CN101519676A - 用裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸的方法 - Google Patents

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Abstract

利用裂殖壶菌(Schizochytrium)工业化发酵生产含甘油三酯型二十二碳六烯酸油脂的方法，包括：以裂殖壶菌为菌种，采用具有微量元素的培养基，经发酵制得二十二碳六烯酸油脂；所述具有微量元素的培养基包含碳源、氮源、无机盐和微量元素，所述微量元素包括生物素、叶绿素、β－胡萝卜素、维生素B1、维生素B6和维生素B12中的至少一种。本发明制得的二十二碳六烯酸油脂不需要进一步的化学改性即可直接用于为需要DHA的人群，包括婴幼儿、孕妇或哺乳期妇女，或是表现出DHA不足性疾病的人提供补充DHA。本发明DHA产量高、纯度高，质量安全可靠，生产成本低，生产稳定，并且基本不含EPA；能够低成本、大量生产绿色、安全的高含量的甘油三酯型DHA油脂。

Description

用裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵生产方法，具体涉及利用裂殖壶菌菌株发酵生产甘油三酯型二十二碳六烯酸。
背景技术
二十二碳六烯酸(cis-4，7，10，13，16，19-docosahexaenoic acid，简称DHA)是欧米嘎3系列长链多不饱和脂肪酸，是大脑、视网膜的重要结构物质，还能够调节中枢神经系统功能、预防和治疗心血管疾病、消除炎症、抑制癌症。
DHA的商业来源目前主要是鱼油和微藻。鱼油的产量和DHA含量都不稳定，提取物夹杂鱼腥味，而且从鱼油中提取的含DHA混合油脂中还含有二十碳五烯酸(EPA)，据研究，EPA对婴幼儿的发育具有不利的影响。目前的海洋渔业资源接近枯竭，从鱼油中提取DHA造成极大的浪费。微澡的培养需要光照和二氧化碳，生产工艺繁杂，成本较高。随着人口的增加，以及人们对健康的迫切需求，全世界对DHA的需求量相应增加，需要寻求大量的DHA新来源，而且最好是此来源的DHA不含有EPA。
破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)是一类类似于微藻但缺乏叶绿体故而不行光合作用的专性海生真核微生物，嗜腐败，广泛存在于有机溶解物多和盐度高的环境中。破囊壶菌科属管毛生物界(Stramenopila)、不等毛门(Heterokonta)、网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)、破囊壶菌目(Thraustochytriales)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)。
授权公告号为CN 1264967C的专利公开了一种以裂殖壶菌SR21的菌株为出发菌株，通过化学和物理诱变相结合而得到的一株突变株OUC88，在优化培养条件下，DHA产量达到8.27g/1，菌体中DHA的百分含量为18-35％。虽然其经诱变获得的裂殖壶菌菌株在DHA产量上比之前的研究提高了一倍，但因其所发明的方法为生产可食用或药用的产品，其利用诱变得到的菌株存在未知的安全性问题，并且，经诱变得到的菌株，其本质是为发生了变异的菌株，其具有回复突变的特点，这也使其在工业化大生产中存在着生产难以稳定的缺陷。
公开号为CN 1916156A的专利公开了一种采用松树花粉垂钓法分离得到的裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU47711(其保藏编号为CGMCC No.1730)在优化的培养条件下培养5天，DHA生产率最高为2.76克/(升.天)。虽然其DHA生产较之以前的研究有了较大的提高，但对于进行工业化大生产，大大降低其生产成本，降低其市场价格，使其在普通消费者中能够得到大力推广和普及使用的要求还是远远不够的。
因此，需要寻找一种利用裂殖壶菌(Schizochytrium)原始菌株为菌种，经优化的生产工艺和或生产培养基配方，能够大量生产绿色、安全的含高含量甘油三酯型DHA油脂的方法，从而可以达到较大幅度的降低DHA生产成本，进而降低含DHA终端产品价格，降低DHA的使用门槛，使其在普通大众消费者中能够得到大力的推广和普及使用。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种利用裂殖壶菌(Schizochytrium)原始菌株为菌种，工业化发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，该方法能够低成本、大量生产绿色、安全的高含量的甘油三酯型DHA油脂。
本发明提供的技术方案是：利用裂殖壶菌(Schizochytrium)工业化发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，包括：以裂殖壶菌为菌种，采用具有微量元素的培养基，经发酵制得二十二碳六烯酸油脂，其中二十碳五烯酸含量在1％以下；所述具有微量元素的培养基包含碳源、氮源和微量元素，所述微量元素包括生物素、叶绿素、β一胡萝卜素、维生素B1、维生素B6和维生素B12中的至少一种。
所添加的微量元素为生物素、叶绿素、β一胡萝卜素、维生素B1、维生素B6和维生素B12中的一种或几种，当为其中一种时，添加量为培养基重量的0.002—0.01％；当为其中几种时，任意一种组分的添加量为培养基重量的0.002—0.01％。
所述菌种为经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养得到的裂殖壶菌；或为经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养得到得裂殖壶菌和二级扩大培养后得到的裂殖壶菌。
在发酵培养40—60h时添加发酵液体积0.1—0.3％的柠檬酸。
在发酵培养60—80h时，添加发酵液体积0.1-1.0％的乙醇。
上述碳源包括葡萄糖、糖蜜、玉米糖浆或其他用于发酵的常规碳源中的至少一种；氮源包括大豆粉、植物蛋白水解物、玉米浆、谷氨酸钠、酵母提取物、谷氨酸、蛋白胨、硝酸钠、硫酸铵和硝酸铵等中的一种或多种；
所述具有微量元素的培养基还包含无机盐。无机盐包括氯化钠、氯化镁、海盐、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和磷酸钠等中的一种或多种。
本发明可在整个发酵过程中通入空气，空气通气量为1：0.2至1：0.8VVM；发酵初始pH控制在6.5—7.5，发酵40h-60h时添加柠檬酸使发酵液pH维持在6.8—7.0；在发酵过程中通过补充碳源将培养基中的还原糖控制在4.0-5.0％(w/w)；在发酵进入稳定期(本发明所用菌种进入稳定期的时间为40-45h)前控制温度为28—30℃，在进入稳定期后控制温度为24—26℃。
本发明上述补充碳源最好在培养基中还原糖为3—3.5％(w/w)时进行。
本发明发酵结束后可通过离心、过滤或絮凝的方法分离得到菌体，然后将菌体通过挤压或酶解法破壁后利用非极性溶剂回收含二十二碳六烯酸的粗油，并通过精炼得到二十二碳六烯酸油脂。
上述非极性溶剂为正己烷。
本发明制得的二十二碳六烯酸油脂不需要进一步的化学改性即可直接用于为需要DHA的人群，包括婴幼儿、孕妇或哺乳期妇女，或是表现出DHA不足性疾病的人提供补充DHA。本发明的优点在于DHA产量高，DHA纯度高，质量安全可靠，生产成本低，生产稳定，并且基本不含EPA；能够低成本、大量生产绿色、安全的高含量的甘油三酯型DHA油脂。
具体实施方式
本发明通过优化培养基和培养条件采用传统的发酵方法生产二十二碳六烯酸油脂，优化的培养基配方见下表
表 优化的发酵培养基配方(以克/100ml培养基计)
 
项目 含量 项目 含量
初始葡萄糖 3-5 味精 0.8-2
酵母膏 0.8-1.5 海盐 0.8-1.5
硫酸钠 0.05-0.1 七水硫酸镁 0.2-0.6
磷酸氢二钾 0.2-0.6 谷氨酸 0.1-0.4
玉米浆 0.1-0.g 生物素 0-0.01
叶绿素 0-0.01 贝塔胡萝卜素 0-0.01
VB1 0-0.01 VB6 0-0.01
VB12 0-0.01 pH 5.5-6.5
斜面菌种经摇瓶及种子罐扩大培养后按照1—10％的接种量接入发酵罐中，初始pH在6.5—7.5，控制罐温28—30℃，菌体生长进入稳定期控制温度为24—26℃。罐压0.03kpa，不进行机械搅拌，通气量控制在1：0.2—1：0.8VVM，发酵过程中控制还原糖为4.0—5.0％，当还原糖低于3.5％时即补充灭菌的浓度为40—60％的葡萄糖，在发酵40-60h时添加0.1-0.3％的柠檬酸，将发酵液pH控制在6.8-7.0，发酵90—95h，在还原糖降低到3.0％，氨基氮浓度为0.037％以下放罐。
由此发酵工艺生产DHA，干菌体中含油量为60—80％，油脂中DHA含量为50—55％，而且其中EPA含量不超过1.0％，DHA生产率达到4.86克/(升.天)，比已见报道菌株生产率高出约1倍。
在本发明方法中，在适合于生产含DHA油的条件下培养裂殖壶菌。一般，真菌培养技术是本领域技术人员所熟知的，这些技术可以用于本发明方法。通常采用斜面菌种接种摇瓶，摇瓶接种一级种子罐，一级种子罐接种二级种子罐，二级种子罐接种发酵罐的工艺流程进行发酵培养裂殖壶菌生产含甘油三酯型DHA的混合油脂。
发酵培养基的组成可以不相同，但都含有碳源和氮源。较好的碳源是葡萄糖，其含量为每升培养基中约80-150克。用量可以随最终培养物密度而不同。可以使用的碳源包括葡萄糖，糖蜜，玉米糖浆或其他用于发酵的低成本常规碳源。本领域熟练技术人员很容易确定这些碳源的合适用量。通常，在培养过程中需要分批另外补充碳源，以满足微生物对碳源的消耗，而一次性加入全部碳源则会抑制微生物的生长。
氮源通常选择有机和无机氮源。有机氮源通常可以选用的有大豆粉、植物蛋白水解物、玉米浆、酵母提取物和蛋白胨。无机氮源通常可以选用的有硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵等。有机氮源作为长效氮源使用，而无机氮源作为速效氮源使用，通常情况下，在发酵培养基中选择有机和无机氮源配合使用，较好的是使用酵母提取物和硝酸氨的配合，其用量一般为碳源的六一十分之一。本领域熟练技术人员很容易确定这些氮源的添加量。氮源可以分批加入，也可以在配制培养基时一次性加入。
本发明在培养基中强化添加特定微量元素，不仅可以促进菌体的生长，而且在含量产率的提高方面具有明显的效果。可以选用的微量元素有生物素、叶绿素、β—胡萝卜素、维生素B1、维生素B6和维生素B12。较好的是在培养基中添加0.01％的生物素、0.01％的叶绿素、0.01％的维生素B1和0.01％的维生素B12。
通常，按照需要的碳源和氮源的添加量在普通发酵罐中配制培养基。例如，可以按照每升自配海水中添加50克葡萄糖、10克酵母提取物、1克硫酸钠、0.1克的生物素、0.1克的叶绿素、0.1克的VB1和0.1克的VB12以及其他盐类来配制发酵用培养基。如前所述，可以使用其他碳源和氮源及其混合物。
将配制好的培养基经高温灭菌(121℃，30min，0.1—0.12Mpa)，并冷却至约30℃后接入培养好的裂殖壶菌菌种进行培养。在发酵液中通以空气进行气体交换，供给菌体生长所需要的氧气，并达到搅拌的效果。通气量据不同发酵阶段可不相同，以1：0.5VVM为宜。
接种量以2％至10％为好，最好使用约10％体积的接种量。
发酵过程中需要监测营养物消耗水平。当发酵液中还原糖水平下降至低于3.5％时，应补充葡萄糖。在一个优选的实施例中，一个发酵周期消耗每升培养基100克葡萄糖和15克酵母提取物。
发酵温度一般控制在24至30℃。在发酵的不同阶段可以控制不同的温度，一般在发酵的初始阶段控制在稍高的温度，较好的是控制在28-30℃，以利于菌体的生长和繁殖，而在油脂积累的阶段将温度控制在诱导DHA优先产生积累的值，优选的是控制在24-26℃。
在发酵的不同阶段建议控制不同的pH值：发酵开始将pH调节至6.5-7.5，随着培养过程的进行，当菌体生长进入稳定期，添加发酵液体积0.1-0.3％的柠檬酸，并将发酵液pH控制在6.8-7.0，意外发现，添加柠檬酸而非其他物质以调节发酵液的pH，其最终发酵液中的DHA含量和油脂产量都可以达到更高的水平。
在发酵过程中，维持培养基中的高溶氧浓度，能够缓解高营养物浓度引起的生长抑制和/或提高油脂中的DHA残基的相对浓度。溶氧浓度通常情况下可以通过提高罐压，和进行机械搅拌来达到，本发明发酵过程采用无搅拌方式发酵，在发酵的后期添加0.1-1.0％(v/v)的乙醇来增加溶氧量，获得了较好的效果。在此条件下进行发酵，可以提高碳的利用率，从而得到较高的生物量和DHA产量，同时节约了能耗，降低了生产成本。
进行一项或多项的改进，可以发酵得到含有高于50％DHA残基的甘油三酯类油脂，最佳条件下可以得到含有高于55％的DHA残基的甘油三酯类油脂。
在最佳的实施方式中，发酵培养基中葡萄糖浓度约80g/l，酵母抽提物浓度约15g/l，硝酸钠浓度约10g/1，强化微量元素(添加0.01％的生物素、0.01％的叶绿素、0.01％的VB1和0.01％的VB12)，在发酵过程中少量多次补充共计60g/l的葡萄糖，通气量为0.5VVM。当菌体生长进入稳定期，添加发酵液体积0.1-0.3％的柠檬酸，并将发酵液pH控制在6.8-7.0。在发酵60h-80h，菌体生长进入发酵后期，通过添加0.5％的乙醇来增加溶氧量。当还原糖浓度下降至3.0％，氨基氮含量不得超过0.037％时结束发酵，能够获得DHA含量为55％的混合油脂，并且其中的EPA含量不超过0.5％。
通过以上发酵过程优化，能够获得较高的生物量，其中含有60％至80％的油脂，其中甘油三酯形式的DHA残基占50％至55％，并且其中的EPA含量小于1％，更加优选的方式下EPA含量低于0.5％。
可以通过各种方法收获菌体，例如离心、絮凝、过滤等。较好的处理菌体的方式是将收集到的菌体利用喷雾干燥的方法，获得干燥的菌体。其中可以对发酵液进行预处理，加入酒精沉淀其中的蛋白质和糖，酒精添加量为1：1—3。
对发酵得到的菌体可以通过机械挤压(例如均质)的方式进行破壁处理，也可以通过酶解的方法进行破壁，其中酶法破壁可以优选复合酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶二种或几种的复合)，添加量为发酵液的0.01—1％。
用非极性溶剂进行萃取，以获得含DHA残基的甘油三酯形式的混合油脂。非极性溶剂优选正己烷。通过萃取得到含甘油三酯型的DHA粗油。粗油可以进一步通过常规精炼的方法得到精油。
本发明的最佳应用是给婴幼儿提供一种优质安全的甘油三酯型的DHA源，使得婴幼儿食品中的DHA含量接近母乳中的DHA含量。
除了用作婴幼儿配方食品外，此种来源的DHA也可以用于给孕妇或哺乳期妇女，以及患有DHA缺乏导致的神经障碍的人经肠或不经肠补充DHA。
以上对本发明进行了全面的描述，以下非限定性实施例用于进一步说明本发明。
实施例1.强化微量元素的培养基配方对DHA含量和产率的影响
培养基配方a(g/100ml培养基)
 
项目 含量 项目 含量
初始葡萄糖 3 味精 0.8
酵母膏 0.8 海盐 0.8
硫酸钠 0.05 七水硫酸镁 0.2
磷酸氢二钾 0.2 谷氨酸 0.1
玉米浆 0.1 pH 6.5-7.5
强化微量元素培养基配方b(g/100ml培养基)
 
项目 含量 项目 含量
初始葡萄糖 3 味精 0.8
酵母膏 0.8 海盐 0.8
硫酸钠 0.05 七水硫酸镁 0.2
磷酸氢二钾 0.2 谷氨酸 0.1
玉米浆 0.1 生物素 0.01
VB12 0.01 VB6 0.01
pH 6.5-7.5
按照上述培养基a和b配方，分别在50L罐中配制30L培养基，pH控制在6.5，经高温灭菌，冷却至30℃备用。
将经活化的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.ATCC20888)斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，28℃摇床培养48小时，摇床转速150r/min，制备裂殖壶菌种子液，其菌体密度约为15g/l。
按照10％的接种量将上述种子液接入上述配制好且已灭菌好的培养基中，通入0.5VVM的空气，在还原糖浓度低于3％时补充浓度为50％的葡萄糖液，使还原糖浓度控制在4％，配方a实验共计补入5％的葡萄糖，配方b实验共计补入7％的葡萄糖；在发酵至40h时，在发酵液中添加0.2％的柠檬酸，并将发酵液pH控制在6.8-7.0，直至发酵结束；在发酵至60h时，添加0.5％的乙醇来增加溶氧量。发酵培养95h，至还原糖浓度为3％，氨基氮浓度为0.037％，终止发酵。通过离心收获菌体，菌体经充分洗涤，离心，挤压破壁，加入1：2体积的正己烷进行萃取，并挥发溶剂后得到含DHA粗油。
结果见下表
 
总脂含量(％) DHA含量(％) DHA生产率(g/l.d) EPA含量(％)
配方a实验 40.5 35.4 2.58 2.66
配方b实验 69.7 52.6 4.26 0.37
由上表可见，培养基强化微量元素的配方能够大幅度提高DHA的含量和生产率，降低油脂中EPA的含量。
实施例2.选用乙醇增加发酵液溶氧对DHA含量和产率的影响
选用实施例1中的培养基b配方，按照实施例1中所描述的方法制备x和y两罐培养基，并按照其中的方法接种裂殖壶菌(Schizochytrium sp.ATCC20888)进行发酵培养，x和y两罐在发酵控制上基本相同，仅在溶氧控制上有所区别。y罐在发酵至60h时添加发酵液体积0.5％的乙醇以增加发酵液中的溶氧水平，而x罐作为对照则相应的补充发酵液体积0.5％的灭菌水。
发酵培养95h，至还原糖浓度为3％，氨基氮浓度为0.037％，终止发酵。通过离心收获菌体，菌体经充分洗涤，离心，挤压破壁，加入1：2体积的正己烷进行萃取，并挥发溶剂后得到含DHA粗油。
结果见下表
 
总脂含量(％)     DHA含量(％)    DHA生产率(g/l.d)    EPA含量(％)   
X罐(空白对照) 54.3 50.6 3.01 0.75
Y罐(添加乙醇) 71.9 54.0 4.35 0.29
由上表可见，发酵过程中选择乙醇来增加发酵液的溶氧水平，能够提高所产油脂中DHA的含量和生产率，并降低油脂中EPA含量。
实施例3.选用柠檬酸调节发酵液pH对DHA含量和产率的影响
选用实施例1中的培养基b配方，按照实施例1中所描述的方法制备X和Y两罐培养基，并按照其中的方法接种裂殖壶菌(Schizochytrium sp.ATCC20888)进行发酵培养，X和Y两罐在发酵控制上基本相同，仅在pH控制的酸度调节剂上有所区别。X罐在发酵40h时，添加发酵液体积0.2％的柠檬酸，并将发酵液pH控制在6.8-7.0，而Y罐在此过程中添加相同体积硫酸。
发酵培养95h，至还原糖浓度为3％，氨基氮浓度为0.037％，终止发酵。通过离心收获菌体，菌体经充分洗涤，离心，挤压破壁，加入1：2体积的正己烷进行萃取，并挥发溶剂后得到含DHA粗油。
结果见下表
 
总脂含量(％)     DHA含量(％)    DHA生产率(g/1.d)   EPA含量(％)   
X罐(硫酸) 61.2 50.4 3.64 0.66
Y罐(柠檬酸) 70.9 53.3 4.22 0.32
由上表可见，发酵过程中添加柠檬酸，意外的发现能够提高所产油脂中DHA的含量和生产率。
实施例4 50升罐发酵培养裂殖壶菌生产DHA及在婴幼儿食品使用
培养基配方(g/100ml培养基)
 
项目 含量 项目 含量
初始葡萄糖 3 味精 0.8
酵母膏 0.8 海盐 0.8
硫酸钠 0.05 七水硫酸镁 0.2
磷酸氢二钾 0.2 谷氨酸 0.1
玉米浆 0.1 生物素 0.01
VB12 0.01 VB6 0.01
pH 6.5-7.5
加水至所需体积，pH控制在6.5，高温灭菌，冷却至30℃备用。
将新鲜裂殖壶菌(Schizochytrium sp.ATCC20888)斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，28℃摇床培养72小时，摇床转速150r/min，制备裂殖壶菌种子液，其菌体密度为15g/l。
按照10％的接种量将上述种子液接入含30升培养基50升发酵罐培养基中，通入0.5VVM的空气，当菌体生长进入稳定期，添加发酵液体积0.3％的柠檬酸，并将发酵液pH控制在6.8-7.0；在发酵至60h时，添加0.5％的乙醇来增加溶氧量。在还原糖浓度低于3％时补充浓度为50％的葡萄糖液，使还原糖浓度控制在4％，共计补入7％的葡萄糖。发酵培养95h，至还原糖浓度为3％，氨基氮浓度为0.037％，终止发酵。通过离心收获菌体，菌体经充分洗涤，离心，酶法破壁，加入1：2体积的正己烷进行萃取，并挥发溶剂后得到含DHA粗油。
进行相关指标分析获得：生物量为43g/l，油脂含量为70％，气相色谱检测DHA含量为54％，EPA含量为0.1％。以下为发酵后所得混合油脂的组成成分：
C12:0           0.1086
C14:0           4.5434
C16:0           16.7649
C16:1           1.0338
C18:0           0.6105
C18:1           0.3714
C18:2           0.3588
C18:3           0.1092
C20:4           1.7050
C20:5           0.1132
C22:5           18.3429
C22:6           54.1821
实施例5 50升罐发酵培养裂殖壶菌生产DHA及在婴幼儿食品使用
培养基配方(g/100ml培养基)
 
项目 含量 项目 含量
初始葡萄糖 3 味精 0.8
酵母膏 0.8 海盐 0.8
硫酸钠 0.05 七水硫酸镁 0.2
磷酸氢二钾 0.2 谷氨酸 0.1
玉米浆 0.1 生物素 0.01
VB12 0.01 VB6 0.01
pH 6.5-7.5
加水至所需体积，pH控制在6.5，高温灭菌，冷却至30℃备用。
将新鲜裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum ATCC MYA-1381)斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，28℃摇床培养72小时，摇床转速150r/min，制备裂殖壶菌种子液，其菌体密度为15g/l。
按照10％的接种量将上述种子液接入含30升培养基50升发酵罐培养基中，通入0.5VVM的空气，当菌体生长进入稳定期，添加发酵液体积0.3％的柠檬酸，并将发酵液pH控制在6.8-7.0；在发酵至60h时，添加0.5％的乙醇来增加溶氧量。在还原糖浓度低于3％时补充浓度为50％的葡萄糖液，使还原糖浓度控制在4％，共计补入7％的葡萄糖。发酵培养95h，至还原糖浓度为3％，氨基氮浓度为0.037％，终止发酵。通过离心收获菌体，菌体经充分洗涤，离心，酶法破壁，加入1：2体积的正己烷进行萃取，并挥发溶剂后得到含DHA粗油。
进行相关指标分析获得：生物量为45g/l，油脂含量为67％，气相色谱检测DHA含量为52％，EPA含量为0.3％。以下为发酵后所得混合油脂的组成成分：
C12:0           0.1507
C14:0           4.8548
C16:0           18.6231
C16:1           1.1132
C18:0           0.7244
C18:1           0.3035
C18:2           0.3692
C18:3           0.1154
C20:4           1.5637
C20:5           0.3058
C22:5           17.6587
C22:6           52.0381
实施例4.500升发酵培养裂殖壶菌生产DHA
培养基配方(g/100ml培养基)
 
项目 含量 项目 含量
初始葡萄糖 4.5 味精 0.9
酵母膏 1.0 海盐 0.9
硫酸钠 0.1 七水硫酸镁 0.2
磷酸氢二钾 0.2 谷氨酸 0.1
玉米浆 0.1 生物素 0.01
VB12 0.01 VB6 0.01
pH 6.5-7.5
加水至所需体积，pH控制在7.0，高温灭菌，冷却至30℃备用。
按照例1的方法制备裂殖壶菌(Schizochytrium sp.ATCC20888)种子液，并通过50升罐扩培至32升。
按照8％的接种量将上述种子液接入含400升培养基500升发酵罐培养基中，通入0.5VVM的空气，当菌体生长进入稳定期，添加发酵液体积0.3％的柠檬酸，并将发酵液pH控制在6.8-7.0；在发酵至60h时，添加了0.5％的乙醇来增加溶氧量。在还原糖浓度低于3.5％时补充浓度为50％的葡萄糖液，使还原糖浓度控制在3％，共计补入8％的葡萄糖。发酵培养90h，至还原糖浓度为3％，氨基氮浓度为0.037％，终止发酵。通过离心收获菌体，菌体经充分洗涤，离心，酶法破壁，加入1：2体积的正己烷进行萃取，并挥发溶剂后得到含DHA粗油。
进行相关指标分析获得：生物量为48g/l，油脂含量为73％，气相色谱检测DHA含量为52％，EPA含量为0.3％。下表为发酵后所得混合油脂的组成成分。
表
C12:0           0.1074
C14:0           4.6375
C16:0           16.5583
C16:1           1.0273
C18:0           0.6971
C18:1           0.3721
C18:2           0.3541
C18:3           0.1075
C20:4           1.7063
C20:5           0.3107
C22:5             19.1403
C22:65            2.0711
实施例5.10吨罐发酵培养裂殖壶菌生产DHA
培养基配方(g/100ml培养基)
 
项目 含量 项目 含量
初始葡萄糖 5 味精 1.4
酵母膏 1.0 海盐 1.1
硫酸钠 0.1 七水硫酸镁 0.2
磷酸氢二钾 0.5 谷氨酸 0.3
玉米浆 0.3 生物素 0.01
叶绿素 0.01 贝塔胡萝卜素 0.01
VB1 0.01 VB6 0.01
VB12 0.01 pH 6.5-7.5
加水至所需体积，pH控制在6.8，高温灭菌，冷却至30℃备用。
按照例1的方法制备裂殖壶菌(Schizochytrium sp.ATCC20888)种子液，并通过500升罐扩培至350升。
按照7％的接种量将上述种子液接入含7吨培养基10吨发酵罐培养基中，通入0.5VVM的空气，当菌体生长进入稳定期，添加发酵液体积0.3％的柠檬酸，并将发酵液pH控制在6.8-7.0；在发酵至60h时，添加0.5％的乙醇来增加溶氧量。在还原糖浓度低于3.5％时补充浓度为50％的葡萄糖液，使还原糖浓度控制在3％，共计补入10％的葡萄糖。发酵培养95h，至还原糖浓度为3％，氨基氮浓度为0.037％，终止发酵。通过离心收获菌体，菌体经充分洗涤，离心，挤压破壁，加入1：2体积的正己烷进行萃取，并挥发溶剂后得到含DHA粗油，经常规油脂精炼后得到成品DHA油脂。
进行相关指标分析获得：生物量为53g/l，油脂含量为72％，气相色谱检测DHA含量为50％，EPA含量为0.4％。下表为发酵后所得混合油脂的组成成分。
表
C12:0              0.1079
C14:0              4.3130
C16:0              16.3231
C16:1              1.0312
C18:0              0.6153
C18:1            0.3764
C18:2            0.3476
C18:3            0.1037
C20:4            1.7105
C20:5            0.4433
C22:5            18.1532
C22:6            50.1026

Claims (11)

1.用裂殖壶菌(Schizochytrium)发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，包括：以裂殖壶菌为菌种，采用具有微量元素的培养基，经发酵制得二十二碳六烯酸油脂，其中二十碳五烯酸含量在1％以下；所述具有微量元素的培养基包含碳源、氮源、无机盐和微量元素，所述微量元素包括生物素、叶绿素、β—胡萝卜素、维生素B1、维生素B6和维生素B12中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所添加的微量元素为生物素、叶绿素、β—胡萝卜素、维生素B1、维生素B6和维生素B12中的一种或几种，当为其中一种时，添加量为培养基重量的0.002—0.01％；当为其中几种时，任意一种组分的添加量为培养基重量的0.002—0.01％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述菌种为经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养得到的裂殖壶菌；或为经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养和二级扩大培养后得到的裂殖壶菌。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：在发酵培养40—60h时添加发酵液体积0.1—0.3％的柠檬酸。
5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：在发酵培养60—80h时，添加发酵液体积0.1-1.0％的乙醇。
6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：碳源包括葡萄糖、糖蜜和玉米糖浆中的至少一种；氮源包括大豆粉、植物蛋白水解物、玉米浆、谷氨酸钠、酵母提取物、谷氨酸、蛋白胨、硝酸钠、硫酸铵和硝酸铵中的一种或多种。
7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述具有微量元素的培养基还包含无机盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：无机盐包括氯化钠、氯化镁、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和磷酸钠中的一种或多种。
9.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：在发酵过程中通入空气，空气通气量为1:0.2至1：0.8VVM；发酵初始pH控制在6.5—7.5，发酵40h-60h时添加柠檬酸使发酵液pH维持在6.8—7.0；在发酵过程中通过补充碳源将培养基中的还原糖浓度控制在4.0—5.0wt％；在发酵进入稳定期前控制温度为28—30℃，在进入稳定期后控制温度为24—26℃。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：在培养基中还原糖浓度在3—3.5wt％时补充碳源。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于：发酵结束后通过离心、过滤或絮凝的方法分离得到菌体，然后将菌体通过挤压或酶解法破壁后利用非极性溶剂回收含二十二碳六烯酸的粗油，并通过精炼得到二十二碳六烯酸油脂。
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