JP2016540514A - 微生物から油を回収する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年12月20日に出願された米国仮特許出願第61/918,880号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に援用される。
湿式抽出法または乾式抽出法を使用して、微生物(微細藻類等)から油を回収することができる。乾式抽出法において、典型的には微生物は採取され、油の抽出の前に乾燥される。しかしながら、乾燥は高価かつエネルギー多消費型のプロセスである。また、油が多価不飽和脂肪酸(PUFA)に富むならば(例えば食品及び栄養サプリメントの適用のために)、プロセスは、乾燥に関与する高温に起因してPUFAの著しい酸化を引き起こし得る。
微生物から油(すなわち脂質)を回収する方法が本明細書において提供される。方法は、例えば栄養油及び/または脂質バイオ燃料を得ることに有用である。本明細書において記述される油を回収する方法は、随意に、一体化されたバイオプロセスとして(すなわち「ワンポット」方法として)遂行され得る。
微生物の集団から脂質を回収する方法が本明細書において記載される。脂質を回収する方法は、微生物の破砕を引き起こす条件下で1つまたは複数の酵素と微生物の集団を接触させることと、低減させた量の有機溶媒の存在下または有機溶媒の非存在下において、破砕した微生物から脂質を抽出することとを含む。同じ容器内で微生物による油の産生及び細胞破砕を遂行して、油を随意に放出することができるので、本明細書において記述される方法は、「ワンポット」または「一体化」プロセスと称することができる。したがって、下流のプロセッシング工程(例えば油の抽出及び回収)は、上流プロセッシング工程(例えば発酵)の末端で一体化することができる。
本明細書において記述される方法は微生物の集団から脂質を回収することを含む。本明細書において記述される微生物の集団は、藻類(例えば微細藻類)、菌類(酵母が含まれる)、細菌または原生生物であり得る。随意に、微生物には、Thraustochytriales目のThraustochytrid類、より具体的にはThraustochytriales目のThraustochytrium属及びSchizochytrium属が含まれる。随意に、微生物の集団には、米国特許第5,340,594号及び第5,340,742(それらの全体は参照により本明細書に援用される)中で記述されているようなThraustochytriales目が含まれる。微生物は、Thraustochytrium属の種(ATCCアクセッション番号PTA−6245として寄託されたThraustochytrium属の種(すなわちONC−T18)等)であり得る。
発酵
本明細書において記述される微生物は当技術分野において公知の方法に従って培養することができる。例えば、Thraustochytrid(例えばThraustochytrium属の種)は、米国特許公開US2009/0117194またはUS2012/0244584(それらの全体は参照により本明細書に援用される)中で記述される方法に従って培養することができる。微生物は増殖培地(「培養培地」としても公知)中で増殖される。多様な培地のうちの任意ものは本明細書において記述される微生物の培養における使用のために適切であり得る。随意に、培地は微生物のための様々な栄養成分(炭素源及び窒素源が含まれる)を供給する。
随意に、もたらされたバイオマスを低温殺菌して、細胞を死滅させてバイオマス中に存在する所望されない物質を不活性化する。例えば、バイオマスを低温殺菌して、物質を分解する化合物を不活性化することができる。バイオマスは発酵培地中に存在することができるか、または低温殺菌工程のために発酵培地から単離することができる。低温殺菌工程は、バイオマス及び/または発酵培地を高温へ加熱することによって遂行することができる。例えば、バイオマス及び/または発酵培地は、約50℃〜約95℃(例えば約60℃〜約90℃、または約65℃〜約80℃)の温度で加熱することができる。随意に、バイオマス及び/または発酵培地は、約30分間〜約120分間(例えば約45分間〜約90分間、または約55分間〜約75分間)で加熱することができる。低温殺菌は、当業者に公知であるような適切な加熱手段を使用して(直接的な蒸気噴射によって等)遂行することができる。
随意に、バイオマスは当業者に公知の方法に従って採取することができる。例えば、バイオマスは、随意に様々な従来の方法(遠心分離(例えば固体排出遠心分離機)または濾過(例えばクロスフロー濾過)等)を使用して、発酵培地から収集することができ、細胞バイオマスの収集の加速のために沈殿剤(例えばリン酸ナトリウムまたは塩化カルシウム)の使用も含むことができる。
細胞の加水分解(すなわち細胞破砕)は、化学的、酵素的、及び/または機械的な方法を使用して遂行され得る。細胞の加水分解のための化学的方法は細胞への酸の添加を含むことができ、本明細書において酸加水分解と称される。酸加水分解法において、バイオマスは例えば遠心分離を使用して水により洗浄され、細胞の加水分解の前に上述のように濃縮され得る。随意に、バイオマスは水により約15%の固体へ濃縮される。
上述のように、脂質は、低減させた量の有機溶媒の存在下において(すなわち有機溶媒抽出)または有機溶媒の非存在下において、微生物の集団から抽出される。
本明細書において記述される方法に従って産生された多価不飽和脂肪酸(PUFA)及び他の脂質は、例えばそれらの生物学的特性または栄養特性を利用して、任意の多様な適用において利用することができる。随意に、化合物は、医薬品、食品サプリメント、動物用飼料添加剤、化粧品、及び同種のものにおいて使用することができる。本明細書において記述される方法に従って産生された脂質は、他の化合物の産生における中間体としても使用することができる。
低温殺菌
T18バイオマスを60℃で1時間撹拌しながら加熱して細胞を低温殺菌した。
低温殺菌されたT18バイオマスを周囲温度で20分間4150rpmで遠心分離して、細胞ペーストから最終培地を分離した。培地を除去し、同等の質量の水を細胞ペーストへ添加して細胞を洗浄した。細胞ペースト−水混合物を1分間振盪し、再遠心分離し、水相を除去した。
水洗浄T18細胞ペーストを水により150g/Lへ調整した。サブサンプル(10mL)を取り出し、50mL遠心分離チューブへ添加した。各々のサブサンプルを表1に従って最終濃度へ酸または塩基により処理した。混合物を121℃で15分間オートクレーブして細胞を加水分解した。加水分解後に、サンプルをヘキサン抽出して、回収された油のパーセンテージを物質収支によって決定した(図1)。160mMのHCl及びH2SO4による加水分解は85%を超える油回収をもたらした。
水洗浄T18細胞ペーストを水により220g/Lへ調整した。pHを1NのNaOHにより7.5へ調整した。サブサンプル(10mL)を取り出し、50mL遠心分離チューブへ添加した。各々のサブサンプルを表2に従って酵素により処理した。混合物を50℃で22時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。加水分解後に、サンプルをヘキサン抽出して、回収された油のパーセンテージを物質収支によって決定した(図2)。アルカラーゼ単独または別の酵素と組み合わせた加水分解は85%を超える油回収をもたらした。
低温殺菌非洗浄T18バイオマス(10mL)のサブサンプルを50mL遠心分離チューブへ添加した。対照を水洗浄し、水で170g/Lへ調整し、50mL遠心分離チューブの中へサブサンプルをとった。各々のサブサンプルを表3に従って酸または酵素により処理した。酸加水分解サンプルを121℃で15分間オートクレーブして細胞を加水分解した。酵素的に加水分解したサンプルを1NのNaOHによりpH7.5へ調整し、50℃で26時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。酸加水分解または酵素的加水分解後に、サンプルをヘキサン抽出して、回収された油のパーセンテージを物質収支によって決定した(図3)。洗浄した油の回収に同等な洗浄していない油の回収は、0.2%のアルカラーゼ加水分解で達成された。
水洗浄T18細胞ペーストを水により210g/Lへ調整した。pHを1NのNaOHにより7.5へ調整した。サブサンプル(10mL)を50mL遠心分離チューブの中へ添加した。各々のサブサンプルを0.2%のv/vアルカラーゼにより処理した。混合物を70℃で4時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。対照を55℃で18時間振盪ながらインキュベーションした。加水分解後に、サンプルをヘキサン抽出して、回収された油のパーセンテージを物質収支によって決定した(図4)。70℃へ温度を増加させることによって、55℃で18時間の加水分解に同等な油の回収は、4時間で達成された。
水洗浄T18細胞ペーストを水により220g/Lへ調整した。pHを1NのNaOHにより7.5へ調整した。サブサンプル(10mL)を50mL遠心分離チューブへ添加した。各々のサブサンプルを0.2%のv/vアルカラーゼにより処理した。混合物を55℃で22時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。加水分解後に、各々のサブサンプルを表4に従って抽出し、回収された油のパーセンテージを物質収支によって決定した(図5)。対照は、1:2(湿潤バイオマス:ヘキサン)でヘキサン抽出した。サンプル2は、40℃で20分間4150rpmで遠心分離した。サンプル3は、20g/LのNaClにより処理し、続いて遠心分離した。サンプル4は、20g/LのNaClにより処理し、続いて遠心分離した。油層を除去し、1:0.2(湿潤バイオマス:ヘキサン)を添加して残りの油を抽出した。ヘキサン抽出の前に遊離油を除去することによって、1:2(湿潤バイオマス:ヘキサン)比に同等な油回収は、1:0.2(湿潤バイオマス:ヘキサン)比により達成された。
水洗浄T18細胞ペーストを水により200g/Lへ調整し、pHを1NのNaOHにより7.5へ調整した。サブサンプル(10mL)を取り出し、50mL遠心分離チューブへ添加した。各々のサブサンプルを0.2%のv/vアルカラーゼにより処理した。混合物を55℃で18時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。加水分解後に、各々のサブサンプルを表5に従ってバイオ燃料により抽出し、油のパーセンテージを物質収支によって決定し、純粋な油の脂質クラスプロファイルに基づかせた(図6及び表5)。1:0.4(湿潤バイオマス:バイオ燃料)による抽出は、脂質クラスプロファイルに基づいて、85%を超える油回収をもたらした。トリグリセリド(TG)藻類油をエチル化し(EE)、親TG油に加えて、油抽出のために使用した(表6)。湿潤バイオマス:EE藻類油のすべての比は、脂質クラスプロファイルに基づいて、85%を超える油回収をもたらした。
Claims (28)
- 微生物の集団から脂質を抽出する方法であって、微生物の破砕を引き起こす条件下で1つまたは複数の酵素と微生物の集団を接触させ、接触工程が界面活性剤の非存在下において遂行されることと;低減させた量の有機溶媒の存在下または有機溶媒の非存在下において、破砕した微生物から脂質を抽出することとを含む、該方法。
- 前記抽出工程が有機溶媒の非存在下において遂行される、請求項1に記載の方法。
- 脂質の少なくとも60%が微生物の集団から抽出される、請求項2に記載の方法。
- 前記抽出工程が低減させた量の有機溶媒を使用して遂行される、請求項1に記載の方法。
- 脂質の少なくとも90%が微生物の集団から抽出される、請求項4に記載の方法。
- 破砕した微生物対有機溶媒の比が1:6〜1:0.2の体積:体積である、請求項4または5に記載の方法。
- 破砕した微生物対有機溶媒の比が1:0.2の体積:体積である、請求項6に記載の方法。
- 前記有機溶媒がヘキサンである、請求項4〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触工程の前に前記微生物の集団を濃縮することを更に含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物の集団が遠心分離によって濃縮される、請求項9に記載の方法。
- 前記微生物の集団が20%の固体まで濃縮される、請求項9または10に記載の方法。
- 前記微生物の集団が15%〜20%の固体へ濃縮される、請求項9または10に記載の方法。
- 前記接触工程が6〜9のpHで遂行される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触工程が55℃〜70℃の温度で遂行される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触工程が70℃以下の温度で遂行される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触工程が1〜20時間遂行される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触工程が4時間遂行される、請求項16に記載の方法。
- 前記酵素がプロテアーゼである、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素がアルカラーゼ2.4Lである、請求項18に記載の方法。
- 前記酵素が0.2%〜0.4%の体積/体積の濃度である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触工程が、0.2%または0.4%の酵素の存在下において55℃で18〜20時間遂行される、請求項1に記載の方法。
- 前記抽出工程が油の存在下において遂行される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記油がココナッツ油である、請求項22に記載の方法。
- 前記抽出工程がバイオ燃料の存在下において遂行される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が乾燥工程を欠く、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物の集団が、藻類、菌類、細菌及び原生生物からなる群から選択される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物の集団がThraustochytrium属、Schizochytrium属及びその混合物から選択される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物の集団が、ATCCアクセッション番号PTA−6245として寄託されたThraustochytrium属の種である、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
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