CN105132485B

CN105132485B - 一种裂殖壶菌发酵生产dha的方法

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Publication number: CN105132485B
Application number: CN201510618060.4A
Authority: CN
Inventors: 马兴群; 宋琦; 刘雨; 吕丽娟
Original assignee: SHANDONG SUNWIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANDONG SUNWIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2015-09-24
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2035-09-24
Also published as: CN105132485A

Abstract

本发明公开了一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，包括将裂殖壶菌在发酵培养基中发酵制得DHA，在所述发培养基中添加通式(1)化合物中的一种或者两种以上；式中R₁代表C₁～C₂₀烷基，R₂代表羧基或者磺丙基。在发酵中后期引入通式(1)化合物，促进菌体的呼吸作用，利于菌体的生长代谢和DHA的生产。本发明公开的DHA的生产方法具有产量高，DHA纯度高，质量安全可靠，生产成本低，生产稳定，并且基本不含EPA等优点。能够经济大量的提供绿色、安全、高含量的甘油三酯型DHA油脂。

Description

一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵生产方法，具体涉及利用裂殖壶菌菌株发酵生产甘油三酯型DHA的方法。

背景技术

二十二碳六烯酸(cis-4，7，10，13，16，19-docosahexaenoic acid，简称DHA，CAS号：6217-54-5)属于多不饱和脂肪酸，具有十分重要的生理功能，是人体自身不能大量合成但又不可缺少的重要营养素。

由于DHA含有六个不饱和键的特殊结构，因此对于人体的健康具有特殊的作用和重要的影响。

首先，DHA是人体大脑的主要组成成分之一，主要以磷脂的形式存在，约占脑细胞脂肪酸的30％左右。在胎儿时期，DHA必须从母体获得,妇女在怀孕期间，如果DHA摄入量不足，会导致胎儿的脑细胞生长和发育不正常，严重的会产生弱智。在婴幼儿时期，大脑处于生长发育阶段，研究表明，饮食中含DHA丰富的婴儿，思维比一般的婴儿更加敏捷，语言能力和学习能力也比一般的婴儿强，患神经系统疾病(如神经官能症)的几率也低得多。青少年学生，由于学习任务繁重，多摄入DHA可以增强记忆力、改善注意力等。对成年人来讲，DHA也是维持生理功能必不可少的物质，特别是脑力劳动者和中老年人，如果DHA摄入不足，则大脑功能会降低，会出现注意力不集中、心情抑郁和效率低下等状况，更严重的可能会导致老年痴呆症。

第二，DHA具有抗凝血、抑制血小板凝集和血栓形成的作用，从而可以预防心肌梗塞等心血管疾病的发生。

第三，DHA在人的视网膜中含量丰富，是视网膜组织的重要组成成分。实验证明，在食物中加入一定量的DHA，有助于婴儿眼睛的发育，婴儿视觉发育和功能成熟也早一些，且他们比普通儿童的视觉灵敏；长期缺乏DHA，视力会降低，这主要是由于DHA能促进视神经膜延伸，维持视觉正常功能。

第三，DHA会抑制发炎前驱物质的形成，具有消炎作用。

第四，降低孕妇妊高症的风险，减少产后神经衰弱及抑郁症的发生。

最后，DHA有抑制癌症的作用，能明显抑制肿瘤的产生、成长和转移。研究表明，科学家使DHA从神经系统中转移到髓母细胞瘤中，当DHA在细胞内代谢后，再对细胞中的副产物进行分析。随后科学家研究了DHA及其衍生物对癌细胞生长的影响。研究结果表明，DHA杀死了所有的癌细胞，而且由DHA衍生物产生的毒性比DHA本身更能有效地杀死癌细胞。这表明，DHA可成为一种新的治疗神经母细胞瘤或其他癌症的新药物。

基于二十二碳六烯酸的这些重要作用，它已经广泛应用于食品、医药、饲料等方面。

目前，DHA的商业来源主要是鱼油和微藻。其缺点是:

(1)鱼油的产量和DHA含量都不稳定，提取物夹杂鱼腥味，极大地影响了产品的品质；

(2)鱼油中提取的含DHA混合油脂中还含有二十碳五烯酸(EPA)，据研究，EPA对婴幼儿的发育具有不利的影响；

(3)上述DHA存在形式一般为DHA乙酯，乙酯型DHA不稳定且生物利用率低；另外含有大量其他饱和及低不饱和的脂肪酸，后期纯化工艺复杂，成本高；

(4)因海洋污染，鱼油中含有重金属和二恶英等有害物质；

(5)目前的海洋渔业资源接近枯竭，从鱼油中提取DHA造成极大的浪费。微澡的培养需要光照和二氧化碳，生产工艺繁杂，成本较高。

随着人口的增加，以及人们对健康的迫切需求，全世界对DHA的需求量相应增加，需要寻求大量的DHA新来源。据荷兰帝斯曼公司的估计，DHA的全球市场价值约为25～26.2亿美元，并且以每年15％以上的速度增长。

近年来发展起来生产DHA的方法为发酵法。微生物主要是破囊壶菌、裂殖壶菌等海洋真菌。研究发现海洋微生物裂殖壶菌(Schizochytrium)细胞中能积累大量DHA，而且具有培养周期短和不易受污染等优点，能够克服鱼油资源所面临的种种问题；同时裂殖壶菌来源的DHA已通过FDA等权威机构的安全认证，是安全的DHA新资源。裂殖壶菌又称裂壶藻，属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。其发酵产DHA有如下优点：(1)裂殖壶菌分裂快，发酵时间短，可节约时间成本。(2)裂殖壶菌可以积累大量油脂，其比重可占细胞干重的70％以上，且总脂中二十二碳六烯酸(DHA)含量非常高,可达到35％～40％，是DHA的高产菌株。(3)油脂中的DHA结构类似物含量低,易分离纯化，节约了下游成本。(4)裂殖壶菌中DHA为天然的甘油三酯型，较稳定，生物利用度高。因此裂殖壶菌是可用于DHA生产的优良菌种，也是DHA发酵生产当中研究的比较多的一种菌。

国内外进行了大量裂殖壶菌生产DHA的相关研究。

比如：申请号为200910061419.7、201210251850.X、201210380900.4、201210338013.0、200910130628.2201010104774.0、201310571413.0的专利公开了利用裂殖壶菌发酵生产DHA的工艺，培养基均使用葡萄糖、蛋白胨和酵母粉等传统碳氮源。但是上述方法产量并不高。

于是，一些研究人员开始在自然界或者采用突变的方法寻找裂殖壶菌的高产菌种。

比如，授权公告号为CN 1264967C的专利公开了一种以裂殖壶菌SR21的菌株为出发菌株，通过化学和物理诱变相结合而得到的一株突变株OUC88，在优化培养条件下，DHA产量达到8.27g/1，菌体中DHA的百分含量为18～35％。虽然其经诱变获得的裂殖壶菌菌株在DHA产量上比之前的研究提高了一倍，但因其所发明的方法为生产可食用或药用的产品，其利用诱变得到的菌株存在未知的安全性问题，并且，经诱变得到的菌株，其本质是为发生了变异的菌株，其具有回复突变的特点，这也使其在工业化大生产中存在着生产难以稳定的缺陷。

公开号为CN 1916156A的专利公开了一种采用松树花粉垂钓法分离得到的裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU47711(其保藏编号为CGMCC No.1730)在优化的培养条件下培养5天，DHA生产率最高为2.76克/(升.天)。虽然其DHA生产较之以前的研究有了较大的提高，但对于进行工业化大生产，大大降低其生产成本，降低其市场价格，使其在普通消费者中能够得到大力推广和普及使用的要求还是远远不够的。

中国专利CN 102864111公开了一种在山东省青岛市黄海水域中筛选得到了性状稳定、发酵周期短、在25-30℃可高产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌Schizochytriumlimacinum JN168。但是该方法需要特定的裂殖壶菌菌种，难以推广应用。

因此，需要寻找一种利用裂殖壶菌(Schizochytrium)原始菌株为菌种，经优化的生产工艺和或生产培养基配方，能够大量生产绿色、安全的含高含量甘油三酯型DHA油脂的方法，从而可以达到较大幅度的降低DHA生产成本，进而降低含DHA终端产品价格，降低DHA的使用门槛，使其在普通大众消费者中能够得到大力的推广和普及使用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种工艺简单、成本低廉、高产、高纯度的裂殖壶菌发酵生产DHA的方法。

为了实现上述目的，本发明提供的裂殖壶菌发酵生产DHA的方法为：

将裂殖壶菌在发酵培养基发酵制得二十二碳六烯酸(DHA)，所述发酵培养基中添加通式(1)化合物中的一种或者两种以上；

R₁代表C₁～C₂₀烷基，R₂代表羧基或者磺丙基。

优选的通式(1)化合物为甜菜碱、月桂基甜菜碱(N-十二烷基-N,N-二甲基甘氨酸)、辛基甜菜碱(N-辛基-N,N-二甲基甘氨酸)、异丙基甜菜碱(N-异丙基-N,N-二甲基甘氨酸)、十二烷基磺丙基甜菜碱(十二烷基二甲基磺丙基甜菜碱)、十四烷基磺丙基甜菜碱(十四烷基二甲基磺丙基甜菜碱)、十六烷基磺丙基甜菜碱(十六烷基二甲基磺丙基甜菜碱)。

最优的通式(1)化合物中R₁为甲基，R₂为羧基，即为甜菜碱，可以选自无水甜菜碱、一水甜菜碱、盐酸盐甜菜碱、磷酸甜菜碱中的一种或者两种以上。

甜菜碱，又名N,N,N-三甲基甘氨酸，是一种季铵型水溶性生物碱。因最初从甜菜中提取而得名甜菜碱，纯品为白色片状结晶，有甜味，易吸潮，可速溶于水，易被消化吸收，使用安全，无毒副作用。除了上述可能的作用机理外，甜菜碱对提高种子液中菌球的分散度和菌体量也有明显的良性效果。

通式(1)化合物在发酵培养基中的浓度优选为2～2.5g/L。

优选在发酵40～42h时，添加通式(1)化合物中的一种或者两种以上。

发酵培养基的碳源没有特别的要求，可以选自糖类、油脂、有机酸、正烷烃中的一种或者两种以上，优选为葡萄糖母液。

优选的发酵培养基((g·L^-1))为葡萄糖母液(40～45％干物，下同)200～250，酵母粉10～12，乙酸铵1.5～2，MgSO₄·7H₂O 4.5～5，KCl 0.5～0.8，CaCl₂·2H₂O 3.5～5，调pH6.0～6.5。发酵40～42h时，添加2～2.5g/L的通式(1)化合物中的一种或者两种以上。

优选的发酵培养条件为：接种量8～12％，培养温度23～27℃，通气量0.5～1vvm，发酵时间90～96h。发酵开始后，通过流加氢氧化钠和葡萄糖母液控制pH6.0～6.5。当菌体进入生长期时，通过控制搅拌转速使OUR(OUR指生物发酵过程中的氧气的摄入量)维持在12～15mmol/L/H，当58～60h时，降低搅拌转速使OUR控制在8～12mmol/L/H至发酵结束。在发酵结束前16～20h停止补料，消耗发酵液中的残糖。

优选的在进行发酵培养前可以进行种子培养以获得一定数量和质量的裂殖壶菌菌种。

种子培养基的碳源没有特别的要求，可以选自糖类、油脂、有机酸、正烷烃中的一种或者两种以上，优选为葡萄糖母液。

优选的种子培养基为(g·L^-1):葡萄糖母液100～140，酵母粉4.5～5.5，KH₂PO₄0.7～1，NaCl 4～8，MgSO₄·7H₂O 2～3，KCl 0.5～1，CaCl₂·2H₂O 0.5～1，pH 6.0～6.5。

优选的种子培养条件为将保藏的斜面接种到种子培养基中，23～27℃、180～220r·min-1培养42～45h。

本发明采用的裂殖壶菌没有特别的限制，比如可以采用裂殖壶菌Schizochytriumsp.ATCC20888为菌种。

发酵结束后可以通过各种方法收获菌体，例如离心、絮凝、过滤等。较好的处理菌体的方式是将收集到的菌体利用喷雾干燥的方法，获得干燥的菌体。

对发酵得到的菌体可以通过机械挤压(例如均质)的方式进行破壁处理，也可以通过酶解的方法进行破壁，其中酶法破壁可以优选复合酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶二种或几种的复合)，添加量为发酵液的0.01～1％。

用非极性溶剂进行萃取，以获得含DHA残基的甘油三酯形式的混合油脂。非极性溶剂优选正己烷。通过萃取得到含甘油三酯型的DHA粗油。粗油可以进一步通过常规精炼的方法得到精油。

从上述的实施例可以看出：本发明的培养基中使用的葡萄糖母液作为葡糖糖生产中的废料，价格相对低廉，其葡萄糖含量35％左右，另外还含有3.5％的氯化钠。其用于本工艺中，除可作为碳源外，还可减少培养基中氯化钠的额外添加，节约了发酵成本。发酵中后期引入通式(1)化合物，促进菌体的呼吸作用，利于菌体的生长代谢和DHA的生产。发酵过程中流加葡萄糖母液，既是调节pH的手段，同时又补充了菌体代谢所需的营养，省去了调节pH所用的酸，节约了成本。OUR指标可以反应菌体氧代谢的情况，通过调节发酵转速控制OUR，进而控制菌体处于最佳的目标产物生产状态，进一步提高了DHA的产量。

另外，本发明制得的二十二碳六烯酸油脂EPA含量的极低，因此不需要进一步的化学改性即可直接用于为需要DHA的人群，包括婴幼儿、孕妇或哺乳期妇女，或是表现出DHA不足性疾病的人提供补充DHA。本发明的优点在于DHA产量高，DHA纯度高，质量安全可靠，生产成本低，生产稳定，并且基本不含EPA；能够低成本、大量生产绿色、安全的高含量的甘油三酯型DHA油脂。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1(对比例)

(1)种子培养

种子培养基(g·L^-1):葡萄糖母液125，酵母粉4.5，KH₂PO₄ 1，NaCl 5，MgSO₄·7 H₂O2.5，KCl 0.5，CaCl₂·2H₂O 1，pH 6.0。

将保藏的斜面接种到种子培养基中，26℃、200r·min^-1培养42h。

(2)发酵培养

发酵初始培养基(g·L^-1)：葡萄糖母液220，酵母粉12，乙酸铵1.5，MgSO₄·7H₂O4.5，KCl 0.8，CaCl₂·2H₂O 4，调pH 6.0。全程不添加通式(1)化合物。

培养条件：接种量10％，培养温度25℃，通气量0.8vvm，发酵时间96h。发酵开始后，通过流加氢氧化钠和葡萄糖母液控制pH6.0。当菌体进入生长期时，通过控制搅拌转速使OUR维持在12～15mmol/L/H，当58h时，降低搅拌转速使OUR控制在8～12mmol/L/H至发酵结束。在发酵结束前20h停止补料，消耗发酵液中的残糖。

通过离心收获菌体，菌体经充分洗涤，离心，挤压破壁，加入1：2体积的正己烷进行萃取，并挥发溶剂后得到含DHA粗油。

结果见下表所示：

表1

	总脂含量％	DHA含量％	EPA含量％
				实施例1	41	37	3.0

实施例2

(1)种子培养

种子培养基(g·L^-1):葡萄糖母液100，酵母粉5.5，KH₂PO₄ 0.7，NaCl 4，MgSO₄·7H₂O 2.3，KCl 0.8，CaCl₂·2H₂O 0.5，pH 6.0。

将保藏的斜面接种到种子培养基中，26℃、220r·min^-1培养42h。

(2)发酵培养

发酵初始培养基(g·L^-1)：葡萄糖母液200，酵母粉10，乙酸铵2，MgSO₄·7H₂O 4.5，KCl 0.5，CaCl₂·2H₂O 3.5，调pH 6.0。发酵41h时，添加2.0g/L的月桂基甜菜碱。

培养条件：接种量8％，培养温度26℃，通气量1vvm，发酵时间90h。发酵开始后，通过流加氢氧化钠和葡萄糖母液控制pH6.2。当菌体进入生长期时，通过控制搅拌转速使OUR维持在12～15mmol/L/H，当58h时，降低搅拌转速使OUR控制在8～12mmol/L/H至发酵结束。在发酵结束前16h停止补料，消耗发酵液中的残糖。

结果见下表所示：

表2

	总脂含量％	DHA含量％	EPA含量％
				实施例2	75	60	0.4

实施例3

(1)种子培养

种子培养基(g·L^-1):葡萄糖母液140，酵母粉4.5，KH₂PO₄ 0.9，NaCl 8，MgSO₄·7H₂O 2，KCl 1.0，CaCl₂·2H₂O 0.9，pH 6.5。

将保藏的斜面接种到种子培养基中，23℃、210r·min^-1培养45h。

(2)发酵培养

发酵初始培养基(g·L^-1)：葡萄糖母液225，酵母粉12，乙酸铵1.6，MgSO₄·7H₂O5.0，KCl 0.8，CaCl₂·2H₂O 5.0，调pH 6.5。发酵40h时，添加1.1g/L的辛基甜菜碱和1.1g/L异丙基甜菜碱。

培养条件：接种量10％，培养温度23℃，通气量0.5vvm，发酵时间96h。发酵开始后，通过流加氢氧化钠和葡萄糖母液控制pH6.5。当菌体进入生长期时，通过控制搅拌转速使OUR维持在12～15mmol/L/H，当58h时，降低搅拌转速使OUR控制在8～12mmol/L/H至发酵结束。在发酵结束前20h停止补料，消耗发酵液中的残糖。

结果见下表所示：

表3

	总脂含量％	DHA含量％	EPA含量％
				实施例3	70	55	0.4

实施例4

(1)种子培养

种子培养基(g·L^-1):葡萄糖母液135，酵母粉5.0，KH₂PO₄ 0.75，NaCl 5.5，MgSO₄·7 H₂O 3.0，KCl 0.5，CaCl₂·2H₂O 0.65，pH 6.3。

将保藏的斜面接种到种子培养基中，25℃、205r·min^-1培养43h。

(2)发酵培养

发酵初始培养基(g·L^-1)：葡萄糖母液250，酵母粉10.5，乙酸铵1.5，MgSO₄·7H₂O4.9，KCl 0.65，CaCl₂·2H₂O 3.5，调pH 6.3。发酵40h时，添加0.9g/L的十二烷基磺丙基甜菜碱、0.3g/L的十六烷基磺丙基甜菜碱及1g/L甜菜碱。

培养条件：接种量9％，培养温度27℃，通气量0.7vvm，发酵时间96h。发酵开始后，通过流加氢氧化钠和葡萄糖母液控制pH6.3。当菌体进入生长期时，通过控制搅拌转速使OUR维持在12～15mmol/L/H，当59h时，降低搅拌转速使OUR控制在8～12mmol/L/H至发酵结束。在发酵结束前20h停止补料，消耗发酵液中的残糖。

结果见下表所示：

表4

	总脂含量％	DHA含量％	EPA含量％
				实施例4	71	54	0.5

实施例5

(1)种子培养

(2)发酵培养

发酵初始培养基(g·L^-1)：葡萄糖母液220，酵母粉12，乙酸铵1.5，MgSO₄·7H₂O4.5，KCl 0.8，CaCl₂·2H₂O 4，调pH 6.0。发酵40h时，添加2g/L的甜菜碱。

培养条件：接种量10％，培养温度25℃，通气量0.7vvm，发酵时间96h。发酵开始后，通过流加氢氧化钠和葡萄糖母液控制pH6.0。当菌体进入生长期时，通过控制搅拌转速使OUR维持在12～15mmol/L/H，当60h时，降低搅拌转速使OUR控制在8～12mmol/L/H至发酵结束。在发酵结束前20h停止补料，消耗发酵液中的残糖。

结果见下表所示：

表5

	总脂含量％	DHA含量％	EPA含量％
				实施例5	78	60	0.25

实施例6

(1)种子培养

种子培养基(g·L^-1):葡萄糖母液100，酵母粉5.5，KH₂PO₄ 0.8，NaCl 4，MgSO₄·7H₂O 2.3，KCl 0.8，CaCl₂·2H₂O 0.8，pH 6.2。

(2)发酵培养

发酵初始培养基(g·L^-1)：葡萄糖母液230，酵母粉10，乙酸铵2，MgSO₄·7H₂O 4.8，KCl 0.7，CaCl₂·2H₂O 4，调pH 6.2。发酵42h时，添加2.5g/L的甜菜碱。

培养条件：接种量8％，培养温度26℃，通气量0.8vvm，发酵时间95h。发酵开始后，通过流加氢氧化钠和葡萄糖母液控制pH6.2。当菌体进入生长期时，通过控制搅拌转速使OUR维持在12～15mmol/L/H，当60h时，降低搅拌转速使OUR控制在8～12mmol/L/H至发酵结束。在发酵结束前18h停止补料，消耗发酵液中的残糖。

结果见下表所示：

表6

总脂含量％

DHA含量％

EPA含量％

实施例6

77

69

0.3

实施例7

(1)种子培养

种子培养基(g·L^-1):葡萄糖母液130，酵母粉5，KH₂PO₄ 0.9，NaCl 6，MgSO₄·7 H₂O2，KCl 0.7，CaCl₂·2H₂O 0.9，pH 6.5。

将保藏的斜面接种到种子培养基中，23℃、210r·min^-1培养44h。

(2)发酵培养

发酵初始培养基(g·L^-1)：葡萄糖母液225，酵母粉12，乙酸铵1.6，MgSO₄·7H₂O4.8，KCl 0.55，CaCl₂·2H₂O 4.5，调pH 6.5。发酵41h时，添加2.2g/L的甜菜碱。

培养条件：接种量10％，培养温度23℃，通气量0.9vvm，发酵时间94h。发酵开始后，通过流加氢氧化钠和葡萄糖母液控制pH6.5。当菌体进入生长期时，通过控制搅拌转速使OUR维持在12～15mmol/L/H，当58h时，降低搅拌转速使OUR控制在8～12mmol/L/H至发酵结束。在发酵结束前20h停止补料，消耗发酵液中的残糖。

结果见下表所示：

表7

	总脂含量％	DHA含量％	EPA含量％
				实施例7	78	69	0.4

实施例8

(1)种子培养

种子培养基(g·L^-1):葡萄糖母液135，酵母粉5.0，KH₂PO₄ 0.75，NaCl 5.5，MgSO₄·7 H₂O 2.6，KCl 0.65，CaCl₂·2H₂O 0.65，pH 6.3。

(2)发酵培养

发酵初始培养基(g·L^-1)：葡萄糖母液240，酵母粉10.5，乙酸铵1.7，MgSO₄·7H₂O4.9，KCl 0.65，CaCl₂·2H₂O 3.5，调pH 6.3。发酵40h时，添加2g/L的甜菜碱。

结果见下表所示：

表8

	总脂含量％	DHA含量％	EPA含量％
				实施例8	79	71	0.3

应当指出，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，包括将裂殖壶菌在发酵培养基中发酵制得DHA，其特征在于在所述发酵培养基中添加甜菜碱；其中，在发酵40～42h时，添加甜菜碱；

所述发酵培养基为葡萄糖母液200～250g·L^-1，酵母粉10～12g·L^-1，乙酸铵1.5～2g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 4.5～5g·L^-1，KCl 0.5～0.8g·L^-1，CaCl₂·2H₂O 3.5～5g·L^-1，调pH 6.0～6.5；

所述发酵的培养条件为：接种量8～12％，培养温度23～27℃，通气量0.5～1vvm，发酵时间90～96h；发酵开始后，通过流加氢氧化钠和葡萄糖母液控制pH6.0～6.5；当菌体进入生长期时，通过控制搅拌转速使OUR维持在12～15mmol/L/H，当58～60h时，降低搅拌转速使OUR控制在8～12mmol/L/H至发酵结束；在发酵结束前16～20h停止补料，消耗发酵液中的残糖。

2.根据权利要求1所述的裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，其特征在于所述甜菜碱在发酵培养基中的浓度为2～2.5g/L。

3.根据权利要求1所述的裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，其特征在于在所述发酵培养前进行种子培养。

4.根据权利要求3所述的裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，其特征在于所述种子培养的种子培养基为:葡萄糖母液100～140g·L^-1，酵母粉4.5～5.5g·L^-1，KH₂PO₄ 0.7～1g·L^-1，NaCl 4～8g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 2～3g·L^-1，KCl 0.5～1g·L^-1，CaCl₂·2H₂O 0.5～1g·L^-1，pH 6.0～6.5。

5.根据权利要求3或4所述的裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，其特征在于所述种子培养的培养条件为将保藏的斜面接种到种子培养基中，23～27℃、180～220r·min^-1培养42～45h。

6.根据权利要求1～4任意一项所述的裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，其特征在于所述发酵结束后通过离心、絮凝或者过滤的方法收集菌体；然后将菌体通过挤压或酶解法破壁；接着利用非极性溶剂回收含二十二碳六烯酸的粗油，并通过精炼得到二十二碳六烯酸油脂。