CN105829539A - 从微生物中回收油的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供从微生物中回收油的方法。该方法用于例如获得营养油和/或脂质生物燃料。本文所述的回收油的方法包括：在导致微生物破裂的条件下，使微生物群体接触一种或多种酶；以及在减少量的有机溶剂存在下或者在不存在有机溶剂下，从微生物群体中提取脂质。

Description

从微生物中回收油的方法
对优先权申请的交叉引用
本申请要求2013年12月20日提交的美国临时申请No.61/918,880的优先权，其通过引用整体并入本文中。
背景
使用湿法提取方法或干燥提取方法可从诸如微藻类的微生物中提取油。在干燥提取方法中，通常在油提取之前收获和干燥微生物。然而，干燥是昂贵和高耗能步骤。此外，如果油中富含多不饱和脂肪酸(PUFA)(例如，用于食品和营养补充应用)，则由于干燥中涉及到的高温，该方法可导致PUFA的严重氧化。
此外，通常使用诸如己烷的有机溶剂来进行从微生物中回收油的干燥提取方法，并且该方法需要结合用于获得适合出油率的机械细胞破裂方法。然而，机械破裂方法昂贵和高耗能，并且有机溶剂易燃、有毒，因而必须从最终油产品中去除有机溶剂。
概述
本文提供从微生物中回收油(即，脂质)的方法。该方法用于例如获得营养油和/或脂质生物燃料。本文所述回收油的方法可任选作为整合生物工艺来进行，即，作为“一锅”法。
本文所述的从微生物群体中回收脂质的方法包括：在导致微生物破裂的条件下，使微生物群体接触一种或多种酶；以及在减少量的有机溶剂存在下或者在不存在有机溶剂下，从破裂的微生物中提取脂质。任选地，接触步骤发生在发酵培养基中。
提取步骤可任选在不存在有机溶剂下进行。在这些例子中，可从微生物群体中提取至少60％的脂质。如与传统提取方法相比，任选可使用减少量的有机溶剂来进行提取步骤。在这些例子中，可从微生物群体中提取至少90％的脂质。任选地，微生物与有机溶剂的比率为1:6至1:0.2体积：体积(例如，1:0.2体积：体积)。有机溶剂可任选为己烷。
在接触步骤之前可任选浓缩微生物群体。任选地，通过离心和固相回收来浓缩微生物群体。可将微生物群体浓缩到至多20％固体(例如，15至20％固体)。
可在不存在表面活性剂下进行接触步骤。任选地，可在介于且包括6至8.5(例如，约7.5)的pH下进行接触步骤。在介于且包括55℃至70℃的温度下任选地进行接触步骤。任选地，在70℃或以下的温度下可进行接触步骤。接触步骤可进行一至二十小时(例如，四小时)。
任选地，在接触步骤中使用的酶为蛋白酶。酶任选为Alcalase2.4L。任选地，酶的浓度为0.2％至0.4％体积/体积.。在55℃下、在0.4％或0.2％酶的存在下，可任选进行接触步骤十八至二十小时。例如，在55℃下、在0.4％酶的存在下，可进行接触步骤十八小时。任选地，在70℃下、在0.4％酶的存在下进行接触步骤四至六小时。
任选地，在油的存在下(例如，椰子油)进行提取步骤。任选地，在生物燃料的存在下进行提取步骤。
任选地，该方法缺少干燥步骤。
微生物群体选自由以下组成的组：藻类、真菌、细菌和原生生物。任选地，微生物群体选自：破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)或其混合物。任选地，微生物群体为以ATCC登录号PTA-6245保存的海洋破囊壶菌。
一个或多个实施方案的详细情况在附图和以下简述中说明。其他特征、目标和优势由说明书、附图和权利要求书会显而易见。
附图简述
图1是显示从使用40mM(左侧条)、100mM(中间条)和160mM(右侧条)的盐酸、磷酸、硫酸、氢氧化钠和氢氧化钾水解的细胞中回收的油百分比的图。
图2是显示从使用0.2％(左侧条)和0.4％(右侧条)的Viscozyme、Alcalase、Flavourzyme和Mannaway酶进行酶水解的细胞中回收的油百分比的图。
图3是显示从使用40mMH2SO4，160mMH2SO4和0.2％Alcalase水解后未经洗涤(左侧条)和经洗涤(右侧条)的细胞中回收的油百分比的图。
图4是显示从在55℃下酶水解18小时和在70℃下酶水解4小时的细胞中回收的油百分比的图。
图5是显示从酶水解和使用有机溶剂提取、使用减少量的有机溶剂提取和不存在使用有机溶剂提取的细胞中回收的油百分比的图。
图6是显示从酶水解和基于纯油类的脂质分类简图(lipidclassprofile)来使用生物燃料提取的细胞中回收油的百分比的图，其包括甘油三酯(TG)藻油(左侧条)、生物燃料(中间条)和乙醇化(EE)藻油(右侧条)。
发明详述
本文描述从微生物群体中回收脂质的方法。回收脂质的方法包括：在导致微生物破裂的条件下，使微生物群体接触一种或多种酶；以及在减少量的有机溶剂存在下或在不存在有机溶剂下，从破裂的微生物中提取脂质。本文所述的方法可称为“一锅”或者“整合”工艺，因为微生物油生产和用于释放油的细胞破裂可任选在相同容器内进行。因此，下游加工步骤(例如，油提取和回收)可整合到上游加工步骤终点(例如，发酵)处。
I.微生物
本文所述的方法包括从微生物群体中回收脂质。本文所述的微生物群体可以为藻类(例如，微藻类)、真菌(包括酵母)、细菌或原生生物。任选地，微生物包括破囊壶菌目(Thraustochytriales)的破囊壶菌(Thraustochytrids)，更具体而言，破囊壶菌属的破囊壶菌和裂殖壶菌属。任选地，微生物群体包括如在美国专利No.5,340,594和5,340,742中所述的破囊壶菌目，其通过引用整体并入本文。微生物可以为海洋破囊壶菌，例如以ATCC登录号PTA-6245(即，ONC-T18)保存的海洋破囊壶菌。
本文所述的方法中使用的微生物可产生各种脂质化合物。如本文所使用，术语脂质包括磷脂、游离脂肪酸、脂肪酸酯、三酰甘油、甾醇类和甾醇酯、类胡萝卜素、叶黄素(例如，含氧类胡萝卜素)、烃类和本领域普通技术人员已知的其他脂质。任选地，脂质化合物包括不饱和脂质。不饱和脂质可包括多不饱和脂质(即，包含至少2个诸如双键的不饱和碳-碳键的脂质)或者高度不饱和脂质(即，包含4个或多个不饱和碳-碳键的脂质)。不饱和脂质的例子包括ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸，例如二十二碳六烯酸(即，DHA)、二十碳五烯酸(即，EPA)和其他天然存在的不饱和、多不饱和和高度不饱和化合物。
II.工艺
发酵
根据本领域已知的方法可培养本文所述的微生物。例如，破囊壶菌(例如，海洋破囊壶菌)可根据通过引用整体并入本文中的美国专利公开US2009/0117194或US2012/0244584中描述的方法来培养。微生物在生长培养基(也称为“培养基”)中生长。各种培养基中任一种均可适用于培养本文所述的微生物。任选地，培养基为微生物提供各种营养成分，包括碳源和氮源。
任选地，本文提供的微生物在增加生物质和/或目标化合物生成(例如，油或总脂肪酸(TFA)含量)的条件下培养。例如，破囊壶菌典型在盐水培养基中培养。任选地，破囊壶菌可在具有约2.0g/L至约50.0g/L的盐浓度培养基中培养。任选地，破囊壶菌在具有约2g/L至约35g/L(例如，约18g/L至约35g/L)的盐浓度培养基中培养。任选地，本文所述的破囊壶菌可在低盐条件下生长。例如，破囊壶菌可在具有约5g/L至约20g/L(例如，约5g/L至约15g/L)的盐浓度培养基中培养。培养基任选包括NaCl。任选地，培养基包括天然或人工海盐和/或人工海水。
如与传统方法相比，在培养基中可降低氯浓度(即，减少量)。培养基可包括不含氯的钠盐(例如，硫酸钠)作为钠的来源。例如，很大一部分总钠可通过非钠盐提供，从而使得在培养基中约100％、75％、50％或25％的总钠不通过氯化钠提供。
任选地，培养基具有小于约3g/L、500mg/L、250mg/L或120mg/L的氯浓度。例如，培养基具有介于且包括约60mg/L和120mg/L之间的氯浓度。根据本方法适合使用的非氯钠盐的例子包括但不限于苏打灰(碳酸钠和氧化钠的混合物)、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠及其混合物。参见例如美国专利No.5,340,742和6,607,900，其各自以全部内容通过引用并入本文。
用于破囊壶菌培养的培养基可包括各种碳源的任一种。碳源的例子包括：脂肪酸；脂质；甘油；三甘油；糖类，例如葡萄糖、淀粉、纤维素、半纤维素、果糖、右旋糖、木糖、乳果糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原、明胶、淀粉(玉米或小麦)、醋酸纤维、m-肌醇(来源于玉米浆)、半乳糖醛酸(来源于果胶)、L-岩藻糖(来源于半乳糖)、龙胆二糖、葡萄糖胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸(来源于葡萄糖)、纤维二糖、糊精和α-环糊精(来源于淀粉)；蔗糖(来自糖蜜)；多元醇，例如麦芽糖醇、赤藓糖醇、侧金盏花醇和油酸，例如丙三醇和吐温80；氨基糖，例如N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺和N-乙酰基-β-D-甘露糖胺；以及任何类型的生物质或者废液。
任选地，培养基包括约5g/L至约200g/L浓度的碳源。培养基可具有介于约1:1至约40:1之间的C:N(碳：氮)比率。当使用两相培养时，则培养基的第一相可具有介于且包括约1:1至约5:1之间的C:N比率，而第二相为约1:1至约1:～0(即，不存在氮或者极少氮)。如本文所使用，术语极少是指小于约10％(例如，小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％、小于约0.2％或小于约0.1％)。例如，在培养基中极少氮可表示在培养基中小于约10％(例如，小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％、小于约0.2％或小于约0.1％)的氮。
用于破囊壶菌培养的培养基可包括各种氮源的任一种。示例性氮源包括铵溶液(例如，在H2O中NH4)、铵或胺盐(例如，(NH4)2SO4，(NH4)3PO4，NH4NO3，NH4OOCH2CH3(NH4Ac))、蛋白胨、胰胨、酵母提取物、麦精、鱼粉、谷氨酸钠、大豆提取物、酪蛋白氨基酸和酒糟。在合适培养基中氮源浓度范围通常介于且包括约1g/L至约25g/L之间。
培养基任选包括磷酸盐，例如磷酸钾或磷酸钠。在培养基中无机盐和微量营养物可包括硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰、氯化钙和EDTA。诸如盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、泛酸钙、p-氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素B12的维生素类可包括在内。
使用酸或碱(合适的情况下)和/或使用氮源，可将培养基的pH调整到介于且包括3.0至10.0之间。任选地，将培养基的pH调整到4.0至6.5(包括端值)。可将培养基消毒。
一般而言，用于培养微生物的培养基为液态培养基。然而，用于培养微生物的培养基可以为固体培养基。除了如本文所讨论的碳源和氮源之外，固体培养基可包含提供结构支持和/或使得培养基呈固态的一种或多种成分(例如，琼脂或琼脂糖)。
可将细胞在任何地方培养1天至60天。任选地，培养进行14天或更少、13天或更少、12天或更少、11天或更少、10天或更少、9天或更少、8天或更少、7天或更少、6天或更少、5天或更少、4天或更少、3天或更少、2天或更少、1天或更少。培养任选在约4℃至约30℃，例如约18℃至约28℃的温度下进行。培养可包括通风-振荡培养、振荡培养、静置培养、分批培养、半连续培养、连续培养、旋转分批培养、波动培养(waveculture)等。可使用常规搅拌发酵罐、泡罩塔发酵罐(分批培养或连续培养)、波动发酵罐等来进行培养。
可通过包括振荡的各种方法中一种或多种来通气培养物。任选地，振荡范围为约100rpm至约1000rpm，例如约350rpm至约600rpm或者约100至约450rpm。任选地，在生成生物质阶段和生成脂质阶段，使用不同的振荡速度来通气培养物。可选地或此外，振荡速度可根据培养容器类型(例如，烧瓶的形状或尺寸)来改变。
任选地，溶解氧(DO)的水平在生物质生成阶段比它在脂质生成阶段高。因此，DO水平在脂质生成阶段下降(即，DO水平小于在生物质生成阶段中溶解氧的量)。任选地，将溶解氧的水平降低到饱和度以下。例如，可将溶解氧的水平降低到非常低或甚至达到不可检测水平。
通过根据包括改变一个或多个培养条件以获得较高量的所需化合物的方法培养细胞可增加所需脂质生成。任选地，首先将细胞在最大化生物质的条件下培养，然后改变一个或多个培养条件为有利于脂质产率的条件。改变的条件可包括氧浓度、C:N比率、温度及其组合。任选地，进行两阶段培养，其中第一阶段有利于生物质生成(例如，使用高氧条件(例如，一般而言或者相对于第二阶段))、低C:N比率和环境温度)，然后进行有利于脂质生成的第二阶段(例如，在第二阶段中，降低氧，增加C:N比率，并且降低温度)。
巴氏灭菌
任选地，将所得的生物质巴士灭菌以杀灭细胞和使生物质中存在的不需要的物质灭活。例如，可将生物质巴士灭菌以灭活化合物降解物质。巴氏灭菌步骤中，生物质可存在于发酵培养基中或者从发酵培养基中分离。通过加热生物质和/或发酵培养基到高温可进行巴士灭菌步骤。例如，可将生物质和/或发酵培养基加热到约且包括50℃至约且包括95℃(例如，约且包括60℃至约且包括90℃或者约且包括65℃至约且包括80℃)。任选地，可将生物质和/或发酵培养基加热约且包括30分钟至约且包括120分钟(例如，约且包括45分钟至约且包括90分钟或者约且包括55分钟至约且包括75分钟)。使用如本领域技术人员已知的合适加热方法可进行巴士灭菌，例如通过直接蒸汽喷射。
收获和洗涤
任选地，根据本领域技术人员已知的方法可收获生物质。例如，可任选使用各种常见方法从发酵培养基中收集生物质，例如离心(例如，固体喷射离心)或过滤(例如，交叉流过滤)，并且生物质也可包括使用用于加速细胞生物质收集的沉淀剂(例如，磷酸钠或氯化钙)。
任选地，使用水洗涤生物质。任选地，可将生物质浓缩至多约且包括20％固体。例如，可将生物质浓缩到约且包括5％至约且包括20％固体、约且包括7.5％至约且包括15％固体或者约且包括15％固体至约且包括20％固体或者在所述范围内任意比例。任选地，可将生物质浓缩到约20％固体或更少、约19％固体或更少、约18％固体或更少、约17％固体或更少、约16％固体或更少、约15％固体或更少、约14％固体或更少、约13％固体或更少、约12％固体或更少、约11％固体或更少、约10％固体或更少、约9％固体或更少、约8％固体或更少、约7％固体或更少、约6％固体或更少、约5％固体或更少、约4％固体或更少、约3％固体或更少、约2％固体或更少或者约1％固体或更少。
水解
使用化学法、酶法和/或机械法可进行细胞水解(即，细胞破裂)。用于水解细胞的化学方法可包括将酸加入至细胞，这在本文中称为酸水解。在酸水解方法中，可使用诸如离心经水洗涤生物质，然后在水解细胞之前如上所述浓缩。任选地，将生物质浓缩到约15％含水固体。
然后将酸加入到经洗涤的湿润生物质。任选地，在加入酸之前，不干燥生物质。在酸水解步骤中使用的合适的酸包括硫酸、盐酸、磷酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸以及本领域技术人员已知的其他强酸。可将适量酸加入经洗涤的湿润生物质中以得到约且包括100mM至约且包括200mM(例如，约且包括120mM至约且包括180mM或者约且包括140mM至约且包括160mM)的最终浓度。可将硫酸加入到经洗涤的湿润生物质中以得到160mM的最终浓度。
然后可将包括水、生物质和酸的所得混合物温育一段时间以水解细胞。任选地，可将混合物在约且包括30℃至约且包括200℃的温度下温育。例如，可将混合物在约且包括45℃至约且包括180℃、约且包括60℃至约且包括150℃或约且包括80℃至约且包括130℃的温度下温育。任选地，在121℃的温度下，将混合物温育在高压釜中。可将混合物温育一段时间，使适于水解至少50％细胞(例如，至少60％细胞、至少70％细胞、至少80％细胞、至少90％细胞、至少95％细胞或100％细胞)。温育细胞的时间段取决于温育温度。在较高温度下温育混合物可导致以更快速率进行水解(即，水解需要的时间段较短)。在一些例子中，可将细胞在60℃下温育1小时。任选地，使用直接或间接巴氏灭菌设备来进行温育步骤，例如由Microthermics(例如，MicroThermicsUHT/HTSTLab25EHVHybrid)(Raleigh,NorthCarolina)市售的连续流动热力系统。
如上所述，使用酶方法可进行细胞水解(即，细胞破裂)。具体而言，可在导致微生物破裂的条件下使微生物群体接触一种或多种酶。任选地，该酶为蛋白酶。合适的蛋白酶的例子为ALCALASE2.4LFG(Novozymes；Franklinton,NorthCarolina)。任选地，在酶水解之前，未使用水洗涤细胞。
可将微生物群体发酵以漂浮在水性培养基中。可使发酵培养基在发酵罐中重力沉降，然后可将培养基倾析或者除去以提供所需浓度的微生物群体。可选地，可通过离心来浓缩发酵培养基，从而提供所需浓度的微生物群体。可将微生物群体浓缩到至多且包括20％固体。例如，可将微生物群体浓缩到约且包括5％至约且包括20％固体、约且包括7.5％至约且包括15％固体或约且包括15％固体至约且包括20％固体或者在所述范围内任何百分比。使微生物接触一种或多种酶之前，可浓缩微生物群体。
在使微生物接触一种或多种酶之前，可任选将发酵培养基的pH调整到约且包括6至8.5，例如约且包括6.5至8.5或约且包括7至8，或者在所述范围内任何值。例如，可任选将发酵培养基的pH调整到6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。可使用例如碱来调节pH，例如氢氧化钠(例如，1NNaOH)、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钾。
可使微生物接触一种或多种酶，同时微生物群体是在发酵培养基中(即，接触步骤在发酵培养基中发生)。任选地，加入发酵培养基的酶浓度为约0.2％至约0.4％体积/体积(v/v)。例如，加入发酵培养基的酶浓度可以为0.2％(v/v)、0.25％(v/v)、0.30％(v/v)、0.35％(v/v)或0.4％(v/v)。
在70℃或以下的温度下可进行接触步骤。例如，在约70℃或以下、约65℃或以下、约60℃或以下、约55℃或以下、约50℃或以下或者约45℃或以下的温度下可使微生物接触一种或多种酶。任选地，在约且包括45℃至约且包括70℃、约且包括50℃至约且包括70℃或者约且包括55℃至约且包括65℃的温度下进行接触步骤。可进行适当时间段的接触步骤，从而导致微生物破裂。例如，可进行接触步骤约且包括1小时至约且包括20小时，例如，2小时至18小时、4小时至16小时、6小时至14小时或8小时至12小时或者所述范围内任意时间段。任选地，可进行接触步骤约四小时，并且水解温度可任选为约70℃。
最佳温度、时间、pH和酶浓度取决于具体酶，并且本领域普通技术人员能够视情况调整给定酶的温度、时间、pH和酶浓度。
任选地，在约55℃下、在约0.2％或约0.4％酶存在下，进行接触步骤约18至20小时。例如，在55℃下、在0.4％酶的存在下，可进行接触步骤十八小时。可选地，在70℃下、在0.4％酶的存在下，进行接触步骤四至六小时。任选地，在不存在表面活性剂下(即，表面活性剂不存在)进行接触步骤。
任选地，使用如本领域技术人员已知的其他化学和机械方法可进行细胞破裂。例如，使用碱水解、珠粒研磨、超声处理、洗涤剂水解、溶剂提取、急速减压(即，细胞炸弹法)或高剪切机械法、与化学制剂接触、均化作用、超声、研磨、剪切力、弗氏细胞压碎器、冷压、加热、干燥、渗透压冲击、压力振动、自溶基因的表达或者这些的组合可进行细胞破裂。任选地，使用两种或多种本文所述的化学、酶和/或机械方法的组合(例如，联合珠粒研磨的酶水解)可进行细胞破裂。可相继进行细胞破裂方法(例如，珠粒研磨后进行酶水解)。
提取
如上所述，在减少量的有机溶剂存在下(即，有机溶剂提取)或者在不存在有机溶剂下从微生物群体中提取脂质。
任选地，如与从整个干燥微生物细胞中提取脂质所需要的有机溶剂量相比，使用减少量的有机溶剂来进行提取步骤。如本文所使用，术语与从整个干燥微生物细胞中提取脂质所需要的有机溶剂量相比减少量的有机溶剂是指有机溶剂量小于从整个干燥微生物细胞中提取脂质所需要的有机溶剂量。例如，整个干燥微生物细胞所需要的微生物或生物质与有机溶剂的比率通常为1:4或更大。因此，减少量的有机溶剂可提供小于约1:4的微生物或生物质与有机溶剂的比率。例如，用于由本文所述的经水解湿润生物质中提取油的微生物或生物质与有机溶剂的比率可以为约且包括1:0.2至约且包括1:1(例如，1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8或1:0.9)。任选地，可使用额外量的有机溶剂，例如至多约1:6的微生物或生物质与有机溶剂的比率。
在提取步骤中使用的合适的有机溶剂包括己烷、异丙醇、二氯甲烷、十二烷、甲醇、乙基化的油和超临界二氧化碳。
可将有机溶剂和微生物或生物质混合适于从微生物或生物质中提取脂质的一段时间。例如，可将有机溶剂和微生物或生物质混合约10分钟或更久、20分钟或更久、30分钟或更久、40分钟或更久、50分钟或更久、1小时或更久或者2小时或更久。随后，通过离心溶液可从混合物的剩余成分中分离脂质。
任选地，使用该方法从微生物群体中提取理论上通过微生物生成的至少约50％的脂质(即，该方法提供至少50％产率)。例如，从微生物群体中提取的脂质产率可以为至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在不存在有机溶剂下，也可从微生物群体中提取脂质。如本文所使用，在不存在有机溶剂下是指以微生物群体的重量计，小于约0.5％有机溶剂(例如，小于约0.4％、小于约0.3％、小于约0.2％、小于约0.1％、小于约0.05％、小于约0.01％、小于约0.005％或者0％)。
任选地，通过使用油(例如，椰子油)或生物燃料可从破裂的微生物中提取脂质。
任选地，在提取步骤中加入的油可以为营养油(例如，由营养来源得到或获得的油)。在本文所述的方法中使用的合适营养油例子包括椰子油、棕榈油、菜籽油、葵花子油、大豆油、玉米油、橄榄油、红花油、棕榈仁油、棉籽油及其组合。也可使用任何那些油的衍生物，例如烷基化衍生物(例如，甲基化或乙基化的油)。
如本文所使用，生物燃料是指从生物质起始材料获得的任何燃料、燃料添加剂、芳香族和/或脂肪族化合物。例如，在本文所述的方法中使用的合适的生物燃料可由植物来源或藻类来源获得。生物燃料的合适来源的例子包括藻类、玉米、柳枝稷、甘蔗、甜菜、油菜籽、大豆等。
任选地，通过由生物来源收获油并且将油转化为生物燃料可得到生物燃料。转化由生物来源得到的油(例如，由植物和/或藻类来源中得到的油)的方法是本领域技术人员已知的。任选地，得到生物燃料的方法可包括：培养产油生物质(例如，藻类)，提取油(例如，藻油)，以及转化油(例如，藻油)以形成生物燃料。任选地，使用酯基转移可将油转化为生物燃料。如本文所使用，酯基转移是指通过另一种醇来交换酯中烷氧基的过程。例如，在本文所述的方法中使用的酯基转移过程可包括转化诸如三甘油酯的藻油为生物柴油，例如脂肪酸烷基酯和丙三醇。通过使用传统化学工艺如酸或碱催化反应或者通过使用酶催化反应可完成酯基转移。
如本文所使用，术语有机溶剂不包括生物燃料，因该术语由本文所定义，且其不包括营养油，例如椰子油、棕榈油、菜籽油、葵花子油、大豆油、玉米油、橄榄油、红花油、棕榈仁油、棉籽油或其烷基化(例如，甲基化或乙基化)衍生物。
任选地，用于从破裂的微生物中提取脂质的油或生物燃料随后不从提取的脂质中去除。不认为提取油的后续分馏会从提取的脂质中去除油或生物燃料，在提取的油中，加入的油或生物燃料仅保留在一种油馏分中。例如，在回收之后，可将本文所述的油合并到其他油中来用作本文所述的一种或多种产品或者并入到本文所述的一种或多种产品。可选地或者除了在回收过程结束之后合并回收的油之外，可将那些其他油或产品(例如生物燃料)中任一种加入到脂质和生物质的混合物中。在提取步骤中加入其他油可帮助反乳化和从消耗的生物质中分离脂质。
在依赖有机溶剂提取以从生物质中分离脂质的传统方法中，在回收之后必须将有机溶剂从脂质中去除，但之后通常残留至少痕量的溶剂。然而，在本文所述的方法中，在回收的油用作最终产品或并入最终产品时，在提取步骤中加入的任选超过约80％的油或生物燃料仍旧保留其中。也就是说，在回收的油用作最终产品或者并入最终产品之前，在提取步骤中加入的任选小于约20％的油或生物燃料从回收的油中去除。例如，在回收的油用作最终产品或者并入最终产品之前，在提取步骤中加入的任选小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约2％或者0％的油或生物燃料从回收的油中去除。
任选地，使用该方法从微生物群体中提取至少40％的理论上通过微生物生成的脂质(即，该方法提供至少约40％产率)。例如，从微生物群体中提取的脂质产率可以为至少约50％、至少60％、至少70％或至少80％。
可选地，使用机械方法可提取脂质。可将水解的生物质和微生物离心，并且可从成分剩余物中分离脂质。任选地，脂质包含在离心材料的上层中，因而可通过抽吸或倾析例如从其他材料中去除。
III.产品
根据本文所述方法生产的多不饱和脂肪酸(PUFA)和其他脂质可用于各种应用的任一种中，例如，开发它们的生物或营养性质。任选地，化合物可用于药物、食品补充剂、动物饲料添加剂、化妆品等。根据本文所述方法生成的脂质也可用作生产其他化合物的中间产品。
任选地，根据本文所述的方法生产的脂质可并入最终产品(例如，食品或饲料补充剂、婴儿配方、药物、燃料等)。并入本文所述脂质的合适的食品或饲料补充剂包括饮料，例如牛奶、水、运动型饮料、能量饮料、茶和果汁等；糖果类，例如果冻和饼干；包含脂肪的食品和饮料，例如乳制品；加工食品产品，例如软米(或粥)；婴儿配方；早餐谷物等。任选地，可将一种或多种生成的脂质并入饮食补充剂内，例如，复合维生素。任选地，根据本文所述的方法产生的脂质可包含入饮食补充剂，任选可直接并入食品或饲料(例如，食品补充剂)成分内。
通过本文所述方法产生的脂质可并入的饲料的例子包括宠物食品，例如猫粮、狗粮等；水族箱鱼、养殖鱼类或甲壳类动物饲料等；农场培育动物(包括家畜和鱼或水产养殖培育的甲壳类动物)的饲料。根据本文所述方法产生的脂质可并入的食品或饲料材料优选适合生物体味觉，生物体是预期接受者。该食品或饲料材料可具有目前已知的用于食物材料的任意物理性质(例如，固体、液体、软质)。
任选地，可将一种或多种产生的化合物(例如，PUFA)并入药物中。这些药物例子包括各种类型的片剂、胶囊、可饮用试剂等。任选地，药物适于局部应用。剂型可包括例如胶囊、油类、颗粒、细粒剂、散剂、片剂、丸剂、锭剂等。
通过联合各种试剂的任一种可将根据本文所述方法产生的脂质并入如本文所述的产品内。例如，使用一种或多种粘结剂或填料可合并这些化合物。在一些实施方案中，产品可包括一种或多种螯合剂、颜料、盐、表面活性剂、保湿剂、粘度调节剂、增稠剂、软化剂、芳香剂、防腐剂等及其组合。
以下实例旨在进一步阐述本文所述的方法和组合物的某些方面，但并不是意图限制权利要求范围。
实施例
实施例1.巴氏灭菌、收获和洗涤以及化学水解
巴氏灭菌
在60℃下将T18生物质边搅拌边加热1小时以巴士灭菌细胞。
收获和洗涤
在环境温度下将经巴士灭菌的T18生物质在4150rpm下离心20分钟，从而从细胞糊状物中分离最终培养基。将培养基去除，然后将等效质量的水加入细胞糊状物以洗涤细胞。将细胞糊状物-水混合物振荡1分钟，重新离心，然后去除水相。
化学水解
使用水将经水洗涤的T18细胞糊状物调整到150g/L。取出子样品(10mL)，并将其加入50mL离心管。使用酸或碱处理每个子样品到根据表1的最终浓度。在121℃下将混合物高压灭菌15分钟以水解细胞。在水解之后，使用己烷提取样品，从而通过质量平衡测定回收的油百分比(图1)。使用160mMHCl和H2SO4水解得到超过85％的油回收。
表1：
样品编号 酸/碱类型 浓度(mM) 油回收(％)
1 HCl 40 1
2 HCl 100 47
3 HCl 160 100
4 H3PO4 40 12
5 H3PO4 100 3
6 H3PO4 160 5
7 H2SO4 40 7
8 H2SO4 100 68
9 H2SO4 160 94
10 NaOH 40 8
11 NaOH 100 40
12 NaOH 160 52
13 KOH 40 8
14 KOH 100 20
15 KOH 160 54
实施例2.酶水解
使用水将经水洗涤的T18细胞糊状物调整到220g/L。使用1NNaOH调节pH到7.5。取出子样品(10mL)，并将其加入50mL离心管。根据表2使用酶来处理每个子样品。在50℃下将混合物边振荡边温育22小时以水解细胞。在水解之后，使用己烷提取样品，从而通过质量平衡测定回收的油百分比(图2)。单独使用Alcalase或其联合另外的酶进行水解得到超过85％的油回收。
表2：
实施例3.酸和酶水解、洗涤效果
将经巴士灭菌、未经洗涤的T18生物质(10mL)的子样品加入50mL离心管。将对照水洗，调整至170g/L水，并二次取样到50mL离心管内。根据表3使用酸或酶来处理每个子样品。在121℃下将经酸水解的样品高压灭菌15分钟以水解细胞。使用1NNaOH将经酶水解的样品调节到pH7.5，然后在50℃下边振荡边温育26小时以水解细胞。在酸或酶水解之后，使用己烷提取样品，从而通过质量平衡测定回收的油百分比(图3)。使用0.2％Alcalase水解得到未经洗涤的油回收与经洗涤的油回收等效。
表3：
实施例4.酶水解、温度/时间效果
使用水将经水洗涤的T18细胞糊状物调整到210g/L。使用1NNaOH调节pH到7.5。将子样品(10mL)加入50mL离心管内。使用0.2％v/vAlcalase处理每个子样品。在70℃下将混合物边振荡边温育4小时以水解细胞。在55℃下将对照边振荡边温育18小时。在水解之后，使用己烷提取样品，从而通过质量平衡测定回收的油百分比(图4)。通过增加温度到70℃，在4小时达到与在55℃下水解等效的油回收。
实施例5.酶水解、使用减少量的有机溶剂提取
使用水将经水洗涤的T18细胞糊状物调整到220g/L。使用1NNaOH调节pH到7.5。将子样品(10mL)加入50mL离心管内。使用0.2％v/vAlcalase处理每个子样品。在55℃下将混合物边振荡边温育22小时以水解细胞。在水解之后，根据表4提取每个子样品，然后通过质量平衡测定回收的油百分比(图5)。使用1:2(湿润生物质：己烷)来己烷提取对照。在40℃下将样品2在4150rpm下离心20分钟。使用20g/LNaCl来处理样品3，然后离心。使用20g/LNaCl来处理样品4，然后离心。去除油层，然后加入1:0.2(湿润生物质：己烷)以提取剩余油。通过在己烷提取之前去除游离油，使用1:0.2(湿润生物质：己烷)比率得到与1:2(湿润生物质：己烷)比率等效的油回收。
表4：
实施例6.酶水解、使用生物燃料提取
使用水将经水洗涤的T18细胞糊状物调整到200g/L，然后使用1NNaOH将pH调节到7.5。取出子样品(10mL)，并将其加入50mL离心管。使用0.2％v/vAlcalase来处理各个子样品。在55℃下将混合物边振荡边温育18小时以水解细胞。在水解之后，根据表5使用生物燃料来提取每个子样品，然后通过质量平衡和基于纯油类的脂质分类简图测定油百分比(图6和表5)。基于脂质分类简图，使用1:0.4(湿润生物质：生物燃料)提取得到超过85％的油回收。将甘油三酯(TG)藻油乙醇化(EE)，并将其用于油提取以及母体TG油(表6)。基于脂质分类简图，湿润生物质：EE藻油的所有比率均得到超过85％的油回收。
表5：
表6：
所附权利要求的组合物和方法的范围不受本文所述具体组合物和方法的限制，该具体组合物和方法旨在说明权利要求的某些方面，并且功能上等效的任何组合物和方法均在该公开的范围内。除了所显示和本文所述的那些之外，组合物和方法的各种变形均旨在落入所附权利要求的范围之内。而且，尽管仅具体描述了某些代表性组合物、方法和这些组合物和方法的某些方面，但其他组合物和方法和组合物和方法的各种特征组合均旨在落入所附权利要求的范围之内，即使其未被具体引用。因此，本文可明确提及步骤、元素、组分或成分的组合；但是步骤、元素、组分和成分的所有其他组合也包括在内，即使其并未明确规定。

Claims (28)

1.一种从微生物群体中提取脂质的方法，其包括：在导致微生物破裂的条件下，使所述微生物群体接触一种或多种酶，其中所述接触步骤是在不存在表面活性剂下进行；以及在减少量的有机溶剂存在下或在不存在有机溶剂下，从所述破裂的微生物中提取脂质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取步骤是在不存在有机溶剂下进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其中从所述微生物群体中提取至少60％的脂质。
4.根据权利要求1所述的方法，其中使用减少量的有机溶剂来进行所述提取步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中从所述微生物群体中提取至少90％的脂质。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述破裂的微生物与有机溶剂的比率为1:6至1:0.2体积：体积。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述破裂的微生物与有机溶剂的比率为1:0.2体积：体积。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂为己烷。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其还包括：在所述接触步骤之前，浓缩所述微生物群体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中通过离心来浓缩所述微生物群体。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中将所述微生物群体浓缩到至多20％固体。
12.根据权利要求9或10所述的方法，其中将所述微生物群体浓缩到15％至20％固体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在6至9的pH下进行所述接触步骤。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在55℃至70℃的温度下进行所述接触步骤。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在70℃或以下的温度下进行所述接触步骤。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述接触步骤进行一至二十小时。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述接触步骤进行四小时。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述酶为蛋白酶。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述酶为Alcalase2.4L。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述酶的浓度为0.2％至0.4％体积/体积。
21.根据权利要求1所述的方法，其中在55℃下、在0.2％或0.4％酶的存在下，进行所述接触步骤十八至二十小时。
22.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在油的存在下进行所述提取步骤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述油为椰子油。
24.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在生物燃料的存在下进行所述提取步骤。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述方法缺少干燥步骤。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述微生物群体选自由以下组成的组：藻类、真菌、细菌和原生生物。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述微生物群体选自：破囊壶菌属、裂殖壶菌属及其混合物。
28.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述微生物群体为以ATCC登录号PTA-6245保存的海洋破囊壶菌。
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