KR20160100340A - 미생물로부터 오일을 회수하는 방법 - Google Patents

미생물로부터 오일을 회수하는 방법 Download PDF

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Abstract

미생물로부터 오일을 회수하는 방법이 본원에 제공된다. 본 방법은 예컨대 영양 오일 및/또는 지질 생물연료를 수득하는데 있어서 유용하다. 본원에 기술된 오일을 회수하는 방법은 미생물의 집단을 상기 미생물의 파괴를 유발하는 조건 하에 하나 이상의 효소와 접촉시키는 단계 및 감소된 양의 유기 용매의 존재 하에 또는 유기 용매의 부재 하에 상기 미생물의 집단으로부터 지질을 추출하는 단계를 포함한다.

Description

미생물로부터 오일을 회수하는 방법{METHODS OF RECOVERING OIL FROM MICROORGANISMS}
우선권 출원의 교차-참조
본원은, 전문이 본원에 참고로 포함된, 2013년 12월 20일자로 출원된 미국 가특허원 제61/918,880호에 대한 우선권을 주장한다.
오일은 습윤 추출 방법 또는 건조 추출 방법을 사용하여 미세조류와 같은 미생물로부터 회수될 수 있다. 건조 추출 방법에서, 미생물은 전형적으로 오일 추출 전에 수거되어 건조된다. 그러나, 건조는 비용이 많이 들고 에너지 소모성인 공정이다. 또한, 오일이 다중불포화된 지방산(PUFA)(예를 들면, 식품 및 영양 보충물 적용의 경우)에 농축되어 있는 경우, 상기 공정은 건조시 포함되는 고온으로 인하여 PUFA의 유의적인 산화를 유발할 수 있다.
또한, 미생물로부터 오일을 회수하는 건조 추출 방법은 전형적으로 헥산과 같은 유기 용매를 사용하여 수행되며, 적합한 오일 수득을 위해 기계적인 세포 파괴 방법과 커플링(coupling)할 필요가 있다. 그러나, 기계적인 파괴 방법은 비싸고 에너지 집약적인 반면, 유기 용매는 가연성이고, 독성이며, 최종 오일 생성물로부터 반드시 회수되어야 한다.
본원에는 미생물로부터 오일(예를 들면, 지질)을 회수하는 방법이 제공된다. 본 방법은 예컨대 영양 오일 및/또는 지질 생물연료를 수득하는데 있어서 유용하다. 본원에 기술된 오일을 회수하는 방법은 임의적으로 통합 생물공정, 즉, "원-포트" 방법("one-pot" method)으로서 수행될 수 있다.
본원에 기술된 미생물의 집단으로부터 지질을 회수하는 방법은, 상기 미생물의 집단을 상기 미생물의 파괴를 유발하는 조건 하에 하나 이상의 효소와 접촉시키는 단계; 및 상기 파괴된 미생물로부터 감소된 양의 유기 용매의 존재 하에 또는 유기 용매의 부재 하에 지질을 추출하는 단계를 포함한다. 임의적으로, 상기 접촉 단계는 발효 배지 중에서 일어난다.
추출 단계는 유기 용매의 부재 하에 임의적으로 수행된다. 이러한 예에서, 적어도 60 %의 지질이 미생물의 집단으로부터 추출될 수 있다. 추출 단계는 전통적인 추출 방법과 비교하여 감소된 양의 유기 용매를 사용하여 임의적으로 수행될 수 있다. 이러한 예에서, 적어도 90 %의 지질이 미생물의 집단으로부터 추출될 수 있다. 임의적으로, 미생물 대 유기 용매의 비는 1:6 내지 1:0.2 용적:용적(예를 들면, 1:0.2 용적:용적)이다. 유기 용매는 임의적으로 헥산일 수 있다.
미생물의 집단은 접촉 단계 전에 임의적으로 농축될 수 있다. 임의적으로, 미생물의 집단은 원심분리 및 고체 상의 회수에 의해 농축된다. 미생물의 집단은 20 % 이하의 고체(예를 들면, 15 내지 20 %의 고체)로 농축될 수 있다.
상기 접촉 단계는 계면활성제의 부재 하에 수행될 수 있다. 임의적으로, 상기 접촉 단계는 상하한 포함 범위 6 내지 8.5의 pH(예를 들면, 약 7.5의 pH)에서 수행될 수 있다. 상기 접촉 단계는 상하한 포함 범위 55 내지 70 ℃의 온도에서 수행된다. 임의적으로, 상기 접촉 단계는 70 ℃ 이하의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 접촉 단계는 1 내지 20시간(예를 들면, 4시간) 동안 수행될 수 있다.
임의적으로, 상기 접촉 단계에서 사용된 효소는 프로테아제이다. 상기 효소는 임의적으로 알칼라제 2.4L이다. 임의적으로, 상기 효소는 0.2 내지 0.4 %의 용적/용적의 농도로 존재한다. 상기 접촉 단계는 임의적으로 0.4 % 또는 0.2 % 효소의 존재 하에 55 ℃에서 18 내지 20시간 동안 수행될 수 있다. 예컨대 상기 접촉 단계는 0.4 % 효소의 존재 하에 55 ℃에서 18시간 동안 수행될 수 있다. 임의적으로, 상기 접촉 단계는 0.4 % 효소의 존재 하에 70 ℃에서 4 내지 6시간 동안 수행될 수 있다.
임의적으로, 상기 접촉 단계는 오일(예를 들면, 코코넛 오일)의 존재 하에 수행된다. 임의적으로, 상기 추출 단계는 생물연료의 존재 하에 수행된다.
임의적으로, 상기 방법에는 건조 단계가 없다.
미생물의 집단은 조류, 진균, 세균 및 원생생물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의적으로, 미생물의 집단은 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속, 스키조키트리움(Schizochytrium) 속, 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다. 임의적으로, 상기 미생물의 집단은, 예컨대 ATCC 수탁번호 제PTA-6245호로 기탁된, 트라우스토키트리움 종(Thraustochytrium sp.)이다.
하나 이상의 구현예의 세부사항은 도면 및 하기 설명에 설정되어 있다. 다른 특징, 목적, 및 장점은 설명 및 도면으로부터, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 40 mM(좌측 바아), 100 mM(중간 바아), 및 160 mM(우측 바아)의 염산, 인산, 황산, 수산화나트륨, 및 수산화칼륨으로 가수분해된 세포로부터 회수된 오일의 %를 나타내는 그래프이다.
도 2는 0.2 %(좌측 바아) 및 0.4 %(우측 바아)의 비스코자임, 알칼라제, 플라보르자임, 및 만나웨이 효소로 효소적으로 가수분해된 세포로부터 회수된 오일의 %를 나타내는 그래프이다.
도 3은 40 mM H2SO4, 160 mM H2SO4, 및 0.2 % 알칼라제로 가수분해 후 세척되지 않은(좌측 바아) 및 세척된(우측 바아) 세포로부터 회수된 오일의 %를 나타내는 그래프이다.
도 4는 55 ℃에서 18시간 동안 및 70 ℃에서 4시간 동안 효소적으로 가수분해된 세포로부터 회수된 오일의 %를 나타내는 그래프이다.
도 5는 유기 용매를 사용하여, 감소된 양의 유기 용매를 사용하여, 및 유기 용매를 사용하지 않고, 효소적으로 가수분해하여 추출한 세포로부터 회수된 오일의 %를 나타내는 그래프이다.
도 6은 트리글리세라이드(TG) 조류 오일(좌측 바아), 생물연료(중간 바아), 및 에틸화된(EE) 조류 오일(우측 바아)을 포함하는, 순수한 오일의 지질 부류 프로파일을 기준으로 하여 생물연료로 효소적으로 가수분해하여 추출한 세포로부터 회수된 오일의 %를 나타내는 그래프이다.
미생물의 집단으로부터 지질을 회수하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 지질을 회수하는 방법은, 상기 미생물의 집단을 상기 미생물의 파괴를 유발하는 조건 하에 하나 이상의 효소와 접촉시키는 단계; 및 상기 파괴된 미생물로부터 감소된 양의 유기 용매의 존재 하에 또는 유기 용매의 부재 하에 지질을 추출하는 단계를 포함한다. 본원에 기술된 방법은, 미생물 오일 생산 및 오일을 방출하기 위한 세포 파괴가 동일한 용기 내에서 임의적으로 수행될 수 있으므로, "원-포트" 또는 "통합된" 공정으로 본원에서 언급될 수 있다. 따라서, 하류 가공 단계(예를 들면, 오일 추출 및 회수)는 상류 가공 단계(예를 들면, 발효)의 말기에 통합될 수 있다.
I. 미생물
본원에 기술된 방법은 미생물의 집단으로부터 지질을 회수함을 포함한다. 본원에 기술된 미생물의 집단은 조류(미세조류 포함), 진균(효모 포함), 세균 또는 원생생물일 수 있다. 임의적으로, 미생물은 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목의 트라우스토키트리드(Thraustochytrid), 보다 구체적으로 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 및 스키조키트리움(Schizochytrium) 속의 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales)를 포함한다. 임의적으로, 미생물의 집단은, 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,340,594호 및 제5,340,742호에 기술된 바와 같은 트라스토키트리알레스를 포함한다. 상기 미생물은 ATCC 수탁번호 제PTA-6245호(즉, ONC-T18)로서 기탁된 트라우스토키트리움 종과 같은 트라우스토키트리움 종일 수 있다.
본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 미생물은 다양한 지질 화합물을 생산할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "지질"은 인지질, 유리 지방산, 지방산의 에스테르, 트리아실글리세롤, 스테롤 및 스테롤 에스테르, 카로테노이드, 크산토필(예를 들면, 옥시카로테노이드), 탄화수소, 및 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 지질을 포함한다. 임의적으로, 지질 화합물은 불포화 지질을 포함한다. 상기 불포화 지질은 다중불포화된 지질(즉, 적어도 2개의 불포화 탄소-탄소 결합, 예컨대 이중 결합을 함유하는 지질) 또는 고도로 불포화된 지질(즉, 4개 이상의 불포화 탄소-탄소 결합을 함유하는 지질)을 포함할 수 있다. 불포화된 지질의 예는 오메가-3 및/또는 오메가-6 다중불포화된 지방산, 예컨대 도코사헥사엔산(즉, DHA), 에이코사펜타엔산(즉, EPA), 및 다른 천연적으로 존재하는 불포화된, 다중불포화된, 및 고도로 불포화된 화합물을 포함한다.
II. 공정
발효
본원에 기술된 미생물은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 배양될 수 있다. 예를 들면, 트라우스토키트리드(Thraustochytrid), 예컨대 트라우스토키트리움 종(Thraustochytrium sp.)을, 전문이 본원에 참고로 포함된, 미국 특허공개 제US 2009/0117194호 또는 제US 2012/0244584호에 기술된 방법에 따라 배양할 수 있다. 미생물은 성장 배지(또한 "배양 배지"로 공지됨) 중에서 성장된다. 다양한 배지 중 임의의 것이 본원에 기술된 미생물을 배양하는데 있어서 사용하기에 적합할 수 있다. 임의적으로, 배지는 미생물에 대해 탄소 공급원 및 질소 공급원을 포함하는, 다양한 영양 성분을 공급한다.
임의적으로, 본원에 제공된 미생물은 바이오매스 및/또는 목적한 화합물의 생산(예를 들면, 오일 또는 총 지방산(TFA) 함량)을 증가시키는 조건 하에 배양된다. 예를 들면, 트라우스토키트리드는 전형적으로 염수 배지 중에서 배양된다. 임의적으로, 트라우스토키트리드는, 염 농도가 약 2.0 g/L 내지 약 50.0 g/L인 배지 중에서 배양될 수 있다. 임의적으로, 트라우스토키트리드는, 염 농도가 약 2 g/L 내지 약 35 g/L(예를 들면, 약 18 g/L 내지 약 35 g/L)인 배지 중에서 배양된다. 임의적으로, 본원에 기술된 트라우스토키트리드는 저 염 조건에서 성장될 수 있다. 예를 들면, 트라우스토키트리드는, 염 농도가 5 g/L 내지 약 20 g/L(예를 들면, 약 5 g/L 내지 약 15 g/L)인 배지 중에서 배양될 수 있다. 상기 배양 배지는 NaCl을 임의적으로 포함한다. 임의적으로, 상기 배지는 천연 또는 인공 바다 염 및/또는 인공 해수를 포함한다.
배양 배지 중의 클로라이드 농도는 전통적인 방법과 비교하여 감소(즉, 양에 있어서 보다 적은 양)될 수 있다. 상기 배양 배지는 나트륨 공급원으로서 비-클로라이드-함유 나트륨 염(예를 들면, 황산나트륨)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 총 나트륨의 유의적인 비율은 비-클로라이드 염에 의해 공급되어 배양 배지 중 약 100 %, 75 %, 50 %, 또는 25 % 미만의 총 나트륨이 염화나트륨에 의해 공급되도록 할 수 있다.
임의적으로, 배양 배지는, 클로라이드 농도가 약 3 g/L, 500 mg/L, 250 mg/L, 또는 120 mg/L 미만이다. 예를 들면, 배양 배지는, 클로라이드 농도가 상하한 포함 범위 약 60 mg/L 내지 120 mg/L이다. 본 발명의 방법에 따라 사용하기에 적합한 비-클로라이드 나트륨 염의 예는 소다 회(탄산나트륨과 산화나트륨의 혼합물), 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 황산나트륨, 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,340,742호 및 제6,607,900호를 참고한다.
트라우스토키트리드 배양을 위한 배지는 다양한 탄소 공급원 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 탄소 공급원의 예는 지방산; 지질; 글리세롤; 트리글리세롤; 탄수화물, 예컨대 글루코즈, 전분, 셀룰로즈, 헤미셀룰로즈, 프럭토즈, 덱스트로즈, 크실로즈, 락툴로즈, 갈락토즈, 말토트리오즈, 말토즈, 락토즈, 글리코겐, 젤라틴, 전분(옥수수 또는 밀), 아세테이트, m-이노시톨(옥수수대 액으로부터 기원함), 갈락투론산(펙틴으로부터 기원함), L-푸코즈(갈락토즈로부터 기원함), 겐티오비오스, 글루코사민, 알파-D-글루코즈-1-포스페이트(글루코즈로부터 기원함), 셀룰로비오스, 덱스트린, 및 알파-사이클로덱스트린(전분으로부터 기원함); 슈크로즈(당밀로부터 기원함); 폴리올, 예컨대 말티톨, 에리트리톨, 아도니톨 및 올레산, 예컨대 글리세롤 및 트윈 80; 아미노 당, 예컨대 N-아세틸-D-갈락토사민, N-아세틸-D-글루코사민 및 N-아세틸-베타-D-만노사민; 및 임의의 유형의 바이오매스 또는 폐 스트림을 포함한다.
임의적으로, 배지는 약 5 g/L 내지 약 200 g/L의 농도의 탄소 공급원을 포함한다. 배지는, C:N(탄소 대 질소)의 비가 약 1:1 내지 약 40:1일 수 있다. 2상 배양을 사용하는 경우, 배지는, C:N의 비가 제1의 상의 경우 상하한을 포함하는 범위 약 1:1 내지 약 5:1, 이후에 제2의 상의 경우 상하한을 포함하는 범위 약 1:1 내지 약 1:~0(즉, 질소가 함유되지 않거나 최소임)일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "최소"는 약 10 % 미만(예를 들면, 약 9 % 미만, 약 8 % 미만, 약 7 % 미만, 약 6 % 미만, 약 5 % 미만, 약 4 % 미만, 약 3 % 미만, 약 2 % 미만, 약 1 % 미만, 약 0.9 % 미만, 약 0.8 % 미만, 약 0.7 % 미만, 약 0.6 % 미만, 약 0.5 % 미만, 약 0.4 % 미만, 약 0.3 % 미만, 약 0.2 % 미만, 또는 약 0.1 % 미만)을 지칭한다. 예를 들면, 배지 중 최소 질소는 배지 중 약 10 % 미만(예를 들면, 약 9 % 미만, 약 8 % 미만, 약 7 % 미만, 약 6 % 미만, 약 5 % 미만, 약 4 % 미만, 약 3 % 미만, 약 2 % 미만, 약 1 % 미만, 약 0.9 % 미만, 약 0.8 % 미만, 약 0.7 % 미만, 약 0.6 % 미만, 약 0.5 % 미만, 약 0.4 % 미만, 약 0.3 % 미만, 약 0.2 % 미만, 또는 약 0.1 % 미만)의 질소를 지칭할 수 있다.
트라우스토키트리드 배양용 배지는 다양한 질소 공급원 중의 임의의 것을 포함할 수 있다. 예시적인 질소 공급원은 암모늄 용액(예를 들면, H2O 중 NH4), 암모늄 또는 아민 염(예를 들면, (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, NH4NO3, NH4OOCH2CH3(NH4Ac)), 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 어분(fish meal), 글루탐산나트륨, 대두 추출물, 카사미노산 및 증류 낟알(distiller grain)을 포함한다. 적합한 배지 중 질소 공급원의 농도는 전형적으로 상하한 포함 범위 약 1 g/L 내지 약 25 g/L이다.
배지는 임의적으로 인산칼륨 또는 인산나트륨과 같은 인산염을 포함한다. 배지 중 무기 염 및 미량의 영양소는 황산암모늄, 중탄산나트륨, 오르토바나드산나트륨, 크롬산칼륨, 몰리브덴산나트륨, 셀렌산, 황산니켈, 황산구리, 황산아연, 염화코발트, 염화철, 염화망간, 염화칼슘, 및 EDTA를 포함할 수 있다. 피리독신 하이드로클로라이드, 티아민 하이드로클로라이드, 칼슘 판토테네이트, p-아미노벤조산, 리보플라빈, 니코틴산, 바이오틴, 엽산 및 비타민 B12와 같은 비타민도 포함될 수 있다.
배지의 pH는 산 또는 염기를 사용하고/하거나, 경우에 따라 질소 공급원을 사용하여 상하한 포함 범위 3.0 내지 10.0으로 조정될 수 있다. 임의적으로, 배지의 pH는 상하한 포함 범위 4.0 내지 6.5로 조정된다. 배지는 멸균될 수 있다.
일반적으로, 미생물의 배양을 위해 사용된 배지는 액체 배지이다. 그러나, 미생물의 배양을 위해 사용된 배지는 고체 배지일 수 있다. 본원에 논의된 바와 같은 탄소 및 질소 공급원 외에도, 고체 배지는 구조적 지지체를 제공하고/하거나 배지가 고체형으로 되도록 하는 하나 이상의 성분(예를 들면, 아가 또는 아가로즈)을 함유할 수 있다.
세포는 1일 내지 60일 동안의 임의의 시간 동안 배양될 수 있다. 임의적으로, 배양은 14일 이하, 13일 이하, 12일 이하, 11일 이하, 10일 이하, 9일 이하, 8일 이하, 7일 이하, 6일 이하, 5일 이하, 4일 이하, 3일 이하, 2일 이하, 또는 1일 이하 동안 수행된다. 배양은 약 4 ℃ 내지 약 30 ℃, 예컨대 약 18 ℃ 내지 약 28 ℃의 온도에서 임의적으로 수행된다. 배양은 통기-진탕 배양, 진탕 배양, 정지 배양(stationary culture), 회분(batch) 배양, 반-연속 배양, 연속 배양, 롤링(rolling) 회분 배양, 파동(wave) 배양 등을 포함할 수 있다. 배양은 통상의 교반 발효기, 거품 컬럼 발효기(bubble column fermenter)(회분 또는 연속 배양), 파동 발효기 등을 사용하여 수행될 수 있다.
배양물은 진탕을 비롯한 하나 이상의 다양한 방법에 의해 통기될 수 있다. 임의적으로, 진탕은 약 100 내지 약 1000 rpm, 예컨대 약 350 내지 약 600 rpm 또는 약 100 내지 약 450 rpm의 범위이다. 임의적으로, 배양물은 바이오매스를 생산하는 상 동안 및 지질을 생산하는 상 동안에 상이한 진탕 속도를 사용하여 통기된다. 대안적으로 또는 추가로, 진탕 속도는 배양 용기의 유형(예를 들면, 플라스크의 형태 또는 크기)에 따라 변할 수 있다.
임의적으로, 용존 산소(DO)의 수준은, 이것이 지질 생산 상 동안인 경우보다 바이오매스 생산 상 동안에 더 높다. 따라서, DO 수준은 지질 생산 상 동안 감소된다(즉, DO 수준은 바이오매스 생산 상에서 용존 산소의 양보다 더 적다). 임의적으로, 용존 산소의 수준은 포화 이하로 감소된다. 예를 들면, 용존 산소의 수준은 매우 낮은, 또는 심지어 검출불가능한 수준으로 감소될 수 있다.
바람직한 지질의 생산은 바람직한 화합물의 보다 많은 양을 수득하기 위하여 하나 이상의 배양 조건의 이동(shift)을 포함하는 방법에 따라 세포를 배양함으로써 향상될 수 있다. 임의적으로, 세포는 바이오매스를 최대화하는 조건하에 배양된 후 하나 이상의 배양 조건을 지질 생산성에 양호한 조건으로 이동시킴으로써 배양된다. 이동되는 조건은 산소 농도, C:N 비, 온도, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 임의적으로, 바이오매스 생산을 선호하는(예를 들면, (일반적으로 또는 제2 단계에 대해 상대적으로) 높은 산소, 낮은 C:N 비, 및 주위 온도의 조건을 사용하는) 제1 단계 및 이어서 지질 생산을 선호하는(예를 들면, 산소는 감소되고, C:N 비는 증가되고, 온도는 감소되는) 제2 단계를 수반하는, 2단계 배양을 수행한다.
저온살균( Pasteurization )
임의적으로, 생성되는 바이오매스를 저온살균시켜 세포를 사멸시키고 바이오매스 중에 존재하는 바람직하지 않은 물질을 불활성화시킨다. 예를 들면, 바이오매스를 저온살균시켜 물질을 분해하는 화합물을 불활성화시킬 수 있다. 바이오매스는 발효 배지 중에 존재할 수 있거나 저온살균 단계용 발효 배지로부터 단리될 수 있다. 저온살균 단계는 바이오매스 및/또는 발효 배지를 고온으로 가열함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 바이오매스 및/또는 발효 배지를 상하한 포함 범위 약 50 ℃ 내지 약 95 ℃의 온도(예를 들면, 상하한 포함 범위 약 60 ℃ 내지 약 90 ℃, 또는 상하한 포함 범위 약 65 ℃ 내지 약 80 ℃)로 가열할 수 있다. 임의적으로, 바이오매스 및/또는 발효 배지는 상하한 포함 범위 약 30분 내지 약 120분(예를 들면, 상하한 포함 범위 약 45분 내지 약 90분, 또는 상하한 포함 범위 약 55분 내지 약 75분) 동안 가열될 수 있다. 저온살균은 직접적인 증기 주입(steam injection)에 의해서와 같이, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적합한 가열 수단을 사용하여 수행될 수 있다.
수거 및 세척
임의적으로, 바이오매스는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 수거될 수 있다. 예를 들면, 바이오매스는 원심분리(예를 들면, 고체-배출 원심분리(solid-ejecting centrifuges)) 또는 여과(예를 들면, 교차-유동 여과)와 같은 다양한 통상의 방법을 사용하여 발효 배지로부터 임의적으로 수집될 수 있고 또한 세포 바이오매스의 가속화된 수집을 위한 침전제(예를 들면, 인산나트륨 또는 염화칼슘)의 사용을 포함할 수 있다.
임의적으로, 바이오매스는 물로 세척된다. 임의적으로, 바이오매스는 상한 포함 범위 약 20 %까지의 고체로 농축될 수 있다. 예를 들면, 바이오매스는 상하한 포함 범위 약 5 % 내지 약 20 %의 고체, 상하한 포함 범위 약 7.5 % 내지 약 15 %의 고체, 또는 상하한 포함 범위 약 15 % 내지 약 20 %의 고체, 또는 언급된 범위 내의 임의의 %의 고체로 농축될 수 있다. 임의적으로, 바이오매스는 약 20 % 이하의 고체, 약 19 % 이하의 고체, 약 18 % 이하의 고체, 약 17 % 이하의 고체, 약 16 % 이하의 고체, 약 15 % 이하의 고체, 약 14 % 이하의 고체, 약 13 % 이하의 고체, 약 12 % 이하의 고체, 약 11 % 이하의 고체, 약 10 % 이하의 고체, 약 9 % 이하의 고체, 약 8 % 이하의 고체, 약 7 % 이하의 고체, 약 6 % 이하의 고체, 약 5 % 이하의 고체, 약 4 % 이하의 고체, 약 3 % 이하의 고체, 약 2 % 이하의 고체, 또는 약 1 % 이하의 고체로 농축될 수 있다.
가수분해
세포 가수분해(즉, 세포 파괴)는 화학적, 효소적, 및/또는 기계적 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 세포를 가수분해하기 위한 화학적 방법은 산을 세포에 첨가함을 포함할 수 있으며, 이는 본원에서 산 가수분해로 언급된다. 산 가수분해 방법에서, 바이오매스는, 예컨대 원심분리를 사용하여, 물로 세척될 수 있으며, 세포를 가수분해하기 전에 위에서 기술한 바와 같이 농축될 수 있다. 임의적으로, 바이오매스는 물을 사용하여 약 15 %의 고체로 농축된다.
이후에, 세척된 습윤 바이오매스에 산을 첨가한다. 임의적으로, 바이오매스는 산을 첨가하기 전에 건조되지 않는다. 산 가수분해 단계에서 사용하기에 적합한 산은 황산, 염산, 인산, 브롬화수소산, 질산, 과염소산, 및 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 다른 강산을 포함한다. 적합한 양의 산을 세척된 습윤 바이오매스에 첨가하여 상하한 포함 범위 약 100 mM 내지 약 200 mM의 최종 농도(예를 들면, 상하한 포함 범위 약 120 mM 내지 약 180 mM 또는 상하한 포함 범위 약 140 mM 내지 약 160 mM)를 달성할 수 있다. 황산을 세척된 습윤 바이오매스에 160 mM의 최종 농도로 첨가할 수 있다.
이후에, 물, 바이오매스, 및 산을 포함하는 생성되는 혼합물은 세포를 가수분해하기에 충분한 기간 동안 항온처리될 수 있다. 임의적으로, 상기 혼합물은 상하한 포함 범위 약 30 ℃ 내지 약 200 ℃의 온도에서 항온처리될 수 있다. 예를 들면, 상기 혼합물은 상하한 포함 범위 약 45 ℃ 내지 약 180 ℃, 상하한 포함 범위 약 60 ℃ 내지 약 150 ℃, 또는 상하한 포함 범위 약 80 ℃ 내지 약 130 ℃에서 항온처리될 수 있다. 임의적으로, 상기 혼합물은 오토클레이브(autoclave) 중에서 121 ℃의 온도에서 항온처리된다. 상기 혼합물은 세포의 적어도 50 %(예를 들면, 세포의 적어도 60 %, 세포의 적어도 70 %, 세포의 적어도 80 %, 세포의 적어도 90 %, 세포의 적어도 95 %, 또는 세포의 100 %)를 가수분해하기에 적합한 기간 동안 항온처리될 수 있다. 세포를 항온처리하는 기간은 항온처리 온도에 의존한다. 혼합물을 보다 높은 온도에서 항온처리하면 가수분해를 보다 빠른 속도(즉, 가수분해를 위한 보다 짧은 기간을 필요로 함)에서 진행시킬 수 있다. 일부 예에서, 세포는 60 ℃에서 1시간 동안 항온처리될 수 있다. 임의적으로, 항온처리 단계는 직접적인 또는 간접적인 저온살균 장비, 예를 들어 마이크로써믹스(Microthermics)(미국 노쓰 캐롤라이나주 랄레이 소재)로부터 상업적으로 입수가능한 연속 유동 열 시스템(예를 들면, MicroThermics UHT/HTST Lab 25 EHV Hybrid)을 사용하여 수행된다.
전술된 바와 같이, 세포 가수분해(즉, 세포 파괴)는 효소적 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 미생물의 집단은 미생물의 파괴를 유발하는 조건 하에 하나 이상의 효소와 접촉될 수 있다. 임의적으로, 효소는 프로테아제이다. 적합한 프로테아제의 예는 알칼라제 2.4L FG(제조원: 미국 노쓰 캐롤라이나주 프랭클린톤 소재의 노보자임즈(Novozymes))이다. 임의적으로, 세포는 효소적 가수분해 전에 물로 세척되지 않는다.
미생물의 집단을 발효시켜 수성 배지 중에서 부유시킬 수 있다. 발효 배지는 발효기 중에 중력 정착될 수 있으며 상기 배지를 경사분리하거나 대안적으로 제거하여 미생물의 집단의 목적하는 농도를 제공할 수 있다. 대안적으로, 발효 배지를 원심분리로 농축시켜 미생물의 집단의 목적하는 농도를 제공할 수 있다. 미생물의 집단은 상한 포함 범위 20 %까지의 고체로 농축될 수 있다. 예를 들면, 미생물의 집단은 상하한 포함 범위 약 5 % 내지 약 20 %의 고체, 상하한 포함 범위 약 7.5 % 내지 약 15 %의 고체, 또는 상하한 포함 범위 약 15 % 내지 약 20 %의 고체, 또는 언급된 범위 내의 임의의 %로 농축될 수 있다. 미생물의 집단은 미생물을 하나 이상의 효소와 접촉시키기 전에 농축될 수 있다.
미생물을 하나 이상의 효소와 접촉시키기 전에, 발효 배지의 pH를 상하한 포함 범위 약 6 내지 8.5, 예컨대 상하한 포함 범위 약 6.5 내지 8.5 또는 상하한 포함 범위 약 7 내지 8, 또는 인용된 범위 내 임의의 값으로 임의적으로 조정할 수 있다. 예를 들면, 발효 배지의 pH를 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 또는 8.5로 임의적으로 조정할 수 있다. pH를 예컨대 수산화나트륨(예를 들면, 1 N NaOH), 수산화암모늄, 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 또는 수산화칼륨과 같은 염기를 사용하여 조정할 수 있다.
미생물을, 미생물의 집단이 발효 배지 중에 있는 동안 하나 이상의 효소와 접촉시킬 수 있다(즉, 접촉 단계는 발효 배지 중에서 일어난다). 임의적으로, 발효 배지에 첨가된 효소는 약 0.2 % 내지 약 0.4 % 용적/용적(v/v)의 농도로 존재한다. 예를 들면, 발효 배지에 첨가된 효소는 0.2 %(v/v), 0.25 %(v/v), 0.30 %(v/v), 0.35 %(v/v), 또는 0.4 %(v/v)의 농도로 존재할 수 있다.
상기 접촉 단계를 70 ℃ 이하의 온도에서 수행할 수 있다. 예를 들면, 상기 미생물을 하나 이상의 효소와 약 70 ℃ 이하, 약 65 ℃ 이하, 약 60 ℃ 이하, 약 55 ℃ 이하, 약 50 ℃ 이하, 또는 약 45 ℃ 이하의 온도에서 접촉시킬 수 있다. 임의적으로, 상기 접촉 단계를 상하한 포함 범위 약 45 내지 약 70 ℃, 상하한 포함 범위 약 50 내지 70 ℃, 또는 상하한 포함 범위 약 55 내지 약 65 ℃의 온도에서 수행한다. 상기 접촉 단계를 미생물의 파괴를 초래하기에 적합한 기간 동안 수행할 수 있다. 예를 들면, 상기 접촉 단계를 상하한 포함 범위 약 1시간 내지 약 20시간, 예컨대 2시간 내지 18시간, 4시간 내지 16시간, 6시간 내지 14시간, 또는 8시간 내지 12시간 동안, 또는 인용된 범위 내 임의의 시간범위 동안 수행할 수 있다. 임의적으로, 상기 접촉 단계를 약 4시간 동안 수행할 수 있으며 상기 가수분해 온도는 임의적으로 약 70 ℃일 수 있다.
최적 온도, 시간, pH, 및 효소 농도는 특정 효소에 의존하며, 당해 분야의 통상의 기술자는 제공된 효소에 적절한 것으로서 온도, 시간, pH, 및 효소 농도를 조절할 수 있다.
임의적으로, 상기 접촉 단계를 약 0.2 % 또는 약 0.4 %의 효소의 존재 하에 약 18시간 내지 20시간 동안 약 55 ℃에서 수행한다. 예를 들면, 상기 접촉 단계를 0.4 %의 효소의 존재 하에 55 ℃에서 18시간 동안 수행할 수 있다. 대안적으로, 접촉 단계를 0.4 % 효소의 존재 하에 70 ℃에서 4시간 내지 6시간 동안 수행한다. 임의적으로, 상기 접촉 단계를 계면활성제의 부재(즉, 계면활성제가 존재하지 않음) 하에 수행한다.
임의적으로, 상기 세포 파괴를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 다른 화학적 및 기계적 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 세포 파괴를 알칼리성 가수분해, 비드 분쇄(bead milling), 음파처리, 세제 가수분해, 용매 추출, 신속한 감압(즉, 세포 밤(cell bomb) 방법, 또는 고-전단 기계적 방법, 화학물질과의 접촉, 균질화, 초음파, 분쇄, 전단력, 프렌치 프레스(French press), 냉간 프레스(cold-pressing), 가열, 건조, 삼투압 쇼크, 압력 맥동(pressure oscillation), 자기분해 유전자의 발현, 또는 이들의 조합을 사용하여 수행할 수 있다. 임의적으로, 세포 파괴를 본원에 기술된 화학적, 효소적, 및/또는 기계적 방법 중의 2개 이상의 조합(예를 들면, 효소적 가수분해와 비드 분쇄의 조합)을 사용하여 수행할 수 있다. 세포 파괴 방법을 순차적으로(예를 들면, 비드-분쇄에 이은 효소 가수분해) 수행할 수 있다.
추출
전술된 바와 같이, 지질은 감소된 양의 유기 용매의 존재(즉, 유기 용매 추출) 하에 또는 유기 용매의 부재 하에 미생물의 집단으로부터 추출된다.
임의적으로, 상기 추출 단계는 전체적인 무수 미생물 세포로부터 지질을 추출하는데 필요한 유기 용매의 양과 비교하여 유기 용매의 감소된 양을 사용하여 수행된다. 본원에 사용된 용어 "전체적인 무수 미생물 세포로부터 지질을 추출하는데 필요한 유기 용매의 양과 비교하여 유기 용매의 감소된 양"은 전체적인 무수 미생물 세포로부터 지질을 추출하는데 필요한 것보다 적은 유기 용매의 양을 의미한다. 예를 들면, 미생물 또는 바이오매스 대 전체 무수 미생물 세포에 필요한 유기 용매의 비는 전형적으로 1:4 이상이다. 따라서, 유기 용매의 감소된 양은 약 1:4 미만의 미생물 또는 바이오매스 대 유기 용매의 비를 제공할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 가수분해된 습윤 바이오매스로부터 오일을 추출하기 위한 미생물 또는 바이오매스 대 유기 용매의 비는 상하한 포함 범위 약 1:0.2 내지 약 1:1(예를 들면, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 또는 1:0.9)일 수 있다. 임의적으로, 유기 용매의 추가의 양은 약 1:6 비 이하와 같은, 미생물 또는 바이오매스 대 유기 용매의 추가의 양을 사용할 수 있다.
상기 추출 단계에서 사용하기에 적합한 유기 용매는 헥산, 이소프로필 알코올, 염화메틸렌, 도데칸, 메탄올, 에틸화된 오일, 및 초임계 이산화탄소를 포함한다.
유기 용매 및 미생물 또는 바이오매스를 상기 미생물 또는 바이오매스로부터 지질을 추출하기에 적합한 기간 동안 혼합할 수 있다. 예를 들면, 유기 용매 및 미생물 또는 바이오매스를 약 10분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 40분 이상, 50분 이상, 1시간 이상, 또는 2시간 이상 동안 혼합할 수 있다. 후속적으로, 상기 지질을 용액을 원심분리함으로써 상기 혼합물의 나머지 성분으로부터 분리할 수 있다.
임의적으로, 미생물에 의해 이론적으로 생산된 상기 지질의 적어도 약 50 %를 상기 미생물의 집단으로부터 당해 방법을 사용하여 미생물의 집단으로부터 추출한다(즉, 상기 방법은 적어도 50 % 수율을 제공한다). 예를 들면, 상기 미생물의 집단으로부터 추출된 지질의 수율은 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %일 수 있다.
지질을 또한 유기 용매의 부재 하에 미생물의 집단으로부터 추출할 수 있다. 본원에 사용된 "유기 용매의 부재 하"란, 미생물의 집단의 중량을 기준으로 하여, 약 0.5 % 미만(예를 들면, 약 0.4 % 미만, 약 0.3 % 미만, 약 0.2 % 미만, 약 0.1 % 미만, 약 0.05 % 미만, 약 0.01 % 미만, 약 0.005 % 미만, 또는 0 %)의 유기 용매를 의미한다.
임의적으로, 상기 지질을 오일(예를 들면, 코코넛 오일) 또는 생물연료를 사용함으로써 파괴된 미생물로부터 추출할 수 있다.
임의적으로, 상기 추출 단계 동안 첨가된 오일은 영양 오일(예를 들면, 영양 공급원으로부터 기원하거나 수득된 오일)일 수 있다. 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 적합한 영양 오일의 예는 코코넛 오일, 팜 오일, 캐놀라 오일, 해바라기 오일, 대두 오일, 옥수수 오일, 올리브 오일, 잇꽃 오일, 팜 커넬 오일, 면화씨 오일, 및 이들의 조합물을 포함한다. 알킬화된 유도체와 같은 이들 오일 중 임의의 것의 유도체(예를 들면, 메틸화된 또는 에틸화된 오일)가 또한 사용될 수 있었다.
본원에 사용된 생물연료는 바이오매스 출발 물질로부터 유도된 임의의 연료, 연료 첨가물, 방향족, 및/또는 지방족 화합물을 지칭한다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법에서 사용하기에 적합한 생물연료는 식물 공급원 또는 조류 공급원으로부터 유도될 수 있다. 생물연료용으로 적합한 공급원의 예는 조류, 옥수수, 스위치그래스(switchgrass), 사탕수수, 사탕무우, 평지씨, 대두 등을 포함한다.
임의적으로, 생물학적 공급원으로부터 오일을 수거하여 상기 오일을 생물연료로 전환함으로써 생물연료를 수득할 수 있다. 생물학적 공급원으로부터 수득된 오일(예를 들면, 식물 및/또는 조류 공급원으로부터 수득된 오일)을 전환하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 임의적으로, 생물연료를 수득하는 방법은 오일을 생산하는 바이오매스(예를 들면, 조류)를 배양하는 단계, 상기 오일(예를 들면, 조류 오일)을 추출하는 단계, 및 상기 오일(예를 들면, 조류 오일)을 전환하여 생물연료를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 임의적으로, 상기 오일을 에스테르교환반응을 사용하여 생물연료로 전환할 수 있다. 본원에 사용된 에스테르교환반응은 에스테르의 알콕시 기를 다른 알코올로 교환하는 공정을 지칭한다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 에스테르교환반응 공정은 조류, 예컨대 트리글리세라이드를 생물디젤, 예컨대 지방산 알킬 에스테르 및 글리세롤로 전환함을 포함할 수 있다. 산 또는 염기 촉매된 반응과 같은 전통적인 화학적 공정을 사용하거나, 효소-촉매된 반응을 사용함으로써 에스테르교환반응을 달성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유기 용매"는, 당해 용어가 본원에서 정의되며, 코코넛 오일, 팜 오일, 캐놀라 오일, 해바라기 오일, 대두 오일, 옥수수 오일, 올리브 오일, 잇꽃 오일, 팜 커넬 오일, 면화씨 오일 또는 이의 알킬화된(예를 들면, 메틸화된 또는 에틸화된) 유도체와 같은 영양 오일을 포함하지 않으므로, 생물연료를 포함하지 않는다.
임의적으로, 파괴된 미생물로부터 지질을 추출하는데 사용된 오일 또는 생물연료는 추출된 지질로부터 후속적으로 제거되지 않는다. 첨가된 오일 또는 생물연료가 단지 하나의 오일 분획과 함께 머무는, 추출된 오일의 후속적 분별은, 추출된 지질로부터의 오일 또는 생물연료의 제거를 고려하지 않는다. 예를 들면, 본원에 기술된 오일은 회수 후 본원에 기술된 하나 이상의 생성물로서 사용하기 위해 다른 오일과 합해지거나, 하나 이상의 생성물 내로 혼입될 수 있다. 생물연료와 같은, 다른 오일 또는 생성물 중의 어느 하나도 회수 공정의 종결 후에 회수된 오일과 합하는 것에 대한 대안으로서, 또는 이와 합하는 것 외에, 추출 단계 동안에 지질 및 바이오매스의 혼합물에 첨가될 수 있다. 추출 단계 동안 다른 오일의 첨가는 소비된 바이오매스로부터 지질의 탈유화(demulsification) 및 분리를 보조할 수 있다.
바이오매스로부터 지질을 분리하기 위한 유기 용매 추출에 의존하는 전통적인 방법에서, 유기 용매는, 비록 전형적으로 적어도 미량의 용매가 남아있다고 하더라도, 회수 후 지질로부터 제거되어야만 한다. 그러나, 본원에 기술된 방법에서, 임의적으로 추출 단계 동안 첨가된 오일 또는 생물연료 중 약 80 % 초과는, 이것이 최종 생성물로서 사용되거나 최종 생성물 내로 혼입되는 경우 회수된 오일 중에 잔존한다. 즉, 임의적으로 추출 단계 동안 첨가된 오일 또는 생물연료의 약 20 % 미만이 최종 생성물로서 사용되기 전에 또는 최종 생성물 내로 혼입되기 전에 회수된 오일로부터 제거된다. 예를 들면, 임의적으로 추출 단계 동안 첨가된 오일 또는 생물연료의 약 15 % 미만, 약 10 % 미만, 약 5 % 미만, 약 2 % 미만, 또는 0 %가 최종 생성물로서 사용되기 전에 또는 최종 생성물 내로 혼입되기 전에 회수된 오일로부터 제거된다.
임의적으로, 미생물에 의해 이론적으로 생산된 지질의 적어도 40 %를 상기 미생물의 집단으로부터 당해 방법을 사용하여 추출한다(즉, 상기 방법은 적어도 약 40% 수율을 제공한다). 예를 들면, 상기 미생물의 집단으로부터 추출된 지질의 수율은 적어도 약 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 또는 적어도 80 %일 수 있다.
대안적으로, 상기 지질을 기계적 방법을 사용하여 추출할 수 있다. 가수분해된 바이오매스 및 미생물은 원심분리될 수 있고 지질은 성분의 나머지로부터 분리될 수 있다. 임의적으로, 상기 지질은 원심분리된 물질의 상부 층 중에 함유되며, 예컨대 다른 물질로부터 흡입 또는 경사분리에 의해 제거될 수 있다.
III . 생성물
본원에 기술된 방법에 따라 생산된 다중불포화된 지방산(PUFA) 및 다른 지질은, 예컨대 이들의 생물학적 또는 영양학적 특성을 이용하는, 다양한 적용 중 임의의 것에서 이용될 수 있다. 임의적으로, 화합물은 약제, 식품 보충물, 동물 사료 첨가물, 화장품 등에서 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 또한 다른 화합물의 생산시 중간체로서 사용될 수 있다.
임의적으로, 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 지질을 최종 생성물(예를 들면, 음식 또는 사료 보충물, 유아식, 약제, 연료 등) 내로 혼입할 수 있다. 본원에 기술된 지질을 혼입하기에 적합한 식품 또는 사료 보충물은 우유, 물, 스포츠 음료, 에너지 음료, 차, 및 쥬스와 같은 음료; 젤리 및 비스켓과 같은 당과제품; 유제품과 같은 지방-함유 식품 및 음료; 연질미(또는 오트밀)와 같은 가공된 식료품; 이유식; 아침식사용 시리얼 등을 포함한다. 임의적으로, 하나 이상의 생산된 지질은, 예컨대 멀티비타민과 같은 식이 보충물 내로 혼입될 수 있다. 임의적으로, 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 식이 보충물 내로 혼입될 수 있으며 임의적으로 식품 또는 사료(예를 들면, 식품 보충물)의 성분 내로 직접 혼입될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 생산된 지질이 혼입될 수 있는 사료의 예는 고양이 사료; 개 사료 등과 같은 애완동물 사료; 관상어, 양식어류 또는 갑각류 등을 위한 사료; 농장에서 키운 동물을 위한 사료(예를 들면, 가축 및 수산증식에서 생성된 어류 또는 갑각류 포함)를 포함한다. 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 지질이 혼입될 수 있는 식품 또는 사료 물질은 바람직하게는 의도된 수용체인 유기체의 구미에 맞을 수 있다. 당해 식품 또는 사료 물질은 식품 재료에 대해 현재 공지된 임의의 물리적 특성(예를 들면, 고체, 액체, 연질)을 가질 수 있다.
임의적으로, 생산된 화합물(예를 들면, PUFA) 중의 하나 이상이 약제 내로 혼입될 수 있다. 이러한 약제의 예는 다양한 유형의 정제, 캅셀제, 마실 수 있는 제제 등을 포함한다. 임의적으로, 약제는 국소 적용에 적합하다. 용량형은 예컨대 캅셀제, 오일, 과립제, 과립 섭틸(granula subtilae), 산제, 정제, 환제, 트로키제 등을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 다양한 제제 중의 임의의 것을 조합함으로써 본원에 기술된 바와 같은 생성물 내로 혼입될 수 있다. 예를 들면, 이러한 화합물은 하나 이상의 결합제 또는 충전제와 합해질 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 하나 이상의 킬레이트제, 안료, 염, 계면활성제, 습윤화제, 점도 조절제, 증점제, 연화제, 향료, 방부제 등, 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
하기 실시예는 본원에 기술된 방법 및 조성물의 특정 국면을 추가로 예증하기 위한 의도이며, 청구범위의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 저온살균, 수거 및 세척, 및 화학적 가수분해
저온살균
T18 바이오매스를 60 ℃에서 1시간 동안 교반하면서 가열함으로써 세포를 저온살균시켰다.
수거 및 세척
저온살균된 T18 바이오매스를 4150 rpm에서 20분 동안 주위 온도에서 원심분리하여 세포 페이스트로부터 최종 배지를 분리하였다. 배지를 제거하고, 등가 질량의 물을 세포 페이스트에 첨가하여 세포를 세척하였다. 세포 페이스트-물 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 재-원심분리하고, 수성 상을 제거하였다.
화학적 가수분해
물로 세척한 T18 세포 페이스트를 물을 사용하여 150 g/L로 조정하였다. 부샘플(subsample)(10 mL)을 제거하고 50 mL 원심분리 튜브에 첨가하였다. 각각의 부샘플을 표 1에 따른 최종 농도로 산 또는 염기를 사용하여 처리하였다. 혼합물을 121 ℃에서 15분 동안 오토클레이빙(autoclaving)하여 세포를 가수분해하였다. 가수분해 후 샘플을 헥산으로 추출하여 질량 균형에 의해 회수된 오일의 %를 측정하였다(도 1). 160 mM HCl 및 H2SO4를 사용한 가수분해로 85 % 초과의 오일 회수율을 수득하였다.
샘플 번호 산/염기 유형 농도 ( mM ) 오일 회수율 (%)
1 HCl 40 1
2 HCl 100 47
3 HCl 160 100
4 H3PO4 40 12
5 H3PO4 100 3
6 H3PO4 160 5
7 H2SO4 40 7
8 H2SO4 100 68
9 H2SO4 160 94
10 NaOH 40 8
11 NaOH 100 40
12 NaOH 160 52
13 KOH 40 8
14 KOH 100 20
15 KOH 160 54
실시예 2: 효소적 가수분해
물로 세척된 T18 세포 페이스트를 물을 사용하여 220 g/L로 조정하였다. pH를 1 N NaOH를 사용하여 7.5로 조정하였다. 부샘플(10 mL)을 제거하고 50 mL 원심분리 튜브에 첨가하였다. 각각의 부샘플을 표 2에 따른 효소로 처리하였다. 상기 혼합물을 50 ℃에서 22시간 동안 진탕하면서 항온처리하여 세포를 가수분해하였다. 가수분해 후, 샘플을 헥산으로 추출하여 질량 균형으로부터 회수된 오일의 %를 측정하였다(도 2). 알칼라제 단독 또는 다른 효소와의 조합물을 사용한 가수분해로 85 % 초과의 오일 회수율을 수득하였다.
샘플 번호 효소 농도 (% v/v) 오일 회수율 (%)
1 비스코자임 0.2 0.1
2 0.4 0.3
3 알칼라제 0.2 96
4 0.4 96
5 플라보르자임 0.2 1
6 0.4 0.3
7 만나웨이 0.2 0
8 0.4 0.8
9 알칼라제/비스코자임 0.2/0.2 93
10 알칼라제/만나웨이 0.2/0.2 91
11 플라보자임/만나웨이 0.2/0.2 0.3
실시예 3: 산 및 효소적 가수분해, 세척의 효과
저온살균되고, 세척되지 않은 T18 바이오매스(10 mL)의 부샘플을 50 mL 원심분리 튜브에 첨가하였다. 대조군을 물로 세척하고, 170 g/L 물로 조정하고, 50 mL 원심분리 튜브 내로 부샘플링하였다. 각각의 부샘플을 표 3에 따른 산 또는 효소로 처리하였다. 산 가수분해된 샘플을 121 ℃에서 15분 동안 오토클레이빙하여 세포를 가수분해하였다. 효소적으로 가수분해된 샘플을 1 N NaOH를 사용하여 pH 7.5로 조정하고 50 ℃에서 26시간 동안 진탕하면서 항온처리하여 세포를 가수분해하였다. 산 또는 효소적 가수분해 후, 샘플을 헥산으로 추출하여 질량 균형에 의해 회수된 오일의 %를 측정하였다(도 3). 세척된 오일 회수율과 등가인 세척되지 않은 오일 회수율은 0.2% 알칼라제 가수분해로 달성되었다.
샘플 번호 세척됨/세척되지 않음 산/효소 처리 농도 오일 회수율 (%)
1 세척되지 않음 H2SO4 40 mM 5
2 세척됨 H2SO4 40 mM 61
3 세척되지 않음 H2SO4 160 mM 27
4 세척됨 H2SO4 160 mM 91
5 세척되지 않음 알칼라제 0.2% v/v 93
6 세척됨 알칼라제 0.2% v/v 94
실시예 4: 효소적 가수분해, 온도/시간의 효과
물로 세척된 T18 세포 페이스트를 물을 사용하여 210 g/L로 조정하였다. pH를 1 N NaOH을 사용하여 7.5로 조정하였다. 부샘플(10 mL)을 50 mL의 원심분리 튜브 내로 첨가하였다. 각각의 부샘플을 0.2 % v/v 알칼라제로 처리하였다. 상기 혼합물을 70 ℃에서 4시간 동안 진탕하면서 항온처리하여 세포를 가수분해하였다. 대조군은 55 ℃에서 18시간 동안 진탕하면서 항온처리하였다. 가수분해 후, 샘플을 헥산으로 추출하여 질량 균형에 의해 회수된 오일의 %를 측정하였다(도 4). 상기 온도를 70 ℃로 상승시킴으로써, 55 ℃에서 18시간 동안 가수분해한 것에 대해 등가인 오일 회수율이 4시간 내에 달성되었다.
실시예 5: 효소적 가수분해, 감소된 양의 유기 용매를 사용한 추출
물로 세척된 T18 세포 페이스트를 물을 사용하여 220 g/L로 조정하였다. pH를 1 N NaOH을 사용하여 7.5로 조정하였다. 부샘플(10 mL)을 50 mL 원심분리 튜브에 첨가하였다. 각각의 부샘플을 0.2 % v/v 알칼라제로 처리하였다. 혼합물을 55 ℃에서 22시간 동안 진탕하면서 항온처리하여 세포를 가수분해하였다. 가수분해 후, 각각의 부샘플을 표 4에 따라 추출하고 회수된 오일의 %를 질량 균형에 의해 측정하였다(도 5). 대조군은 1:2(습윤 바이오매스:헥산)로 추출한 헥산이었다. 샘플 2를 4150 rpm에서 20분 동안 40 ℃에서 원심분리하였다. 샘플 3을 20 g/L NaCl로 처리한 후 원심분리하였다. 샘플 4를 20 g/L NaCl로 처리한 후 원심분리하였다. 오일 층을 제거하고 1:0.2 습윤 바이오매스:헥산을 첨가하여 나머지 오일을 추출하였다. 헥산 추출 전에 유리 오일을 제거함으로써 1:2(습윤 바이오매스:헥산) 비와 등가인 오일 회수율이 1:0.2(습윤 바이오매스:헥산) 비로 달성되었다.
샘플 번호 추출 방법 오일 회수율 (%)
1 1:2의 습윤 바이오매스:헥산 95
2 용매 부재(원심분리 단독) 12
3 20g/L NaCl + 원심분리 51
4 NaCl + 원심분리 > 1:0.2 습윤 바이오매스:헥산 99
실시예 6: 효소적 가수분해, 생물연료로 추출
물로 세척된 T18 세포 페이스트를 물을 사용하여 200 g/L로 조정하고, pH를 1 N NaOH를 사용하여 7.5로 조정하였다. 부샘플(10 mL)을 제거하고 50 mL 원심분리 튜브에 첨가하였다. 각각의 부샘플을 0.2 % v/v 알칼라제로 처리하였다. 상기 혼합물을 55 ℃에서 18시간 동안 진탕하면서 항온처리하여 세포를 가수분해하였다. 가수분해 후, 각각의 부샘플을 표 5에 따라 생물연료로 추출하고 오일의 %를 질량 균형에 의해 및 순수한 오일의 지질 부류 프로파일을 기준으로 측정하였다(도 6 및 표 5). 1:0.4(습윤 바이오매스:생물연료)를 사용한 추출로 지질 부류 프로파일을 기준으로 하여 85 % 초과의 오일 회수율을 수득하였다. 트리글리세라이드(TG) 조류 오일을 에틸화(EE)하고 오일 추출 뿐만 아니라 모 TG 오일을 위해 사용하였다(표 6). 습윤 바이오매스:EE 조류 오일의 모든 비는 지질 부류 프로파일을 기준으로 하여 85 % 초과의 오일 회수율을 생성하였다.
습윤 바이오매스 :생물연료
비 		TG : EE - FFA
비 		조류 오일
% 		실제 조류 오일
% 		오일 회수율
(%)
순수한 조류 오일 52.8 100
1:2 0.0455 4.45 7.96 56
1:1 0.0764 7.44 14.7 51
1:0.4 0.268 20.48 23.5 96
1:0.2 0.42 31.42 46.4 68
생물연료 0.00291 0
습윤 바이오매스 :추출 오일
비 		오일 추출 효율
(질량 균형 기준)(%) 		오일 추출 효율
( DHA :올레산 비 기준)(%)
생물연료
1:2 76 56
1:1 54 51
1:0.4 59 96
1:0.2 54 68
TG 조류 오일
1:2 52
1:1 40
1:0.4 34
1:0.2 43
EE 조류 오일
1:2 76 100
1:1 70 100
1:0.4 75 100
1:0.2 83 100
첨부된 청구범위의 조성물 및 방법은 본원에 기술된 구체적인 조성물 및 방법에 의해 범위를 한정하지 않으며, 이는 청구범위의 몇몇의 국면 및 본 기재내용의 범위 내에 있는 기능적으로 등가인 임의의 조성물 및 방법을 예증하는 것으로 의도된다. 본원에 나타내고 기술된 것 이외의 조성물 및 방법의 다양한 변형이 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 또한, 특정의 대표적인 조성물, 방법, 및 이들 조성물 및 방법의 국면이 구체적으로 기술되어 있지만, 다른 조성물 및 방법, 및 상기 조성물 및 방법의 다양한 특징의 조합은, 구체적으로 언급되어 있지 않다고 해도, 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 따라서, 단계, 요소, 성분, 또는 구성의 조합이 본원에 명시적으로 언급될 수 있지만; 명시적으로 언급되어 있지 않은 단계, 요소, 성분, 및 구성의 모든 다른 조합도 포함된다.

Claims (28)

  1. 미생물의 집단으로부터 지질을 추출하는 방법으로서,
    상기 미생물의 집단을, 상기 미생물의 파괴를 유발하는 조건 하에 및 계면활성제의 부재 하에 하나 이상의 효소와 접촉시키는 단계; 및
    상기 파괴된 미생물로부터, 감소된 양의 유기 용매의 존재 하에 또는 유기 용매의 부재 하에 지질을 추출하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 추출 단계가 유기 용매의 부재 하에 수행되는, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 미생물의 집단으로부터 지질의 60 % 이상이 추출되는, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 추출 단계가 감소된 양의 유기 용매의 존재 하에 수행되는, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 미생물의 집단으로부터 지질의 90 % 이상이 추출되는, 방법.
  6. 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서,
    상기 파괴된 미생물 대 유기 용매의 비가 1:6 대 1:0.2 용적:용적인, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 파괴된 미생물 대 유기 용매의 비가 1:0.2 용적:용적인, 방법.
  8. 청구항 4 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 유기 용매가 헥산인, 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 단계 전에 상기 미생물의 집단을 농축시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 미생물의 집단이 원심분리에 의해 농축되는, 방법.
  11. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    상기 미생물의 집단이 20 % 고체까지 농축되는, 방법.
  12. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    상기 미생물의 집단이 15 내지 20 % 고체로 농축되는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 단계가 6 내지 9의 pH에서 수행되는, 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 단계가 55 내지 70 ℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 13 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 단계가 70 ℃ 이하의 온도에서 수행되는, 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 단계가 1 내지 20시간 동안 수행되는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 접촉 단계가 4시간 동안 수행되는, 방법.
  18. 청구항 1 내지 청구항 17 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소가 프로테아제인, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 효소가 알칼라제(Alcalase) 2.4L인, 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 18 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소가 0.2 내지 0.4 % 용적/용적의 농도로 존재하는, 방법.
  21. 청구항 1에 있어서,
    상기 접촉 단계가 55 ℃에서 18 내지 20시간 동안 0.2 % 또는 0.4 %의 효소의 존재 하에 수행되는, 방법.
  22. 청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 단계가 오일의 존재 하에 수행되는, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 오일이 코코넛 오일인, 방법.
  24. 청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 추출 단계가 생물연료의 존재 하에 수행되는, 방법.
  25. 청구항 1 내지 청구항 24 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이 건조 단계를 결여하고 있는, 방법.
  26. 청구항 1 내지 청구항 25 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물의 집단이 조류, 진균, 세균 및 원생생물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  27. 청구항 1 내지 청구항 25 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물의 집단이 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속, 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 및 이들의 혼합물로부터 선택되는, 방법.
  28. 청구항 1 내지 청구항 25 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물의 집단이 ATCC 수탁 번호 제PTA-6245호로 기탁된 트라우스토키트리움 종(Thraustochytrium sp.)인, 방법.
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