CN107746818B - 一种改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法，包括混合菌液和复合载体，所述混合菌液为贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌和阴沟肠杆菌的混合菌液，所述复合载体为沸石粉与乳清粉的混合物；制备方法包括：将混合菌液先与膨化玉米粉混合，再与复合载体混合。与现有技术相比，该复合益生菌剂尤其适用于肠道功能发育尚不完全仔猪，将其应用在仔猪饲料添加剂中，具有助消化、软化粪便等功效，可提高仔猪的免疫性能和生长性能。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种微生物制剂，尤其涉及的是一种改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法。
背景技术
近年来，我国畜牧行业水平高速增长，禽畜养殖在我国经济产业中起到重要支撑作用并在国民经济中的占比日益增加。然而一直有一个巨大问题正在困扰着养殖者，如畜禽疾病多，产品质量低下等；与此同时，肉蛋奶食品药物残留引起的食品安全问题威胁着人类健康。随着食品安全问题日益突出，不含抗生素、激素类等添加剂的畜禽肉蛋奶产品逐渐代替了之前的产品，成为人们优先选择的对象。而益生菌恰巧可以解决这些问题，成为研究的热点。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物的统称，具有促进动物肠道和消化系统健康和增强动物免疫力等功效。它们生存在于动物肠道、生殖系统内，能产生有益健康的功效，从而改善宿主的微生态平衡、发挥有益作用。
益生菌的代谢产物能促进动物生长，抑制病害发生。可以提高动物对于饲料的利用水平，提高利用率，从而降低购买饲料的成本；益生菌可以除臭，改善饲养环境；还能够增进动物健康，有效控制预防细菌和寄生虫以及呼吸系统疾病的预防；促进动物快速生长，从而缩短饲养的时间；减少使用抗生素，提高禽肉蛋、绿色禽畜产品的质量。
仔猪通常也被人们广泛叫做小仔猪，通常是指在出生到生长到30公斤范围内的仔猪。仔猪通常从出生到成年仔猪这段期间生长发育特别的快，在出生后的苗仔猪期间免疫力较为弱，肠道对于饲料中的营养反应极为敏感。因此，开发一种适合仔猪肠道的益生菌剂，能够有效帮助仔猪出生后对于营养需求的提高，对于仔猪存活率及出栏率有重要意义。
芽孢杆菌(Bacillus)，细菌的一科，能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌(bacillus)为杆菌科的一属细菌。
贝莱斯芽孢杆菌是2005年由Ruiz-Garcia等新命名的芽孢杆菌菌种，是一种革兰氏阳性杆状菌，其内生孢子是椭圆形的，位于非肿胀孢子囊的中间或下位。贝莱斯芽孢杆菌具有十种不同的抗生素合成能力，包括一些聚酮类化合物、脂肽类化合物、多肽类化合物等，是一种具有高效生防性能和植物促生活性的土壤细菌。目前，国内外对贝莱斯芽孢杆菌在生物防治等方面的应用进行了大量的研究，国内也有学者将贝莱斯芽孢杆菌添加进动物饲料中，实验证明贝莱斯芽孢杆菌对动物腹泻起到显著的降低作用。
肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰氏阳性球菌，无芽孢，无鞭毛，是一种需氧或兼性厌氧菌。肠球菌是人类和动物肠道正常菌群的一部分，作为新选育出的菌种，其具有优良的生物学特性，可以在肠道中迅速形成优势菌群，通过生物夺氧、生物拮抗，增加有益菌数量，抑制有害微生物的繁殖，增强机体免疫功能，促进营养物质的消化吸收，达到提高生长性能，促进动物健康生长的目的。肠杆菌除了能够加速奶酪的发酵过程，还具有水解蛋白和脂类产生特殊口感和芳香味的能力，成为奶酪制作的重要菌种。在动物饲料中添加肠杆菌，能明显降低仔猪腹泻率，增加动物生产性能，提高血清总蛋白、钙、血红蛋白、红细胞浓度及颗粒细胞吞噬指数，降低仔猪粪便中大肠杆菌的数量等，且效果优于抗生素。此外，肠球菌作为微生物制剂的应用主要集中在粪肠球菌和屎肠球菌，可用于治疗腹泻、肠炎等多种肠道疾病。
阴沟肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，在自然界中分布广泛。有周身鞭毛、无芽孢，兼性厌氧，无荚膜。阴沟肠杆菌在蔗糖、离子为CuCl2(10mmol.L-1)、乐果浓度100mg.L-1、培养时间36h、培养温度30℃、pH值8、氮源(酵母3g.L-1)条件下,对乐果农药的降解率可达到58.90％。氯氟氰菊酯是一种仿生物农药，在35℃、pH值7.5时，阴沟肠杆菌对其有最大降解活性，降解产物是α-氰基-3-苯氧基苄醇和2,2-二甲基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)环丙烷羧酸。阴沟肠杆菌可产生一种中性蔗糖酶--β-呋喃果糖苷酶，该酶只有水解功能而没有转糖基功能，可水解棉子糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和水苏糖。在pH＝6～8的范围内，阴沟肠杆菌btex－4可以正常生长并在72h内将底物全部降解。同时可以降解 25-200mg/L的BTEX。在污水中含有较多的BTEX，故可将阴沟肠杆菌用于污水处理。阴沟肠杆菌的Cel8A基因可合成一种具有β-1，4-内切葡聚糖酶活性的内切去纤维素酶，在 pH＝7,40℃条件下可高效水解纤维素。阴沟肠杆菌还具有高固氮活性，可做为水稻等植物的固氮共生菌。其还能合成铁氢酶，有明显的产氢活性，可利用多种碳源产氢，为微生物制氢提供新方向。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法，以提供一种新的尤其适合仔猪肠道的饲料添加剂，改善仔猪生长发育状况。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂，所述复合益生菌剂由混合菌液和复合载体组成，其中，所述混合菌液为6.5-8.3×1013CFU/m L贝莱斯芽孢杆菌、3.5-6.6× 1012CFU/m L肠球菌、5.1-7.6×1012CFU/mL枯草芽孢杆菌和5.5-6.8×1012CFU/ml的阴沟肠杆菌按照体积比3:1:1混合所得，所述载体为沸石粉与乳清粉按照质量比4-5:1混合所得。
本发明还提供了上述改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别将贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌和阴沟肠杆菌种子菌液接种在LB 液体培养基中，在37℃、120r/min条件下进行扩大培养并调节至贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌和阴沟肠杆菌的浓度分别为6.5-8.3×1013CFU/mL、3.5-6.6×1012CFU/mL、 5.1-7.6×1012CFU/mL和5.5-6.8×1012CFU/ml；将经过扩大培养的贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌和阴沟肠杆菌菌液按照体积比3:1:3:1混合，制成混合菌液；
(2)将沸石粉和乳清粉按照质量比为4-5:1混合，获得复合载体；
(3)先将步骤(1)的混合菌液与膨化玉米粉混合，再将含菌的膨化玉米粉与复合载体混合，获得所述复合益生菌剂。
进一步地，所述步骤(3)中，每1.0kg的膨化玉米粉中混合菌液的加入量为100ml。
进一步地，所述步骤(3)中，含菌的膨化玉米粉与复合载体的用量的质量比为1：100。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂及其制备方法，该复合益生菌剂应用在仔猪饲料添加剂中，具有助消化、软化粪便等功效，可提高仔猪的免疫性能和生长性能。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1制备混合菌液
称取50克LB培养基，溶解2000m L自来水中，充分混匀，均分四份，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，接种5m L贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌和阴沟肠杆菌种子菌液，在37℃、120r/min条件下进行扩大培养，调节至贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌和阴沟肠杆菌的浓度分别为6.5-8.3×1013CFU/mL、3.5-6.6×1012CFU/mL、5.1-7.6×1012CFU/mL和5.5-6.8×1012CFU/ml。
LB培养基的配方为：胰蛋白胨20g、酵母提取物10g、NaCl 20g。
将经过扩大培养的贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌和阴沟肠杆菌菌液按照体积比3:1:3:1混合，制成混合菌液。
2.2制备复合载体
将沸石粉和乳清粉按照质量比为4：1混合，获得复合载体。
2.3制备复合益生菌剂
取100ml混合菌液，加入1.0kg的膨化玉米粉中，搅拌混合均匀，再将所有的混有菌液的膨化玉米粉加入100kg的复合载体中，搅拌混合均匀，获得所述复合益生菌剂。
2.4益生菌剂耐受性鉴定
2.4.1人工胃液耐受性
将步骤2.1的混合菌液和步骤2.3的复合益生菌剂分别接入pH为2、3、4的人工胃液中， 37℃、140r/min摇床摇动，在0h、2h、4h、6h时分别取样，测量活菌数，计算存活率。
人工胃液：取质量分数为10％的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为2、3、4，每100mL溶液中加1g胃蛋白酶，充分溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
2.4.2胆盐耐受性
将步骤2.1的混合菌液和步骤2.3的复合益生菌剂分别接入到含禽胆盐分别为0.1％、 0.3％、0.5％的人工肠液中，37℃,140r/min摇床摇动,在0h、2h、4h、8h时分别取样,测量活菌数,计算存活率。
人工肠液:取KH2PO4 6.8g，加蒸馏水500mL溶解，用0.4％(w/v)的NaOH溶液调节pH值至6.8，加水至1000mL，每100mL溶液中加入1g胰蛋白酶，充分溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。用时每100mL加入质量浓度为10％的禽胆盐溶液1mL、3mL、5mL即为含禽胆盐0.1％、0.3％、0.5％的人工肠液。
2.4.3耐受性检测结果及结论
结果如下表1-2所示
表1：人工胃液耐受性鉴定结果
表2：胆盐耐受性鉴定结果
表1-2可以看出，利用本发明制备获得的复合益生菌剂因为有载体和膨化玉米粉的保护，其耐受性大大提高，说明载体可保持益生菌菌体活性，提高了益生菌的有效利用效率。
2.5益生菌剂对仔猪营养物质代谢的影响
2.5.1饲养管理
试验开始前对圈舍进行消毒并进行隔离分区，选取刚出生的小猪，随机分成4组，不分公母，每组5只，进行为期60天的饲养试验，期间让仔猪以饲养基地日常习惯进行管理。保持日常光照时间，按规定程序进行防疫及消毒，若出现病猪，统计病猪头数，并进行单独隔离饲养。
CK组：空白对照组，不添加任何菌剂，前20天以母猪奶水为主，以后逐渐过渡到饲喂全价饲料；
Ⅰ组：在CK组饲养管理的基础上添加贝莱斯芽孢杆菌，使每日饲料中的活菌含量为5×108CFU/g；
Ⅱ组：在CK组饲养管理的基础上添加复合益生菌剂，使每日饲料中的活菌含量为5×108CFU/g。
2.5.2益生菌对仔猪粪便及其营养物质残留量的影响
试验期每晚清除剩余饲料，在第7、14、21、30、37、44、51、60天清晨收集粪便，按组混合均匀，每组取二份，其中：一份50g/组鲜粪，置于烧杯中，加入5mL质量浓度为10％的硫酸搅拌均匀(进行固氮)，放于65～70℃的烘箱中烘干，供用于粗蛋白含量测定；另一份200g/组鲜粪置于65～70℃烘箱中烘干用于测定粪样中的钙、磷的百分含量。
粗蛋白含量测定依据GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白测定方法进行检测；
磷含量的测定依据GB/T 6437-2002饲料中总磷的测定(分光光度法)；
钙含量的测定依据GB/T 6436-2002饲料中钙的测定。
在试验的第7、14、21、30、37、44、51、60天全天观察仔猪的排便状态，并观察排便状态，标记方法为：5％或以上的粪便干结记为“++”，正常记为“+”，5％或以上的粪便过稀(腹泻)记为“-”。
2.5.4结果与结论
结果如下表4所示
表4：益生菌对仔猪粪便及其营养物质残留量的影响结果
表4中可以看出，无论是单独添加贝莱斯芽孢杆菌，还是添加所述复合益生菌剂，各类营养物质在粪便中的残留相比对照都有一定幅度减少，说明贝莱斯芽孢杆菌有促进营养物质分解、促进吸收的作用。但单独添加贝莱斯芽孢杆菌时，仔猪粪便出现干结固化的情况，这对肠道功能尚未发育完全的仔猪的肠道带来了一定的不利影响。而贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌与阴沟肠杆菌配合后，由于肠球菌具有软化粪便的作用，贝莱斯芽孢杆菌固化粪便的现象显著缓解，且相比较单独添加贝莱斯芽孢杆菌，其营养物质在粪便中的残留更少，说明本发明所述的复合益生菌剂可进一步促进营养物质的分解和吸收。
2.6益生菌剂对仔猪免疫性能的影响
2.6.1饲养管理
同上述步骤2.5.1的饲养管理和分组方法。
2.6.2仔猪患病情况
全程试验中，除了CK组出现两头病猪，其它无病猪或死亡病例，说明相比较对照组，添加益生菌组对仔猪的免疫能力具有一定的提高。
2.6.3平均日增重
试验第1、30、60天清晨，对各组仔猪进行称重(kg)，取平均值。
平均日增重＝(阶段末重-阶段初重)/阶段天数
结果如下表5所示：
表5：益生菌剂对仔猪平均日增重的影响结果
表5中可以看出，添加益生菌的组Ⅰ、Ⅱ与对照组相比，平均日增重显著升高。而添加复合益生菌剂的组Ⅱ升高幅度最大，说明本发明的复合益生菌剂对乳猪生长性能具有显著提高。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
Claims (4)
1.一种改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂由混合菌液和复合载体组成，其中，所述混合菌液为6.5-8.3×1013 CFU/m L贝莱斯芽孢杆菌、3.5-6.6×1012 CFU/mL肠球菌、5.1-7.6×1012 CFU/mL枯草芽孢杆菌和5.5-6.8×1012CFU/mL 的阴沟肠杆菌按照体积比3:1:3:1混合所得，所述载体为沸石粉与乳清粉按照质量比为4-5:1混合所得。
2.一种如权利要求1所述的改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分别将贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌和阴沟肠杆菌种子菌液接种在LB液体培养基中，在37℃、120r/min条件下进行扩大培养并调节至贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌和阴沟肠杆菌的浓度分别为6.5-8.3×1013 CFU/mL、3.5-6.6×1012 CFU/mL、5.1-7.6×1012 CFU/mL和5.5-6.8×1012CFU/mL ；将经过扩大培养的贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌、枯草芽孢杆菌和阴沟肠杆菌菌液按照体积比3:1:3:1混合，制成混合菌液；
（2）将沸石粉和乳清粉按照质量比为4-5:1混合，获得复合载体；
（3）先将步骤（1）的混合菌液与膨化玉米粉混合，再将含菌的膨化玉米粉与复合载体混合，获得所述复合益生菌剂。
3.根据权利要求2所述的一种改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，每1.0kg的膨化玉米粉中混合菌液的加入量为100ml。
4.根据权利要求2所述的一种改善仔猪肠道功能的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，含菌的膨化玉米粉与复合载体的用量的质量比为1：100。
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