CN103649313B

CN103649313B - 工程化破囊壶菌属微生物

Info

Publication number: CN103649313B
Application number: CN201280018055.4A
Authority: CN
Inventors: S.张; R.阿门塔
Original assignee: DSM Nutritional Products AG
Current assignee: DSM Nutritional Products AG
Priority date: 2011-03-07
Filing date: 2012-03-07
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2032-03-07
Also published as: US9133463B2; EP2683824A4; AU2012226528B2; MX2013010167A; CA2829296A1; JP2014507952A; AU2012226528A1; JP6168700B2; NO2773848T3; ES2678997T3; CN103649313A; EP2683824A1; CN107630017A; US20120244584A1; PT2683824T; US20160010095A1; MX338479B; WO2012120375A1; DK2683824T3; EP2683824B1

Abstract

本公开尤其提供破囊壶菌以及相关方法和试剂，包括来自破囊壶菌属或破囊壶菌和/或在破囊壶菌属或破囊壶菌中可操作的工程化调控序列、适用于工程化微生物例如破囊壶菌属的选择性标记、使微生物突变的方式、通过突变诱发产生的新型菌株、以及在微生物中产生与特定化合物有关的方法和组合物。

Description

工程化破囊壶菌属微生物

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年3月7日提交的美国临时申请序列号61/449,848的权益和优先权，其全部内容以全文引用的方式并入本文中。

序列表

本说明书参考如国际申请在提交时所公开的序列表(标题为“Sequence_Listing.txt”，在2012年3月7日创建，并且为108千字节)。所述序列表的全部内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及可以提供有用的化合物和试剂来源的经过基因改造的破囊壶菌属类。

发明背景

多不饱和脂肪酸(PUFA)长久以来被认为对健康具有有益影响。营养补充物的主要来源是来自具有高浓度PUFA的例如鳀鱼、沙丁鱼、鲑鱼、鲱鱼、鲭鱼和金枪鱼等鱼类物种的油。然而，来源缺乏可靠性，并且从鱼类分离得到的PUFA的质量和/或数量具有可变性，这意味着对PUFA的替代性来源仍存在需要。

破囊壶菌属类是水生的真核微生物，其有能力产生有用的产物，包括PUFA和抗氧化剂(Carmona等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.67(4):884-888,2003)。这些生物体在世界各地的海洋和河口中均有发现。破囊壶菌属类能够利用广泛各种碳源和氮源来生长，从而表明一种利用廉价营养物进行工业化培养的潜力。

对改进的PUFA来源和其他有用的化合物仍存在需要。

发明概要

本发明涵盖利用可用的PUFA来源和其他有用的化合物和试剂来认识某些问题。本发明涵盖如下认知：不论是通过传统的突变诱发还是以别的方式而被基因改造的破囊壶菌属类可以提供有用的PUFA来源和其他化合物和试剂。

在多种实施方案中，本发明提供用于对破囊壶菌属类进行基因工程化的系统，以及具有多种用途(例如产生PUFA和/或产生生物燃料)的基因工程化破囊壶菌属类。

在某些实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，其包含破囊壶菌属或破囊壶菌基因元件，例如破囊壶菌属或破囊壶菌启动子或终止子。所提供的分离的核酸分子中的示例性启动子包括(但不限于)微管蛋白(tubulin)启动子(例如与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高序列一致性的核酸序列)、Δ5延伸酶(elongase)启动子(例如与SEQ ID NO:19具有至少80％序列一致性的核酸序列)和Δ4去饱和酶(desaturase)启动子(例如与SEQ ID NO:24具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高序列一致性的核酸序列)。所提供的分离的核酸分子中的示例性终止子包括(但不限于)微管蛋白终止子(例如与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高序列一致性的核酸序列)。

在一些实施方案中，提供分离的核酸分子，其包含可操作地连接到破囊壶菌属或破囊壶菌基因启动子和破囊壶菌属或破囊壶菌基因终止子的异源序列。在一些实施方案中，所述异源序列编码多肽。在一些实施方案中，所提供的分离的核酸分子进一步包含zeocin抗性基因。

在某些实施方案中，提供宿主细胞，其包含一种或多种所提供的分离的核酸。

在某些实施方案中，提供诱使微生物(例如破囊壶菌属或破囊壶菌)细胞突变的方法，包括以下步骤：在培养基上培养所述微生物细胞，所述培养基包含zeocin并且zeocin浓度能杀死60-80％的所述细胞；以及分离在培养中存活下来的细胞亚群，从而使微生物细胞突变。

在某些实施方案中，提供破囊壶菌属或破囊壶菌细胞，其含有对编码与破囊壶菌属或破囊壶菌的PUFA生物合成途径有关的酶多肽或酶多肽复合物的部分的一个或多个基因的一种或多种修饰。在一些实施方案中，当在可比条件下培养经过修饰的细胞和参考细胞时，相较于参考破囊壶菌属或破囊壶菌细胞，所述一种或多种修饰使经过修饰的细胞产生的一种或多种PUFA增加。在一些实施方案中，所述酶多肽或酶多肽复合物选自由以下组成的组：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延伸酶、Δ12延伸酶、Δ4去饱和酶以及聚酮PUFA合酶(PKS)。在一些实施方案中，所述一种或多种PUFA选自由以下组成的组：α-亚麻酸(“ALA”)、花生四烯酸(“ARA”)、二十二碳六烯酸(“DHA”)、二十二碳五烯酸(“DPA”)、二十碳五烯酸(“EPA”)、γ-亚麻酸(“GLA”)以及亚油酸(“LA”)。在一些实施方案中，所述酶或酶复合物选自由以下组成的组：聚酮PUFA合酶(PKS)、Δ9去饱和酶、延伸酶以及ω-3去饱和酶。

在某些实施方案中，提供使破囊壶菌属或破囊壶菌细胞转化的方法，包括以下步骤：(a)提供感受态(competent)破囊壶菌属或破囊壶菌细胞；(b)将重组核酸递送到所述感受态破囊壶菌属或破囊壶菌细胞中，其中所述重组核酸包含选择性标记；以及(c)在含有选择剂的培养基中培养所述感受态破囊壶菌属或破囊壶菌细胞，所述选择剂能在无所述选择性标记存在下减少细胞的生长。在一些实施方案中，所述选择性标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择剂是抗生素。例如，所述抗生素可以是zeocin。在一些实施方案中，zeocin是以大于50μg/mL(例如约100μg/mL)的浓度存在。

在所提供的使破囊壶菌属或破囊壶菌细胞转化的方法的一些实施方案中，重组核酸进一步包含不同于所述选择性标记的基因表达盒。

在一些实施方案中，所提供的使破囊壶菌属或破囊壶菌细胞转化的方法进一步包括以下步骤：分离含有所述选择性标记的感受态破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。

在一些实施方案中，所述递送步骤包括：生物弹射式递送(biolistic delivery)涂有所有重组核酸的粒子。例如，包含金粒子的粒子可以用于生物弹射式递送中。

在一些实施方案中，所述培养基含有介于较低盐浓度与较高盐浓度之间的盐含量。在一些实施方案中，较低浓度是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约12、约15、约17、约18、约19g/L或约20g/L。在一些实施方案中，较高盐浓度是约20、约22、约25、约27、约30、约32、约35、约37、约40、约45、约50、约55、约60、约65g/L或约70g/L。在一些实施方案中，盐浓度是介于约3g/L与约70g/L之间；介于约5g/L与约60g/L之间；介于10g/L与约40g/L的盐之间(例如介于约15g/L与约35g/L的盐之间，或介于约18g/L与约35g/L的盐之间；或介于约9g/L与约18g/L之间)。在一些实施方案中，所述盐是或包含选自以下的盐：钠盐(例如海盐、氯化钠、食盐(table salt)、硫酸钠等)、钾盐以及其组合。在一些实施方案中，所述盐是或包含非氯盐。在一些实施方案中，所述盐是或包含非氯化物的钠盐。

在某些实施方案中，提供遗传转化感受态破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。

在某些实施方案中，提供已用重组核酸转化的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。

在某些实施方案中，提供培养破囊壶菌属或破囊壶菌细胞的方法，所述方法包括：使包含破囊壶菌属或破囊壶菌细胞的培养物在第一组条件下生长，在所述第一组条件下生物质发生增加(并且任选地，其他特征也发生增加或减少)；将所述第一组培养条件改变成第二组条件，在所述第二组条件下脂质生产率发生增加，其中所述改变包含以下中的一者或多者：(a)使氧浓度从第一氧浓度降低到第二氧浓度；(b)使C:N比率从第一C:N比率增加到第二C:N比率；(c)使温度从第一温度降低到第二温度；以及其组合。

在某些实施方案中，提供提供PUFA的方法，所述方法包括：提供相较于参考破囊壶菌属或破囊壶菌细胞经过修饰的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞，其中经过修饰的细胞含有一种或多种遗传修饰，当在可比条件下培养经过修饰的细胞和参考细胞时，相较于参考细胞，所述遗传修饰使经过修饰的细胞产生的一种或多种PUFA增加；以及在足以实现所述一种或多种PUFA的产生的条件下和时间内培养经过修饰的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。

在一些实施方案中，所述提供步骤包括提供含有至少一个工程化破囊壶菌属或破囊壶菌启动子的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。

在一些实施方案中，所述提供步骤包括提供含有至少一个工程化破囊壶菌属或破囊壶菌终止子的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。

在一些实施方案中，所述提供步骤包括提供相对于参考破囊壶菌属或破囊壶菌细胞经过修饰的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞，其中经过修饰的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞含有至少一种已表达的异源多肽。在一些实施方案中，所述至少一种异源蛋白是由可操作地与工程化破囊壶菌属或破囊壶菌启动子、工程化破囊壶菌属或破囊壶菌终止子或两者连接在一起的基因表达。在一些实施方案中，所述至少一种异源多肽包含至少一种异源PUFA生物合成多肽。

在一些实施方案中，所述遗传修饰包含至少一个核苷酸突变，其使PUFA生物合成多肽的表达或活性增加。在一些实施方案中，表达或活性发生增加的PUFA生物合成多肽是内源PUFA产生多肽。在一些实施方案中，表达或活性发生增加的PUFA产生多肽是异源PUFA生物合成多肽。

在某些实施方案中，提供表达异源PUFA产生多肽的工程化破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。

在某些实施方案中，提供工程化破囊壶菌属或破囊壶菌细胞，当在可比条件下培养工程化细胞和非工程化细胞时，所述工程化细胞产生的至少一种PUFA的含量比非工程化破囊壶菌属或破囊壶菌细胞高至少36％。

在某些实施方案中，提供组合物，其包含：至少一种PUFA；以及以下的一种或多种组分：含有抗生素抗性基因的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞或者是含有抗生素抗性基因的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞的子代。在一些实施方案中，抗生素抗性基因是zeocin抗性基因。

在某些实施方案中，提供组合物，其包含：至少一种PUFA；以及以下的一种或多种组分：(a)已在培养基中或在培养基上培养的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞，所述培养基包含zeocin并且zeocin浓度能杀死60-80％的所述细胞；或(b)已在培养基中或在培养基上培养的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞的子代，所述培养基包含zeocin并且zeocin浓度能杀死60-80％的所述细胞。

在以下附图和说明书中阐述本发明的一个或多个实施方案的详情。本发明的其他特征、目标和优势将从说明书和附图以及权利要求书中显而易见。所有被引专利、专利申请和参考资料(包括属于公共序列数据库记录的参考资料)以全文引用的方式并入以用于所有目的。

附图简述

图1显示PUFA在破囊壶菌属种ONC-T18(“ONC-T18”，ATCC登录号：PTA-6245；国际专利申请号PCT/IB2006/003977，其全部内容以引用的方式并入本文中)中的预测生物合成途径的示意图。FAS：脂肪酸合酶；EL：延伸酶；Δ8：Δ8去饱和酶；Δ5：Δ5去饱和酶；Δ4：Δ4去饱和酶；ω3：ω-3去饱和酶；C14:0：肉豆蔻酸；C16:0：棕榈酸；C16:1n-7：棕榈烯酸；C18:0：硬脂酸；C18:1n-7：顺式-十八碳烯酸；C18:1n-9：油酸；C18:2n-6(LA)：亚油酸；C18:3n-3(ALA)：α-亚麻酸；C18:3n-6(GLA)：γ-亚麻酸；C18:4n-3(STA)：亚麻油酸；C20:2n-6(EDA)：二十碳二烯酸；C20:3n-6(DGLA)：二高-γ-亚麻酸；C20:4n-3(ETA)：二十碳四烯酸；C20:3n-3(ETE)：二十碳四烯酸；C20:4n-6(ARA)：花生四烯酸；C20:5n-3(EPA)：十二碳五烯酸；C22:4n-6(DTA)：二十二碳四烯酸；C22:5n-3(DPA)：二十二碳五烯酸；C22:5n-6：二十二碳五烯酸；C22:6n-3(DHA)：二十二碳六烯酸；以及PKS：聚酮PUFA合酶。指示ω-6PUFA生物合成途径并且指示ω-3PUFA生物合成途径。

图2是生成基因表达载体pd4DPZ1的示意图。

图3是生成基因表达载体pd5EPZ1的示意图。

图4是生成基因表达载体pd5EPrsGFP1以及由所述过程产生的中间质粒的构建体的示意图。

图5是生成基因表达载体p341PZ40T的示意图。

图6是生成基因表达载体p341PZ347T的示意图。

图7是生成基因表达载体p341PZ713T的示意图。

图8是生成基因表达载体p701PZ40T的示意图。

图9是生成基因表达载体p341PsmRsGFP40T的示意图。

图10是生成基因表达载体pD4DPZ18S以及由所述过程产生的中间质粒的构建体的示意图。

图11是生成基因表达载体p341PZ5EpEx以及由所述过程产生的中间质粒的构建体的示意图。

图12说明抗生素zeocin对ONC-T18在生长培养基ONC-T18-GM0板中在不同盐度下的生长和群落数目的影响。结果表明ONC-T18在ONC-T18-GM0培养基中在较高盐度(例如35g/L人工海盐)下比在较低盐度(例如8.5g/L人工海盐)下生长得更快速并且产生更多群落。在中等盐度(例如18g/L人工海盐)下，浓度为30μg/mL的zeocin能完全地抑制ONC-T18在ONC-T18-GM0琼脂板中的生长。

图13说明用质粒DNA转化的ONC-T18菌株的zeocin抗性，其中在生长培养基(ONC-T18-GM0)的琼脂板中在不同ONC-T18基因启动子和终止子下驱动zeocin抗性基因。结果显示所有ONC-T18转化体菌株对抗生素zeocin具抗性，但对野生型ONC-T18菌株无抗性。一些转化体菌株对zeocin(例如5000μg/mL)具高度抗性。

图14说明zeocin抗性基因的转基因在已转化的zeocin抗性菌株中的检测。利用PCR技术使用zeocin抗性基因特异性引物由每个转化体菌株的基因组DNA扩增zeocin基因特异性DNA片段。

图15说明野生型和不同的转化ONC-T18菌株在含有浓度为18g/L或35g/L的海盐的生长培养基(ONC-T18-GM0)的琼脂板中的生长速率。将1μL细胞悬浮液点样于ONC-T18-GM0琼脂板上并且每日测量群落的直径。

图16说明野生型和不同的转化ONC-T18菌株在含有浓度为18g/L或35g/L的人工海盐的液体生长培养基(ONC-T18-GM0)中的生物质生产率。结果显示在较低盐度下，所测试的所有菌株产生的生物质比在较高盐度下要多。

图17说明野生型和不同的转化ONC-T18菌株在含有浓度为18g/L或35g/L的人工海盐的液体生长培养基(ONC-T18-GM0)中的DHA生产率。结果显示转化菌株的DHA生产率在广泛范围内有差别；相较于在较高盐度下，多数菌株在较低盐度下产生高DHA产率，并且可以由筛选单一群落培养物来分离出高DHA产率生产菌株。

图18说明生长在具有不同盐度的液体ONC-T18-GM0培养基中的转化菌株的脂肪酸分布(fatty acid profile)和总脂质生产率。此图说明ble转基因在已转化的ONC-T18菌株中的稳定性。

图19说明诱变ONC-T18菌株和亲代菌株的生物质、脂质和DHA生产率的比较。

定义

感受态：如本文中关于细胞所用的术语“感受态”是指细胞吸收细胞外遗传物质的能力。细胞可以天然地呈感受态和/或以人工方式诱导(例如在实验室中)成呈感受态。在一些实施方案中，当通过特定方法，例如特定转化方法引入细胞外遗传物质时，感受态细胞能够吸收细胞外遗传物质。例如，细胞可以对一种转化方法呈感受态，但对另一种却并不是如此。或者或另外，细胞可以对不止一种转化方法呈感受态。感受态细胞可以获自多种来源中的任一种。例如，它们可以从自然界分离得之，在实验室中制备，并且/或者从市场上购得。在一些实施方案中，细胞的感受态是暂时的。在一些实施方案中，细胞的感受态是永久的。

组分：术语“组分”当在本文中关于细胞使用时意指细胞的任何部分，例如细胞中所含的结构、结构的一部分、大分子复合物和/或分子，包括(但不限于)细胞膜、细胞壁、细胞核、细胞溶质、遗传物质(例如染色体)、细胞器或者任何上述组分的任何部分或任何上述组分中所含的生物分子。典型地含于细胞中的细胞器可能视细胞类型而有所不同。例如，一些细胞器仅存在于真核细胞中。一些细胞器仅存在于植物细胞中，并且一些仅存在于动物细胞中。细胞器的类型的非限制性实例为细胞核、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、溶酶体、空泡、高尔基氏体、内质网、核糖体以及中心体。细胞中所含的生物分子的非限制性实例包括(但不限于)核酸(例如DNA和/或RNA)、多肽(例如蛋白质)、核蛋白复合物、脂质和磷脂。一些细胞可以含有外源遗传物质(例如通过人的手引入到细胞中的物质)。这样的外源物质包括在这个定义内。一些细胞可以具有细胞外组分，例如细胞外囊、鞭毛或菌毛(伞毛)。这些细胞外组分也包括在这个定义内。

工程化：一般来说，术语“工程化”是指已通过人的手加以操纵的状态。例如，当不按自然界中的顺序连接在一起的两个或更多个序列通过人的手加以操纵而在工程化聚核苷酸中彼此直接连接时，所述聚核苷酸被认为是“工程化”的。例如，在本发明的一些实施方案中，工程化聚核苷酸包含在自然界中发现与第一编码序列操作性缔合，但不与第二编码序列操作性缔合，并且已通过人的手来连接而与第二编码序列操作性缔合的调控序列。为了只举一个本文中所述的特定实例，在本发明的一些实施方案中，破囊壶菌Δ4去饱和酶启动子连接到编码多肽而不是破囊壶菌Δ4去饱和酶多肽的核酸。同等地，如果已对细胞或生物体进行操纵以使其遗传信息发生改变(例如已引入先前不存在的新遗传物质，例如通过转化、杂交或其他机制来实现，或者先前存在的遗传物质已发生改变或被移除，例如通过取代或缺失突变来实现)，那么所述细胞或生物体被认为是“工程化”的。如同常见作法，并且本领域技术人员应了解，工程化聚核苷酸或细胞的子代典型地仍被称为“工程化”的，即使已对先前实体进行实际操纵也是如此。

遗传修饰：如本文所用的术语“遗传修饰”是指通过人的手经由使用遗传工程化进行操纵。术语“遗传修饰”涵盖对细胞遗传物质任何类型的改变，包括对细胞遗传物质的核苷酸(例如DNA或RNA)序列的改变以及对细胞遗传物质的化学修饰(例如会影响基因座表达的修饰，例如甲基化)。已以这种方式操纵的细胞或生物体被认为是“经过遗传修饰”的或者是“转基因”的。例如，如本文所用的术语“转基因细胞”是指DNA含有原本不存在于非转基因细胞中的外源核酸的细胞。转基因细胞可以由转化细胞衍生或再生或者由转基因细胞衍生。在本发明背景下，示例性转基因细胞包括(但不限于)转基因破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。转基因细胞典型地表达赋予细胞不同于相同菌株的天然非转基因细胞的特征的DNA序列。转基因细胞的子代同样典型地被认为是转基因的。

异源：如本文所用的术语“异源”是指核酸(例如包括调控序列和/或基因的核酸)或多肽，是指核酸或多肽是以人工方式引入细胞中并且/或者并不是天然地存在于其所存在的细胞中。在一些实施方案中，异源核酸具有与天然地存在于细胞中的核酸一致的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，破囊壶菌属宿主细胞被工程化而包括具有破囊壶菌属或破囊壶菌调控序列的核酸。尽管破囊壶菌属或破囊壶菌调控序列可以天然地存在于宿主细胞中，但所引入的核酸根据本公开是异源的。在许多实施方案中，异源核酸具有不同于天然地存在于细胞中的任何核酸的核苷酸序列。在一些实施方案中，对特定细胞来说异源的核酸具有与天然地存在于不同于其中引入异源核酸的细胞的来源生物体中的核酸一致的核酸序列。

宿主细胞：如本文所用的“宿主细胞”是根据本公开经过操纵的细胞。例如，在一些实施方案中，对宿主细胞进行操纵以使得其产生的一种或多种PUFA增加(例如经由增加PUFA的修饰来实现)。如本文所用的“经过修饰的宿主细胞”是相较于其他相同亲代细胞，和/或相较于特定参考细胞(例如野生型细胞)，已根据本公开经过修饰、工程化或操纵的任何宿主细胞。在一些实施方案中，经过修饰的宿主细胞具有至少一种(并且任选地不止一种)修饰，相较于亲代或参考细胞，所述修饰使经过修饰的宿主细胞产生的PUFA或其他细胞物质增加(例如至少一种增加PUFA的修饰)。

引入：如本文中关于将核酸引入到细胞或生物体中所用的术语“引入”意在具有其最广泛的含义并且涵盖例如通过转化方法(例如氯化钙介导的转化、电穿孔、粒子轰击)引入，以及通过包括转导、接合和杂交的其他方法引入。在一些实施方案中，利用载体来将核酸引入细胞或生物体中。

分离：如本文所用的术语“分离”意谓所分离的实体已经与至少一个先前与其缔合的组分分离开来。当多数其他组分已被移除时，所分离的实体被“纯化”或被“浓缩”。分离和/或纯化和/或浓缩可以使用本领域中已知的任何技术，包括(例如)分馏、萃取、沉淀或其他分离法来进行。

可操作地连接：如本文所用的术语“可操作地连接”是指两个核酸序列之间的关系，其中核酸序列之一的表达是通过另一核酸序列来控制、调控或调节。在一些实施方案中，可操作地连接到第二核酸序列的一个核酸序列直接或间接地共价连接到所述第二序列，不过任何有效的三维缔合是可以接受的。单一核酸序列可以可操作地连接到多个其他序列。例如，单一启动子可以引导多个RNA种类的转录。

多肽：如本文所用的术语“多肽”一般具有其在技术上公认的具有至少三个氨基酸的聚合物的含义。然而，所述术语也用于指多肽的特定功能类别，例如去饱和酶、延伸酶等。对于每个所述类别，本说明书提供所述多肽的已知序列的数个实例。然而，本领域普通技术人员将认识到，术语“多肽”意在足够普遍地不仅涵盖具有本文中(或在本文中具体提及的参考资料或数据库中)所列出的完整序列的多肽，而且涵盖代表所述完整多肽的功能性片段(即保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域普通技术人员了解到，蛋白质序列一般容许在不破坏活性的情况下有一些取代。因此，保留活性并且与相同类别的另一多肽共有至少约30-40％总序列一致性，常常大于约50％、60％、70％或80％，并且进一步通常在一个或多个高度保守的区域中包括至少一个一致性要高得多的区域，常常大于90％或者甚至95％、96％、97％、98％或99％，通常涵盖至少3-4个并且常常达到20个或更多个氨基酸的任何多肽涵盖在如本文所用的相关术语“多肽”之内。其他具有相似性和/或一致性的区域可以由本领域普通技术人员通过分析本文所述的不同多肽的序列来测定。正如由本领域普通技术人员所知，多种策略是已知的，并且可利用用于执行氨基酸或核苷酸序列的比较以便评估一致性和/或相似性程度的工具。这些策略包括(例如)手动比对、计算机辅助的序列比对和其组合。许多用于执行序列比对的算法(其一般由计算机实施)是广泛可用的，或者可以由本领域技术人员来生成。代表性算法包括例如Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.,1981,2:482)；Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.,1970,48:443)；Pearson和Lipman的搜索相似性的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),1988,85:2444)；和/或这些算法的计算机化实施(例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，WisconsinGenetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575 ScienceDr.,Madison,Wis.)。容易获得的合并这些算法的计算机程序包括例如BLASTN、BLASTP、Gapped BLAST、PILEUP、CLUSTALW等。当利用BLAST和Gapped BLAST算法时，可以使用相应程序的默认参数。或者，实践者可以视其实验和/或其他要求而定使用非默认参数(参见例如，网址：URL www.ncbi.nlm.nih.gov)。

PUFA生物合成途径：“PUFA生物合成途径”是产生PUFA和/或PUFA前体的生物合成途径。

PUFA生物合成多肽：如本文所用的术语“PUFA生物合成多肽” 是指与产生例如(但不限于)以下的PUFA有关的多肽：α亚麻酸(“ALA”)、花生四烯酸(“ARA”)、二十二碳六烯酸(“DHA”)、二十二碳五烯酸(“DPA”)、十二碳五烯酸(“EPA”)、γ-亚麻酸(“GLA”)、亚油酸(“LA”)和/或亚麻酸。在一些实施方案中，PUFA生物合成多肽是可在最终产生PUFA的合成途径中催化特定步骤的酶。在一些实施方案中，PUFA生物合成多肽是脂肪酸合酶。在一些实施方案中，PUFA生物合成多肽催化脂肪酸的延长过程。在一些实施方案中，PUFA生物合成多肽催化脂肪酸的去饱和过程。在一些实施方案中，术语“PUFA生物合成多肽”还可以涵盖本身不会催化合成反应，但可调控有此作用的其他多肽的表达和/或活性的多肽。PUFA生物合成多肽包括例如脂肪酸合酶多肽、延伸酶多肽、Δ9去饱和酶多肽、Δ12去饱和酶多肽、Δ6去饱和酶多肽、Δ8去饱和酶多肽、Δ5去饱和酶多肽、Δ4去饱和酶多肽和ω3去饱和酶多肽。

增加PUFA的修饰：如本文所用的“增加PUFA的修饰”是指对宿主细胞所作的增加至少一种PUFA的产生的修饰。在一些实施方案中，所述的产生增加使得PUFA含量比野生型高至少1％-1000％，例如比其中引入修饰的亲代细胞和/或比特定参考细胞(例如野生型细胞)高约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％。在一些实施方案中，增加PUFA的修饰增加一种或多种PUFA生物合成多肽的表达或活性。在一些实施方案中，增加PUFA的修饰降低一种或多种会干扰PUFA生物合成多肽表达或活性(包括例如由与PUFA生物合成多肽竞争接近底物而引起)的多肽的表达或活性。在一些实施方案中，增加PUFA的修饰包含将异源核酸引入到宿主细胞中。在一些实施方案中，增加PUFA的修饰增加细胞中脂肪酸的总含量。在一些实施方案中，增加PUFA的修饰增加细胞中一种或多种特定PUFA的总含量，并且或者并不增加细胞中脂肪酸的总含量。在一些实施方案中，增加PUFA的修饰增加包括(但不限于)ALA、ARA、DHA、DPA、EPA、GLA和/或LA的PUFA的含量。

子代：术语“子代”当在本文中关于细胞使用时意指由另一细胞(“亲代细胞”)(例如通过细胞分裂或出芽)产生以使得“子代细胞”含有亲代细胞的至少一些遗传物质的细胞。在一些实施方案中，子代细胞含有亲代细胞的所有遗传物质。在一些实施方案中，子代细胞并不含有亲代细胞的所有遗传物质。在一些实施方案中，子代细胞含有除亲代细胞的遗传物质以外的一些遗传物质。在一些这样的实施方案中，所述其他遗传物质对细胞的菌株或种类来说是异源的。术语“子代”意在不仅涵盖亲代细胞的直接子代(例如由亲代细胞单次分裂或出芽而产生的细胞)，而且涵盖亲代细胞的所有间接子代(例如由亲代细胞不止一次的分裂或出芽周期而产生的细胞)。因此，给定亲代细胞可以具有许多细胞子代，即使所述细胞可能在每一分裂或出芽周期内仅仅产生有限数目的(例如两个)细胞也是如此。术语“子代”也意在涵盖已经通过人的手进行一次或多次操纵(例如被遗传操纵或被遗传工程化)的细胞。因此，例如，当亲代细胞系被遗传操纵或遗传工程化时，由此产生的所有细胞被认为是所述细胞系的子代。那些子代的所有子代也被认为是亲代细胞系的子代，以此类推。

启动子或启动子元件：如本文所用的术语“启动子”和“启动子元件”是指可调控可操作地连接到启动子的所选聚核苷酸序列的表达并且影响所选聚核苷酸序列在细胞中的表达的聚核苷酸。如本文所用的术语“破囊壶菌启动子”是指在破囊壶菌细胞中起作用的启动子。如本文所用的术语“破囊壶菌属启动子”是指在破囊壶菌属细胞中起作用的启动子。

参考细胞：如本文所用的短语“参考细胞”是指出于比较目的就至少一个特征来讲是正常的细胞。例如，用于与遗传工程化细胞作比较的参考细胞可以是未被遗传工程化的细胞。在一些实施方案中，参考细胞不含遗传修饰。在一些实施方案中，参考细胞是野生型菌株的细胞。在一些实施方案中，参考细胞含有与其相比较的特定菌株所特有的一些遗传修饰，但不含有与其相比较的所述特定菌株所特有的一种或多种遗传修饰。例如，这样的参考细胞将可用于评估其不含有的所述一种或多种遗传修饰的作用。因此，例如，术语“参考破囊壶菌细胞”(或“参考破囊壶菌属细胞”)意指同与其相比较的细胞相同或类似的菌株的破囊壶菌细胞(或破囊壶菌属细胞)，只是参考破囊壶菌细胞(或参考破囊壶菌属细胞)缺乏与参考破囊壶菌细胞(或参考破囊壶菌属细胞)作比较的破囊壶菌细胞(或破囊壶菌属细胞)的一种或多种特征(例如一种或多种遗传修饰)。

选择性标记：如本文所用的短语“选择性标记”是指编码允许选择的产物(蛋白质)的核苷酸序列(例如基因)，抑或基因产物(例如蛋白质)本身。术语“选择性标记”在本文中是如同本领域中对其普遍理解的那样来使用并且是指在细胞或生物体内的存在可在某些确定的培养条件(选择性条件)下赋予所述细胞或生物体显著的生长或存活优势或劣势的标记。例如，这些条件可以是存在或不存在特定化合物或特定环境条件，例如升高的温度、增加的辐射、存在在无标记时具有毒性的化合物等等。存在或不存在这样的化合物或环境条件被称为一个“选择性条件”或“数个选择性条件”。“生长优势”意指相对于其他相同细胞或生物体来说增强的活力(例如具有生长优势的细胞或生物体相对于其他相同细胞，平均具有增加的寿命)、增加的增殖速率(在本文中也称为“生长速率”)抑或两者。一般来说，相较于缺乏生长优势的其他相同细胞群体，具有生长优势的细胞群体将展现较少的死亡或不能存活的细胞和/或较大的细胞增殖速率。尽管典型的是选择性标记将赋予细胞生长优势，但是某些选择性标记赋予细胞生长劣势，例如它们使该细胞对某些化合物或环境条件的有害效应比不表达标记的其他相同细胞更加敏感。抗生素抗性标记是一类能用于选择表达标记的细胞的选择性标记的非限制性实例。在适当浓度的抗生素(选择性条件)存在下，这样的标记赋予表达标记的细胞生长优势。因此，表达抗生素抗性标记的细胞能够在抗生素存在下存活和/或增殖，而不表达抗生素抗性标记的细胞不能在抗生素存在下存活并且/或者无法增殖。例如，常用于植物细胞中的这种类型的选择性标记是NPTII蛋白质，其编码提供针对抗生素卡那霉素的抗性的蛋白质。其他选择性标记包括赋予针对羧苄青霉素(例如β-内酰胺酶)的抗性的蛋白质、赋予针对庆大霉素、潮霉素等抗性的蛋白质。选择性标记的第二非限制性类别是营养标记。这样的标记一般是在生物合成途径中起作用以产生为细胞生长或存活所需的化合物的酶。一般来说，在非选择性条件下，所需化合物存在于环境中或者通过替代性途径在细胞中产生。在选择性条件下，需要其中涉及标记的生物合成途径起作用以产生所述化合物。

选择剂：如本文所用的短语“选择剂”是指可对细胞或细胞群体引入选择性压力以有利于或对抗具有选择性标记的细胞或细胞群体的试剂。例如，在某些实施方案中，选择剂是抗生素并且选择性标记是抗生素抗性基因。在某些示例性实施方案中，zeocin用作选择剂。

来源生物体：如本文所用的“来源生物体”是天然地含有或产生将要根据本发明引入到接受细胞或宿主细胞中的聚核苷酸、多肽或其他化合物(例如异源核酸)的生物体。在一些实施方案中，将要选择的特定来源生物体对于本公开的实施来说并不是必需的。相关考虑因素可以例如包括潜在来源和宿主生物体在进化中如何密切相关、或者来源生物体与其他相关核酸和/或多肽的序列所选自的其他来源生物体如何相关。当多个不同异源核酸将要被引入宿主细胞中并且/或者由宿主细胞表达时，不同序列可以来自不同来源生物体，或来自同一来源生物体。为了只举一个实例，在一些情况下，个别多肽可以代表具有复杂蛋白活性的个别亚单位，并且/或者可能为与其他多肽协同作用以便实现本公开的目标所需。在一些实施方案中，将会常常需要这样的多肽来自同一来源生物体，并且/或者是充分相关的以在共同表达于宿主细胞中时适当地起作用。在一些实施方案中，这样的多肽可以来自不同、甚至不相关的来源生物体。将进一步了解到，在异源多肽将要表达于宿主细胞中时，将会常常需要利用编码所述多肽的核酸序列，其已被调整以适应宿主细胞的密码子偏好性并且/或者使编码序列与在宿主细胞中具活性的调控元件连接。例如，当宿主细胞是破囊壶菌细胞时，将会常常需要改变编码给定多肽的基因序列，以使得其更接近地符合这种细胞的密码子偏好性。在某些实施方案中，对编码给定多肽的基因序列进行优化，甚至当这样的基因序列衍生自宿主细胞本身(并且因此不是异源的)时也如此。例如，编码相关多肽的基因序列可能没有为了表达于给定宿主细胞中而被进行密码子优化，即使这样的基因序列是从宿主细胞菌株中分离出来也是如此。在这样的实施方案中，可以对基因序列进一步进行优化以引起宿主细胞的密码子偏好性。本领域普通技术人员将会知道宿主细胞密码子偏好性并且将会能够采用本文所公开的方法和组合物来优化给定多肽在宿主细胞中的表达。

底物：如本文中用于描述酶的底物的“底物”是指可以通过酶的活性来修饰的任何实体。

终止子：如本文所用的术语“终止子”是指阻止可操作地连接到终止子的所选聚核苷酸序列在细胞中表达的聚核苷酸。在一些实施方案中，终止子序列在基因中处于终止密码子下游。如本文所用的术语“破囊壶菌终止子”是指在破囊壶菌细胞中起作用的终止子。如本文所用的术语“破囊壶菌属终止子”是指在破囊壶菌属细胞中起作用的终止子。

转化：如本文所用的术语“转化”是指将外源核酸分子(例如载体或重组核酸分子)引入到接受细胞或微生物中的过程。外源核酸分子可能被整合到或可能没有被整合到(即共价连接到)构成宿主细胞或微生物基因组的染色体DNA中。例如，外源聚核苷酸可以维持在附加型元件(例如质粒)上。或者或另外，外源聚核苷酸可以整合到染色体中以使得其通过子细胞经由染色体复制而遗传。转化方法包括(但不限于)磷酸钙沉淀；Ca²⁺处理；接受细胞与含有重组核酸的细菌原生质体融合；用含有重组核酸的脂质体处理接受细胞；DEAE葡聚糖；使用聚乙二醇(PEG)进行的融合；电穿孔；磁穿孔(magnetoporation)；生物弹射式递送；反转录病毒感染；脂转染；以及直接将DNA微量注射到细胞中。在一些情形下，外源核酸通过与另一细胞杂交而引入到一种细胞中。例如，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中，细胞彼此杂交。

已转化的：如关于细胞所用的术语“已转化的”是指已对细胞进行如本文所述的“转化”，以使得细胞携带外源遗传物质(例如重组核酸)。术语“已转化的”也可以或者替代性地用于指微生物、微生物菌株、组织、生物体等等。

某些具体实施方案的详细描述

如本文所述，本发明提供多种与产生PUFA和/或修饰破囊壶菌属类有关的试剂和方法。一般来讲，本发明涉及修饰破囊壶菌属宿主细胞，并且尤其涉及工程化破囊壶菌属类，尤其涉及使其相关化合物(例如PUFA)的产生增加。本发明涵盖鉴别某些破囊壶菌属种基因调控元件，以及开发诱使破囊壶菌属或破囊壶菌突变的方法。在某些实施方案中，本发明进一步提供工程化破囊壶菌属种菌株，以及由其并且用其产生的产物。本发明的这些和其他方面的具体实施方案的某些详情更详细地描述于下文中。

宿主细胞

如上所述，本发明提供用于操纵宿主细胞的试剂和方法。

一般来讲，可以利用所鉴别的试剂(例如调控元件、载体、选择性标记、诱变剂等)和方法(包括例如诱变方法)以及任何适当的宿主细胞。已阅读了本公开并且因此手头上拥有这些试剂的本领域普通技术人员将会容易地能够鉴别其中这些元件具有活性的适当宿主细胞。

在一些实施方案中，根据本发明使用的宿主细胞是破囊壶菌属细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是破囊壶菌目(Thraustochytriales)的成员。在一些实施方案中，宿主细胞是破囊壶菌科亚纲的成员。在一些实施方案中，宿主细胞是选自以下的属的成员：破囊壶菌、吾肯氏壶菌(Ulkenia)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、橙黄壶菌(Aurantiochytrium)、不动壶菌(Aplanochytrium)、葡萄串壶菌(Botryochytrium)、日本壶菌(Japonochytrium)、椭圆壶菌(Oblongichytrium)、帕里蒂氏壶菌(Parietichytrium)以及葫芦状壶菌(Sicyoidochytrium)。在一些实施方案中，宿主细胞不属于裂殖壶菌属。

在一些实施方案中，根据本发明利用的宿主细胞是破囊壶菌属的成员。在一些实施方案中，宿主细胞是来自以下种类之一的破囊壶菌细胞：聚合破囊壶菌(Thraustochytrium aggregatum)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)、盖氏破囊壶菌(Thraustochytrium gaertnerium)、金尼破囊壶菌(Thraustochytrium kinnei)、动孢破囊壶菌(Thraustochytrium motivum)、多基底增殖破囊壶菌(Thraustochytriummultirudimentale)、厚皮破囊壶菌(Thraustochytrium pachydermum)、罗斯破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)、破囊壶菌属种1.3A4.1、破囊壶菌属种ATCC 26185、破囊壶菌属种BL13、破囊壶菌属种BL14、破囊壶菌属种BL2、破囊壶菌属种BL3、破囊壶菌属种BL4、破囊壶菌属种BL5、破囊壶菌属种BL6、破囊壶菌属种BL7、破囊壶菌属种BL8、破囊壶菌属种BL9、破囊壶菌属种BP3.2.2、破囊壶菌属种BP3.3.3、破囊壶菌属种caudivorum、破囊壶菌属种CHN-1、破囊壶菌属种FJN-10、破囊壶菌属种HK1、破囊壶菌属种HK10、破囊壶菌属种HK5、破囊壶菌属种HK8、破囊壶菌属种HK8a、破囊壶菌属种KK17-3、破囊壶菌属种KL1、破囊壶菌属种KL2、破囊壶菌属种KL2a、破囊壶菌属种ONC-T18、破囊壶菌属种PJA10.2、破囊壶菌属种TR1.4、破囊壶菌属种TRR2、纹状破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)或威瑟氏吾肯氏破囊壶菌(Thraustochytrium visurgense)。

在一些实施方案中，根据本发明使用的宿主细胞是裂殖壶菌属的成员。在一些实施方案中，宿主细胞是来自以下种类之一的破囊壶菌细胞：蛞蝓裂殖壶菌(Schizochytriumlimacinum)、红树林裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovei)、小裂殖壶菌(Schizochytriumminutum)、裂殖壶菌属种(ATCC 20111)、裂殖壶菌属种(ATCC 20888)、裂殖壶菌属种BR2.1.2、裂殖壶菌属种BUCAAA 032、裂殖壶菌属种BUCAAA 093、裂殖壶菌属种BUCACD 152、裂殖壶菌属种BUCARA 021、裂殖壶菌属种BUCHAO 113、裂殖壶菌属种BURABQ 133、裂殖壶菌属种BURARM 801、裂殖壶菌属种BURARM 802、裂殖壶菌属种FJU-512、裂殖壶菌属种KH105、裂殖壶菌属种KR-5、裂殖壶菌属种PJ10.4、裂殖壶菌属种SEK 210、裂殖壶菌属种SEK 345、裂殖壶菌属种SEK 346、裂殖壶菌属种SR21或裂殖壶菌属种TIO01。

在某些实施方案中，宿主细胞是破囊壶菌属种ONC-T18细胞。ONC-T18是最初从加拿大新斯科舍省芬迪湾阿德沃基特港(Advocate Harbor,Bay of Fundy,Nova Scotia,Canada)的盐沼草叶子中分离出来的海产破囊壶菌。ONC-T18描述于美国专利公布2009/0117194中，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞具有与SEQID NO:68至少97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高(例如包括100％)一致的18s rRNA序列。在一些实施方案中，宿主细胞是来自以ATCC菌株登录号PTA-6245保藏的细胞的破囊壶菌属种ONC-T18细胞。

工程化微生物

本公开尤其提供用于操纵例如破囊壶菌属类微生物的调控元件、选择性标记、诱变方法和转化方法。正如由本领域普通技术人员在考虑本公开之后将会认识到，本文中提供的工具可以单独使用并且以多种组合形式使用以实施任何所要的遗传修饰。例如，在某些实施方案中，所提供的转化方法用于引入编码一个或多个基因的核酸分子。核酸分子可以包括本文中提供的启动子、终止子或选择性标记序列或其组合。在某些实施方案中，所提供的诱变方法用于产生具有所要性质的菌株(例如破囊壶菌属菌株)。这些菌株也可以被转化(例如用包括本文中提供的一个或多个调控元件的核酸)。

基因表达

本公开涵盖用于工程化微生物的组合物和方法。在某些实施方案中，本公开提供用于工程化破囊壶菌属类(例如破囊壶菌)的组合物和方法。“工程化”细胞包括已被修饰(例如通过引入外源核酸而被修饰)的细胞以及其保留所述修饰的子代。

在一些实施方案中，本公开提供包括来自破囊壶菌属或破囊壶菌的调控序列的核酸。在真核生物中的基因表达常常需要调控序列，其具有种特异性，或者在密切相关的生物体中起作用。来自破囊壶菌属或破囊壶菌的调控序列的可用性允许相关基因表达于破囊壶菌属类中。在一些实施方案中，调控序列包括启动子序列。在一些实施方案中，调控序列包括终止子序列。

本公开提供分离的核酸，其包括破囊壶菌属或破囊壶菌启动子。在一些实施方案中，本文中提供的核酸包括破囊壶菌Δ4去饱和酶基因启动子。示例性Δ4去饱和酶基因启动子的序列示于SEQ ID NO:24中。在一些实施方案中，本文中提供的核酸包括破囊壶菌Δ5延伸酶基因启动子。示例性Δ5延伸酶基因启动子的序列示于SEQ ID NO:19中。破囊壶菌Δ5延伸酶基因启动子在破囊壶菌属类(例如破囊壶菌)中是强启动子。在一些实施方案中，本文中提供的核酸包括破囊壶菌属或破囊壶菌微管蛋白基因启动子。示例性破囊壶菌微管蛋白基因启动子的序列示于SEQ ID NO:6和10中。

在一些实施方案中，本文中提供的包括破囊壶菌属或破囊壶菌启动子的分离的核酸是一种盒子，例如表达盒。在一些实施方案中，本文中提供的包括破囊壶菌属或破囊壶菌启动子的分离的核酸是一种载体，例如表达载体。

在一些实施方案中，本公开提供已被工程化而包括破囊壶菌属或破囊壶菌基因启动子的细胞。在一些实施方案中，破囊壶菌属或破囊壶菌细胞被工程化而包括破囊壶菌属或破囊壶菌启动子，例如破囊壶菌Δ4去饱和酶基因启动子、破囊壶菌Δ5延伸酶基因启动子或破囊壶菌微管蛋白基因启动子。

本公开提供包括破囊壶菌属或破囊壶菌基因终止子的分离的核酸。在一些实施方案中，本文中提供的核酸包括破囊壶菌属或破囊壶菌微管蛋白基因终止子。示例性破囊壶菌微管蛋白基因终止子的序列示于SEQ ID NO:14和18中。

在一些实施方案中，本文中提供的包括破囊壶菌属或破囊壶菌基因终止子的分离的核酸是一种盒子，例如表达盒。在一些实施方案中，本文中提供的包括破囊壶菌属或破囊壶菌基因终止子的分离的核酸是一种载体，例如表达载体。

在一些实施方案中，所提供的分离的核酸包括一个或多个基因调控元件。在一些这样的实施方案中，所包括的基因调控元件有助于诱导性基因调控。可以与所提供的核酸组合使用的诱导性系统的非限制性实例包括四环素诱导性系统、乙醇诱导性系统和化学诱导性基因表达系统。(参见例如Park和(2005)；Li等人(2005)；以及Jepson等人(1998)，所述文献各自的全部内容以引用的方式并入本文中)。

本文中提供的具有调控序列的核酸可以可操作地连接到异源序列，例如编码异源多肽的基因。例如，在一些实施方案中，提供基因表达盒，其典型地包含可操作地连接到异源核酸序列的破囊壶菌属或破囊壶菌基因启动子，所述异源核酸序列可操作地连接到破囊壶菌属或破囊壶菌基因终止子。在一些实施方案中，异源核酸序列包含基因中的编码序列的至少一部分，例如异源核酸序列编码基因产物，例如多肽或RNA。在一些实施方案中，所提供的基因表达盒进一步包含选择标记(例如zeocin抗性基因，例如Sh ble，或本文中所讨论的任何其他选择标记)。

分子生物学和DNA操纵程序一般可以根据Sambrook等人或Ausubel等人(SambrookJ,Fritsch E F,Maniatis T(eds).1989.Molecular Cloning.A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory Press:New York；Ausubel F M,Brent R,Kingston R E,Moore D D,Seidman J G,Smith J A,Struhl K(eds).1998.Current Protocols inMolecular Biology.Wiley:New York)来执行。

诱变

在另一方面，本公开提供用于诱使微生物突变的试剂和/或方法，以及通过诱变产生的菌株和/或细胞。例如，如本文中所述，已经发现，例如博莱霉素(bleomycin)、腐草霉素(phleomycin)和/或他利霉素(tallysomycin)的抗生素可以用于诱使微生物突变。用于例如破囊壶菌属类(例如破囊壶菌)的微生物的这样的有效诱变剂的可用性允许开发具有所要特征的菌株。特别是，本公开证实，zeocin(腐草霉素D1)可以用于诱使例如破囊壶菌属类(例如破囊壶菌)的微生物突变。

抗生素zeocin是来自轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)突变体的培养肉汤的碱性水溶性铜螯合糖肽(InvivoGen,San Diego,CA,USA)。zeocin是作为已被广泛用作对抗淋巴瘤、头颈部癌和睾丸癌的有效抗肿瘤剂的糖肽的抗生素的腐草霉素族群的成员(Umezawa 等人，New antibiotics,bleomycin A and B,Journal of Antibiot.,(1966)19:200-209；Sikic等人，Bleomycin Chemotherapy,Academic Press,Orlando,Florida,(1985))。普遍认为，这些抗生素的分子作用模式与其通过插入其平面的含有联噻唑的部分来结合DNA并且使DNA裂解，从而产生导致细胞死亡的单链断链或双链断链的能力有关(Povirk等人，Nucleic Acids Research,(1977)4:3573-3580)。由于具有针对广谱细胞类型的毒性，该组抗生素被用作用于阳性选择的药物。本公开涵盖以下发现：zeocin是可用于工业微生物菌株改良的诱变剂。另外，本文中显示，在zeocin能杀死多数处理过的细胞的特定浓度下，存活细胞的突变频率有增加。产生突变频率有增加的细胞的能力允许更容易地选择和分离已被诱变的菌株。

在一些实施方案中，本公开提供用于诱使破囊壶菌属细胞突变的系统和/或方法。在一些实施方案中，本公开提供用于诱使选自由以下组成的组的细胞突变的系统和方法：破囊壶菌细胞、吾肯氏壶菌细胞、裂殖壶菌细胞、橙黄壶菌细胞、不动壶菌细胞、葡萄串壶菌细胞、日本壶菌细胞、椭圆壶菌细胞、帕里蒂氏壶菌细胞、葫芦状壶菌细胞、被孢霉属(Mortierella)真菌、异养生长的藻类(例如隐甲藻属(Crypthecodinium)中的种)。在一些具体实施方案中，本发明提供用于诱变ONC-T18的系统和/或试剂。

在某些示例性实施方案中，微生物通过施加于包含相关抗生素(例如zeocin)的合适固体培养基(例如琼脂培养基)而被诱变，其中抗生素是以低于其展现完全或接近完全地抑制细胞生长时的浓度的浓度存在。用于这些方法的微生物并不携带zeocin抗性基因(例如Sh ble)。在一些实施方案中，抗生素(例如zeocin)以低于其杀死至少85％、90％、95％或100％的那种类型的细胞时的浓度的浓度用于诱变。在一些实施方案中，抗生素(例如zeocin)以高于其杀死30％、40％、50％或60％的那种类型的细胞时的浓度的浓度用于诱变。在一些实施方案中，抗生素(例如zeocin)被用于突变。在一些实施方案中，抗生素以其使暴露于其的细胞中的突变频率增加超过针对所述细胞所观测到的自发突变频率时的浓度和条件使用。在一些实施方案中，抗生素以其抑制那种类型的细胞生长或者杀死60-80％的那种类型的细胞时的浓度和条件使用。

ONC-T18细胞对浓度为100g/mL的zeocin具高度敏感性(参见实施例3)。因此，在一些实施方案中，zeocin以低于100g/mL的浓度(例如90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35或30g/mL)用于诱变。在一些实施方案中，zeocin以约50g/mL的浓度用于诱变。在一些实施方案中，其中用zeocin诱使细胞突变的培养基具有18g/L或更小的盐浓度。相对于在较低浓度下或在无诱变剂存在下生长的细胞，已被诱变的细胞会显示形态变化。为了只举几个实例，在一些实施方案中，已被诱变的细胞显示生长速率、颜色和/或全部或特定的脂质量发生改变。

在某些示例性诱变方法中，将细胞(例如破囊壶菌属或破囊壶菌细胞)展布于含有浓度为40-60g/mL的抗生素(例如zeocin)的固体培养基上。分离出在这些条件下在至少4天(例如5天、6天、7天、8天、9天或10天)之后显露出的群落。可以测试所分离的细胞由诱变产生的所要特征。例如，可以将来自诱变群落的细胞与参考细胞(例如亲代细胞)比较以检测例如生物质和/或脂质生产率的特征的变化。

本公开提供微生物(例如破囊壶菌属或破囊壶菌)，其通过抗生素(例如zeocin)诱变来分离。在一些实施方案中，通过抗生素(例如zeocin)诱变来分离的微生物菌株(例如破囊壶菌菌株)产生比亲代或参考菌株多至少10％、20％、30％、40％、50％的总脂质。在一些实施方案中，通过zeocin诱变来分离的破囊壶菌属菌株产生比亲代菌株多至少10％、20％、30％、40％、50％的ALA、ARA、DHA、DPA、EPA、GLA和/或LA，或其组合。在一些实施方案中，通过zeocin诱变来分离的破囊壶菌属菌株产生比亲代菌株多至少10％、20％、30％、40％、50％的ARA、DHA、EPA，或其组合。

通过zeocin诱变来分离的ONC-T18的一个特定菌株产生比其亲代菌株多约36％的DHA。

选择

本公开提供用于选择例如破囊壶菌属类(例如破囊壶菌)的微生物的方法。这样的方法可以与例如如本文所述的转化方法结合并且/或者作为例如如本文所述的转化方法的一部分来使用以便对微生物进行遗传操纵。

一般来说，在所提供的选择方法中，使用选择剂来有利于携带适用于选择剂的选择性标记的微生物的生长超过不具有选择性标记的微生物。典型地，选择剂抑制、减少和/或减缓不具有选择标记的微生物的生长。在选择期间，典型地在如本文中所述的生长培养基中培养微生物，只是生长培养基补充有选择剂(“选择培养基”)。

在本公开的某些选择方法中，在选择培养基中培养微生物持续一段足以允许培养物变得主要包含具有选择标记的细胞的时间。即，在生长于选择培养基中的期间内，不具有选择标记的细胞没有发生生长并且在培养物中被具有选择标记的细胞超越。在一些实施方案中，在选择培养基中培养微生物持续1到15天、1到12天、或1到9天。在某些实施方案中，在选择培养基中培养微生物持续一段长于1、2、3、4、5、6、7、8、9天或10天并且/或者短于50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11天或10天的时间。在某些示例性实施方案中，在选择培养基中培养微生物持续介于约3天与约5天、或介于约5天与约10天之间等的时间。在一些实施方案中，微生物在选择之后保持在选择培养基中。在一些实施方案中，将微生物转移到无选择剂的培养基中持续至少一段时间，例如在复原期(recovery phase)期间。

在一些实施方案中，在细胞已经在选择培养基中生长一段时间之后移除选择性标记。选择性标记的移除可以在细胞生长于选择培养基中的这段时间之后立即，在细胞生长于无选择剂的培养基中的“复原期”之后，或者稍后(例如在细胞已被储存一段时间之后，在细胞已被冷冻并且接着熔融之后)执行。对细胞进行遗传工程化以使得所引入的遗传元件(例如选择性标记)可以稍后被移除的方法是本领域中熟知的。这样的方法典型地采用使用重组酶多肽，其典型地识别特定核苷酸序列(“识别位点”或“识别序列”)。例如，选择性标记可以被工程化到具有侧接选择性标记的特定重组酶的识别位点的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞中。当需要缺失选择性标记时，细胞可以暴露于适当重组酶(即识别侧接选择性标记的识别位点的重组酶)，其在识别位点上进行同源重组反应，从而使介于识别位点之间的核酸序列缺失或倒位。

在一些实施方案中，选择剂是或者包含抗生素，并且选择标记是或者包含抗生素抗性基因。

在一些实施方案中，使用选择剂的组合并且/或者使用选择标记的组合。

在某些示例性实施方案中，微生物通过施加于包含zeocin的适合培养基而经历选择，其中zeocin以高于阈值浓度的浓度存在。

阈值浓度可以大致对应于zeocin展现完全或接近完全地抑制不含有zeocin抗性基因的细胞的生长时的浓度。在一些实施方案中，阈值浓度为或者高于zeocin杀死至少85％、90％或100％的那种不含zeocin抗性基因的类型的细胞时的浓度。在一些实施方案中，阈值浓度可以视培养条件(例如盐浓度、培养基类型、培养温度、液体或固体培养物等)而变化。在许多实施方案中，阈值浓度高于50μg/mL。在一些实施方案中，阈值浓度为或者高于60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μg/mL。在一些实施方案中，阈值浓度为或者约100μg/mL。

在一些实施方案中，抗生素抗性基因是或者包含腐草霉素、博莱霉素和/或他利霉素抗性基因。在一些实施方案中，抗生素抗性基因是或者包含来自印度斯坦链异壁菌(S.hidustanus)的基因(例如ble基因)。

在一些实施方案中，在选择期间使用的培养基的盐浓度不同于在无选择下用于培养微生物的培养基中典型使用的盐浓度。在一些实施方案中，在选择期间使用的培养基中的盐浓度大致与在无选择下用于培养微生物的培养基中典型使用的盐浓度相同。在某些示例性实施方案中，盐浓度是介于约10g/L与约40g/L之间，介于约15g/L与约35g/L之间，并且/或者介于约18g/L与约35g/L之间。在一些实施方案中，盐浓度是约18g/L。在一些实施方案中，盐浓度是约35g/L。

在一些实施方案中，当培养基具有约18g/L的盐浓度时使用30μg/mL或高于30μg/mL的zeocin浓度。在一些实施方案中，当培养基具有约35g/L的盐浓度时使用100μg/mL或高于100μg/mL的zeocin浓度。

在某些示例性实施方案中，在选择期间使用的适合培养基是固体培养基。当使用固体培养基时，微生物可以在固体培养基的平坦表面上被展布开来(例如使用接种环、细胞展布器、珠粒或其他展布机制)，以使得可以允许单细胞群落生长。

可以对单细胞群落进行拣选并且培养以获得较多和/或充分数量来用于分析(例如转基因分析、生长特征分析、脂质分布分析等)和/或产生如本文所述的化合物。或者或另外，由此获得的单细胞群落和/或培养物可被储存(例如通过冷冻在适当的冷冻培养基中)以供后续使用。

转化

本公开提供用于转化破囊壶菌属(例如破囊壶菌)细胞的方法。这样的方法一般包含以下步骤：提供感受态破囊壶菌属细胞；将异源 (例如重组或工程化)核酸递送到感受态细胞中，其中重组核酸包含选择性标记；以及在含有选择剂的培养基中培养感受态细胞，所述选择剂可在无选择性标记存在下减少细胞生长。

本公开提供遗传转化感受态破囊壶菌属细胞。在某些示例性实施方案中，感受态细胞属于菌株ONC-T18。这样的感受态细胞可以通过多种方法中的任一种来提供，这些方法的非限制性实例更详细地描述于实施例5中。在制备感受态细胞的方法(例如实施例5中所述的方法)中，感受态细胞是通过用来自破囊壶菌属或破囊壶菌的所要菌株的接种物对固体或液体培养基进行接种并且允许细胞生长，在必要时供应新鲜的培养基而获得。感受态细胞的制备典型地涉及在液体培养基中的一个或多个生长阶段，接着对细胞进行离心分离，并且使细胞再悬浮于无菌液体中达到所要细胞密度。感受态细胞可以在实验中需要时新鲜制备，并且/或者可以对其进行制备并接着加以储存(例如冷冻)以供将来使用。

在一些实施方案中，细胞生长于烧瓶(例如体积为250mL、500mL或1L)中。

在一些实施方案中，细胞生长于富含氮源的培养基中。为了只举一例，在一些实施方案中，细胞生长于具有高含量蛋白胨的培养基中。在一些这样的实施方案中，细胞生长于包含至少5-25g/L蛋白胨(或其他氮源)的培养基中。

在一些实施方案中，细胞生长于高含量的溶解氧中。在一些实施方案中，在生长期间，例如以约100到约500、或约125到约400、或约150到约300rpm来搅动细胞。

在一些实施方案中，在营养繁殖期间诱使细胞突变。在一些实施方案中，在旺盛的营养繁殖期间诱使细胞突变。在一些实施方案中，在游动孢子阶段期间并不诱使细胞突变。

异源(例如重组、合成(以化学方式或以生物学方式)和/或工程化，其中其核酸序列是通过人的手来选择)核酸可以是DNA、RNA、RNA:DNA杂交体或其任何适合的衍生物。在许多实施方案中，重组核酸是以载体的一部分来递送。多种载体中的任一种可以适于根据本公开的方法来使用，包括(但不限于)质粒、粘粒、BAC(细菌人工染色体)、YAC(酵母人工染色体)和病毒载体。在一些实施方案中，异源DNA可以是或者包含化学合成的聚核苷酸。在一些实施方案中，异源DNA可以包含酶合成的聚核苷酸。在一些实施方案中，异源DNA为或者包含聚合酶链反应(“PCR”)产物。

重组或工程化核酸典型地包含用于如本文所述的选择方法中的选择标记。典型地，选择标记包含允许基因产物的表达的基因表达盒，其当存在于细胞中时，允许细胞生长于含有浓度为如本文所述的阈值浓度或高于这个阈值浓度的选择剂的选择培养基中。例如，在抗生素用作选择剂的实施例中，选择标记包含用于表达相应抗生素抗性基因的基因表达盒。

在一些实施方案中，重组或工程化核酸进一步包含用于表达一种或多种所要基因产物的一个或多个其他基因表达盒。代表性一种或多种所要基因产物可以例如包括具有商业价值的多肽，并且/或者可以是对于合成具有商业价值的一种或多种下游产物(例如如PUFA的化合物)来说很重要的多肽(例如酶多肽或其他生物合成途径组分)。或者或另外，所要基因产物可以赋予微生物某些所要特征(例如在一组特定条件下生长的适合性；在大规模生产方法中生长的适合性等)。或者或另外，所要基因产物可以是允许标记已经转化的细胞的产物。或者或另外，在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生高含量的一种或多种生物燃料、药物、疫苗、抗体、脂质、消退素、神经蛋白、药物化合物、多肽等。

本文中已经描述了典型地含于基因表达盒中的元件，例如驱动基因表达的启动子或其他基因调控元件、将要表达的基因以及在将被转化的微生物中起作用的终止子序列。将要表达的基因可以称为“转基因”。转基因在某些实施方案中可以是异源基因，例如通常不存在于微生物中的基因。选择标记和其他基因表达盒中的任一者或两者可以包括这样的异源基因。

因此，适于根据本公开的方法来使用的载体包括基因表达载体。

在一些实施方案中，将一种重组核酸递送到微生物中。例如，可以用包含重组核酸的一种质粒建构体使微生物转化。

在一些实施方案中，将不止一种重组核酸递送到微生物中。例如，可以将质粒建构体的组合(每个质粒建构体包含重组核酸)递送到微生物中。在一些这样的实施方案中，使用选择剂与选择标记的组合来选择所要重组核酸的组合的存在。

多种用于将遗传物质(例如包含重组核酸的遗传物质)引入到细胞中的方法中的任一种可以适于根据本公开的转化方法来使用。引入方法包括(但不限于)磷酸钙沉淀；Ca²⁺处理；接受细胞与含有重组核酸的细菌原生质体融合；用含有重组核酸的脂质体处理接受细胞；DEAE葡聚糖；使用聚乙二醇(PEG)进行的融合；电穿孔；磁穿孔；生物弹射式递送；反转录病毒感染；脂转染；以及直接将DNA微量注射到细胞中。

在某些示例性实施方案中，使用生物弹射式递送方法(也称为“基因炮击(genecannon)”、“粒子轰击”和“微抛射”方法)。在这样的实施方案中，生物弹射装置促使涂有重组核酸的粒子加速到足以穿透细胞膜(和/或细胞壁，若存在时)的速度。在一些实施方案中，粒子包含金粒子或由金粒子组成。用于生物弹射式递送遗传物质的方法是本领域已知的，并且用于进行这样的生物弹射式递送的设备和试剂可从市面上购得。参见例如Sanford等人，Part.Sci.Technol.5:27(1987)；Sanford,J.C.,Trends Biotech.6:299(1988)；Sanford,J.C.,Physiol.Plant 79:206(1990)；以及Klein等人，Biotechnology 10:268(1992)，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，使用正如将会由本领域普通技术人员所已知并了解的例如土壤杆菌属介导的转化、原生质体转化等方法来递送核酸。

正如本文在“选择”章节中所述，在递送异源(例如重组或工程化)核酸之后，在含有可在无选择性标记存在下减少细胞生长的选择剂的培养基中培养细胞。所选择的细胞(例如展现存在选择性标记并且因此存在重组核酸)可以被储存、分析并且/或者在适当时以更多数量生长。

在某些示例性实施方案中，对转化细胞进行一种或多种分析以确认重组核酸的存在。例如，可以使用PCR分析来确认作为重组核酸一部分的遗传元件(例如转基因和/或选择性标记)的存在。

工程化菌株

本公开尤其提供能够操纵某些例如破囊壶菌属类微生物的调控序列、转化方法、诱变方法和遗传选择方法。本文中提供的组合物和方法可以在许多应用的任一种中用于工程化微生物(例如破囊壶菌属类)。如上所述，本文中提供的调控序列和选择性标记可以用于在生物体中表达任何相关多肽，在这种生物体中这些序列和/或选择性标记是可操作的(例如在破囊壶菌属类中)。在一些实施方案中，表达来自不同生物体的多肽。在一些实施方案中，表达来自宿主细胞的多肽(例如过表达)。

在一些实施方案中，对微生物进行工程化以使相关化合物的产生增加。在一些实施方案中，对微生物进行工程化以使脂肪酸、抗氧化剂、消退素和/或保护素的产生增加。或者或另外，在一些实施方案中，对细胞进行工程化以产生高含量的一种或多种生物燃料、药物、疫苗、抗体、脂质、消退素、神经蛋白、药物化合物、多肽等。

本公开提供已被工程化以使PUFA的产生增加的破囊壶菌属微生物(例如破囊壶菌)。即，本公开提供工程化破囊壶菌属细胞，其包括增加PUFA的修饰。在一些实施方案中，对这样的微生物进行工程化以改变PUFA生物合成多肽的表达(例如增加或减少)。

如图1中所示，ONC-T18中的PUFA生物合成涉及由脂肪酸合酶(FAS)酶复合物产生脂肪酸，例如肉豆蔻酸(C14:0)和硬脂酸(C18:0)，接着在这样的脂肪酸上发生一系列酶促反应。这些反应各自典型地由去饱和酶(其移除氢原子以形成碳-碳双键)或延伸酶(其通过向脂肪酸的羧酸末端添加两个碳原子来延长脂肪酸)催化。聚酮PUFA合酶(PKS)复合物还在ONC-T18中产生DHA。ONC-T18中的PUFA生物合成似乎具有至少两个交叉的生物合成途径：ω-6和ω-3PUFA生物合成途径。使ω-6脂肪酸转化为ω-3脂肪酸可以由ω-3去饱和酶所催化。因此，如图1中所示，在途径中的不同点产生多种脂肪酸。

在一些实施方案中，调控编码酶多肽的一个或多个基因在途径中的表达以在适当时增加特定PUFA和/或其他脂肪酸的产生。例如，可以下调FAS基因的表达以增加PUFA产生。Δ5延伸酶、Δ4去饱和酶和/或任何PKS基因的表达的下调可以增加EPA产生和/或PUFA产生。PKS基因中的任何一种的表达的下调可以增加ARA产生。PKS基因中的任何一种的表达的上调可以增加DHA产生。Δ12延伸酶基因的表达的上调可以增加ARA和EPA产生。

在一些实施方案中，调控编码酶多肽的一个或多个基因在途径中的表达以产生生物燃料。例如，PKS、Δ9去饱和酶、延伸酶和ω-3去饱和酶基因中任一者的表达的下调和/或FAS基因表达的上调可以增加用作生物燃料库存的短链脂质的产生。

在一些实施方案中，途径组分的基因表达的改变(例如下调或上调)是通过产生基因敲除体，例如通过同源重组来实现。典型地，使用包括(但不限于)生物弹射式抛射型DNA递送的多种技术中的任一种将线性化DNA建构体引入细胞中。在一些实施方案中，同源重组在ONC-T18中的频率大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。

在一些实施方案中，途径组分的基因表达的改变(例如下调或上调)是通过诱使一个或多个基因靶标突变来实现。

在一些实施方案中，本文中提供的工程化微生物可以产生包含n-3DHA、EPA和n-6DPA的脂质部分，其量为大于约4.0g/L培养基。在一些实施方案中，本文中提供的微生物可以产生包含n-3DHA、EPA和n-6DPA的脂质组合物，其量为大于约20.0g/L培养基。在一些实施方案中，微生物可以产生包含n-3DHA、EPA和n-6DPA的脂质组合物，其量为大于约14.0g/L培养基。在一些实施方案中，微生物可以产生约1.5g/L到约5.0g/L之间(例如约4.6g/L)的n-3DHA、约0.5g/L到约1.5g/L之间(例如约0.22g/L)的n-3EPA以及约0.5g/L到约1.5g/L的n-6DPA。在一些实施方案中，本文中提供的工程化微生物可以产生包含n-3DHA、EPA、n-6DPA或ARA的脂质组合物，产量达到约120g/L，这对应于超过约75％的总脂质。在一些实施方案中，本文中提供的工程化微生物可以产生包含短链脂肪酸(典型地为C12-C18脂肪酸)的脂质组合物，产量达到约128g/L，这对应于超过约80％的总脂质。此外，微生物可以产生包含肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸以及二十二碳五烯酸的脂质部分，其量为大于300mg/g或者甚至800mg/g细胞生物质。在一些实施方案中，微生物也可以产生包含以下的部分：介于44.3mg/g与57mg/g之间的肉豆蔻酸(等于1134.5到1458.1mg/L)、0.5到0.65mg/g的肉豆蔻油酸(等于13.3到16.63mg/L)、33.5到34.6mg/g的十五烷酸(等于856.9到885.1mg/L)、121.9到165.1mg/g的棕榈酸(等于3118.2到4923.3mg/L)、7.9到28.5mg/g的棕榈烯酸(等于202.1到729mg/L)、4.38 到5.9mg/g的硬脂酸(等于112到151mg/L)、6.94到9.9mg/g的油酸(等于177.5到253.2mg/L)、0.4到1.3mg/g的亚油酸(等于11.26到33.3mg/L)、0.5到1.0mg/g的二十碳二烯酸(等于12.8到25.6mg/L)、0.4到0.5mg/g的花生四烯酸(等于10.2到13mg/L)、75到100mg/g的二十二碳六烯酸(等于1918到2560mg/L)、1.9到6mg/g的二十碳五烯酸(等于48.6到153.5mg/L)以及17.1到33.7mg/g的二十二碳五烯酸(等于437.4到862.1mg/L)，在细胞生物质内的总脂肪酸含量介于301到800mg/g之间(等于7700到20,209mg/L)。

发酵和产生

某些本发明方法包括培养微生物(例如破囊壶菌属，例如破囊壶菌属种)的步骤或者可以与培养微生物(例如破囊壶菌属，例如破囊壶菌属种)的步骤结合使用。破囊壶菌属类的培养方法已经例如描述于美国专利公布US2009/0117194A1中，其全部内容以引用的方式并入本文中。典型地，微生物生长于生长培养基(也称为“培养基”)中。多种培养基中的任一种可以适于根据本发明的选择方法来使用。典型地，培养基为微生物供应多种营养组分，包括碳源和氮源。

可以在能增加生物质和/或相关化合物的产生的条件下培养本文中提供的微生物。典型地在生理盐水培养基中培养破囊壶菌属类。例如，可以在盐浓度介于约2.0-50.0g/L之间的培养基中培养破囊壶菌属类。在一些实施方案中，在盐浓度介于约2-35g/L之间的培养基中培养破囊壶菌属类。在一些实施方案中，在盐浓度介于约18-35g/L之间的培养基中培养破囊壶菌属类。已经在某些情形下发现，破囊壶菌属类在低盐条件下生长得很好。在一些实施方案中，在盐浓度介于约5-20g/L之间的培养基中培养破囊壶菌属类。在一些实施方案中，在盐浓度介于约5-15g/L之间的培养基中培养破囊壶菌属类。培养基可能包括或可能不包括NaCl。培养基可能包括或可能不包括加入NaCl。在一些实施方案中，培养基含有人工海盐，例如INSTANT OCEAN^TM,Aquaria,Inc。培养基可能包括或可能不包括天然或人工海水。在一些实施方案中，培养基含有天然或人工海水，例如约2％到100％海水。

氯离子会导致腐蚀发酵器或其他下游加工设备。在一些实施方案中，降低培养基中的氯离子浓度。在一些实施方案中，培养基包括不含氯离子的钠盐(例如硫酸钠)作为钠源。例如，总钠量的很大一部分可以由非氯盐供应，以使得培养基中的总钠量的不到约100％、75％、50％或25％是由氯化钠供应。

在一些实施方案中，培养基的氯离子浓度小于约3g/L、500mg/L、250mg/L或120mg/L。在一些实施方案中，培养基的氯离子浓度介于约60mg/L与120mg/L之间。

适于根据本发明来使用的非氯化物的钠盐的实例包括(但不限于)苏打灰(碳酸钠与氧化钠的混合物)、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠以及其混合物。参见例如美国专利号5,340,742和6,607,900，所述文献各自的全部内容以引用的方式并入本文中。

破囊壶菌属培养物的培养基可以包括多种碳源中的任一者。碳源的实例包括脂肪酸；脂质；甘油；甘油三酯；碳水化合物，例如葡萄糖、淀粉、纤维素、半纤维素、果糖、右旋糖、木糖、乳果糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原；明胶；淀粉(玉米或小麦)；乙酸盐；m-肌醇(源自于玉米浆)、半乳糖醛酸(源自于果胶)、L-岩藻糖(源自于半乳糖)、龙胆二糖、葡糖胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸盐(源自于葡萄糖)、纤维二糖、糊精和α-环糊精(源自于淀粉)；蔗糖(来自糖蜜)；多元醇，例如麦芽糖醇、赤藓糖醇、阿东糖醇和油酸，例如甘油和吐温80；氨基糖，例如N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺和N-乙酰基-β-D-甘露糖胺；以及任何种类的生物质或废物流。

在一些实施方案中，培养基包括碳源，浓度为约5g/L到约200g/L。在一些实施方案中，培养基具有介于约1:1与约40:1之间的C:N 比率(碳氮比率)。在使用两相培养物的一些实施方案中，培养物的C:N比率在第一相中介于约1:1与约5:1之间，接着在第二相中为约1:1到约1:约0(即没有或几乎没有氮)。

破囊壶菌属类培养物的培养基可以包括多种氮源中的任一者。示例性氮源包括铵盐溶液(例如于H₂O中的NH₄)、铵盐或胺盐(例如(NH₄)₂SO₄、(NH₄)₃PO₄、NH₄NO₃、NH₄OOCH₂CH₃(NH₄Ac))、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、鱼粉、谷氨酸钠、大豆提取物、酪蛋白氨基酸以及酒糟。氮源在适合培养基中的浓度范围典型地介于约1g/L与约25g/L之间。

在一些实施方案中，培养基包括磷酸盐，例如磷酸钾或磷酸钠。培养基中的无机盐和微量营养物可以包括硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰氯化钙以及EDTA。可以包括维生素，例如吡哆醇盐酸盐、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素B12。

例如，适合培养基可能包含介于约11与约13g/L之间(例如约12g/L)的硫酸钠、介于约0.45与约0.55g/L之间(例如约0.5g/L)的KCl、介于约1.8与约2.2g/L之间(例如约2g/L)的MgSO₄·7H₂O、介于约0.3与约0.4g/L之间(例如约0.35g/L)的Hodag K-60消泡剂、介于约0.60与约0.70g/L之间(例如约0.65g/L)的K₂SO₄、介于约0.9与约1.1g/L之间(例如约1.0g/L)的KH₂PO₄、介于约0.95与约1.1g/L之间(例如约1g/L)的(NH₄)₂SO₄、介于约0.15与约0.19之间(例如约0.17g/L)的CaCl₂·H₂O、介于约2与约10g/L之间(例如约4.5g/L)的95DE玉米糖浆(固体基准)、介于约2.7与约3.3mg/L之间(例如约3mg/mL)的MnCl₂·4H₂O、介于约2.7与约3.3mg/L之间(例如约3mg/mL)的ZnSO₄·7H₂O、介于约0.035与约0.045mg/L之间(例如约0.04mg/L)的CoCl₂·6H₂O、介于约0与约0.045mg/L之间(例如约0.04mg/L)的Na₂MoO₄·2H₂O、介于约1.8与约2.2mg/L 之间(例如约2mg/L)的CuSO₄·5H₂O、介于约1.8与约2.2mg/L之间(例如约2mg/L)的NiSO₄·6H₂O、介于约9与约11mg/L之间(例如约10mg/L)的FeSO₄·7H₂O、介于约4与约15mg/L之间(例如约9.5mh/L)的硫胺素、介于约0.05与约0.25mg/L之间(例如约0.15mg/L)的维生素B₁₂、介于约1.3与约5.1之间(例如约3.2mg.L)泛酸钙以及约28％NH₄OH溶液。

在适当时，使用酸或碱，并且/或者使用氮源将培养基的pH值调整到3.0到10.0之间。在一些实施方案中，将培养基调整到pH 4.0到6.5之间。可以对培养基进行杀菌。

在一些实施方案中，用于培养微生物的培养基是液体培养基。在一些实施方案中，用于培养微生物的培养基是固体培养基。除了如本文所论述的碳源和氮源以外，固体培养基可以含有一种或多种组分(例如琼脂或琼脂糖)，其提供结构支持并且/或者允许培养基呈固体形式。

可以对细胞进行培养持续介于1-60天之间的任何天数。在一些实施方案中，进行培养持续14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天，或更少时间。在一些实施方案中，在介于4到30℃之间，例如18到28℃的温度下进行培养。在一些实施方案中，培养包括通气振荡培养、振荡培养、静置培养、分批培养、半连续培养、连续培养、滚动式分批培养或波动培养等等。可以使用常规的搅拌式发酵器、泡罩塔发酵器(分批培养或连续培养)、波动发酵器等进行培养。

在一些实施方案中，通过振荡对培养物进行通气。在一些实施方案中，振荡从100到1000rpm，例如从350到600rpm、从1000到450rpm变动。在一些实施方案中，在产生生物质的阶段期间以及在产生脂质的阶段期间以不同方式对培养物进行通气(例如使用不同的振荡速度)。例如，在一些实施方案中，通过振荡，在生物质阶段期间以介于约150与约350rpm之间的速度并且在产生脂质的阶段期间以介于约30与约120rpm之间的速度对培养物进行通气。或者或另外，振荡速度可以视培养容器类型(例如烧瓶形状或尺寸)而变化。

在一些实施方案中，溶解氧(DO)含量在生物质产生阶段期间高于其在脂质产生阶段期间的含量，例如DO含量在脂质产生阶段期间发生降低。在一些实施方案中，使溶解氧含量降低到低于饱和值；在一些实施方案中，使溶解氧含量降低到极低或者甚至无法检测的程度。

已经发现，可以通过根据涉及改变一个或多个培养条件以便获得较高数量的所要化合物的方法培养细胞来促进所要脂质的产生。在一些实施方案中，首先在能最大化生物质的条件下培养细胞，接着将一个或多个培养条件改变成有利于脂质生产率的条件。所改变的条件可以包括氧浓度、C:N比率、温度以及其组合。在某些实施方案中，进行两阶段培养，其中第一阶段有利于生物质产生(例如使用高氧条件(例如一般来讲或相对于第二阶段来讲)、低C:N比率和环境温度)，接着为第二阶段，其有利于脂质产生(例如其中氧被减少，C:N比率升高，并且温度降低)。即，在一些实施方案中，本发明提供涉及在第一组条件下培养细胞的方法，所述第一组条件包括一个或多个选自以下的条件：第一氧浓度、第一C:N比率、第一温度以及其组合。在这个第一组条件下进行的培养持续第一时间段，其持续时间可有所变化。在第一时间段结束时(这并非必定为离散的时间点)，改变一个或多个条件以便在第二组条件下培养细胞，所述第二组条件包括一个或多个选自以下的条件：第二氧浓度、第二C:N比率、第二温度以及其组合。在一些实施方案中，在第一时间段结束时改变一些条件，并且维持一些条件直到第二时间段结束，在所述第二时间段时可以再次改变一个或多个条件，并且/或者可以第一次改变一个或多个条件。在一些实施方案中，第一C:N比率在约2:1到约1:1的范围内；并且第一温度在约10到约30℃的范围内。在一些实施方案中，第二C:N比率是约1:约0；并且第二温度在约15℃到约30℃的范围内。

在一些实施方案中，从第一条件到第二条件的改变是逐步地进行并且/或者发生；在一些实施方案中，从第一条件到第二条件的改变是突然地进行并且/或者发生。

在本文提供的培养方法的一些实施方案中，在培养期间以数种可能方式，包括例如通过改变通气强度来改变(例如降低)氧浓度。

在本文提供的培养方法的一些实施方案中，在培养期间将温度改变(例如降低)至少2℃。在一些实施方案中，将温度改变3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃。在一些实施方案中，将温度从约25℃改变到约20℃。

可以通过任何可用的方法来评估相关化合物的细胞生产率。

产物

根据本公开产生的PUFA和其他化合物可以用于多种应用的任一种中，例如利用其生物或营养性质。在本公开的一些实施方案中，化合物被用于药物、食物补充剂、动物饲料添加剂、化妆品等中。根据本公开产生的化合物也可以作为中间体用于产生其他化合物。

应认识到，在本公开的一些实施方案中，在宿主细胞的背景下，由如本文所述的经过操纵的细胞产生的PUFA和/或其他化合物被合并到最终产物(例如食物或饲料补充剂、婴儿配方食品、药物等)中。例如，宿主细胞可以被冻干，冷冻干燥，冷冻，巴氏灭菌，或者以别的方式灭活，并且接着全细胞可以被合并到最终产物中或者用作最终产物。在一些实施方案中，宿主细胞(无论是否经过干燥)可以在合并于产物中之前进一步加以处理(例如经由溶解、超声处理、珠粒研磨、压力处理、冷冻-熔融、用于分离组分的脉冲场电泳(PFE)和/或酶处理、或者其组合来进行；在一些实施方案中，利用至少两种或更多种这样的处理)。可以使用适当溶剂将溶解的细胞萃取到油中并且使用熟知方法进行精炼。在一些实施方案中，最终产物仅仅合并从整体分离出的宿主细胞的一部分(例如根据尺寸、溶解度分馏)。例如，在本公开的一些实施方案中，从宿主细胞中分离出脂质并且合并到最终产物中或者用作最终产物。含有PUFA的脂质可以使用超临界流体萃取法或者用一种或多种溶剂(例如丙酮、氯仿、异丙醇、己烷、二氯甲烷或甲醇)的萃取法来萃取。在一些实施方案中，通过例如尿素包合法(urea complexation)、柱色谱法和/或超临界流体分馏法等多种方法中的任一者来浓缩脂质。用于浓缩溶剂萃取的脂质的技术包括水解(例如使用碱、酸，或者酶水解)、进一步的萃取、酸化、结晶、过滤以及其组合(参见例如美国专利公布2009/0117194)。

在本公开的一些实施方案中，一种或多种产生的PUFA和/或其他化合物被合并到食物或饲料的组分(例如食物补充剂)中。可以根据本公开合并化合物的食物产品的类型不受特别限制，并且包括饮料，例如牛奶、水、运动饮料、能量饮料、茶和果汁；点心，例如果冻和饼干；含有脂肪的食物和饮料，例如乳制品；加工食品，例如软米(或粥)；婴儿配方食品；早餐谷类食品等等。在一些实施方案中，一种或多种产生的化合物被合并到例如复合维生素的膳食补充剂中。在某些实施方案中，根据本公开产生的PUFA化合物包括于膳食补充剂中并且可以直接地合并到食物或饲料的组分(例如食物补充剂)中。

可以合并根据本公开产生的化合物的饲料的实例包括例如宠物食物，例如猫食物、狗食物等等；用于水族箱鱼、养殖鱼或甲壳类动物等的饲料；用于农场饲养动物(包括牲畜以及水产业中养殖的鱼类或甲壳类动物)的饲料。合并根据本公开产生的化合物的食物或饲料物质优选的是对作为预期接受者的生物体来说是可口的。这种食物或饲料物质可以具有目前关于食物物质所知的任何物理性质(例如物体、液体、柔软的)。

在一些实施方案中，一种或多种产生的化合物(例如PUFA)被合并到药物中。这样的药物的实例包括例如各种片剂、胶囊、可饮用的药剂等。在一些实施方案中，所述药物适用于局部应用。剂型不受特别限制，并且包括胶囊、油剂、颗粒、细粒剂、粉剂、片剂、丸剂、宝塔糖剂等等。油剂和填充油的胶囊可以提供额外的优点，这既是因为其没有在制造期间发生成分分解现象，又是因为含有PUFA的脂质液滴可以容易地合并到油基配制物中。

根据本公开的药物可以根据本领域中确立的技术，包括例如如在美国药典(United States Pharmacopoeia)中所述的普通程序来制备。

根据本公开产生的化合物(不论是已分离的还是在细胞的背景下)可以通过与多种药剂中的任一者组合而合并到如本文所述的产物中。例如，这样的化合物可以与一种或多种粘合剂或填充剂组合。在一些实施方案中，发明性产物将包括一种或多种螯合剂、颜料、盐、表面活性剂、保湿剂、粘度调节剂、增稠剂、软化剂、芳香剂、防腐剂等等以及其组合。

实施例

实施例1：分离和鉴定启动子和终止子序列

此实施例描述了从ONC-T18中鉴定和分离某些示例性基因表达启动子和终止子核酸序列。

加拿大海洋营养有限公司(Ocean Nutrition Canada Limited)已经使用鸟枪法测序和焦磷酸测序(GS-20；454)技术基本上对ONC-T18的基因组进行了测序。尤其，本公开内容提供了例如利用公众可获得的EST(表达序列标签)收集信息(Huang等人,2008)、功能注释和/或生物信息学软件(例如可从Applied Maths获得的Kodon软件包和/或一种或多种算法(如BLAST))来对这种序列信息进行分析。为了提供用于表达同源性和异源性基因(例如参与破囊壶菌属微生物内的脂质和脂肪酸生物合成的基因)的工具，使用聚合酶链反应(PCR)技术从破囊壶菌属种ONC-T18的基因组DNA克隆看家微管蛋白基因启动子和终止子以及去饱和酶和延长酶启动子。

1.分离和鉴定微管蛋白基因启动子#701。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)，基于破囊壶菌属种ONC-T18基因组序列数据来设计寡核苷酸引物#52(SEQ ID NO:1)和#53(SEQ ID NO:2)。寡核苷酸引物是由Invitrogen(California,USA)合成并且购自Invitrogen(California,USA)。

在振荡孵育箱中，在以150rpm进行恒定搅动下，在25℃下从培养在生长培养基(ONC-T18-GM0)中的细胞中提取ONC-T18的基因组DNA，持续36小时。通过在Sorvall SuperT21离心机中，用具有适配器Sorvall#00436的转子ST-H750以4300rpm在室温下离心5分钟来收集50mL培养物中的细胞。使用Ultraclean微生物DNA分离试剂盒(UltracleanMicrobial DNA Isolation kit)(MO BIO Laboratories公司,Solana Beach,California)，遵循制造商的方案从所述细胞中分离基因组DNA。

生长培养基ONC-T18-GM0的组分是：5g/L酵母提取物(RM668，HiMedia labs)、5g/L大豆蛋白胨(RM007，HiMedia labs)、10g/L D(+)-葡萄糖(CERELOSE^TM右旋糖020010，CornProducts International)、35g/L人工海盐(INSTANT OCEAN^TM，AquariaInc.)、1.25mg/L微量元素(5g/L NaH₂PO₄.H₂O、3.15g/L FeCl₃·6H₂O、4.36g/L Na₂EDTA·2H₂O、0.6125mg/LCuSO₄·5H₂O、0.0597g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.022g/L ZnSO₄·7H₂O、0.01g/L CoCl₂·6H₂O、0.18g/L MnCl₂·4H₂O、13μg/L H₂SeO₃、2.7mg/L NiSO₄·6H₂O、1.84mg/L Na₃VO₄以及1.94mg/L K₂CrO₄)以及1.25mg/L维生素(1mg/L维生素B12、1mg/L生物素、0.20g/L盐酸硫胺素)。

使用以下PCR条件从ONC-T18的基因组DNA扩增包括部分开放阅读框序列在内的微管蛋白基因启动子#701：94℃，持续1分钟；94℃，持续30秒；以及68℃，持续6分钟，并且重复30个循环，以及72℃，持续10分钟。在50μL反应混合物中进行PCR，所述反应混合物含有2.5单位TaKaRa LA Taq^TMDNA聚合酶(TAKARA BIO 公司,Shiga,Japan)、1XLA PCR缓冲液II、dNTP混合物(各自0.40mM)、225ηg模板基因组DNA、0.20μM引物#52以及0.20μM引物#53。

在用于电泳的0.8％琼脂糖凝胶中在65伏下拆分PCR产物，持续60分钟。用刀片剪出具有预期大小的条带，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案提取并且纯化DNA。

使用Perfectly 克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)，按照制造商的方案将经过纯化的DNA片段克隆到pT7Blue-3载体中。使用直接群落PCR方法筛选阳性克隆。简单地说，使用牙签挑选经过转化的大肠杆菌(Escherichia coli)群落，并且分别在200μL PCR管中在含有下列组分的20μL PCR反应混合物中涡旋：Taq DNA聚合酶(Sigma)、1X PRC缓冲液、2.5mM MgCl₂、dNTP混合物(各自0.20mM)、0.25μM引物#62(SEQ ID NO:3)以及0.25μM引物#63(SEQ ID NO:4)。同时，还将群落划线接种到参考培养板上以便分离质粒DNA。

在以下条件下进行PCR：94℃，持续3分钟，历经一个循环；94℃，持续1分钟，53℃，持续2分钟，以及72℃，持续4分钟，并且重复30个循环；以及72℃，持续10分钟。在0.8％琼脂糖凝胶中区分PCR产物。扩增得到具有预期大小的PCR产物的群落被认为是阳性群落。

使用Zyppy^TM质粒微量制备试剂盒(Zymo Research公司,Orange,California)从3mL培养物中的细菌大肠杆菌细胞中分离阳性克隆JZ2-17-10的质粒DNA。使用正向引物#62(SEQ ID NO:3)和反向引物#63(SEQ ID NO:4)对它的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。来自于克隆JZ2-17-10的插入物的核苷酸序列的长度是724 个碱基对(SEQ ID NO:5)。基于使用不同生物信息学软件进行的分析将部分预测性微管蛋白基因开放阅读框(ORF)的预测性翻译起始密码ATG的具有498个核苷酸的上游确定为预测性基因表达启动子(序列#701；SEQ ID NO:6)。在这个序列内鉴定出典型的基因启动子元件。使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人,1990)在包括专利序列的数据库在内的不同基因库数据库中对与这个预测性启动子序列#701(SEQ ID NO:6)同源的序列进行搜索。没有发现与这个独特的启动子序列#701同源的序列。在BLAST搜索中，ORF的5'端部分序列与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)β微管蛋白2(TUB2)基因(基因库登录号：XM_001693945)具有最大的同源性。

所鉴定的启动子序列的长度是498个核苷酸，并且含有处于位置444上的-10普里布诺盒(Pribnow-Schaller box)(AGGAAGACT)和处于位置424上的-35盒(CTGACG)、处于位置459上的预测性转录起始位点以及处于位置468上的预测性转录因子结合位点AAGGTAGA。

2.分离和鉴定微管蛋白基因启动子#341。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)，基于破囊壶菌属种ONC-T18基因组序列数据来设计寡核苷酸引物#54(SEQ ID NO:7)和#55(SEQ ID NO:8)。寡核苷酸引物是由Invitrogen(California,USA)合成并且购自Invitrogen(California,USA)。

通过PCR，使用与对于分离微管蛋白基因启动子#701所述的条件相同的条件，从ONC-T18的基因组DNA扩增包括下游部分开放阅读序列在内的微管蛋白基因启动子#341。使用Perfectly 克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)，按照制造商的方案将所扩增的经过纯化的DNA片段克隆到pT7Blue-3载体中。使用Zyppy^TM质粒微量制备试剂盒(Zymo Research公司,Orange,California)从3mL培养物中的大肠杆菌细胞中分离阳性克隆JZ2-17-14的质粒 DNA。

使用正向引物#62(SEQ ID NO:3)和反向引物#63(SEQ ID NO:4)对重组质粒DNA的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆JZ2-17-14的插入核苷酸序列的长度是1115个碱基对(SEQ ID NO:9)。已经鉴定出微管蛋白基因的位于插入物的3'端序列处的部分ORF。ORF的预测性翻译起始密码ATG的上游序列被认为是预测性启动子#341(SEQ ID NO:10)。

使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人,1990)在包括专利序列的数据库在内的不同基因库数据库中对与微管蛋白基因启动子#341(SEQ ID NO:10)同源的序列进行搜索。没有发现与这个独特的微管蛋白基因启动子#341序列同源的序列。在BLAST搜索中，预测性部分ORF的5'端序列与莱茵衣藻α微管蛋白2(TUA2)基因(基因库登录号：5728641)具有最大的同源性。

这个长度是1104个核苷酸的启动子序列含有处于位置542上的-10盒(CGCTAAAAT)和处于位置518上的-35盒(TTCACG)、处于位置557上的预测性转录起始位点以及处于位置543上的预测性转录因子结合位点GCTAAAAT，以及处于位置143上的-10盒(TAGTAGATT)和处于位置125上的-35盒(TTGCTC)、处于位置158上的预测性转录起始位点以及处于位置149上的预测性转录因子结合位点ATTTTGTA和处于位置150上的TTTTGTAA。

3.分离和鉴定微管蛋白基因终止子#347。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)，基于ONC-T18的基因组序列数据来设计寡核苷酸引物#58(SEQ ID NO:11)和#59(SEQ ID NO:12)。寡核苷酸引物是由公司Invitrogen(California,USA)合成并且购自公司Invitrogen(California,USA)。

通过PCR，使用与对于分离微管蛋白基因启动子#341所述的条件相同的条件，从ONC-T18的基因组DNA扩增微管蛋白基因终止子#347。使用Perfectly 克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)，按照制造商的方案将经过纯化的DNA片段克隆到pT7Blue-3载体中。使用Zyppy^TM质粒微量制备试剂盒(ZYMO RESEARCH公司,Orange,California)从3mL培养物中的细菌大肠杆菌细胞中分离阳性克隆JZ2-17-22的质粒DNA。

使用正向引物#62(SEQ ID NO:3)和反向引物#63(SEQ ID NO:4)对重组质粒DNA的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆JZ2-17-22的核苷酸序列的插入物的长度是727个碱基对(SEQ IDNO:13)。所述插入物的5'端序列已经被鉴定为预测性部分ORF，所述预测性部分ORF含有预测性基因翻译终止密码子TAA。终止密码子TAA的下游序列被认为是预测性微管蛋白基因终止子#347(SEQ ID NO:14)。

使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人,1990)在包括专利序列的数据库在内的不同基因库数据库中对与微管蛋白基因终止子#347序列(SEQ ID NO:14)同源的序列进行搜索。没有发现与这个独特的微管蛋白基因终止子#347序列的同源序列。在BLAST搜索中，预测性ORF的部分序列与水蕨(Ceratopteris richardii)α微管蛋白基因(基因库登录号：XM_001691824)具有最大的同源性。

长度是590个核苷酸的终止子序列含有预测性多聚腺苷酸化信号序列AAAACAAAAA，所述预测性多聚腺苷酸化信号序列的功能在于终止通过RNA聚合酶进行的转录。

4.分离和鉴定微管蛋白基因终止子#713。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)，基于ONC-T18的基因组序列数据来设计寡核苷酸引物#60(SEQ ID NO:15)和#61(SEQ ID NO:16)。所述寡核苷酸引物是由Invitrogen(California,USA)合成并且购自Invitrogen(California,USA)。

通过PCR，使用与对于分离微管蛋白基因启动子#341所述的条件相同的条件，从ONC-T18的基因组DNA扩增微管蛋白基因终止子#713。使用Perfectly 克隆试剂盒(Novagen,San Diego,California)，按照制造商的方案将经过纯化的DNA片段克隆到pT7Blue-3载体中。使用Zyppy^TM质粒微量制备试剂盒(Zymo Research 公司,Orange,California)从3mL培养物中的细菌大肠杆菌细胞中分离阳性克隆JZ2-22-9的质粒DNA。

使用正向引物#62(SEQ ID NO:3)和反向引物#63(SEQ ID NO:4)对重组质粒DNA的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆JZ2-22-9的核苷酸序列的插入物的长度是869个碱基对(SEQ ID NO:17)。所述插入物的5'端序列已经被鉴定为预测性部分ORF，所述预测性部分ORF含有预测性基因翻译终止密码子TAA。终止密码子TAA的下游序列被认为是预测性微管蛋白基因终止子#347(SEQ ID NO:18)。

使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人,1990)在包括专利序列的数据库在内的不同基因库数据库中对与微管蛋白基因终止子#713序列(SEQ ID NO:18)同源的序列进行搜索。没有发现与这个独特的微管蛋白基因终止子#713序列同源的序列。在BLAST搜索中，预测性ORF的部分序列与蓝载藻(Cyanophora paradoxa)β1微管蛋白(tubB1)基因(基因库登录号：AF092952)具有最大的同源性。

长度是640个核苷酸的终止子序列(SEQ ID NO:14)含有预测性多聚腺苷酸化信号序列CATAAA，所述多聚腺苷酸化信号序列的功能在于终止通过信使RNA聚合酶进行的转录。

5.分离和鉴定Δ5延长酶基因(PCT/1B2007/004553)启动子序列(SEQ ID NO:19)。基于使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)得到的ONC-T18基因组序列数据，设计了为了便于进行下游分子克隆而在5'端上添加有限制性内切酶位点XbaI的寡核苷酸引物#3(SEQ ID NO:20)以及在5'端上添加有限制性内切酶位点NcoI的引物#4(SEQ ID NO:21)。所述寡核苷酸引物是由Invitrogen(California,USA)合成并且购自Invitrogen(California,USA)。使用PCR从ONC-T18的基因组DNA扩增Δ5延长酶基因启动子，使其沉淀，使用限制性内切酶XhoI和NcoI消化，进行琼脂糖-凝胶纯化并且将其克隆到载体pSV40/Zeo2(Invitrogen公司,California)的相应限制性位点中。使用引物#14(SEQ ID NO:22)和引物#15(SEQ ID NO:23)对阳性克隆JZ1-57-7的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆JZ1-57-7的核苷酸序列的插入物的长度是950个碱基对(SEQ ID NO:19)，并且已经被鉴定为ONC-T18的Δ5延长酶基因启动子(SEQ ID NO:19)。

这个长度是950个核苷酸的启动子序列(SEQ ID NO:19)含有处于位置113上的-10盒(TGCCAGACT)、处于位置91上的-35盒(TTTTCT)、处于位置128上的预测性转录起始位点以及处于位置87、92、93以及131上的预测性转录因子结合位点CTCCTTTT、TTTCTTTT、TTCTTTTT以及TTGCTCCT，以及处于位置444上的-10盒(AGTTCTGAT)、处于位置419上的-35盒(TTTCCG)以及处于位置459上的预测性转录起始位点。

使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人,1990)在包括专利序列的数据库在内的不同基因库数据库中对与Δ5延长酶基因启动子序列(SEQ ID NO:19)同源的序列进行搜索。没有发现与Δ5延长酶基因启动子序列(SEQ ID NO:19)同源的序列。

6.分离和鉴定Δ4去饱和酶基因(PCT/1B2007/004553)启动子序列(SEQ ID NO:24)。使用为了便于进行下游分子克隆而在5'端上添加有限制性内切酶位点XhoI的寡核苷酸引物#1(SEQ ID NO:25)以及在5'端上添加有限制性内切酶位点NcoI的引物#2(SEQ IDNO:26)来分离Δ4去饱和酶基因启动子序列(SEQ ID NO:24)。使用PCR来扩增Δ4去饱和酶基因启动子的DNA片段，使其沉淀，使用限制性内切酶XhoI和NcoI消化，进行琼脂糖-凝胶纯化并且将其克隆到使用相同限制性内切酶消化并且经过凝胶纯化的载体pSV40/Zeo2(Invitrogen公司,California)的相应限制性位点中。使用引物#14(SEQ ID NO:22)和引物#15(SEQ ID NO:23)对阳性克隆JZ1-57-1的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆JZ1-57-1的核苷酸序列的插入物的长度是1216个碱基对(SEQ ID NO:24)，并且已经被鉴定为ONC-T18的Δ4去饱和酶基因启动子(SEQ ID NO:24)。

这个长度是1216个核苷酸的启动子序列(SEQ ID NO:24)含有处于位置58上的-10盒(GCGTATTAT)、处于位置34上的-35盒(CTACAG)、处于位置73上的预测性转录起始位点以及处于位置63和69上的预测性转录因子结合位点TTATATTT和TTTTCGCA，以及处于位置1038上的-10盒(CGTCATCCT)、处于位置1014上的-35盒(TGGACG)以及处于位置1053上的预测性转录起始位点。

使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人,1990)在包括专利序列的数据库在内的不同基因库数据库中对与Δ4去饱和酶基因启动子序列(SEQ ID NO:24)同源的序列进行搜索。没有发现与Δ4去饱和酶基因启动子(SEQ ID NO:15)同源的序列。

实施例2：核酸构建体

这个实施例描述了破囊壶菌属特异性基因表达载体的建构。

1.产生重组质粒载体pD4DPZ1(SEQ ID NO:30；图2)和pE5PZ1(SEQ ID NO:31；图3)。利用PCR，使用ONC-T18的基因组DNA 作为模板并且使用TaKaRa LA Taq^TMDNA聚合酶(TAKARA BIO公司,Shiga,Japan)来扩增ONC-T18的Δ4去饱和酶和Δ5延长酶基因的启动子DNA片段。利用在5'端上带有限制性内切酶位点XhoI的引物#1(SEQ ID NO:25)和在5'端上包含限制性内切酶位点NcoI的引物#2(SEQ ID NO:26)来对Δ4去饱和酶基因启动子(SEQID NO:24)进行扩增。使用在5'端上带有限制性内切酶位点XbaI的引物#3(SEQ ID NO:20)和在5'端上含有限制性内切酶位点NcoI的引物#4(SEQ ID NO:21)来对Δ5延长酶启动子(SEQ ID NO:19)进行扩增。在含有以下各项的50μL体积的反应混合物中进行PCR反应：2.5单位TaKaRa LA Taq^TMDNA聚合酶(TAKARA BIO公司,Shiga,Japan)、1X LA PCR缓冲液II、dNTP混合物(各自0.40mM)、225ηg基因组DNA模板、0.20μM引物[引物对，用于扩增Δ4去饱和酶基因启动子的#1(SEQ ID NO:25)和#2(SEQ ID NO:26)，以及用于扩增Δ5延长酶启动子的#3(SEQ ID NO:20)和#4(SEQ ID NO:21)]，所述PCR反应在以下条件下进行：94℃，持续30秒，历经一个循环；98℃，持续10秒，以及55℃，持续5秒，72℃，持续2分钟，历经30个循环。

遵循以下这些程序使PCR产物沉淀：添加不含核酸酶的ddH₂O到总体积200μL，接着添加20μL 3M NaAc(pH 5.2)和440μL 100％乙醇，并且通过短暂涡旋加以混合，在冰中孵育1小时，使用台式离心机以全速离心10分钟，弃去上清液，添加500μL 75％乙醇并且以全速离心2分钟，弃去上清液并且将DNA沉淀真空干燥约10分钟。在37℃下，在含有1X NE缓冲液2和1X BSA(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)的25μL体积的反应混合物中，用限制性内切酶NcoI(10单位)和XhoI(10单位)将Δ4去饱和酶基因启动子的PCR产物消化2小时。在相同条件下使用限制性内切酶NcoI(10单位)和XbaI(10单位)对Δ5延长酶基因启动子的PCR产物进行消化。在用于电泳的0.8％琼脂糖凝胶中，在88伏下拆分经过消化的PCR产物，持续45分钟。用刀片从琼脂糖凝胶上切出PCR产物的DNA条带，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对DNA进行提取和纯化。将所得的具有酶特异性粘性末端的Δ4去饱和酶基因启动子DNA片段连接到经过相同的限制性内切酶消化并且经过琼脂糖-凝胶纯化的载体pSV40/Zeo2的相应限制性位点NcoI和XhoI中，以便产生载体pD4DPZ1(SEQ ID NO:30；图2)。将所得的具有酶特异性粘性末端的Δ5延长酶基因启动子DNA片段连接到经过NcoI和NheI限制性内切酶消化并且经过琼脂糖-凝胶纯化的载体pSV40/Zeo2(Invitrogen公司,California)的限制性位点中，以便产生载体pE5PZ1(SEQ ID NO:31；图3)。在环境温度下，在含有1X连接缓冲液、插入物和载体DNA(3:1摩尔比)以及0.5单位T4DNA连接酶(Invitrogen,California)的10μL体积的反应混合物中将连接反应进行12小时。然后，将连接的DNA转化到大肠杆菌Top10感受态细胞(Invitrogen公司,California)中。使用Zyppy^TM质粒微量制备试剂盒(Zymo Research公司,Orange,California)从3mL细菌培养物中分离转化体的三个群落的质粒DNA。预先地通过使用酶XhoI和NotI针对Δ5延长酶基因启动子构建体进行限制性内切酶消化，并且使用酶NcoI和XhoI针对Δ4去饱和酶基因启动子构建体进行限制性内切酶消化来测试克隆的完整性。使用引物#14(SEQ ID NO:22))和引物#15(SEQ ID NO:23)对Δ4去饱和酶基因启动子载体的经过预先鉴定的阳性克隆JZ1-57-1以及Δ5延长酶基因启动子载体的经过预先鉴定的阳性克隆JZ1-57-7的插入物进行完全测序。所得的载体pD4DPZ1(SEQ ID NO:30；图2)含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因，所述ble基因由ONC-T18的Δ4去饱和酶基因启动子和SV40终止子侧接。所得的载体pE5PZ1(SEQ ID NO:31；图3)也含有ble基因，所述ble基因由ONC-T18的Δ5延长酶基因启动子和SV40终止子侧接。

本发明因此尤其提供了载体，所述载体包含与异源性基因可操作地连接的破囊壶菌启动子。在一些实施方案中，这类载体包括例如终止子、一个或多个复制起点以及一个或多个检测标记或选择标记。

2.产生绿色荧光蛋白(GFP)标记基因表达载体(SEQ ID NO:32；图4)。为了制备GFP基因的模板质粒DNA，从Arabidopsis Deposit Center(Ohio,USA)购得含有质粒pCD3-327[基因库登录号U70496；(Davis和Vierstra,1998)]的大肠杆菌细菌储备液。将细菌划线接种在含有100μg/mL氨比西林(ampicillin)的LB琼脂板中。将单个群落接种在含有100μg/mL氨比西林的3mL LB培养基中，并且使其生长过夜。使用Ultraclean微生物微量制备DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories Inc,Solana Beach,California)，按照制造商的方案分离所培养的细菌中的质粒DNA。

通过PCR，使用TaKaRa PrimeStar Taq^TMDNA聚合酶(TAKARA BIO公司,Shiga,Japan)、模板质粒pCD3-327DNA以及引物对#5(SEQ ID NO:33)(在5'端上带有限制性内切酶位点XhoI)和#6(SEQ ID NO:34)来扩增GFP基因DNA片段。然后，用乙醇使PCR产物沉淀并且用限制性内切酶XhoI进行消化，并且进行凝胶纯化。将经过凝胶纯化的DNA连接到经过XhoI和BsaAI酶消化并且经过凝胶纯化的载体pE5PZ1质粒DNA(SEQ ID NO:31；图3)的骨架的限制性内切酶位点XhoI和BsaAI中，以便将ble基因置换为绿色荧光蛋白(GFP)标记基因，并且产生表达载体pE5PRsGFP1(SEQ ID NO:32；图4)，在所述表达载体pE5PRsGFP1中，GFP基因由ONC-T18的Δ5延长酶基因启动子和SV40终止子侧接。

本发明因此尤其提供了载体，所述载体包含与异源性基因可操作地连接的破囊壶菌启动子。在一些实施方案中，这类载体包括例如终止子、一个或多个复制起点以及一个或多个检测标记或选择标记。根据本文所提供的对于多种这类载体以及关于某些元件(如启动子和/或终止子)的序列信息(所述序列信息足以允许使得具有这类序列的元件(例如启动子、终止子)与其他元件连接)的描述，阅读本公开内容的本领域技术人员将完全能够经常根据已知技术例如通过将所提供的序列与任何多种已知的其他元件组合来制备并且使用广泛多种不同的单独的载体构建体。

3.产生重组质粒载体p341PZ40T(SEQ ID NO:35；图5)。为了建构含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因的载体p341PZ40T(SEQ ID NO:35；图5)，所述ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和SV40终止子侧接，通过PCR，使用引物对#66(SEQ ID NO:36)和#67(SEQ ID NO:37)以及实施例1中所述的克隆JZ2-17-14的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因启动子#341的DNA片段。引物#66(SEQ ID NO:36)的5'端序列与衍生自载体pT7Blue-3(Novagen,Gibbstown,NJ,USA)的中间载体的小区域互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341的5'端的负链互补。引物#67(SEQ ID NO:37)的5'端序列与ble基因的开放阅读框的5'端序列的正链互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341的3'端的正链互补。

还通过PCR，使用引物对#68(SEQ ID NO:38)和#71(SEQ ID NO:39)以及载体pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的质粒模板DNA来扩增ble基因ORF的DNA片段(包括位于它的3'端上的SV40终止子在内)。引物#68(SEQ ID NO:38)的5'端序列与ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341的3'端序列的负链互补，并且它的3'端序列与ble基因ORF的5'端的负链互补。引物#71(SEQ ID NO:39)的5'端序列与衍生自载体pT7Blue-3的中间载体的小区域互补，并且它的3'端序列与SV40终止子的3'端序列的正链互补。

在含有以下各项的50μL体积的反应混合物中进行PCR反应：2.5单位TaKaRaPrimeStar Taq^TMDNA聚合酶(Takara Bio公司,Shiga,Japan)、1X PrimerStar PCR缓冲液、dNTP混合物(各自0.40mM)、1ηg模板质粒DNA、0.20μM引物对中的每一种引物。使用以下PCR条件：98℃，持续10秒，以及55℃，持续5秒，以及72℃，持续2分钟，历经30个循环。在用于电泳的0.8％琼脂糖凝胶中，在65伏下拆分微管蛋白基因启动子#341和ble基因ORF的PCR产物，持续60分钟。用刀片剪出具有准确大小的条带，并且用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对它们的DNA进行提取和纯化。然后，以相似的摩尔比混合经过凝胶纯化的PCR产物，将其用作DNA模板用于延伸PCR以将微管蛋白基因启动子#341、包括SV40终止子在内的ble基因ORF融合于一起(Higuchi,Krummel以及Saiki,1988；Zhang,Wege以及Jeske,2001)。在50μL体积的反应混合物中，使用TaKaRaPrimeStar Taq^TMDNA聚合酶(Takara Bio公司,Shiga,Japan)、约100ng混合PCR产物的模板DNA，以及引物对#66(SEQ ID NO:36)和#71(SEQ ID NO:39)(各自0.20μM)进行延伸PCR。使用以下PCR条件：98℃，持续10秒，50℃，持续5分钟，以及72℃，持续3分钟，历经6个循环；以及98℃，持续10秒，50℃，持续5秒，以及72℃，持续3分半钟，历经25个循环。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对含有ONC-T18特异性ble基因表达盒的PCR产物进行凝胶纯化，并且使用延伸PCR将其克隆到衍生自载体pT7Blue-3(Novagen,Gibbstown,NJ,USA)的中间载体中(Higuchi,Krummel以及Saiki,1988；Zhang,Wege以及Jeske,2001)。在含有以下各项的50μL体积的PCR反应混合物中进行延伸PCR：2.5单位TaKaRa PrimeStar Taq^TMDNA聚合酶(Takara Bio公司,Shiga,Japan)、1XPrimerStar PCR缓冲液、dNTP混合物(各自0.40mM)、200ng经过凝胶纯化的含有ONC-T18特异性ble基因表达盒的PCR产物的DNA，以及600ng由限制性内切酶HindIII线性化的中间载体的质粒DNA。使用以下PCR条件：98℃，持续10秒，60℃，持续5秒，以及72℃，持续5分半钟，历经30个循环。之后，通过用DpnI进行限制性内切酶消化来破坏模板质粒DNA，所述DpnI特异性地消化从一些细菌菌株中分离的甲基化质粒DNA。在37℃下，在含有以下各项的150μL的反应体积中进行这种消化：50μL延伸PCR产物、30单位DpnI以及1X限制性内切酶反应缓冲液4(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)，持续2小时。在消化后，通过在80℃下孵育20分钟来使DpnI酶失活。然后，在消化混合物中添加无菌水达到350μL并且进一步脱盐，并且使用Microcon柱(YM-100,Millipore公司,Billerica,MA)将DNA浓缩到约100ng/μL。使用1μL 经过脱盐的DNA来使用设置在1890伏的电穿孔仪(Eppendorf 5210)以及1mm间隙的电穿孔小槽(Eppendorf,NY,USA)对Top10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen,California,USA)进行转化。预先地通过实施例1中所述的直接群落PCR，使用引物对#64(SEQ ID NO:40)和#65(SEQ ID NO:41)对阳性群落进行筛选。使用正向引物和反向引物以及内部引物#15(SEQID NO:23)、#16(SEQ ID NO:42)、#54(SEQ ID NO:7)、#64(SEQ ID NO:40)、#65(SEQ ID NO:41)以及#85(SEQ ID NO:43)对阳性克隆JZ2-53-10的插入物进行完全测序。使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)对所得序列进行组装和分析并且确定所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表达载体被命名为p341PZST(SEQ ID NO:35；图5)，在所述载体中，ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和SV40终止子侧接。

4.产生重组质粒载体p341PZ347T(SEQ ID NO:44；图6)。为了建构含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因的载体p341PZ347T(SEQ ID NO:44；图6)，所述ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和微管蛋白基因终止子#347侧接，通过PCR，使用引物对#66(SEQID NO:36)和#67(SEQ ID NO:37)以及实施例1中所述的克隆JZ2-17-14的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因启动子#341的DNA片段。

还通过PCR，使用引物对#68(SEQ ID NO:38)和#72(SEQ ID NO:45)以及载体pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的质粒模板DNA来扩增ble基因ORF的DNA片段。引物#72(SEQ ID NO:45)的5'端序列与微管蛋白基因终止子#347的5'端序列的正链互补。

通过PCR，使用引物对#73(SEQ ID NO:46)和#74(SEQ ID NO:47)以及实施例1中所述的克隆JZ2-17-22的模板质粒DNA扩增微管蛋白基因终止子#347的DNA片段。引物#73(SEQID NO:46)的5'端序列与ble基因的开放阅读框的3'端序列的负链互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因终止子#347的5'端的负链互补。引物#74(SEQ ID NO:47)的5'端序列与衍生自载体pT7Blue-3的中间载体的小区域互补，并且它的3'端与破囊壶菌属种微管蛋白基因终止子#347的3'端的正链互补。

完全如实施例2第3部分中所述来进行PCR。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对PCR产物进行凝胶纯化。以相似的摩尔比混合微管蛋白基因启动子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因终止子#347的经过凝胶纯化的PCR产物，将其用作DNA模板用于延伸PCR以便将微管蛋白基因启动子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因终止子#347融合于一起。使用引物对#66(SEQ ID NO:36)和#74(SEQID NO:47)(各自0.20μM)，如实施例2第3部分中所述进行延伸PCR。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对融合PCR产物进行凝胶纯化，并且使用延伸PCR，如实施例2第3部分中所述将其克隆到衍生自载体pT7blue-3的中间载体中。通过电穿孔将延伸PCR产物转化到Top10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen,California,USA)中。最初通过群落PCR方法，使用引物对#64(SEQ ID NO:40)和#65(SEQ IDNO:41)、引物对#16(SEQ ID NO:42)和#59(SEQ ID NO:12)以及引物对#54(SEQ ID NO:7)和#15(SEQ ID NO:23)对阳性群落进行筛选。使用正向引物和反向引物以及内部引物#15(SEQ ID NO:23)、#16(SEQ ID NO:42)、#54 (SEQ ID NO:7)、#59(SEQ ID NO:12)、#63(SEQID NO:4)、#64(SEQ ID NO:40)、#65(SEQ ID NO:41)以及#85(SEQ ID NO:43)对阳性克隆JZ2-69-2a的插入物进行完全测序。使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)对所得序列进行组装和分析并且确定所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表达载体被命名为p341PZ347T(SEQ ID NO:44；图6)，在所述载体中，ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和终止子#347侧接。

本发明因此尤其提供了载体，所述载体包含与异源性基因可操作地连接的破囊壶菌启动子和终止子(例如，这样使得启动子位于所述基因的上游而终止子位于下游)。在一些实施方案中，这类载体包括例如一个或多个复制起点和一个或多个检测标记或选择标记。本发明因此尤其提供了载体，所述载体包含与异源性基因可操作地连接的破囊壶菌启动子。在一些实施方案中，这类载体包括例如终止子、一个或多个复制起点以及一个或多个检测标记或选择标记。

5.产生重组质粒载体p341P713T(SEQ ID NO:48；图7)。为了建构含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因的载体p341PZ713T(SEQ ID NO:48；图7)，所述ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和微管蛋白基因终止子#713侧接，通过PCR，使用引物对#66(SEQID NO:36)和#67(SEQ ID NO:37)以及实施例1中所述的克隆JZ2-17-14的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因启动子#341的DNA片段。

通过PCR，使用引物对#68(SEQ ID NO:38)和#75(SEQ ID NO:49)以及载体pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的质粒模板DNA来扩增ble基因ORF的DNA片段。引物#75(SEQID NO:49)的5'端序列与微管蛋白基因终止子#713的5'端序列的正链互补。

通过PCR，使用引物对#76(SEQ ID NO:50)和#77(SEQ ID NO:51)以及实施例1中所述的克隆JZ2-22-9的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因终止子#713的DNA片段。引物#76(SEQ ID NO:50)的5'端序列与ble基因ORF的3'端序列的负链互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因终止子#713的5'端的负链互补。引物#77(SEQ ID NO:51)的5'端序列与衍生自载体pT7blue-3的中间载体的小区域互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因终止子#713的3'端的正链互补。

对微管蛋白基因启动子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因终止子#713的PCR产物进行凝胶纯化，将其以相似的摩尔比混合，并且用作DNA模板以使用引物对#66(SEQ IDNO:36)和#77(SEQ ID NO:51)进行延伸PCR以便将微管蛋白基因启动子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因终止子#713融合于一起。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)对融合的PCR产物进行凝胶纯化，并且使用第二轮延伸PCR将其克隆到衍生自载体pT7blue-3的由HindIII线性化的中间载体中。使用1微升(约100ηg)延伸PCR产物DNA以通过电穿孔对Top10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen,California,USA)进行转化。最初通过群落PCR，使用引物对#64(SEQ ID NO:40)和#65(SEQ ID NO.41)、引物对#16(SEQ ID NO:42)和#77(SEQ ID NO:51)以及引物对#54(SEQ ID NO:7)和#15(SEQ ID NO:23)对阳性群落进行筛选。使用正向引物和反向引物以及内部引物#15(SEQ ID NO:23)、#16(SEQ ID NO:42)、#54(SEQ ID NO:7)、#63(SEQ ID NO:4)、#64(SEQ ID NO:40)、#65(SEQ IDNO:41)以及#85(SEQ ID NO:43)对阳性克隆JZ2-69-2b的插入物进行完全测序。使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)对所得序列进行组装和分析并且确定所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表达载体被命名为p341PZ713T(SEQ ID NO:48；图7)，在所述载体中，ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和终止子#713侧接。

本发明因此尤其提供了载体，所述载体包含与异源性基因可操作地连接的破囊壶菌启动子和终止子(例如，这样使得启动子位于所述基因的上游而终止子位于下游)。在一些实施方案中，这类载体包括例如一个或多个复制起点和一个或多个检测标记或选择标记。本发明因此尤其提供了载体，所述载体包含与异源性基因可操作地连接的破囊壶菌启动子。在一些实施方案中，这类载体包括例如终止子、一个或多个复制起点以及一个或多个检测标记或选择标记。根据本文所提供的对于多种这类载体以及关于某些元件(如启动子和/或终止子)的序列信息(所述序列信息足以允许使得具有这类序列的元件(例如启动子、终止子)与其他元件连接)的描述，阅读本公开内容的本领域技术人员将完全能够经常根据已知技术例如通过将所提供的序列与任何多种已知的其他元件组合来制备并且使用广泛多种不同的单独的载体构建体。

6.产生重组质粒载体p701PZ40T(SEQ ID NO:52；图8)。为了建构含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因的载体p701PZ40T(SEQ ID NO:52；图8)，所述ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#701和SV40终止子侧接，通过PCR，使用引物对#87(SEQ ID NO:53)和#88(SEQ ID NO:54)以及实施例1中所述的克隆JZ2-17-10的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因启动子#701的DNA片段。引物#87(SEQ ID NO:48)的5'端序列与载体p341PZ40T的小区域互补，并且它的3'端与微管蛋白基因启动子#701的5'端序列的负链互补。引物#88(SEQ IDNO:54)的5'端序列与ble基因ORF的5'端序列的正链互补，并且它的3'端与微管蛋白基因终止子#701的3'端的正链相匹配。对PCR产物进行凝胶纯化并且使用延伸PCR将其克隆到p341PZ40T载体中以便置换微管蛋白基因启动子#341(Higuchi等人,1988；Zhang等人,2001)。在延伸PCR中使用TaKaRa PrimeStar Taq^TM DNA聚合酶、200ηg经过凝胶纯化的PCR产物的DNA以及600ng载体p341PZ40T的由BglII线性化的质粒DNA。使用1微升(约100ηg)延伸PCR产物DNA以通过电穿孔对Top10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen,California,USA)进行转化。最初通过群落PCR方法，使用引物对#52(SEQ ID NO:51)和#53(SEQ ID NO:52)对阳性群落进行筛选。使用正向引物和反向引物以及内部引物#52(SEQ ID NO:1)和#53(SEQID NO:2)、#15(SEQ ID NO:23)、#16(SEQ ID NO:42)、#63(SEQ ID NO:4)、#64(SEQ ID NO:40)、#65(SEQ ID NO:41)以及#85(SEQ ID NO:43)对阳性克隆的插入物进行完全测序。使用生物信息学软件包Kodon(Applied Maths)对所得序列进行组装和分析并且确定所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表达载体被命名为p701PZ40T(SEQ ID NO:52；图7)，在所述载体中，ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#701和SV40终止子侧接。

7.产生重组质粒载体p341PRsGP40T(SEQ ID NO:55；图9)。为了建构含有来自维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的GFP基因的载体p341PRsGFP40T(SEQ ID NO:55；图9)，所述GFP基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和SV40终止子侧接，通过PCR，使用引物对#66(SEQ ID NO:36)和#78(SEQ ID NO:56)以及实施例1中所述的克隆JZ2-17-14的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因启动子#341的DNA片段。引物#78(SEQ ID NO:56)的5'端序列与GFP基因ORF的5'端序列的正链互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341的3'端的正链相匹配。

还通过PCR，使用引物对#79(SEQ ID NO:57)和#80(SEQ ID NO:58)以及载体pCD3-327的模板质粒DNA来扩增GFP基因ORF的DNA片段。引物#79(SEQ ID NO:57)的5'端序列与ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341的3'端序列的正链互补，并且它的3'端序列与GFP基因ORF的5'端的负链相匹配。引物#80(SEQ ID NO:58)的5'端序列与SV40终止子的5'端序列的正链互补，并且它的3'端与GFP基因ORF的3'端序列的正链相匹配。

还通过PCR，使用引物对#81(SEQ ID NO:59)和#71(SEQ ID NO:39)以及载体pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的模板质粒DNA来扩增SV40终止子的DNA片段。引物#81(SEQ ID NO:59)的5'端序列与GFP基因ORF的3'端序列的负链互补，并且它的3'端序列与SV40终止子的5'端相匹配。

对以上三种PCR产物进行凝胶纯化，将其以相似的摩尔比混合，并且用作DNA模板以使用引物对#66(SEQ ID NO:36)和#71(SEQ ID NO:39)进行延伸PCR以便将微管蛋白基因启动子#341、GFP基因ORF以及SV40终止子融合于一起(Higuchi,Krummel以及Saiki,1988)。对含有ONC-T18特异性GFP基因表达盒的延伸PCR产物进行凝胶纯化，并且在第二轮延伸PCR中将其克隆到由限制性内切酶HindIII线性化的载体p341PZ40T中。净化第二轮PCR产物，脱盐，并且通过电穿孔将其转化到Top10大肠杆菌感受态细胞中。使用直接群落PCR以及引物对#54(SEQ ID NO:7)和#86(SEQ ID NO:60)对阳性群落进行筛选。使用正向引物和反向引物以及内部引物#15(SEQ ID NO:23)、#16(SEQ ID NO:42)、#54(SEQ ID NO:7)、#63(SEQ IDNO:4)、#64(SEQ ID NO:40)、#65(SEQ ID NO:41)、#85(SEQ ID NO:43)以及#86(SEQ ID NO:60)对阳性克隆JZ2-53-20的插入物进行完全测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)对所得序列进行组装和分析并且确定所克隆的插入物的完整性。所得GFP基因表达载体被命名为p341PRsGFP40T(SEQ ID NO:55；图8)，在所述载体中，GFP基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和SV40终止子侧接。

8.产生重组质粒载体pD4DPZ118S(SEQ ID NO:61；图10)。为了建构pD4DPZ18S(SEQID NO:61；图10)载体，使用限制性内切酶SalI和SphI对载体pD4DPZ1的质粒DNA进行消化以便将所述载体线性化，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)按照制造商的方案进行凝胶纯化。通过使用酶XhoI和SphI进行限制性酶切消化以从克隆JZ2-3-1的质粒DNA释放通过PCR使用引物对18SrRNAf(SEQ ID NO:27)和18SrRNAr(SEQ IDNO:28)从ONC-T18的基因组DNA加以扩增并且被克隆到载体pT7Blue-3中的18S rDNA片段(SEQ ID NO:29)，然后进行凝胶纯化并且将其连接到pD4DPZ1的线性化载体的限制性位点SalI和SphI中，以便产生带有18S核糖体RNA基因的DNA片段的pD4DPZ18S(SEQ ID NO:61；图10)。

9.产生重组质粒载体p341PZ5pEx(SEQ ID NO:62；图11)。为了建构构建体p341PZ5pEx以在破囊壶菌属原生生物微生物中过表达同源基因和异源基因、抑制同源基因的表达或敲除同源基因，通过PCR，使用引物LinkerF(SEQ ID NO:63)和LinkerR(SEQ IDNO:64)对zeocin抗性基因表达载体pd5EPPZ1进行修饰以便将zeocin抗性基因ORF置换为多克隆位点，包括核酸内切酶限制性位点(NcoI、SpeI、KpnI、MluI、NdeI、SphI、NruI、BstBI以及BamHI)。在PCR之后，使用核酸内切酶限制性内切酶DpnI破坏模板质粒DNA。使PCR产物沉淀并且使用核酸内切酶限制性内切酶MluI消化，进行凝胶纯化，使用T4DNA连接酶(Invitrogen,California)重新连接到一起，然后将其转化到Top10大肠杆菌细胞中。使用限制性酶切消化对阳性克隆进行初步筛选。通过DNA测序确定阳性克隆的完整性并且将其命名为质粒p5eEP40T(SEQ ID NO:65)。使用核酸内切酶限制性内切酶HindIII和EcoRI对阳性克隆的质粒DNA进行消化，并且对骨架质粒DNA进行凝胶纯化。还从经过相同的核酸内切酶限制性内切酶HindIII和EcoRI消化的载体p18S341PZ40t中分离zeocin抗性基因表达盒并且进行凝胶纯化，在所述zeocin抗性基因表达盒中，zeocin基因ORF由微管蛋白基因启动子#341P和SV40终止子侧接。然后将zeocin抗性基因表达盒连接到质粒p5eEP40T的相应核酸内切酶限制性位点HindIII和EcoRI中，从而产生基因表达载体p341PZ5pEx。

实施例3：鉴定可以被用于对破囊壶菌属种ONC-T18进行遗传操作的抗生素

本实施例描述了鉴定如下抗生素的实验，针对所述抗生素的抗性可以被用作选择标记以对ONC-T18进行遗传操作。

使破囊壶菌属种ONC-T18在琼脂板上生长(每升ONC-T18-GM0 20g琼脂)。将一菌环量的ONC-T18接种物接种到50mL液体ONC-T18-GM0中，并且将培养物在振荡孵育箱中在25℃下在250rpm下孵育36小时。将0.5毫升的培养物转移到1.5mL试管中并且以全速涡旋30秒以便拆散细胞团，然后在50mL无菌水中稀释。将一百微升所得溶液铺到每个ONC-T18-GM0培养基培养板上。每个培养板含有不同浓度中的一种浓度的不同抗生素中的一种。在25℃下孵育培养板并且每天观测群落的出现和生长。如可以在表1中看到，ONC-T18的生长对所测试的大部分抗生素不敏感。然而，zeocin显著地抑制ONC-T18在ONC-T18-GM0琼脂板中的生长。

因此，本实施例将zeocin鉴定为可以被用于在遗传操作实验中进行选择的抗生素。

表1：不同的抗生素对破囊壶菌属种ONC-T18生长的影响

实施例4：优化ONC-T18-GM0培养基中的盐度以有效地选择破囊壶菌属种ONC-T18 转化体

如本领域中所知，zeocin在高盐浓度下不稳定(Invitrogen,CA,USA)。还已经展示，ONC-T18因它的天然存在环境而更喜欢生长在相对高的盐度条件下(PCT/IB2006/003977)。本实施例描述了对使用 zeocin抗性基因作为选择标记来有效地选择ONC-T18转化体的最佳zeocin浓度和盐度的确定。

将由2天培养物1:500稀释的100μL ONC-T18细胞悬浮液铺到含有不同浓度的抗生素zeocin和海盐的ONC-T18-GM0培养板上。在25℃孵育箱中将经过接种的培养板孵育10天。对每个培养板上群落的数目进行计数。两个一式两份培养板中群落数目的平均值呈现于表2中。在接种后第10天，在含有5g/L海盐和不同浓度的zeocin的ONC-T18-GM0琼脂板上没有观测到群落。在含有8.5g/L海盐而不含zeocin的培养板中，仅观测到一个群落。在含有18g/L海盐而不含zeocin的培养板中，群落数目类似于含有35g/L海盐而不含zeocin的培养板。然而，30μg/mL浓度的zeocin完全抑制含有18g/L海盐的ONC-T18-GM0琼脂板中ONC-T18的生长，而需要100μg/mLzeocin来完全抑制含有35g/L海盐的ONC-T18-GM0琼脂板中的ONC-T18。测量两个一式两份培养板中单个群落的直径并且它们的平均值展示于表3中。18g/L与35g/L之间的盐度并不显著地影响群落的大小(图12)。本实施例因此尤其表明了在浓度高于约8.5g/L的海盐存在下观测到更好的生长。根据本发明，8.5g/L至多于35g/L(例如至约36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L、50g/L或更多，甚至可能多达55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L或更多)范围内的浓度可能适于生长。当然，对于使用zeocin对转化体进行选择，希望在维持对zeocin的敏感性的情况下实现稳固生长。因此，对于这一操作，使用18g/L海盐来制备ONC-T18-GM0以对经过带有zeocin抗性基因表达盒的构建体转化的ONC-T18转化体进行选择。

表2：zeocin和盐度对破囊壶菌属种ONC-T18的群落数目的影响

表3：zeocin和盐度对破囊壶菌属种ONC-T18的群落生长速率(直径，以mm为单位)的影响

在不同的压力条件下测试转化效率。在本实施例中，已发现，约1100psi的压力条件与所测试的其他压力条件相比能够产生更好的转化效率。

实施例5：对破囊壶菌属种ONC-T18进行转化

这个实施例描述了对ONC-T18使用的生物弹射式转化法。

材料与方法。

产生感受态细胞。将ONC-T18在ONC-T18-GM0琼脂板上维持于25℃孵育箱中，并且每3至4周转移至新鲜培养板中。将获取自生长旺盛的细胞的一菌环量的ONC-T18接种物在50mLONC-T18-GM0中接种到250mL锥形烧瓶中，然后在振荡孵育箱中在25℃下在150rpm下培养约46小时。在层流净化罩中，在无菌条件下，将0.5毫升的培养物转移到已灭菌的1.5mL离心管中，然后在台式离心机中以3,000rpm离心1分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于0.5mL无菌水中，并且将100μL细胞悬浮液铺到ONC-T18-GM0琼脂板的中心区域(约28cm²)上。将皮氏培养皿在层流净化罩中在无菌条件下保持打开状态10分钟至15分钟以使细胞沉降并且使液体水蒸发。

生物弹射式转化。使用ZYPPY^TM质粒大量提取试剂盒(Plasmid Maxiprep Kit)(Zymo Research公司,Orange,California)按制造商的方案从含有对应质粒的菌株的细菌培养物中分离质粒pd5EPZ1、p341PZ40T、p341PZ347T、p341PZ713T以及pD4DPZ18S(如实施例2中所述进行建构；还参见图3、5、6、7以及10)。如实施例2中所论述，这些质粒中的每一个都含有ble转基因，所述ble转基因赋予了针对zeocin、腐草霉素以及博莱霉素的抗性。(参见例如Gatignol等人(1988)和Dumas等人(1994)，其各自的全部内容以引用的方式并入本文。)在本实施例中，使用Sh ble(印度斯坦链异壁菌)转基因。其他ble转基因也是适合的，如Tn5ble和Sa ble(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))转基因。

对于每个质粒，通过涡旋3分钟将5μL(约1μg/μL)质粒DNA与25μL金粒子悬浮液(60mg/mL，在50％甘油中)混合并且在冰上孵育10分钟。将10μL 0.1M亚精胺和25μL 2.5MCaCl₂添加到混合物中并且立即涡旋4分钟，然后在台式离心机中以全速离心10秒。弃去上清液。用70％乙醇将涂有质粒DNA的金粒子洗涤两次并且重悬于36μL 98％乙醇中。将6μL金粒子悬浮液铺于每个巨载体膜片上并且将膜片空气干燥(Zhang等人,2001)。

在灭菌条件下在层流净化罩中根据制造商的方案将PSD-1000/He粒子递送系统(Bio-Rad Laboratories公司,California)用于将带有zeocin抗性基因表达盒的质粒DNA递送到ONC-T18感受态细胞中。将粒子递送系统的部件，包括巨载体固定器、巨载体、终止屏在内进行高压消毒。通过用70％乙醇进行擦拭来对粒子递送系统的腔室进行消毒。在轰击之后，在25℃孵育箱中在暗处将含有经过转化的细胞的皮氏培养皿孵育6小时。然后使用1mL无菌水将经过转化的细胞从膜片上洗出，转移到1.5mL高压消毒的微量离心管中，并且以3,000rpm离心2分钟。弃去上清液并且将沉淀重悬于0.5mL高压消毒水中。将150μL的细胞悬浮液铺在含有约150-200μg/mLzeocin的琼脂ONC-T18-GM0培养板上。在已经使培养板中的液体蒸发之后，用 M密封培养板并且在25℃孵育箱中孵育6-10天。使用10μL吸移管尖头挑选zeocin抗性群落并且将其在200μL PCR管中悬浮于50μL无菌水中。将1μL细胞悬浮液点样到含有150-200μg/mLzeocin的ONC-T18-GM0琼脂板上。在25℃下孵育3到5天之后，将生长旺盛的群落选用于进行进一步分析。

在生物弹射式转化之后，使zeocin抗性群落在含有150-200μg/mLzeocin的ONC-T18-GM0琼脂板上生长4到6天。使用源自于从ONC-T18分离的不同启动子和终止子的组合的不同构建体产生zeocin抗性菌株。每次转化使用不同的构建体所产生的转化体的数目是可变的。(参见表4)

表4：每次转化产生的转化体的数目

构建体	转化体的数目/5μg质粒DNA
		pd5EPZ1	11
p341PZ40T	9
		p341PZ347T	4
p341PZ713T	7
		pD4DPZ18S	5

实施例6：对破囊壶菌属种ONC-T18的转化体进行PCR分析

这个实施例描述了对经过转化的ONC-T18中转基因的存在的确定。使用PCR测定来评估ble转基因的存在，所述ble转基因存在于用于对ONC-T18进行转化的质粒构建体中的每一个中。

在50mL烧瓶中将一菌环量的在zeocin-ONC-T18-GM0琼脂板上生长的每种可能经过转化的菌株的接种物接种于10mL液体ONC-T18-GM0培养基中，并且使其在振荡孵育箱中在25℃下并且在250rpm下生长2天。使用2mL培养物，使用Ultraclean微生物微量制备DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories公司,Solana Beach,California)，遵循制造商的方案来分离每种菌株的基因组DNA。使用分光光度计Spectro 2000RSP(Lebomed公司,CulverCity,CA,U.S.A)测量基因组DNA浓度。在200μL PCR管中，将0.5μL的基因组DNA用于含有以下组分的20μL PCR反应物：Taq DNA聚合酶(Sigma)、1X PRC缓冲液、2.5mM MgCl₂、dNTP混合物(各自0.20mM)、0.25μM引物#64(SEQ ID NO:66)，以及0.25μM引物#65(SEQ ID NO:67)。使用以下热循环程序进行PCR反应：94℃，持续3分钟，94℃，持续1分钟，55℃，持续2分钟，以及72℃，持续2分钟，历经30个循环。引物#64与用于对ONC-T18进行转化的每个质粒的ble基因的5'端退火，并且引物#65与3'端退火。从阳性转化体的基因组DNA以及从阳性对照的质粒DNA，而未从分离自野生型ONC-T18细胞的阴性对照的基因组DNA扩增到具有约350个碱基对的DNA片段。这些结果确定了大部分zeocin抗性菌株是真实的转化体(图13)。

实施例7：转化体的生长速率

这个实施例描述了对经过转化的单细胞衍生的菌株的生长速率的测定。使用10μL吸移管尖头从每个群落中挑选已经在zeocinONC-T18-GM0琼脂板上转移三次的zeocin抗性菌株的接种物，并且将其在200μL PCR管中重悬于50μL无菌水中。将1μL细胞悬浮液点样于含有18g/L或35g/L海盐的ONC-T18-GM0琼脂板(15g/L琼脂)上。在接种后第1天、第3天、第5天、第7天以及第8天测量点样的群落的直径。

在ONC-T18-GM0琼脂板上大部分所测试的菌株比野生型菌株ONC-T18生长得快，无论它们是生长在含有18g/L或是35g/L海盐的培养板上。在所测试的菌株中，大部分菌株在含有18g/L海盐的培养板上比在含有35g/L海盐的培养板上生长得快。在含有18g/L海盐的ONC-T18-GM0琼脂板上生长最快的一些菌株(如菌株5-3)在含有35g/L海盐的培养板上的生长慢于其他菌株。看来大部分经过转化的菌株更喜欢在含有更低盐度(例如18g/L海盐)的培养基上生长(图14)。

实施例8：经过转化的菌株的zeocin敏感性

这个实施例描述了对单细胞衍生的经过转化的菌株的zeocin敏感性的测定。

使用10μL吸移管尖头从群落中挑选已经在zeocin/ONC-T18-GM0琼脂板上经由群落传代转移三次的zeocin抗性菌株(以及它们的亲本菌株或野生型菌株)的极小量接种物并且将其在200μL PCR管中重悬于50μL无菌水中。将1μL细胞悬浮液点样于含有18g/L海盐(15g/L琼脂)以及浓度在0μg/mL到5000μg/mL范围内的zeocin(Invitrogen,CA,USA)的ONC-T18-GM0琼脂板上。在第1天、第3天、第5天、第7天以及第8天测量点样的群落的直径。

所有所测试的菌株在ONC-T18-GM0琼脂板上在不存在zeocin的情况下都良好地生长，但是它们的生长速率有所不同。亲本菌株(野生型菌株)ONC-T18仅在具有30μg/mL或更少zeocin的ONC-T18-GM0琼脂板上生长。对于所有五种不同的质粒构建体，所有经过转化的带有zeocin抗性基因(来自印度斯坦链异壁菌)表达盒的菌株在具有浓度在30μg/mL到1000μg/mL范围内的zeocin的ONC-T18-GM0琼脂板上都能够良好地生长(图15)。然而，在5000μg/mL浓度的zeocin下，大部分菌株的生长显著慢于它们在具有1000μg/mL或更少zeocin的培养基上的生长，并且一些菌株完全无法在5000μg/mLzeocin上生长(图15)。然而，若干菌株，尤其是那些经过带有由Δ5延长酶基因启动子驱动的zeocin抗性基因表达盒的质粒构建体转化的菌株非常良好地生长(图15)，表明了Δ5延长酶基因启动子是一种非常强的基因表达启动子。

这些结果与以下相符：DHA是破囊壶菌属微藻群组中的主要能量储存脂肪酸(Jain等人,2007)，以及Δ5延长酶延长步骤是DHA ω-3脂肪酸产生微生物中进行DHA生物合成期间的限速步骤(Leonard等人,2004)。经过相同质粒构建体转化的菌株间生长速率的可变性反映了ble转基因的拷贝数的可变性或ble转基因在宿主菌株ONC-T18的染色体中的插入位置的可变性。

这些结果指示从ONC-T18分离的不同的启动子和终止子序列可以有效地驱动PUFA产生微生物中的转基因表达。另外，这些结果指示来自印度斯坦链异壁菌的ble转基因是一种用于破囊壶菌属种菌株的工业菌株改良方案和遗传操作的非常有效的选择标记基因。

实施例9：破囊壶菌属种ONC-T18的经过转化的菌株与野生型菌株之间的生物质生产率的比较

本实施例描述了对转化体的生物质生产率与野生型菌株破囊壶菌属种的生物质生产率的比较，并且尤其表明了某些经过转化的菌株所产生的生物质水平有所升高(例如与野生型相比较升高至少5％、10％、15％、20％、25％或更多)。

将ONC-T18、10mL ONC-T18-GM0(18g/L海盐)培养物各自用经过转化的菌株或野生型菌株ONC-T18接种。由经过转化的菌株接种的培养物在培养基中含有200μg/mLzeocin。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长3天直到OD₆₀₀达到约1.979-2.369为止。然后，在250mL烧瓶中，用OD₆₀₀值为6的每种菌株的接种物对含有18g/L或35g/L海盐的50mL ONC-T18-GM0培养物进行接种，所述菌株包括野生型菌株(测量1mL培养物的OD₆₀₀，然后将培养物的体积按比例扩大以相应于6的OD₆₀₀值；例如，如果OD₆₀₀测量结果是2，那么使用(1mL×(6/2.0))＝3mL作为接种物)。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长2天。然后将5mL经过高压消毒的50％葡萄糖添加到每个培养烧瓶中。使培养物在设定在150rpm的振荡孵育箱中并且在20℃下再连续生长2天。然后将6mL经过高压消毒的50％葡萄糖添加到每个培养烧瓶中并且使培养物在设定在150rpm的振荡孵育箱中并且在20℃下再持续生长3天。通过将细胞培养物转移到50mL锥形离心管(falcon tube)中并且使用SORVALL LEGEND RT+离心机(Thermo Fisher Scientific公司,MA,USA)以4000rpm离心来收集两种类型的ONC-T18-GM0培养基(含有18g/L或含有35g/L海盐)中每种菌株的培养物的生物质。生物质以紧密层的形式浮在液体培养基的表面上。通过使用18G 1 1/2注射器针头在锥形离心管的底部穿出极小的洞来释放液体培养基。将管中的生物质的沉淀在-80℃冰箱中冷冻过夜，然后使用冷冻干燥器冷冻干燥三天。对每个样品的生物质进行称重。测试包括野生型在内的九种菌株。

在生长于含有35g/L人工海盐的ONC-T18-GM0中时，大部分转化体所产生的干燥细胞生物质的量与野生型菌株ONC-T18相似。当在相同条件下生长时，8种经过转化的菌株中有一种所产生的干燥细胞生物质比野生型菌株ONC-T18多约22％(图16)。在含有18g/L海盐的ONC-T18-GM0中，8种经过转化的菌株中有7种所产生的生物质的量与野生型菌株ONC-T18相似或更多。8种所测试的菌株中有一种所产生的生物质比野生型菌株ONC-T18多19.5％(图16)。

实施例10：破囊壶菌属种ONC-T18的经过转化的菌株与野生型菌株之间DHA生产率的比较

本实施例描述了不同的经过转化的菌株中DHA的生产率，并且表明了与野生型相比水平有所升高。本实施例尤其表明了，已经实现比野生型高至少1％-36％范围内(例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％等)的水平。基于这些研究结果，本领域技术人员将了解，可以实现进一步升高(例如，升高到比野生型高1％-1000％范围内的水平，例如，比野生型高约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％或更多的水平)。本实施例进一步表明了实现了约1:4到约1:2范围内的DHA:生物质比率，比在野生型菌株下典型地所观测到的DHA:生物质比率高至少约40％。(参见例如Raghukumar(2008)中的表2，其全部内容以引用的方式并入本文。)基于这些研究结果，本领域技术人员将了解可以至少实现约1:5的比率。我们已经实现约1:8到1:4的DHA:生物质比率(DHA:生物质)；并且预期实现约1:3的比率。文献(如由Raghukumar,2008发表的综述)中的实施例指示已实现不使这个比率降低到1:5以下。

在与实施例9中所述的条件相同的条件下使8种经过转化的菌株和它们的亲本菌株(野生型)的培养物生长，并且收集生物质并且将其冷冻干燥。经由直接酯基转移方法提取脂肪酸甲酯(FAME)。通过涡旋10秒将约20mg经过冷冻干燥的细胞生物质与3mL酯基转移反应缓冲液(甲醇:盐酸:氯仿)混合，然后在90℃水浴槽中孵育两小时。在完成酯基转移之后，移出样品并且冷却到环境温度。添加1mL水并且通过涡旋10秒加以混合。然后通过添加3X 2mL己烷:氯仿(v/v，4:1)溶剂并且涡旋10秒来提取FAME；然后将样品静置直到完成相分离为止。

使用两种内标(200μL)对FAME进行气相色谱(GC)分析。在酯基转移之前添加一种二十六烷酸(C23:0)并且在分析之前直接添加另一种十九烷酸(C19:0)。在安装有30m X0.32mm内径(0.25μm膜厚度)OMEGAWAX 320熔融石英毛细管柱(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO,USA)和设定在250℃的火焰离子化检测器(在275℃下FID检测器的分流比为50:1)的Agilent 6890GC(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)中进行分析。注射体积是1μL。载气是恒定流速为每分钟5.0mL的H₂。使用Trace GC-DSQ质谱仪(Thermo Electron,Boston,USA)并且与实验室标准品的保留时间进行比较来对FAME的身份进行确定。

八种经过转化的菌株中有一种产生约6.337g/L DHA。当生长在含有35g/L人工海盐的ONC-T18-GM0中时，这一产率比野生型菌株ONC-T18多约16％。当在相同条件下生长在含有18g/L人工海盐的ONC-T18-GM0中时，八种经过转化的菌株中有三种所产生的DHA比野生型菌株ONC-T18多，多1％到13％范围内(图17A和B)。

八种经过转化的菌株中有两种分别产生7.445g/L和7.871g/L DHA，分别表示比它们在含有35g/L人工海盐的ONC-T18-GM0中生长的亲本菌株(5.935g/L)多25％和36％(图17B)。使用盐度更低的ONC-T18-GM0不仅会直接降低DHA的生产成本，而且还会减慢由用于培养破囊壶菌属微生物的生长培养基中高浓度的氯化钠盐所引起的对发酵罐的腐蚀。

经过转化的高水平DHA产生菌株的DHA与总脂质的比率高于它们的亲本菌株(图17C)。DHA:总脂质因数可能会影响对从经过转化的菌株的细胞中提取的DHA的下游加工。用本发明的菌株和方法实现的DHA:总脂质比率可能根据发酵条件而改变。举例来说，对于在烧瓶中生长的培养物，可以典型地用经过转化的菌株实现DHA占总脂质约15％到约25％的百分比(相应于约0.15:1到约0.25:1的DHA:总脂质比率)。对于在发酵罐中生长的培养物，可以典型地用经过转化的菌株实现DHA占总脂质约30％到约60％的百分比(相应于约0.3:1到约0.6:1的DHA:总脂质比率)。由本文所公开的经过转化的菌株所获得的DHA产率比可以用野生型菌株获得的DHA产率要大得多。举例来说，经过转化的菌株的DHA产率典型地在约10g/L到约 40g/L(每升培养基DHA的克数)范围内，而野生型菌株的DHA产率典型地在约0.5g/L到约1.6g/L范围内。(参见例如Raghukumar(2008)中的表2)。经过转化的高水平DHA产生菌株的DHA与生物质的比率也高于它们的亲本菌株。这种更高的DHA与生物质比率有利于对经过转化的菌株的细胞生物质中的DHA进行下游提取(图17D)。

这个实施例中的所有培养物都在相同条件下生长。经过转化的菌株能够产生更高水平的DHA指示了那些菌株将碳源转化成DHA的效率更高，这可以降低由那些经过转化的菌株生产DHA的成本。

实施例11：破囊壶菌属种ONC-T18的经过转化的菌株与野生型菌株之间总脂质生产率的比较

如本文所充分描述和表明，ONC-T18作为高效的生物工厂(biofactory)不仅在用于PUFA和它的药物和营养药物(nutraceutical)生物分子生产衍生物方面，而且还在用于生物燃料生产方面具有巨大潜能。为了对ONC-T18根据本发明用于生物燃料生产的能力进行评估和表征，针对在用于针对特殊产品应用改变脂肪酸分布的方法中的潜在用途来分析经过转化的ONC-T18菌株的总脂质生产率和脂肪酸分布。

在与实施例9中所述的条件相同的条件下使8种经过转化的菌株和它们的亲本菌株(野生型)的培养物生长，并且收集生物质并且将其冷冻干燥。如实施例10中所述来进行FAME提取和GC分析。

我们发现当在含有35g/L人工海盐的ONC-T18-GM0中生长时经过转化的菌株的脂肪酸分布与它们的亲本菌株极为相似。八种经过转化的菌株中有四种所产生的总脂质多于它们的亲本菌株，进一步表明了转化过程本身以及转基因的存在和/或表达并没有显著地影响大部分衍生菌株的脂肪酸分布，也没有干扰可能参与脂质代谢通路的基因。因此，看来在转化过程之后，菌株保持了亲本菌株的遗传完整性 (图18A)。

对破囊壶菌菌株进行转化的能力为对这些微生物进行遗传修饰以及引导代谢通路提供了巨大的可能。值得注意的是，当使经过转化的菌株在含有18g/L海盐的ONC-T18-GM0中生长时，两种菌株所展示出的C16脂肪酸产量水平都显著高于它们的亲本菌株。这些结果在将这种菌株ONC-T18研发成短链脂肪酸生物燃料生产平台中是有用的。这些结果表明在对zeocin抗性转化体进行的选择过程期间，突变诱发以相对高的频率出现于细胞中。在菌株改良方案中可以利用这种高突变诱发频率(图18B)。

产生高水平短链脂肪酸的菌株中总脂质与生物质的比率高于低水平产生菌株(图18C)；这种更高的比率可能有益于下游油类提取以及加工成本的降低。

在低海盐ONC-T18-GM0(18g/L)中生长会增强大部分所测试菌株的整体总脂质生产率(图18D)。

举例来说，可能希望提高短链脂肪酸(即具有少于16个碳的脂肪酸)或特定PUFA的产生，如本文在对PUFA生物合成通路的论述中所提及。可能例如希望提高EPA(例如通过使PKS基因和Δ5延长酶基因突变或敲除PKS基因和Δ5延长酶基因)或ARA(例如通过下调任何PKS基因和/或上调Δ12延长酶基因)的产生。

实施例12：ble转基因在破囊壶菌属种ONC-T18的经过转化的菌株中的稳定性

本实施例确定了转基因在本文所述的经过转化的破囊壶菌属种菌株中的稳定性。

转基因稳定性对于在工业微生物菌株改良方案中进行基因工程化的某些应用来说是重要的，在所述工业微生物菌株改良方案中，将微生物用于药物或工业过程中并且其中产品的量和品质是最重要的。我们因此对经过转化的ONC-T18菌株进行转基因稳定性评价测定。对于实施例7中所述的生长速率测定，将每次转化的四种菌株的接种物以及它们的原种野生型菌株在不存在zeocin的情况下点样于ONC-T18-GM0琼脂板上并且在25℃下孵育七天。(每次转化使用五种不同的质粒构建体中的一种进行，每种质粒构建体带有由不同启动子和终止子的组合驱动的不同zeocin抗性基因表达盒)。然后，使用相同的方法，将菌株转移到新的新鲜ONC-T18-GM0琼脂板上并且在25℃下孵育7天；将群落传代进行6次。最后，将菌株转移回不含或含有浓度为每毫升培养基200μg的zeocin的ONC-T18-GM0琼脂板上。

结果指示在六次群落传代之后，所有菌株都可以在含有或不含zeocin的ONC-T18-GM0琼脂板上良好生长(图19)。然而，在具有浓度为每毫升培养基200μg的zeocin的ONC-T18-GM0琼脂板上，仅经过转化的菌株生长良好，而野生型菌株都不能生长(图19)。

这些结果表明在所研究的菌株中没有观测到转基因的丧失。此外，在野生型菌株中没有观测到抗性，指示这些性状没有发生自发突变并且不存在可检测出的污染。如实施例6中所述使用PCR来进一步确定在六次群落传代之后ble转基因在经过转化的菌株中的存在。所有经过转化的菌株即使在6次群落传代之后仍保留ble转基因。因此，ble转基因在经过转化的ONC-T18菌株中展示稳定性。

实施例13：诱变剂

这个实施例尤其描述了有效诱变剂的发现。这种试剂特别可用于在破囊壶菌属中进行突变诱发。

zeocin是一种能够使得细胞中的染色体DNA断裂的抗生素。假定抗生素zeocin将是一种用于菌株改良的有用的破囊壶菌属菌株诱变剂。在某些浓度下，zeocin可以杀死大部分所处理的细胞，但一些细胞仍能够存活。在高浓度下处理细胞会增加突变频率，这可以有助于对突变菌株进行选择和分离。

选择ONC-T18的海洋原生生物野生型菌株作为模型系统来测试zeocin是否将在这种菌株中有效诱导突变诱发。将在含有ONC-T18-GM0培养基[5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、10g/L D(+)-葡萄糖、35g/L人工海盐、1.25mg/L微量元素(5g/L NaH₂PO₄.H₂O、3.15g/LFeCl₃·6H₂O、4.36g/L Na₂EDTA·2H₂O、0.6125mg/L CuSO₄·5H₂O、0.0597g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.022g/L ZnSO₄·7H₂O、0.01g/L CoCl₂·6H₂O、0.18g/L MnCl₂·4H₂O、13μg/L H₂SeO₃、2.7mg/L NiSO₄·6H₂O、1.84mg/L Na₃VO₄以及1.94mg/L K₂CrO₄)、1.25mg/L维生素(1mg/L维生素B12、1mg/L生物素、0.20g/L盐酸硫胺素)以及每升20g琼脂]的琼脂板中生长的一完全菌环量的ONC-T18接种物接种到50mL液体ONC-T18-GM0培养基中，并且在振荡孵育箱中在25℃下在250rpm下孵育36小时。将0.5毫升的培养物转移到1.5mL试管中并且以全速涡旋30秒，然后在50mL无菌水中稀释。将100微升经过稀释的接种物分别铺到含有不同浓度(0μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL)的zeocin的琼脂板上。在25℃孵育箱中孵育培养板。每天观测群落的出现和生长。在接种后第六天，在10μg/mLzeocin下生长的群落的大小与在0μg/mLzeocin下生长的群落大小相似，并且在30μg/mL到50μg/mLzeocin下逐步缩小。每个培养板上的群落数目也在10μg/mL、30μg/mL以及50μg/mLzeocin下逐步减少。在50μg/mLzeocin下仅看到少许群落。值得注意的是，在50μg/mLzeocin下生长的一些群落中观测到发生不同的明显的群落形态改变的群落角变区(colony sector)，但在更低浓度的zeocin下或在不存在zeocin的情况下生长的群落中未观测到，指示zeocin实际上是一种有效的破囊壶菌属菌株诱变剂。在这些条件下，zeocin在至少10-200μg/mL的范围内是有效的；更高浓度很可能也是有效的。举例来说，200-500μg/mL或更高的范围内的浓度可能起作用。在一些情况下，当还增加盐浓度时使用更高浓度的zeocin以抵偿可能由盐所致的zeocin的降解。在本实施例中所用的具体条件下，zeocin在50μg/mL下能够发挥最佳作用。

实施例14：新型发酵程序

这个实施例描述了用于在破囊壶菌属菌株中获得高生物质、总脂质以及PUFA产量的两阶段发酵法。

经由对来自在不同条件(如C:N来源比率、溶解氧水平以及温度)下生长的培养物的细胞进行显微镜观察来详细地研究菌株ONC-T18的生命周期。已发现，在低氧浓度和高碳与氮的比率(C:N)(例如在40:1到1:约0的范围内，并且确切地说为1:1到1:约0)以及环境温度下，菌株ONC-T18生长旺盛并且主要经由产生游动孢子来繁殖，从而产生大量的含有相对小并且较少的亚细胞油体的小营养细胞。相比之下，在高C:N比率、低氧水平以及相对低温(例如在10℃-30℃范围内，并且确切地说在20℃-25℃下)下，菌株ONC-T18主要经由直接营养细胞分裂来繁殖，从而产生大量的含有非常庞大的亚细胞油体的巨细胞。因此，研发两阶段发酵法以使生物质、总脂质以及PUFA生产率达到最大。这是一种用于使高脂质和PUFA破囊壶菌属菌株生长并且对其进行筛选的最佳方法。进行以下三个测定：

测定I：将野生型菌株ONC-T18接种到10mL液体ONC-T18-GM0培养基中。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长2天。然后，在250mL烧瓶中将接种物(OD₆₆₀＝12)接种到100mL ONC-T18-GM0培养基中。每种菌株接种三份培养物。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长2天，然后变成150rpm和20℃，并且使其再生长4天。通过将细胞培养物转移到50mL锥形离心管中并且使用SORVALL LEGEND RT+离心机(ThermoFisher Scientific公司,MA,USA)以4000rpm离心来收集培养物的生物质。生物质以紧密层的形式浮在液体培养基的表面上。通过使用18G 1 1/2注射器针头在锥形离心管的底部穿出极小的洞来释放液体培养基。将管中的生物质的沉淀在-80℃冰箱中冷冻过夜，然后使用冷冻干燥器冷冻干燥三天。对每个样品的生物质进行称重。

测定II：如测定I中所述制备接种物。随后，在250mL烧瓶中将接种物(OD₆₆₀＝6)接种到50mL ONC-T18-GM0培养基中。每种菌株接种三份培养物。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长2天，然后变成150rpm和20℃。在接种后第2天，将5mL经过高压消毒的50％葡萄糖添加到每个培养烧瓶中，然后在接种后第4天，添加6mL葡萄糖。在接种后6天之后，如测定I中所述收集培养物的生物质。

测定III：如测定I中所述制备接种物。然后在250mL振荡三角烧瓶(baffledflask)中将接种物(OD₆₆₀＝6)接种到50mLONC-T18-GM0培养基中。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长。在接种后第2天和第4天，将5mL和6mL经过高压消毒的50％葡萄糖分别添加到每个培养烧瓶中，如测定III中所操作。在接种后第6天，如测定II中所述收集培养物的生物质。

使用直接酯基转移法分析每个样品的总脂质和DHA含量。通过涡旋10秒将约20mg经过冷冻干燥的细胞生物质与3mL酯基转移反应缓冲液(甲醇:盐酸:氯仿)混合，然后在90℃水浴槽中孵育两小时。在完成酯基转移之后，移出样品并且冷却到环境温度。添加1mL水并且经由涡旋10秒加以混合。然后通过添加3X 2mL己烷:氯仿(v/v，4:1)溶剂并且涡旋10秒来提取脂肪酸甲酯(FAME)，并且将其静置直到完成相分离为止。

使用两种内标(200μL)对FAME进行气相色谱(GC)分析。在酯基转移之前添加一种二十六烷酸(C23:0)并且在分析之前直接添加另一种十九烷酸(C19:0)。在安装有30m X0.32mm内径(0.25μm膜厚度)OMEGAWAX 320熔融石英毛细管柱(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和设定在250℃的火焰离子化检测器(在275℃下FID检测器的分流比为50:1)的Agilent 6890GC(Agilent Technologies, Palo Alto,CA,USA)中进行分析。注射体积是1μL。载气是恒定流速为每分钟5.0mL的H₂。使用Trace GC-DSQ质谱仪(Thermo Electron,Boston,USA)并且与实验室标准品的保留时间进行比较来对FAME的身份进行确定。

结果(表5)指示测定II中所用的发酵条件对于ONC-T18中的高脂质和DHA产量来说是最好的；观测到约50％到约70％范围内的干燥生物质水平；基于这些研究结果可以预期高达约70％到约90％的水平。所观测到的DHA产率在约5g/L培养物到约7.5g/L培养物的范围内。基于这些研究结果，可以预期高达约45g/L到约95g/L的DHA产率。

在测定III中例如通过使用振荡三角烧瓶和高振荡速度来增加溶解氧可以显著地提高生物质生产率，但是DHA生产率显著低于测定II中的DHA生产率。因此，对发酵参数(如C:N比率、葡萄糖浓度、溶解氧以及温度)以及发酵过程期间这些参数的动力学进行优化会影响破囊壶菌属菌株中脂质和PUFA的有成本效益的产生。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，发明人认为与测定I相比在测定II中所观测到的产率增加可能至少在某种程度上归因于在测定II中葡萄糖浓度更高和/或溶解氧水平更低。

表5在不同的发酵条件下破囊壶菌属种ONC-T18的生物质、总脂质以及DHA生产率

测定	生物质(g/L)	总脂质(mg/g)	DHA(g/L)
				I	7.10	211.20	0.45
II	41.32	671.09	5.94
				III	46.50	661.07	3.06

实施例15：诱变剂的应用

这个实施例描述了诱变剂zeocin用于对破囊壶菌属进行菌株改良的应用。

将来自群落角变区的接种物转移到新的新鲜培养板中并且产生新的菌株。选择四种新的菌株1a、1b、3a以及3b用于进一步研究(结果展示于表2中)。将这四种菌株和它们的野生型亲本菌株ONC-T18接种到10mL ONC-T18-GM0液体培养基中。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长3天直到OD₆₆₀大于2为止。然后，分别将包括野生型菌株在内的每种菌株的接种物(OD₆₆₀＝6)在250mL烧瓶中接种到50mL ONC-T18-GM0培养基中。以下所用的实验条件和程序与实施例14测定II中相同。

表6破囊壶菌属种ONC-T18的四种所选择的菌株和它们的野生型亲本菌株的生物质、总脂质以及DHA生产率

实验结果指示四种所选择的菌株中有三种相较于它们的野生型亲本菌株产生显著更少的生物质、总脂质以及DHA(表6)。然而，菌株3a比它的野生型菌株产生更多的生物质、更多的脂质和DHA。菌株3a的DHA生产率高不仅是归因于它的生物质生产率高，而且还归因于DHA与生物质的比率高。这个结果指示所发现的诱变剂可以被用于改良微生物菌株的适应性(例如像使用更便宜的碳源的能力，如废物流、甘油、淀粉、纤维素以及半纤维素)、产品的品质和量(如PUFA的ARA、DHA和/或EPA生产率)以及有利于生物燃料应用的脂肪酸和/或脂质分布。

可以通过任何多种手段将所产生的物质与产生菌株和/或培养基组分相分离。在一些实施方案中，例如通过采用改变脂肪酸分泌和/或使细胞壁变得薄弱的一个或多个步骤来促进对所产生的物质进行提取。

实施例16：破囊壶菌属种的新型菌株

这个实施例描述了具有高脂质和DHA生产率水平的新型破囊壶菌属种菌株的发现。

将ONC-T18单细胞铺到含有ONC-T18-GM0培养基和50μg/mLzeocin的琼脂板上。在接种后第10到15天，目测筛选群落。随机分离没有明显形态改变的大群落并且使其产生新的菌株。比较新菌株的生物质、总脂质以及DHA生产率。最初发现一种菌株ONC-T18/35/Z50能够产生显著更多的生物质、总脂质以及DHA，这已经使用实施例14测定II中所述的经过优化的发酵条件、方法以及程序加以反复确定。在使用含有35g/L海盐的ONC-T18-GM0培养基进行的两阶段发酵测定中，新的菌株ONC-T18/35/Z50比它的亲本菌株ONC-T18多产生5％的生物质、多产生7％的总脂质以及多产生14％的DHA。使用相同但含有18g/L海盐的培养基，新的菌株ONC-T18/35/Z50比它的亲本菌株ONC-T18多产生约10％的生物质、多产生20％的总脂质以及多产生36％的DHA(图19)。此外，以高水平DHA产生新菌株ONC-T18/35/Z50的DHA和总脂质与生物质的比率高于它的亲本菌株，表明新菌株具有更稳固的将碳源(如葡萄糖)转化成脂质和DHA的能力。这种新型菌株不仅可用于改良产率，而且还可用于降低用于从微藻生产生物脂质和PUFA(如DHA)的发酵和下游加工成本。

参考文献

Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.,and Lipman,D.J.(1990).Basic local alignment search tool.J Mol Biol 215(3),403-10.

Davis,S.J.,and Vierstra,R.D.(1998).Soluble,highly fluorescentvariants of green fluorescent protein(GFP)for use in higher plants.Plant MolBiol 36(4),521-8.

Dumas et al.(1994)The three-dimensional structure of a bleomycinresistance protein.EMBO J.242(5),595-601.

Gatignol et al.(1988)Bleomycin resistance conferred by a drug-bindingprotein.FEBS Letters,230:171-175.

Higuchi,R.,Krummel,B.,and Saiki,R.K.(1988).A general method of invitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments:study of proteinand DNA interactions.Nucleic Acids Res 16(15),7351-67.

Huang,J.,Jiang,X.,Zhang,X.,Chen,W.,Tian,B.,Shu,Z.,and Hu,S.(2008).Expressed sequence tag analysis of marine fungus Schizochytrium producingdocosahexaenoic acid.J Biotechnol 138(1-2),9-16.

Jain,R.,Raghukumar,S.,Sambaiah,K.,Kumon,Y.,and Nakahara,T.(2007).Docosahexaenoic acid accumulation in thraustochytrids:search for therationale.Mar Biol 151,1657-1664.

Jepson et al.(1998)Pesticide Science,54(4),360-367.

Leonard,A.,Pereira,S.,Sprecher,H.,and Huang,Y.-S.(2004).Elongation oflong-chain fatty acids.Progress in Lipid Research 43,36-54.

Li et al.(2005)Plant Sciences,169(3),463-469.

Park and (2005)Eukaryotic cell 4(8),1328-1342.

Raghukumar S.(2008)Thraustochytrid Marine Protists:Production ofPUFAs and Other Emerging Technologies.Mar.Biotech.10:631-640.

Zhang,S.C.,Wege,C.,and Jeske,H.(2001).Movement proteins (BC1and BV1)of Abutilon mosaic geminivirus are cotransported in and between cells of sinkbut not of source leaves as detected by green fluorescent proteintagging.Virology 290(2),249-60.

等同性

本领域技术人员将认识到，或者仅仅使用常规实验即能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。本发明的范围并不意欲受限于上述描述。替代性方法和材料以及其他应用对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且意欲包括在以下权利要求书之内。

Claims

1.一种使破囊壶菌细胞转化的方法，包括以下步骤：

(a)提供感受态破囊壶菌细胞；

(b)将重组核酸递送到所述感受态破囊壶菌细胞中，其中所述重组核酸包含选择性标记和破囊壶菌微管蛋白启动子，其中所述微管蛋白启动子的核酸序列由SEQ ID NO:10组成；以及

(c)在含有选择剂的培养基中培养所述感受态破囊壶菌细胞，所述选择剂能在无所述选择性标记存在下减少细胞的生长。

2.根据权利要求1所述的方法，其中选择性标记是抗生素抗性基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其中选择剂是抗生素。

4.根据权利要求3所述的方法，其中抗生素是zeocin。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述zeocin是以大于50μg/mL的浓度存在。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述zeocin是以约100μg/mL的浓度存在。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组核酸进一步包含不同于所述选择性标记的基因表达盒。

8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：(d)分离含有所述选择性标记的感受态破囊壶菌细胞。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述递送步骤包括：生物弹射式递送涂有所述重组核酸的粒子。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述粒子包含金粒子。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基含有介于10g/L与40g/L之间的盐。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基含有介于15g/L与35g/L之间的盐。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基含有介于18g/L与35g/L之间的盐。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组核酸包含破囊壶菌微管蛋白终止子，其中所述破囊壶菌微管蛋白终止子的核苷酸序列由SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18组成。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组核酸包含可操作连接到选择性标记的破囊壶菌微管蛋白启动子。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述选择性标记是zeocin抗性基因。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述选择性标记包含ble基因。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述ble基因是Sh ble基因、Tn5ble基因或Sable基因。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是ONC-T18。