养管理

同上述步骤2.5.1的饲养管理和分组方法。

2.6.2免疫器官指数的测定

试验第21天和42天清晨，每组随机抽取三只鹅(体重相近，以减少个体差异)屠宰，分别采摘脾脏、两侧胸腺、法氏囊，将血液清除干净，剔除脂肪后精密称量鲜重，以免疫器官的克数占千克体重的份额(g/Kg)表示免疫器官指数。

计算公式：免疫器官指数(g/Kg)＝免疫器官鲜重/宰前空腹活重

2.6.3结果与结论

结果如下表4所示：

表4：益生菌剂对鹅免疫性能的影响结果

表4中可以看出，贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌均具有免疫调节作用，两者可促进动物免疫器官的生长发育，提高鹅的免疫器官指数，而贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌配合使用，免疫促进效果更加显著。

2.7益生菌剂对鹅生长性能的影响

2.7.1饲养管理

同上述步骤2.5.1的饲养管理和分组方法。

2.7.2鹅死亡情况

全程试验中，除了组Ⅰ有1只鹅死亡外，其余组无死亡病例。

2.7.3平均日增重

试验第1、21、42天清晨，对各组进行称重(g)，取平均值。

平均日增重＝(阶段末重-阶段初重)/阶段天数

结果如下表5所示：

表5：益生菌剂对鹅平均日增重的影响结果

表5中可以看出，添加益生菌的组与对照组相比，平均日增重显著升高。而添加复合益生菌剂的组Ⅲ升高幅度最大，说明本发明的复合益生菌剂对鹅生长性能具有显著提高。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

Claims (4)

1.根据权利要求1所述的一种改善鹅肠道功能的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂由混合菌液和复合载体组成，其中，所述混合菌液为5.5-7.6×10¹³ CFU/m L贝莱斯芽孢杆菌和6.1-8.6×10¹³ CFU/m L肠球菌按照体积比2-3：1混合所得，所述复合载体为由沸石粉与砻糠粉按照质量比4：1混合所得。

2.一种如权利要求1所述的改善鹅肠道功能的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分别将贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌种子菌液接种在LB液体培养基中，在37℃、120r/min条件下进行扩大培养并调节至贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌的浓度分别为5.5-7.6×10¹³CFU/m L、6.1-8.6×10¹³ CFU/m L；将经过扩大培养的贝莱斯芽孢杆菌和肠球菌菌液按照体积比2-3：1混合制成混合菌液；

（2）将沸石粉和砻糠粉按照质量比为4：1混合，获得复合载体；

（3）先将步骤（1）的混合菌液与膨化玉米粉混合，再将含菌的膨化玉米粉与复合载体混合，获得所述复合益生菌剂。

3.根据权利要求2所述的一种改善鹅肠道功能的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，每1.0kg的膨化玉米粉中加入100ml混合菌液。

4.根据权利要求2所述的一种改善鹅肠道功能的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，含菌的膨化玉米粉与复合载体的用量的质量比为1：100。