CN110168071A - 用于使用真核微生物产生富含dha、棕榈酸和蛋白质的生物质的方法 - Google Patents

用于使用真核微生物产生富含dha、棕榈酸和蛋白质的生物质的方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了具有包含长链脂肪酸(LCFA)的简单脂质分布的真核微生物。还提供了包含所述真核微生物的组合物和培养物以及使用所述真核微生物的方法。

Description

用于使用真核微生物产生富含DHA、棕榈酸和蛋白质的生物质 的方法
背景技术
鱼类构成膳食蛋白质的很大一部分，并且在人类饮食中提供必需的ω-3脂质。增加的需求正在驱动海鲜市场的增长，年增长率为6％。水产养殖是这个市场不可或缺的一部分，因为野生捕捞不再能够满足消费者的需求。历史上，鱼粉(蛋白质)和鱼油(脂肪酸，并且特别是ω-3脂肪酸)已被广泛使用。水产养殖的发展需要开发提供碳水化合物、蛋白质和ω-3脂肪酸的新的、可持续的水产养殖饲料来源。由于技术限制，微藻已作为用于改善特定性质的微量成分使用，而不是作为大量(蛋白质、油或碳水化合物)营养素。因此，虽然已知适合作为饲料组分，但是微藻的使用目前限制为用于解决可持续性的手段。
发明内容
本文提供了具有包含长链脂肪酸(LCFA)的简单脂质分布的真核微生物。还提供了包含所述真核微生物和异养培养基的组合物和培养物。本文还提供了使用所公开的真核微生物制备脂质组合物的方法和通过将所述脂质组合物掺入食品中来使用所述脂质组合物的方法。还提供了使用所公开的微生物制备富含蛋白质的生物质并且任选地将所述富含蛋白质的生物质掺入食品中的方法。
附图说明
图1是示出在液体培养基中菌株G3-1的生物至和TFA产生的图：基础(B)和完全发酵培养基(FF)。
图2是示出培养基组成对菌株G3-1的细胞内的油的脂肪酸分布的影响的图：基础(B)、完全发酵培养基(FF)。
图3是示出热TCA处理对来自早期指数期(T16h和T22h)和静止期(T139h和T189h)的冻干G3-1生物质中蛋白质提取效率(作为％的蛋白质含量)的影响的图。
图4是在不同液体培养基组合物下菌株G3-1的细胞内的油的脂肪酸分布的图。
图5是示出菌株G3-1的细胞内的油的脂肪酸分布的图。使用选择的基础培养基在2-L发酵罐中培养细胞。
图6是示出菌株G3-1的细胞内的油的脂肪酸分布的图。使用改良的完全发酵培养基在2-L发酵罐中培养细胞。
图7是示出菌株G3-1的细胞内的油的脂肪酸分布的图。在改良的完全发酵培养基中使用半浓度的硫酸铵在2-L发酵罐中培养细胞。
图8是在不同液体培养基组合物下菌株G3-1的细胞内的油的脂肪酸分布的图。
图9是示出菌株G3-1的细胞内的油的脂肪酸分布的图。使用VU1培养基在30L发酵罐中培养细胞。
图10是示出菌株G3-1的细胞内的油的脂肪酸分布的图。使用VU2培养基在30L发酵罐中培养细胞。
图11是示出菌株G3-1的细胞内的油的脂肪酸分布的图。使用VU3培养基和粗甘油作为碳源，在2L发酵罐中培养细胞。
具体实施方式
微藻是水生生态系统的主要生产者，并且代表必需营养素(例如蛋白质和ω-3脂肪酸)的来源，所述营养素在水生食物链中代谢和/或生物累积。因此，源自微藻的高蛋白质和高ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)产品具有巨大的潜力来可持续地满足快速增长的水产养殖行业的饮食需求。在各种各样的微藻中，异养微藻的使用最有可能提供不受植物和动物产品的供应和需求约束的水产养殖饲料投入。异养微藻生产需要显著更少的土地和水，具有更好的工艺经济性，并且独立于环境条件(即，与气候无关)。例如，异养微藻的体积生物质生产率可比光合微藻高两个数量级。异养微藻的使用还提供了利用廉价且丰富的非食物碳源的机会，通过发酵将所述碳源直接转化为高价值产品。如水产养殖饲料产品所需，此类生产方法也可更容易地按比例放大。
本文提供了具有包含长链脂肪酸(LCFA)的简单脂质分布的真核微生物。包括破囊壶菌在内的微生物产生多种脂质，包括各种形式和量的脂肪酸。如本文所用，术语脂质包括磷脂、游离脂肪酸、脂肪酸的酯、三酰基甘油、固醇和固醇酯、类胡萝卜素、叶黄素(例如，含氧类胡萝卜素(oxycarotenoids))、碳氢化合物以及本领域的普通技术人员已知的其他脂质。脂肪酸是终止于羧基的烃链，如果它们含有至少一个碳-碳双键则称为不饱和的，并且当它们含有多个碳-碳双键时则称为多不饱和的。例如，微生物可产生(i)短链脂肪酸(SCFA)，其是具有少于6个碳的脂族尾部的脂肪酸(例如，丁酸)；(ii)中链脂肪酸(MCFA)，其是具有6至12个碳的脂族尾部的脂肪酸；(iii)长链脂肪酸(LCFA)，其是具有13至21个碳的脂族尾部的脂肪酸；以及极长链脂肪酸(VLCFA)，其是具有长于22个碳的脂族尾部的脂肪酸。各种微生物产生不同类型和量的这些脂肪酸。脂肪酸的具体类型和量在本文中统称为微生物的脂质分布(1ipid profile)。因此，如本文所用，术语“脂质分布”是指微生物中产生的脂质的类型和脂质的量。
如本文所用，“简单脂质分布”是指微生物中95％或更多的甘油三酯由1、2、3或4种主要长链脂肪酸组成的微生物。任选地，微生物中95％、96％、97％、98％、99％或100％的甘油三酯包含1、2、3或4种主要长链脂肪酸。任选地，微生物中95％、96％、97％、98％、99％或100％的甘油三酯包含肉豆蔻酸酯(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、二十二碳五烯酸n-6(C22:5n-6，DPAn6)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3，DHA)。如本文所用，甘油三酯是指由与甘油酯分子共价连接的三种脂肪酸组成的分子。因此，微生物中总脂肪酸的甘油三酯级分可包含95％、96％、97％、98％、99％或100％的肉豆蔻酸酯(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、二十二碳五烯酸n-6(C22:5n-6，DPAn6)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3，DHA)。
长链脂肪酸(LCFA)包括但不限于肉豆蔻酸酯(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、二十二碳五烯酸n-6(C22:5n-6，DPAn6)、二十二碳六烯酸(C22:6n-3，DHA)、月桂酸(C12:0)、十五烷酸(C15:0)、棕榈油酸(C16:1)、十七烷酸(C17:0)、硬脂酸(C18:0)、异油酸(C18:1n-7)、油酸(C18:1n-9)、γ-亚麻酸(C18:3n-6)、α-亚麻酸(C18:3n-3)、十八碳四烯酸(C18:4)、花生酸(C20:0)、二高-γ-亚麻酸(C20:3n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6，ARA)、二十碳五烯酸(C20:5n-3，EPA)、山嵛酸(C22:0)、二十二碳四烯酸(C22:4)、二十二碳五烯酸n3(C22:5n-3，DPAn3)以及二十四烷酸(C24:0)。任选地，四种主要LCFA包括肉豆蔻酸酯、棕榈酸、DPA和DHA。
任选地，简单脂质分布包含大于3％的肉豆蔻酸酯(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、二十二碳五烯酸n-6(C22:5n-6，DPAn6)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3，DHA)中的每种。任选地，简单脂质分布包含甘油三酯，并且95％的所述甘油三酯由肉豆蔻酸酯(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、二十二碳五烯酸n-6(C22:5n-6，DPAn6)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3，DHA)组成。任选地，简单脂质分布包含少于3％的月桂酸(C12:0)、十五烷酸(C15:0)、棕榈油酸(C16:1)、十七烷酸(C17:0)、硬脂酸(C18:0)、异油酸(C18:1n-7)、油酸(C18:1n-9)、γ-亚麻酸(C18:3n-6)、α-亚麻酸(C18:3n-3)、十八碳四烯酸(C18:4)、花生酸(C20:0)、二高-γ-亚麻酸(C20:3n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6，ARA)、二十碳五烯酸(C20:5n-3，EPA)、山嵛酸(C22:0)、二十二碳四烯酸(C22:4)、二十二碳五烯酸n3(C22:5n-3，DPAn3)以及二十四烷酸(C24:0)中的每种。
任选地，简单脂质分布包含少于0.02％的短链脂肪酸。任选地，简单脂质分布在总脂肪酸中的甘油三酯中包含至少35％的C22:6n-3(DHA)。任选地，简单脂质分布在总脂肪酸中的甘油三酯中包含35％-40％、35％-45％、35％-50％、40％-45％、40％-50％或50％-60％的DHA。换句话说，在微生物中的总脂肪酸的甘油三酯级分中，所述甘油三酯可包含35％-40％、35％-45％、35％-50％、40％-45％、40％-50％或50％-60％的DHA。
任选地，真核微生物产生至少20％蛋白质、至少40％蛋白质或至少20％-40％蛋白质的生物质。
任选地，真核微生物在总脂肪酸的甘油三酯中产生至少约10％的C22:6n-3(DHA)。任选地，真核微生物在总脂肪酸的甘油三酯中产生至少30％的棕榈酸。任选地，真核微生物在总脂肪酸的甘油三酯中产生至少40％的棕榈酸。任选地，真核微生物产生一种或多种类胡萝卜素。任选地，一种或多种类胡萝卜素包括β-胡萝卜素。任选地，β-胡萝卜素占所述微生物中产生的类胡萝卜素的至少95％、96％、97％、98％、99％或100％。
公开了产生脂质的真核微生物，其中所述真核微生物具有简单脂质分布。任选地，产生脂质的真核微生物具有与SEQ ID NO：1中列出的序列具有至少97％、98％、99％或100％同一性的18S序列。任选地，真核微生物具有IDAC登录号220716-01，其于2016年7月22日保藏于加拿大国际保藏机构(Intemational Depositary Authority of Canada)(IDAC)，国家微生物实验室(National Microbiology Laboratory)，加拿大公共卫生署(Public Health Agency of Canada)，阿林顿街1015号(1015 Arlington Street)，温尼伯(Winnipeg)，加拿大曼尼托巴省(Manitoba Canada)R3E 3R2并且被指定登录号220716-01。此保藏是根据布达佩斯条约关于出于专利程序目的的微生物保藏的国际认可的条款而作出的。此保藏是示例性的，并且仅为了本领域技术人员的方便而做出，而不是承认可专利性需要保藏(例如，根据美国法典第35篇第112条)。术语“G3-1”或“G3-1菌株”或“菌株G3-1”在本文中可互换使用，并且是指保藏在IDAC并具有IDAC登录号220716-01的真核微生物。
所提供的微生物在其天然环境中具有相对于野生型微生物的区别性特征。野生型微生物可在从海洋环境延伸至淡水湖和河流的天然水生环境中发现，并且还包括含盐的环境，如江口和河口。此类环境不被认为涵盖于术语异养培养基中。所提供的微生物在异养培养基中产生与在其天然环境中的微生物不同量的一种或多种脂质和/或蛋白质含量。
如本文所用，核酸是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物和互补物。所述术语包括呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键联的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的，它们具有与参考核酸相似的结合性质，并且它们以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另外指出，否则可使用核酸序列的保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列来代替本文所述的特定核酸序列。具体地说，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置被混合型碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸以及多核苷酸互换使用。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语相同或同一性百分比是指如使用下文所述的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法与默认参数参数或通过人工比对和目视检查所测量(参见例如，NCBI网站等)，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当比较和比对相对于比较窗或指定区的最大对应性时，相对于指定区具有约60％同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)。此类序列然后被认为是“基本上相同的”。这一定义也指或者可适用于测试序列的补体。所述定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如下文所述，优选的算法可对空位等做出解释。优选地，同一性存在于至少约25个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或更优选地存在于50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与所述参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。优选地，可使用默认程序参数或可指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的比较窗口包括涉及多个连续位置中的任一个区段，所述连续位置选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的组，其中在两个序列最佳对比之后，可将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。比对用于比较的序列的方法是本领域中熟知的。可例如通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman，Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索方法；通过这些算法(威斯康辛遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup，575Science Dr.，Madison，WI)的计算机实现；或通过手动比对和目测检查(参见，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编著1995增刊))来进行用于比较的序列的最佳比对。
适合用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。使用BLAST和BLAST 2.0与本文描述的参数来确定核酸或蛋白质的序列同一性百分比。用于执行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的，如本领域中已知的。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中选定长度(W)的短词来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短词在与数据库序列中具有相同长度的词比对时匹配或满足某些正值的阈值分数T。T被称为邻近词分数阈值(Altschul等人)。这些初始邻近词命中充当种子来启动搜索，以寻找含有它们的较长HSP。只要累积比对分值可增加，则词命中在两个方向上沿每个序列延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是＞0)和N(对于错配残基的罚分；总是＜0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。当：累积的比对分数从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积分数趋于0或0以下；或者到达任一序列的末端时，停止所述词命中在每个方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。期望值(E)表示不同比对的数量，所述比对的分数等于或高于在随机数据库搜索中预期发生的分数。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的默认值是字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4并且进行两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值是字长为3，期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))，比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。
如本文所用的术语多肽通常具有其在本领域公认的具有至少三个氨基酸的聚合物的含义并且意图包括肽和蛋白质。然而，所述术语也用于指特定功能类别的多肽，例如像去饱和酶、延长酶等。对于每个所述类别，本公开提供了此类多肽的已知序列的若干实例。然而，本领域的普通技术人员应了解，术语多肽意图足够普遍地不仅涵盖具有本文中(或在本文所提及的参考资料或数据库中)所列出的完整序列的多肽，而且还涵盖代表此类完整多肽的功能性片段(即保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域的普通技术人员了解到，蛋白质序列通常容许在不破坏活性的情况下的一些取代。因此，保留活性并且与相同类别的另一种多肽共有至少约30％-40％总序列同一性、通常大于约50％、60％、70％或80％，并且进一步通常在一个或多个高度保守区中包括至少一个具有更高同一性、通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％的区，通常涵盖至少3-4个并且通常高达20个或更多个氨基酸的任何多肽涵盖在如本文所用的相关术语多肽之内。本领域的技术人员可通过分析本文所描述的各种多肽的序列来确定具有相似性和/或同一性的其他区。正如本领域的技术人员所知，各种策略是已知的，并且用于执行氨基酸或核苷酸序列的比较以便评估同一性和/或相似性程度的工具是可获得的。这些策略包括例如手动比对、计算机辅助的序列比对以及其组合。许多用于执行序列比对的算法(所述算法通常由计算机实施)是可广泛获得的，或可由本领域的技术人员来产生。代表性算法包括例如，Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.，1981，2：482)；Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.，1970，48：443)；Pearson和Lipman的搜索相似性的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，1988，85：2444)；和/或这些算法的计算机实现(例如，威斯康辛遗传学软件包发布7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)。容易获得的并入此类算法的计算机程序包括例如BLASTN、BLASTP、空位BLAST、PILEUP、CLUSTALW等。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序的默认参数。或者，实践者可取决于他的或她的实验要求和/或其他要求而使用非默认参数(参见例如，网址：URL www.ncbi.nlm.nih.gov)。
所提供的真核微生物可在异养培养基中培养。因此，本文提供了真核微生物，所述真核微生物在异养培养基中具有包含长链脂肪酸(LCFA)的简单脂质分布。还提供了培养物，所述培养物包含：具有18S序列的产生脂质的真核微生物，其中所述18S序列与SEQ IDNO：1中列出的序列具有至少98％同一性；以及异养培养基，所述异养培养基产生具有包含长链脂肪酸(LCFA)的简单脂质分布的产生脂质的真核微生物。任选地，简单脂质分布包含大于3％的肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、二十二碳五烯酸n-6(C22:5n-6，DPAn6)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3，DHA)中的每种。任选地，简单脂质分布包含少于3％的月桂酸(C12:0)、十五烷酸(C15:0)、棕榈油酸(C16:1)、十七烷酸(C17:0)、异油酸(C18:1n-11)、油酸(C18:1n-9)、γ-亚麻酸(C18:3n-6)、α-亚麻酸(C18:3n-3)、十八碳四烯酸(C18:4)、花生酸(C20:0)、二高-γ-亚麻酸(C20:3n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6，ARA)、(C20:3n-3)、二十碳五烯酸(C20:5n-3，EPA)、山嵛酸(C22:0)、二十二碳四烯酸(C22:4)、二十二碳五烯酸n-3(C22:5n-3，DPAn3)以及二十四烷酸(C24:0)中的每种。任选地，微生物中95％、96％、97％、98％、99％或100％的甘油三酯包含肉豆蔻酸酯(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、二十二碳五烯酸n-6(C22:5n-6，DPAn6)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3，DHA)。任选地，简单脂质分布包含少于0.02％的短链脂肪酸。任选地，简单脂质分布在总脂肪酸中的甘油三酯中包含至少35％的C22:6n-3(DHA)。任选地，所述异养培养基使得在整个藻类生物质中产生至少20％的蛋白质。任选地，所述异养培养基使得产生所述生物质的至少20％至40％的蛋白质。任选地，所述异养培养基使得产生至少约40％的蛋白质。任选地，所述异养培养基进一步使得产生至少约10％C22:6n-3(DHA)。任选地，所述异养培养基使得产生至少30％棕榈酸。任选地，所述异养培养基使得产生至少40％棕榈酸。任选地，所述异养培养基使得产生一种或多种类胡萝卜素。任选地，所述一种或多种类胡萝卜素包括β-胡萝卜素，并且其中所述β-胡萝卜素占总类胡萝卜素的至少95％。任选地，β-胡萝卜素占所述微生物中产生的类胡萝卜素的至少95％、96％、97％、98％、99％或100％。
所提供的微生物在小型发酵罐中产生大于50％的DHA。任选地，所提供的微生物在2升(L)或5升(L)发酵罐中产生大于50％的DHA。任选地，所述微生物的生物质生产率在小型发酵罐(例如，2L或5L发酵罐)中是0.5至0.8g/L/h。任选地，所述微生物的总脂肪酸生产率在小型发酵罐(例如，2L或5L发酵罐)中是0.3至0.6g/L/h。任选地，所述微生物的DHA生产率在小型发酵罐(例如，2L或5L发酵罐)中是0.1至0.4g/L/h。任选地，所述微生物的C：16生产率在小型发酵罐(例如，2L或5L发酵罐)中是0.1至0.3g/L/h。
所述异养培养基为所述微生物供给各种营养组分，包括碳源和氮源。用于培养物的培养基可包含多种碳源中的任一种。碳源的实例包括脂肪酸、脂质、甘油、三甘油、碳水化合物、多元醇、氨基糖以及生物质或废物流中的任一种。脂肪酸包括，例如，油酸。碳水化合物包括但不限于葡萄糖、纤维素、半纤维素、果糖、右旋糖、木糖、乳果糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原、明胶、淀粉(玉米或小麦)、乙酸盐、m-肌醇(例如，源自玉米浆)、半乳糖醛酸(例如，源自果胶)、L-岩藻糖(例如，源自半乳糖)、龙胆二糖、葡糖胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸(例如，源自葡萄糖)、纤维二糖、糊精、α-环糊精(例如，源自淀粉)以及蔗糖(例如，来自糖蜜)。多元醇包括但不限于麦芽糖醇、赤藓糖醇以及阿东糖醇。氨基糖包括但不限于N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺以及N-乙酰基-β-D-甘露糖胺。任选地，所述碳源以小于60g/L的浓度存在于异养培养基中。任选地，所述碳源以1至60g/L的浓度存在于异养培养基中。任选地，所述碳源以5至60g/L的浓度存在于异养培养基中。任选地，所述碳源以20至40g/L的浓度存在于异养培养基中。
任选地，可在具有约0.5g/L至约50.0g/L的氯化物浓度的培养基中培养所述微生物。任选地，在具有约0.5g/L至约35g/L(例如，约18g/L至约35g/L)的氯化物浓度的培养基中培养微生物。任选地，在具有约2g/L至约35g/L的氯化物浓度的培养基中培养所述微生物。任选地，本文所描述的微生物可在低氯化物条件下生长。例如，可在具有约0.5g/L至约20g/L(例如，约0.5g/L至约15g/L)的氯化物浓度的培养基中培养所述微生物。所述培养基任选地包含NaCl。所述培养基可包含含非氯化物的钠盐作为钠源。适用于根据本发明方法的非氯化物钠盐的实例包括但不限于苏打灰(碳酸钠和氧化钠的混合物)、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠以及其混合物。参见，例如，美国专利号5,340,742和6,607,900，所述专利各自的全部内容以引用的方式并入本文。任选地，当使用20g/L碳、20g/L大豆蛋白胨和5g/L酵母提取物时，所述培养基包含9g/L氯化物。任选地，当所述培养基含有10g/L碳、5g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/L琼脂时，所述培养基包含35g/L氯化物。任选地，当所述培养基含有20-40g/L碳、1g/L酵母提取物、1-20g/L谷氨酸一钠(MSG)、0.3-2.0g/L磷酸盐、4g/L硫酸镁、5-10g/L硫酸铵、1.5mL/L微量元素溶液、1mL/L维生素B溶液、0.1g/L CaCl2时，所述培养基包含2g/L氯化物。
用于破囊壶菌培养物的培养基可包含多种氮源中的任一种。示例性氮源包括铵溶液(例如，NH4的H2O溶液)、铵盐或胺盐(例如，(NH4)25O4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4OOCH2CH3(NH4Ac))、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、鱼粉、谷氨酸钠、大豆提取物、酪蛋白氨基酸以及酒糟。氮源在合适的培养基中的浓度通常在约1g/L与约25g/L之间且包括约1g/L和约25g/L的范围内。任选地，所述培养基中氮的浓度是约5至20g/L。任选地，所述培养基中氮的浓度是约10至15g/L。任选地，所述培养基中氮的浓度是约20g/L。任选地，当酵母提取物是培养基中复合氮的来源时，氮的浓度是约10至15g/L。任选地，当大豆蛋白胨与L-谷氨酸单钠盐水合物(MSG)或硫酸铵一起在培养基中时，氮的浓度是约1至5g/L。
所述培养基任选地包含磷酸盐，诸如磷酸钾或磷酸钠。任选地，所述培养物或异养培养基包含磷酸二氢钾。
培养基中的无机盐和微量营养物质可包括硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰、氯化钙以及EDTA。任选地，所述培养基包含至少1.5ml/L的微量元素溶液。任选地，所述微量元素溶液包含2mg/mL硫酸铜(II)五水合物、2mg/mL硫酸锌七水合物、1mg/mL氯化钴(II)六水合物、1mg/mL氯化锰(II)四水合物、1mg/mL钼酸钠二水合物、1mg/mL硫酸镍(II)。
任选地，所述培养基包含硫酸镁。任选地，所述异养培养基或培养物包含硫酸镁、微量元素溶液和磷酸二氢钾。
可包括维生素，如吡哆醇盐酸盐、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素B12。
在适当时，可使用酸或碱和/或使用氮源将培养基的pH调整至介于3.0与10.0之间且包括3.0和10.0。任选地，可对所述培养基进行灭菌。
任选地，所述培养基包含L-谷氨酸一钠盐水合物或谷氨酸一钠(MSG)。任选地，所述培养基包含1-20g/L MSG。任选地，当所述培养基包含至少1g/L酵母提取物、40g/L碳、0.3g/L KH2PO4、4g/L硫酸镁和1.5mL/L微量元素溶液时，所述培养基包含1g/L MSG。任选地，当所述培养基包含5-15g/L酵母提取物、0-10g/L硫酸铵、20-40g/L碳、2g/L氯化物、4g/L硫酸镁、1.5mL/L微量元素溶液、0.3-2.0g/L磷酸盐、1mL/L维生素溶液和0.1g/L CaCl2时，所述培养基包含20g/L MSG。
通常，用于培养微生物的培养基是液体培养基。然而，用于培养微生物的培养基可以是固体培养基。除如本文所讨论的碳源和氮源之外，固体培养基可含有提供结构支撑和/或允许所述培养基呈固体形式的一种或多种组分(例如，琼脂和/或琼脂糖)。
微生物的培养可使用已知条件进行，例如，在国际公布号WO 2007/069078和WO2008/129358中描述的那些条件。例如，培养可进行1至30天、1至21天、1至15天、1至12天、1至9天或3至5天。任选地，培养在4℃至30℃之间的温度下进行。任选地，通过通气-振荡培养、振荡培养、静止培养、分批培养、连续培养、滚动分批培养、波动培养等进行培养。任选地，培养在培养基的溶解氧含量在1％与20％之间、在1％与10％之间或在1％与5％之间进行。
本文提供了制备脂质组合物的方法。所述方法包括在异养培养基中培养所提供的产生脂质的真核微生物以产生简单脂质分布并分离所述脂质组合物。任选地，所述产生脂质的真核微生物具有18S序列，其中所述18S序列与SEQ ID NO：1中列出的序列具有至少98％同一性，并且所述异养培养基产生具有包含长链脂肪酸(LCFA)的简单脂质分布的产生脂质的真核微生物。任选地，所述异养培养基含有少于3.75g/L氯化物。任选地，所培养的微生物的生物质生产率大于0.65g/L/h。任选地，所培养的微生物的甘油三酯生产率大于0.3g/L/h。任选地，所述异养培养基含有少于3.75g/L氯化物，并且所培养的微生物的生物质生产率大于0.65g/L/h，并且所培养的微生物的甘油三酯生产率大于0.3g/L/h。任选地，在制备脂质组合物的方法中使用的微生物的简单脂质分布包含大于3％的肉豆蔻酸酯(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、二十二碳五烯酸n-6(C22:5n-6，DPAn6)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3，DHA)中的每种。任选地，简单脂质分布包含少于3％的月桂酸(C12:0)、十五烷酸(C15:0)、棕榈油酸(C16:1)、十七烷酸(C17:0)、硬脂酸(C18:0)、异油酸(C18:1n-7)、油酸(C18:1n-9)、γ-亚麻酸(C18:3n-6)、α-亚麻酸(C18:3n-3)、十八碳四烯酸(C18:4)、花生酸(C20:0)、二高-γ-亚麻酸(C20:3n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6，ARA)、二十碳五烯酸(C20:5n-3，EPA)、山嵛酸(C22:0)、二十二碳四烯酸(C22:4)、二十二碳五烯酸n3(C22:5n-3，DPAn3)以及二十四烷酸(C24:0)中的每种。
任选地，在制备脂质组合物的方法中使用的微生物的简单脂质分布包含少于0.02％的短链脂肪酸。任选地，简单脂质分布在总脂肪酸中的甘油三酯中包含至少35％的C22:6n-3(DHA)。任选地，简单脂质分布在总脂肪酸中的甘油三酯中包含35％-40％、35％-45％、35％-50％、40％-45％、40％-50％或50％-60％的DHA。任选地，如本文所述的真核微生物产生至少20％蛋白质的生物质。任选地，所述生物质是至少20％至40％的蛋白质。任选地，所述生物质是至少约40％的蛋白质。任选地，如本文所述的真核微生物在总脂肪酸的甘油三酯中产生至少约10％的C22:6n-3(DHA)。任选地，根据所公开的方法使用的真核微生物在总脂肪酸的甘油三酯中产生至少30％、至少40％或至少30％-40％的棕榈酸。
任选地，真核微生物产生一种或多种类胡萝卜素。任选地，一种或多种类胡萝卜素包括β-胡萝卜素。任选地，β-胡萝卜素占所述微生物中产生的类胡萝卜素的至少95％、96％、97％、98％、99％或100％。
还提供了制备富含蛋白质的生物质的方法，所述方法包括在异养培养基中培养所提供的产生脂质的真核微生物并分离所述富含蛋白质的生物质。任选地，所述方法还包括将所述富含蛋白质的生物质掺入食品中。任选地，所述食品是宠物食品、牲畜饲料或水产养殖饲料。任选地，如在本发明方法中使用的真核微生物产生至少约20％蛋白质、至少约40％或至少约20％至40％蛋白质的生物质。任选地，真核微生物在总脂肪酸的甘油三酯中产生至少约10％的C22:6n-3(DHA)。
任选地，可将根据本文所述的方法产生的脂质掺入最终产品(例如，食物或饲料补充剂、婴儿配方食品、药物、燃料等)中。因此，提供了一种使用根据本文所述的方法制备的脂质组合物的方法，其中所述使用方法包括将所述脂质组合物掺入食品中。
此外，可将所提供的富含蛋白质的生物质掺入最终产品(例如，食物或饲料添加剂、生物燃料等)中。因此，提供了一种使用富含蛋白质的生物质的方法，所述方法包括将所述富含蛋白质的生物质掺入食品(例如，宠物食品、牲畜饲料或水产养殖饲料)中。
其中可并入脂质的合适的食物或饲料补充剂包括饮品诸如牛奶、水、运动饮料、能量饮料、茶、以及果汁；甜食诸如糖果、果冻和饼干；含脂肪的食物和饮品诸如乳制品；经加工的食物产品诸如软米(或粥)；婴儿配方食品；早餐谷物等。任选地，可将一种或多种所产生的脂质并入到膳食补充剂，例如像维生素或复合维生素中。任选地，根据本文所描述的方法产生的脂质可包含在膳食补充剂中，并且任选地可直接并入到食物或饲料(例如，食物补充剂)的组分中。
可将通过本文所描述的方法产生的脂质并入到其中的饲料的实例包括宠物食物，诸如猫食；狗食；用于水族箱鱼、养殖鱼或甲壳类动物等的饲料；用于农场饲养动物(包括牲畜和水产养殖的鱼类或甲壳类动物)的饲料。可将根据本文所描述的方法产生的脂质并入到其中的食物或饲料材料优选地对于作为预期接受者的生物是可口的。这种食物或饲料材料可具有对于食物材料当前已知的任何物理性质(例如固体、液体、柔软的)。
任选地，可将所产生的化合物(例如，PUFA)中的一种或多种并入到营养制品或药物产品中。这种营养制品或药物的实例包括各种类型的片剂、胶囊、可饮用剂等。任选地，所述营养制品或药物适合于局部应用。剂型可包括例如，胶囊、油、颗粒剂、浓缩细粒剂(granula subtilae)、散剂(pulveres)、片剂、丸剂、锭剂等。
可将根据本文所述的方法产生的油或脂质与多种其他剂中的任一种组合掺入产品中。例如，此类化合物可与一种或多种粘合剂或填充剂、螯合剂、色素、盐、表面活性剂、保湿剂、粘度调节剂、增稠剂、软化剂、芳香剂、防腐剂等或其任何组合进行组合。
公开了材料、组合物以及组分，所述材料、组合物以及组分可用于所公开的方法和组合物、可与所公开的方法和组合物结合使用、可用于制备所公开的组合物，或者是所公开的方法和组合物的产品。本文公开了这些和其他材料，并且应了解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，虽然可未明确公开这些化合物的每个不同个别和共同组合以及排列的特定提及，但是其各自在本文中具体地涵盖和描述。例如，如果公开并讨论了方法并且讨论了可对包括所述方法的多个分子进行的多种修改，除非明确地相反指示，否则明确涵盖了所述方法的每一种组合和排列以及可能的修改。同样地，也具体地涵盖并公开了这些分子的任何子集或组合。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可进行的多个附加步骤，则应理解，这些附加步骤中的每一个可与所公开的方法的方法步骤的任何具体方法步骤或组合一起进行，并且每种此类组合或组合的子集都具体地涵盖并应视为得到公开。
本文引用的出版物和引用它们的材料特此通过引用整体明确地并入。
以下实施例意图进一步说明本文所述的方法和组合物的某些方面，而非意图限制权利要求的范围。
实施例
实施例1.破囊壶菌样菌株G3-1的鉴定和初步分析。
在培养两天后，菌株G3-1显示显著生物质累积。相比之下，在所采用的条件下，其他破囊壶菌需要至少三天的孵育来实现相似水平的生物质累积。初步分析还表明，破囊壶菌样菌株G3-1能够累积高浓度的富含二十二碳六烯酸(DHA)和棕榈酸(C16:0)的油。由于用于人和动物营养，DHA是具有高价值的脂肪酸。当用作生物燃料生产的原料时，棕榈酸也具有价值。此外，考虑到动物营养的应用和水产养殖，特别是破囊壶菌样菌株G3-1已经显示蛋白质累积至构成其生物质干重的约30％的水平。由于这些性质，选择破囊壶菌样菌株G3-1来开发在短时间段内产生富含DHA、棕榈酸和蛋白质的生物质的方法。
实施例2.在两种培养基组合物中评价菌株G3-1。
为了评价破囊壶菌样菌株G3-1，将其在两种条件下培养：完全发酵(FF)培养基和基础(B)培养基。FF培养基是复合培养基，并且B培养基是用于分析和开发不同方法、菌株和条件的基本培养基。
FF对比B培养基中G3-1生产率的比较证明，生物质含量在B培养基中较高，其中G3-1产生多53％的生物质(表1)。由于较高的生物质累积，总脂肪酸(TFA)产量也基于体积增加49％。此外，基于干细胞重量，TFA产生也增加。在FF培养基中，脂肪酸构成289mg g-1生物质，而在B培养基中，这增加至312mg g-1生物质，增加8％(表1)。所获得的结果表明菌株G3-1可对FF培养基中施加高浓度葡萄糖的渗透压敏感。还分析了蛋白质含量，从而揭示至多30％的干细胞重量归因于蛋白质。
实验详情
生长和培养-通过将1mL含有纯菌株G3-1培养物的ASW或取自琼脂板的两个纯菌落环添加至150mL带挡板的爱伦美烧瓶中的30mL的B培养基等分试样中来产生种子培养物。将烧瓶在25℃和200rpm下孵育2天。在无菌条件下取得5mL种子培养物等分试样(先前用无菌新鲜B培养基调节至OD600nm＝1.5)并将其添加至500mL爱伦美烧瓶中的95mL无菌测试培养基中。使用B培养基(如上所述)和FF培养基评价用于这些烧瓶的测试培养基组成和培养条件，所述FF培养基由以下组成：60g L-1葡萄糖、2g L-1海盐、4g L-1大豆蛋白胨、1g L-1酵母提取物、4g L-1硫酸镁、2g L-1氯化钠、5mg L-1氯化铁、3mg L-1硫酸铜、2mg L-1钼酸钠、3mg L-1硫酸锌、2mg L-1氯化钴(II)、2mg L-1氯化锰、2mg L-1硫酸镍、1.6g L-1磷酸二氢钾、1.75g L-1磷酸氢二钾、6.8g L-1硫酸铵、0.1g L-1氯化钙脱水物、0.01g L-1钴胺素、0.01g L-1生物素和2g L-1硫胺盐酸盐。在发酵两天后，从每个烧瓶中取出肉汤样品，并通过在2℃以4150rpm离心20分钟来收获细胞。用蒸馏水冲洗团块以除去盐和残余底物，并且然后再次离心。将颗粒在-80℃冷冻，冷冻干燥并在-20℃下储存，然后进行生物质和脂肪酸分析。将冷冻干燥的细胞团块称重以确定菌株G3-1培养物的生物质，并报告为每单位体积培养基的细胞干重(gL-1)。进行直接一步酯交换方法以从冷冻干燥的生物质制备脂肪酸甲酯(FAME)来估计细胞内的油含量。图1证明培养基组成对G3-1的生物质和TFA产生具有显著影响(p＜0.05)。还参见表1。
表1.在液体培养基中菌株G3-1的生物质和TFA产生。
培养基 生物质(g L<sup>-1</sup>) TFA(g L<sup>-1</sup>)
完全发酵(FF) 6.9±0.3 2.0±0.1
基础(B) 13.1±0.3 4.1±0.3
此研究还证明，培养基组成能够改变由G3-1产生的油的脂肪酸分布(图2)。与FF培养基相比，当G3-1在B培养基中培养时，脂肪酸的组成略有变化。然而，当分别在FF和B培养基中培养时，DHA仍然以高浓度产生，G3-1产生总脂肪酸含量的47.1％和46.9％的DHA。参见表2。
表2.培养基组成对菌株G3-1的细胞内的油的脂肪酸分布的影响：基础(B)、完全发酵培养基(FF)。
脂肪酸 FF B FF B
mg/g mg/g ％ ％
C14:0 6.4±0.4 6.6±0.4 2.2±0.0 2.1±0.0
C15:0 2.3±0.1 47.1±0.7 0.8±0.1 15.1±0.9
C16:0 105.2±6.6 63.1±4.5 36.7±0.3 20.1±0.6
C17:0 1.0±0.1 9.5±0.1 0.4±0.0 3.0±0.1
C18:0 3.2±0.2 1.9±0.1 1.1±0.0 0.6±0.0
C20:4-6 1.2±0.3 2.2±0.1 0.4±0.1 0.7±0.0
EPA 1.1±0.3 0.8±0.0 0.4±0.1 0.3±0.0
C22:5 n-6 DPA 29.8±1.9 31.0±1.4 10.4±0.1 9.9±0.0
DHA 1134.9±9.4 146.9±7.4 47.1±0.2 46.9±0.3
TFA 285.1 309.1
为了分析菌株G3-1生物质的蛋白质含量，从文献中改编了热-TCA方法，并使用在第16小时和第22小时老化的G3-1培养物进行优化。评价了热-TCA条件的四种组合，并且所得蛋白质含量示于图3中。使用条件4，在G3-1中检测到超过30％的蛋白质含量，从而揭示这种菌株产生有意义量的蛋白质(即，＞40％)的潜力并且因此可充当部分鱼粉替代产品。
实施例3.破囊壶菌样菌株G3-1的增强的生物质产生和脂质累积的营养需求。
比较FF和B培养基的先前分析证明，G3-1的营养需求与其他破囊壶菌的营养需求不同。设计了一系列实验以更好地了解B培养基的哪些方面影响G3-1的生长和脂质产生。为此，应用了标准的析因设计实验方法，也称为Plackett-Burman。
结果表明，菌株G3-1的营养需求与其他破囊壶菌的营养需求不同，G3-1具有产生短链饱和脂肪酸(棕榈酸)和长链多不饱和脂肪酸(DHA)的能力，可能通过独立的途径(其是一种经典的延伸和去饱和途径加上独立的聚酮合酶途径)。它们还证明大豆蛋白胨和海盐一起对G3-1生产率具有显著影响。
实验详情。
使用不规则部分析因设计(2^4*3/4)来探讨四种独立变量B介质组分对生物质和脂肪酸产生的影响。在高(+1)和低(-1)浓度下测试独立变量(表3)。如表4所述，一式两份完成总计十二次实验运行。
表3.在不规则部分析因设计中使用的独立变量及其水平。
变量 编码Xi 编码水平
-1 +1
葡萄糖(g L<sup>-1</sup>) X1 20 40
大豆蛋白胨(g L<sup>-1</sup>) X2 4 20
酵母提取物(g L<sup>-1</sup>) X3 1 5
海盐(g L<sup>-1</sup>) X4 2 9
表4.不规则部分析因设计矩阵。
此实验证明，大豆蛋白胨浓度(X2)和大豆蛋白胨与海盐浓度之间的相互作用(X2*X4)对G3-1产生生物质的能力具有显著影响(p＜0.05)。此外，通过菌株G3-1累积的细胞内脂肪酸的量受大豆蛋白胨(X2)、酵母提取物(X3)和海盐浓度(X4)以及葡萄糖与海盐浓度之间的相互作用(X1*X4)显著影响(p＜0.05)。除影响生物质和脂质生产率外，脂肪酸分布也受所施加的变化的影响(图4)。一般而言，对于运行6、7、8和12的以下成分组合(表4中)，在此实验中通过G3-1细胞合成了大量的DHA、47.7％至51.0％的TFA。因此，G3-1具有容易地产生由＞50％DHA组成的生物质的代谢能力。同样重要的是，此系列实验鉴定了使得产生较低量饱和脂肪酸的条件，并且影响总体生产率(表5，图4)。选择用于在实验室规模上增加菌株G3-1的生物质产生、TFA产率和DHA的液体培养基的组成是20g L-1葡萄糖、20g L-1大豆蛋白胨、5g L-1酵母提取物和9g L-1海盐。这与先前描述的基础(B)培养基相同。
实施例4.实验室发酵罐中破囊壶菌样菌株G3-1的评价。
选择来自上述运行8的基础(B)培养基制剂来使用2L发酵罐进行发酵，以评价菌株G3-1产生富含DHA和棕榈酸的生物质的潜力。
在88小时发酵中，破囊壶菌样菌株G3-1产生了由67.3％TFA组成的51.8g L-1生物质。DHA和棕榈酸分别占TFA的38.8％和44.7％。TFA生产率是0.398g L-1hr-1，其超过公开的实施例>32％。
实验详情
将G3-1在含有500mL液体培养基(20g L-1葡萄糖、20g L-1大豆蛋白胨、5g L-1酵母提取物和9g L-1海盐)的爱伦美烧瓶中预培养。将烧瓶在25℃和200rpm的搅拌下孵育2天。在孵育期后，在2-L发酵容器中将200mL预培养物转移到1.8L相同培养基中。如下应用分批培养条件：25℃，在400rpm下开始搅拌并达到600rpm，在0.3VVM下用大气空气通气，以及pH6.8。以10-15小时的间隔收集细胞，并且检查生长、油(TFA)和DHA含量。
在20小时发酵后，培养基中的葡萄糖被完全消耗。补料分批培养共进行88小时。在65小时补料分批发酵后，G3-1产生了34.7g L-1生物质和77.1％的TFA。DHA(40.6％)和棕榈酸(42.7％)，其中在通过这种菌株产生的脂质中发现主要脂肪酸。在88小时发酵后，累积的总生物质是51.8g L-1。在发酵88小时结束时，干生物质、TFA和DHA分别测量为51.8g L-1、70％和38.8％。因此，对于这种发酵，总脂肪酸生产率是0.396g L-1h-1，并且DHA生产率是0.154g L-1h-1。表6和图5呈现在所描述的发酵条件下培养时G3-1的脂肪酸分布。作为最小工艺优化的起点，G3-1被认为是非常高的DHA生产菌株。
实施例5.通过使用改良的完全发酵培养基改进所述方法。
为了实现更高的生物质生产率，评估了改良的完全发酵(MFF)培养基对关于菌株G3-1的生物质和脂肪酸累积的影响。改良的发酵(MFF)培养基是与先前使用的培养基(即FF)相同的富含矿物质和维生素的复合培养基，除了葡萄糖从60g L-1减少至20g L-1以降低渗透压。进行2L补料分批发酵并监测生物质和脂肪酸含量的变化。在这115小时发酵中，破囊壶菌样菌株G3-1产生了由63.6％TFA组成的85.4g L-1生物质。DHA和棕榈酸分别占TFA的43.4％和41.0％。TFA生产率是0.471g L-1h-1，其超过公开的实施例>56％。
实验详情
使用改良的完全发酵培养基(MFF)在2-L发酵罐中培养菌株G3-1以增强生物质和脂肪酸产生。将G3-1在含有500mL所选择的基础培养基(20g L-1葡萄糖、20g L-1大豆蛋白胨、5g L-1酵母提取物和9g L-1海盐)的爱伦美烧瓶中预培养。将烧瓶在25℃和200rpm的搅拌下孵育2天。在孵育期后，将200mL预培养的细胞转移到1.8L的MFF培养基(20g L-1葡萄糖、2g L-1海盐、4g L-1大豆蛋白胨、1g L-1酵母提取物、4g L-1硫酸镁、2g L-1氯化钠、5mg L-1氯化铁、3mg L-1硫酸铜、2mg L-1钼酸钠、3mg L-1硫酸锌、2mg L-1氯化钴(II)、2mg L-1氯化锰、2mg L-1硫酸镍、1.6g L-1磷酸二氢钾、1.75g L-1磷酸氢二钾、6.8g L-1硫酸铵、0.1g L-1氯化钙脱水物、0.01g L-1钴胺素、0.01g L-1生物素和2g L-1硫胺盐酸盐)中，并且在25℃、在450rpm下开始搅拌并达到500rpm、在0.3VVM下用大气空气通气以及pH 6.8的条件下在2-L发酵罐中分批培养。以10-15小时的间隔收集细胞，并且测量生物质、TFA和DHA。培养基中的葡萄糖在发酵18-20小时后并且在那时完全消耗。然后将培养物分批添加75％(w/v)葡萄糖，直至发酵结束时第115.38小时。在发酵结束时(第115.38小时)，生物质、TFA和DHA测量为85.4g L-1、63.6％和43.4％DHA(表7，图6)。对于这种发酵，生物质、TFA和DHA的生产率分别是0.740g L-1h-1、0.471g L-1h-1和0.204g L-1h-1。在这些条件下获得的油的DHA含量高。
当使用MFF培养基在2-L发酵罐中培养G3-1时，生物质产生成功增强。然而，在115.38小时的补料分批发酵后，TFA达到生物质干重的63.6％。对这一点的可能解释是MFF比B培养基含有更少的大豆蛋白胨和海盐。在初始析因设计实验中发现重要的组分。
实施例6.氮限制对破囊壶菌样菌株G3-1的油累积的影响。
调节上述改良的完全发酵培养基(MFF)以使液体培养基中无机氮(呈硫酸铵的形式)的浓度降低50％。在2L发酵罐中培养菌株G3-1。监测葡萄糖消耗，并且当细胞显示饥饿迹象时，用75％(w/v)葡萄糖分批补料发酵。
在这112小时发酵中，破囊壶菌样菌株G3-1产生了由77.4％TFA组成的79.5g L-1生物质。DHA和棕榈酸分别占TFA的36.9％和48.2％。TFA生产率是0.548g L-1h-1，其超过公开的实施例>82％。
实验详情
按照先前描述的相同条件预培养G3-1。将200mL预培养的细胞转移至含有一半正常量的无机氮(2-L容器发酵罐)的1.8L MFF培养基中。使用3.4g L-1的硫酸铵配制培养基，并将所有其他成分保持在与先前描述的相同浓度下。培养条件是25℃、在480rpm下开始搅拌并在发酵过程中增加500rpm，用大气空气将通气保持在0.3VVM，并且保持pH 6.8。以10-15小时的间隔收集细胞，并且分析生物质、TFA和DHA含量。
图7示出在MFF培养基中使用一半浓度的硫酸铵加速了所用菌株的棕榈酸(C16:0)产生速率。在第40小时，氮耗尽。表8中的数据表明生物质和TFA两者继续在G3-1培养物中累积。同样显而易见的是，在氮限制后发生TFA分布的较小变化(图7)。
在此研究中，TFA从干细胞重量的18.3％增加至75.9％(最大)，因为在发酵过程中TFA棕榈酸的百分比从约45％增加至48％。在同一时期段，DHA从45％略微降低至36.9％(表8)。这对应于372.7mg g-1棕榈酸和285.3mg g-1DHA的生物合成。这两种脂肪酸的生产率是0.264g L-1h-1棕榈酸和0.202g L-1h-1DHA。所观察到的棕榈酸生物合成的增加并不出人意料，因为已知氮胁迫在负责棕榈酸产生的经典脂肪酸合成途径中诱导基因的表达。然而，令人欣慰地观察到，无论氮胁迫如何，DHA产生大致保持不变。
实施例7.破囊壶菌样菌株G3-1的分类学表征。
应用表征菌株G3-1的标准方法。使用Taq DNA聚合酶以及引物JBo119(5’-CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3’(SEQ ID NO：2))和JBo120(5’-TCACTACGGAAACCTTGTTACGAC-3’(SEQ ID NO：3))从G3-1基因组DNA扩增18S rDNA序列。50μl PCR反应物含有1.25单位TaqDNA聚合酶(New England Biolabs，M0273(IpSwich，MA))、1x标准反应缓冲液、200μM每种dNTP(A、G、C、T)、0.2μM的每种引物(JBo119和JBo120)以及3％DMSO。将这种PCR反应物在95℃下孵育4分钟，然后进行95℃30秒、52℃30秒和68℃1:45分钟的35个循环，随后在68℃下最终孵育30分钟，之后保持在4℃。将约1.7kb扩增子凝胶纯化，并且通过TA克隆将此扩增片段库克隆到pCR2.1载体中以产生质粒pJB84。分离10个pJB84单独克隆(#1、2、5、6、7、10、12、13、14和15)并送至Genewiz(South Plainfield，NJ)进行测序。每个克隆的18S rRNA序列在SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18和19中提供。每个克隆用总计8种引物进行测序：4种正向引物和4种反向引物。两种测序引物M13R和T7是通用引物，其结合位于TA克隆位点侧翼的载体序列并且由Genewiz提供。其他6种引物(包括用于扩增18S rDNA的JBo119和JBo120)在18S rDNA序列内结合，并基于先前报告的引物序列设计(Burja，A.M.，Radianingtyas，H.，Windust，A.，和Barrow，C.J.(2006).Isolation andcharacterization of polyunsaturated fatty acid producing Thraustochytriumspecies：screening of strains and optimization of omega-3production.Appl.Microbiol.Biotechnol.72，1161-1169；Mo，C.，J.，D.，和B.，R.(2002).Development of a PCRstrategy for thraustochytrid identification based on 18S rDNAsequence.Mar.Biol.140，883-889)。8种引物序列是：
M13R 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’(SEQ ID NO：4)(通用引物)
T75’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’(SEQ ID NO：5)(通用引物)
JBo1195’-CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3’(SEQ ID NO：2)(Burja等人2006)
JBo 1205’-TCACTACGGAAACCTTGTTACGAC-3’(SEQ ID NO：3)(Burja等人2006)
JBo1215’-GTCTGGTGCCAGCAGCCGCG-3’(SEQ ID NO：6)(Mo等人2002)
JBo1225’-CTTAAAGGAATTGACGGAAG-3’(SEQ ID NO：7)(Mo等人2002)
JBo1235’-AGCTTTTTAACTGCAACAAC-3’(SEQ ID NO：8)(Mo等人2002)
JBo1245’-GGCCATGCACCACCACCC-3’(SEQ ID NO：9)(Mo等人2002)
通过缺失含有N′(歧义核苷酸)的5′和3′序列来修整每个克隆的8种测序反应物，从而仅留下每个测序读数的成功部分。使用ChromasPro软件(Technelysium Pty Ltd，South Brisbane，Australia)将这些组装成每个克隆的单个重叠群。这些重叠群含有18SrDNA序列以及侧翼载体序列。从重叠群修整载体序列，从而仅留下通过JBo119和JBo120扩增的18S rDNA序列。由ChromasPro指示的任何歧义核苷酸都是手动确定的，但是存在非常少(如果这些中的任一种有的话)。在所有情况下，18S rDNA序列在其整个长度上被至少2个测序读数覆盖，但在其绝大部分长度上具有至少3个读数覆盖，＞3个读数覆盖一些较短的跨度。所有10个序列彼此至少98％相同。任一对克隆之间的最大变异性在#5和与#6之间，其是98.19％相同的。存在两对100％相同的克隆#1和7以及#12和13，并且这些相同的对彼此98.98％相同。产生了共有序列。基于10个单独测序的克隆的G3-118S rDNA共有序列在下文示出。使用标准IUPAC注释(A，腺嘌呤；C，胞嘧啶；G，鸟嘌呤；T，硫胺素；W，A或T；S，C或G；M，A或C；K，G或T；R，A或G；Y，C或T；B，不是A；D，不是C；H，不是G；V，不是T；N，任何核苷酸)手动策划简并核苷酸。
实施例8.破囊壶菌样菌株G3-1的类胡萝卜素表征。
进行了G3-1生物质和油的类胡萝卜素含量的分析。对来自三个单独2L发酵的生物质进行的类胡萝卜素分析证明，菌株G3-1合成并储存少量类胡萝卜素，其中β-胡萝卜素是主要组分(表9)。这与其中角黄素是主要类胡萝卜素的其他破囊壶菌形成对比，但与针对其他破囊壶菌样菌株公开的观察结果类似(Lee Chang等人，“Biodiscovery of NewAustralian Thraustochytrids for Production of Biodiesel and Long-Chain Omega-3Oils.”中)。
表9.破囊壶菌样菌株G3-1的类胡萝卜素含量的总结。
实验详情
为了分析类胡萝卜素，在冷却的丙酮：甲醇(1∶1v/v)存在下，使用小玻璃珠和珠搅拌器提取生物质两次，然后使用己烷进行两次提取。将合并的上清液在氮气下干燥与抗氧化剂(0.5％丁基化羟基苯甲醚(BHA)和丁基化羟基甲苯(BHT)一起重悬于丙酮中。使用Phenomenex 5μ Luna C18(2)柱在Agilent HPLC上进行分析。
总之，通过四个实验(其包括单个培养基优化和三个2L发酵)，鉴定了使生物质生产率从0.589g L-1h-1增加至0.740g L-1h-1的条件，并单独使TFA合成从0.396g L-1h-1增加至0.548g L-1h-1。这单独超过所公开的最佳TFA生产率(其是0.301g L-1h-1)＞80％。此外，在所产生的油中，DHA产生是0.202g L-1hr-1，并且棕榈酸是0.264g L-1h-1。分析表明，DHA生产率有利地与高度优化的基于破囊壶菌的方法比较，其当在用于产生高DHA油的条件下培养时可产生约0.3g L-1h-1。
实施例9.在具有谷氨酸一钠(MSG)作为确定的有机氮源的不同培养基制剂中鉴定用于G3-1生物质和脂质累积的关键培养基成分以及在这些条件下合成的G3-1脂质的脂肪酸分布的评价。
先前的实施例已经表明，G3-1需要复合氮源(大豆蛋白胨和酵母提取物)来生长和累积生物质。然而，大豆蛋白胨不仅是复合有机氮的昂贵来源，而且在培养基中使用高浓度的大豆蛋白胨来生长一些微藻菌株导致在微藻细胞的脂质部分中合成奇数链饱和脂肪酸(特别是C15:0和C17:0)。例如，当用于生长G3-1的基础培养基中存在20g大豆蛋白胨L-1时，G3-1细胞累积其总脂肪酸的15.1％为C15：0(实施例3)。为了降低G3-1培养基的成本并避免在G3-1细胞的脂质部分中具有奇数链饱和脂肪酸，使用Plackett-Burman实验设计来鉴定支持G3-1细胞增殖并且必须存在于大豆蛋白胨的使用已被MSG和酵母提取物替代的培养基中的关键成分。
实验详情
Plackett-Burman设计用于鉴定六种培养基成分对G3-1生物质和脂质累积的重要性。六种培养基成分(独立变量)在高(+)和低水平(-)下进行测试(表10)。如表11中所述，一式两份测试了具有不同成分组合的总计十二种不同的用于生长G3-1的培养基组合物。基于先前的实验并且为了有利于细胞增殖和脂质合成，对于测试的十二种培养基组合物中的每一种，葡萄糖和氯化钠(NaCl)的浓度分别保持在40g L-1和2。
按照表11中所示的成分组合制备95mL的每种测试的培养基，并用5mL的G3-1种子烧瓶等分试样接种。用于种子烧瓶的培养基的组成是20g葡萄糖L-1、30g酵母提取物L-1和9g海盐L-1。
表10.在Plackett-Burman设计中使用的独立变量及其水平。
表11.Plackett-Burman设计矩阵。
除了葡萄糖(40g L-1)、氯化钠(2g L-1)、酵母提取物和MSG外，必须添加至培养基以有利于G3-1细胞增殖的最重要的成分(p＜0.05)分别是：MgSO4·7H2O(X6)、微量元素(X4)和KH2PO4(X3)。使用具有至少1g酵母提取物L-1、1g MSG L-1、0.3g KH2PO4L-1、1.5mL L-1、4gMgSO4·7H2OL-1、40g葡萄糖L-1和2g NaCl L-1的培养基获得最高生物质累积(13.2±0.1g L-1)。FeCl3未显示对G3-1生物质累积的显著影响(p＞0.05)，因此它从培养基配方中消除以生长G3-1。
另一方面，通过使用Plackett-Burman设计测试的每种培养基的脂质累积数据的ANOVA显示MgSO4·7H2O(X6)、微量元素(X4)和KH2PO4(X3)对表示为总脂肪酸(TFA)的脂质累积具有积极显著影响(p＜0.05)。MSG对TFA浓度也具有统计上显著的影响，然而其对TFA的影响为负面，这意味着当培养基中MSG浓度较高时，G3-1合成较少脂质。这是预期的，因为低碳与氮比(C/N)影响G3-1细胞中的脂质生物合成。获得最高TFA(789mg g-1)的最佳培养基成分组合是：至少1g酵母提取物L-1、0.3g KH2PO4L-1、1.5mL微量元素L-1、4g MgSO4·7H2OL-1、40g葡萄糖L-1和2g NaCl L-1。除了影响生物质和TFA产生之外，脂肪酸分布还受通过使用Plackett-Burman设计测试的不同培养基组合物的影响(图8)。例如，Plackett-Burman设计矩阵(表12)的运行10、11和12的培养基制剂显示非常低的DHA含量：分别1、1.5和3.5；而C16:0含量(％)分别是87.5、82.9和80.9。用于运行10、11和12的培养基缺乏微量元素溶液，这种成分不仅是G3-1细胞增殖所需的，而且它必须被添加至培养基中以增强脂质生物合成并有利于具有更加平衡的脂肪酸分布的脂质的累积，如针对运行4和7获得的产油生物质(表12，图8)。
实施例10.复合氮源(酵母提取物)、简单有机氮源(MSG)和简单无机氮源(硫酸铵，(NH4)2SO4)对G3-1生物质累积的影响。
G3-1细胞显示在缺乏大豆蛋白胨、但分别具有MSG和酵母提取物作为简单和复合有机氮源的液体培养基中累积生物质的能力。本文件中描述的先前实施例已经证明G3-1需要高浓度的复合和简单有机氮以累积相当数量的生物质。在开发微藻发酵技术以产生诸如DHA、蛋白质、类胡萝卜素等的增值产品时，用于产生高浓度的产油G3-1生物质的培养基的配制和发酵策略的开发是必不可少的。
实验详情
在此实施例中，通过使用两级完全析因设计(23)测试了三种不同氮源(酵母提取物、MSG和(NH4)2SO4)对G3-1的生物质累积的影响。在高(+)和低水平(-)下测试三种氮源(独立变量)的浓度(表13)。如表14中所述，一式两份测试了具有酵母提取物、MSG和(NH4)2SO4的不同组合的总计八种不同的用于生长G3-1的培养基组合物。基于先前的实施例并且为了有利于细胞增殖，在所测试的八种培养基组合物的每种中，葡萄糖、NaCl、MgSO4·7H2O、微量元素溶液、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和维生素B溶液的浓度分别保持在40g L-1、2g L-1、4g L-1、1.5mL L-1、1.6g L-1、1.74g L-1、0.5mL L-1和1mL L-1。
按照表14中所示的成分组合制备95mL的每种测试的培养基，并用5mL的纯洗涤的G3-1培养物等分试样接种。
表13.在完全析因设计(23)中使用的独立变量及其水平。
表14.完全析因23设计矩阵和生物质结果。
生物质数据的ANOVA显示影响生物质累积的最具统计学意义(p＜0.05)的氮源是：MSG和酵母提取物。MSG与酵母提取物之间的相互作用也是显著的(p＜0.05)，这意味着G3-1细胞优先摄取MSG且然后开始使用酵母提取物作为氮源。当G3-1在具有15g酵母提取物L-1、20g MSG L-1和5g(NH4)2SO4L-1的培养基中生长时，获得该此实施例的最高生物质浓度(32.5±0.5g L-1)(运行4表14)。运行8也显示良好的生物质累积(30.7±0.4g L-1)，然而与运行4相比，这种培养基制剂需要多50％的(NH4)2SO4。
基于此实施例中描述的结果，用于运行4和8的培养基制剂分别命名为VU1和VU2，并且被选择用于开发发酵方法以获得两种不同的G3-1生物质产品：(1)在总脂肪酸中的甘油三酯中具有至少60％脂质和35％C22:6n-3(DHA)的产油生物质，以及(2)在整个藻类生物质中具有至少18％真蛋白质的生物质。真蛋白质表示为生物质样品中氨基酸浓度的总和。
实施例11.富含ω-3的产油生物质的产生。
选择VU1培养基制剂以使用30L发酵罐进行发酵来获得富含ω-3的产油生物质，并应用于水产饲料。在这116.5小时发酵中，G3-1产生了由66.2％TFA和8％真蛋白质组成的98.4g L-1生物质。DHA和棕榈酸分别占TFA的39.4％和46.1％。
实验详情
将G3-1在含有500mL种子烧瓶培养基(20g葡萄糖L-1、5g酵母提取物L-1、2g NaCl L-1、4g MgSO4L-1、3mg硫酸铜L-1、2mg钼酸钠L-1、3mg硫酸锌L-1、2mg氯化钴(II)L-1、2mg氯化锰L-1和2mg硫酸镍L-1)的爱伦美烧瓶中预培养。将烧瓶在25℃和200rpm的搅拌下孵育2天。在孵育期后，将1L的预培养的细胞转移到19L VU1培养基中。每升VU1培养基的组成是：15g酵母提取物、20g MSG、5g(NH4)2SO4、40g葡萄糖、2g NaCl、4g MgSO4、1.6g KH2PO4、1.75g K2HPO4、3mg硫酸铜、2mg钼酸钠、3mg硫酸锌、2mg氯化钴(II)、2mg氯化锰、2mg硫酸镍、0.1g氯化钙脱水物、0.01g钴胺素、0.01g生物素和2g盐酸硫胺素。在30L发酵罐中在以下条件下进行分批发酵：25℃，pH 6.8，在0.5VVM下用大气空气通气，在357rpm下开始搅拌并达到447rpm。以10-18小时的间隔收集细胞，并测量生物质、TFA、DHA和蛋白质。在发酵24小时后，培养基中的初始葡萄糖完全耗尽，并且然后在那时将培养物补料75％(w/v)葡萄糖，直至发酵结束时的第116.5小时。对于这种发酵，生物质、TFA和DHA的生产率分别是：0.84g L-1h-1、0.56g L- 1h-1和0.22g L-1h-1(表15，图9)。另一方面，发酵结束时的生物质具有8％的真蛋白质。
开发用于产生G3-1富含ω-3的产油生物质的发酵技术可在4.9天内容易地实现≥15g/L d的生物质生产率、66％脂质和>39％DHA。具有这种组成的生物质可用于在体内试验中喂养鱼类以评估其作为养殖鱼类的富含DHA的水产饲料产品的适合性。
实施例12.具有较高蛋白质含量的富含ω-3的微藻生物质的产生
选择VU2培养基制剂以使用30L发酵罐进行发酵来获得富含ω-3的高蛋白质生物质。具有高DHA和高蛋白质、但仍含有30％-45％脂质的生物质产品具有用作水产饲料产品的潜力。在这72小时发酵中，G3-1产生了由43.6％TFA、47.8％DHA、36.9％棕榈酸和18.6％真蛋白质组成的93.4g L-1生物质。
实验详情
将G3-1在含有500mL种子烧瓶培养基(20g葡萄糖L-1、5g酵母提取物L-1、2g NaCl L-1、4g MgSO4 L-1、3mg硫酸铜L-1、2mg钼酸钠L-1、3mg硫酸锌L-1、2mg氯化钴(II)L-1、2mg氯化锰L-1和2mg硫酸镍L-1)的爱伦美烧瓶中预培养。将烧瓶在25℃和200rpm的搅拌下孵育2天。在孵育期后，将1L的预培养的细胞转移到19L VU2培养基中。每升VU2培养基的组成是：15g酵母提取物、20g MSG、10g(NH4)2SO4、40g葡萄糖、2g NaCl、4g MgSO4、1.6g KH2PO4、1.75gK2HPO4、3mg硫酸铜、2mg钼酸钠、3mg硫酸锌、2mg氯化钴(II)、2mg氯化锰、2mg硫酸镍、0.1g氯化钙脱水物、0.01g钴胺素、0.01g生物素和2g盐酸硫胺素。在30L发酵罐中在以下条件下进行分批发酵：25℃，在0.5VVM下用大气空气通气，在357rpm下开始搅拌并达到370rpm。最后，通过使用氢氧化铵水溶液将培养物的pH保持在约6.2。以6-18小时的间隔收集细胞，并测量生物质、TFA、DHA和蛋白质。在发酵22小时后，培养基中的初始葡萄糖完全耗尽，并且然后在那时将培养物补料75％(w/v)葡萄糖，直至发酵结束时的第72小时。对于这种发酵，生物质、TFA和DHA的生产率分别是：1.3g L-1h-1、0.57g L-1h-1和0.27g L-1h-1(表16，图10)。
在此实施例中描述的发酵方法产生了G3-1生物质产品，所述生物质产品不仅富含ω-3DHA，而且与描述为富含ω-3的产油G3-1生物质的产品相比具有更高的蛋白质含量。在VU2培养基中生长G3-1并使用氢氧化铵水溶液来控制pH并且还将氮脉冲到容器中不仅改变了发酵液中的C/N比，而且有利于细胞中的氮代谢途径，其进而限制G3-1合成脂质的能力，从而提高G3-1蛋白质含量。通过遵循此实施例中描述的发酵技术，可在3天内容易地实现31.1g/L d的生物质生产率、43.6％脂质、＞47％DHA和18.6％真蛋白质。
实施例13.通过使用来自生物柴油生产的粗甘油产生低脂质以及DHA和EPA增强(表示为总脂肪酸的百分比)的G3-1生物质。
粗甘油用于培养产油微生物的潜在用途已经变得普及，主要是为了降低培养成本。同时，由于生物燃料的繁荣，将甘油作为生物柴油的副产物增值的需要日益增加。取决于原料和用于生产生物柴油的方法，粗甘油中存在的污染物变化。最常见的污染物是甲醇和皂，但也含有高盐度。因此，大量的粗甘油需要进行增值或归类为工业废物。粗甘油的高盐度对许多生物体具有不希望的影响，然而，它有利于海洋微藻的使用。旨在获得更高数量的增值代谢物，如PUFA、特别是EPA和DHA的基于粗甘油作为碳源的发酵方法是具有最高价值的方法(Abad和Turon，Mar.Drugs.13：7275(2015))。先前在海洋微藻发酵生物过程中使用粗甘油的努力集中于高浓度细胞内脂质的产生，然而，关于使用发酵过程来延迟产油微生物中的油累积、同时使用粗甘油作为碳源的信息很少。在此实施例中，将具有1120g甘油L-1的粗甘油原料与称为VU3的液体培养基制剂组合使用以在异养条件下生长G3-1。在这118.5小时发酵中，G3-1产生了由15.6％TFA、55％DHA、19.7％棕榈酸和4.1％EPA组成的61.7g L-1生物质。
实验详情
将G3-1在含有250mL种子烧瓶培养基(20g葡萄糖L-1、5g酵母提取物L-1、2g NaCl L-1、4g MgSO4 L-1、1g MSG L-1和3mg硫酸铜L-1、2mg钼酸钠L-1、3mg硫酸锌L-1、2mg氯化钴(II)L-1、2mg氯化锰L-1和2mg硫酸镍L-1)的爱伦美烧瓶中预培养。将烧瓶在25℃和200rpm的搅拌下孵育2天。在孵育期后，将0.14L的预培养的细胞转移到1.26L VU3培养基中。每升VU3培养基的组成是：2g酵母提取物、5g MSG、10g(NH4)2SO4、66g粗甘油、2g NaCl、4g MgSO4、1.6gKH2PO4、1.75g K2HPO4、3mg硫酸铜、2mg钼酸钠、3mg硫酸锌、2mg氯化钴(II)、2mg氯化锰、2mg硫酸镍、0.1g氯化钙脱水物、0.01g钴胺素、0.01g生物素和2g盐酸硫胺素。在2L发酵罐中在以下条件下进行分批发酵：25℃，在1VVM下用大气空气通气，在550rpm下开始搅拌并达到710rpm。在发酵的最初65.75小时期间，通过使用氢氧化铵水溶液将培养物的pH保持在约6.16-6.26。然后用5M NaOH交换氢氧化铵溶液以使pH保持在6.05左右直至发酵188.5小时。以6-18小时的间隔收集细胞，并且测量生物质、TFA、棕榈酸、DHA和EPA。在发酵40小时后，培养基中的初始葡萄糖完全耗尽，并且然后在那时将培养物补料1120g粗甘油L-1，直至发酵停止时的第188.5小时。在所述过程结束时，生物质和TFA的生产率是0.33g L-1h-1和0.05g L- 1h-1。另一方面，DHA和EPA含量(表示为TFA的％)是55％和4.1％。在先前的实施例中，当葡萄糖用作碳源时，G3-1显示出在其脂质部分中累积EPA的能力较差(其含量在TFA的0.5％至1％范围内)，但是在此实施例中描述的条件下，通过G3-1合成的EPA的量高3倍(表17，图11)。不良培养条件如液体培养基中的营养缺乏或毒性化合物刺激了破囊壶菌合成EPA。假设由破囊壶菌生物合成EPA和其他PUFA是提供抗氧化能力以在经受氧化应激时保护细胞(Ugalde等人，J.Appl.Phycol.(2017))。
在发酵的最初65.75小时期间，将74.5mL的氢氧化铵溶液脉冲到2L容器中。从65.75小时至188.5小时，将氢氧化铵溶液交换成NaOH 5M的溶液以将pH保持在约6.05并推动G3-1细胞累积脂质。如表17所示，呈氢氧化铵形式的脉冲氮有助于增加生物质含量，然而，将氢氧化铵溶液交换成NaOH 5M并保持发酵再运行五天不利于G3-1细胞中的脂质累积。G3-1细胞摄取呈氢氧化铵形式的氮，但似乎氢氧化铵的分解代谢干扰G3-1中的脂质生物合成途径。另一方面，不仅硫酸铵而且粗甘油用作碳原料可能具有应激的G3-1细胞。本实施例中使用的粗甘油含有0.8％甲醇和高盐度，这些杂质即使对于能够耐受高盐度环境的海洋微藻也充当胁迫因子。据报告，非生物胁迫经常引起氨基酸(其充当潜在的胁迫缓解剂)累积。除了作为蛋白质的构建块之外，氨基酸还充当含有N的分子如核酸、多胺、季铵化合物和一些激素的前体。在环境胁迫下，通常抑制从头蛋白质合成并且蛋白质转换和蛋白水解活性增加，从而导致总游离氨基酸增加。N和C代谢密切相关；N同化和氨基酸生物合成需要减少来自碳代谢的等效物(例如，葡萄糖、甘油等)和来自三羧酸(TCA)循环的C骨架(Chen等人，Biotechnol.Biofuels 10：153(2017))。在发酵结束时(例如，在188.5小时)，即使G3-1细胞消耗160.5g的粗甘油，G3-1细胞也累积了15.6％的细胞内脂质(表17)。似乎由粗甘油代谢产生的能量和C骨架不用于脂质累积，而是被重定向至G3-1细胞中的不同代谢途径。
序列表
<110> 玛拉可再生能源公司(Mara Renewables Corporation)
<120> 用于使用真核微生物产生富含DHA、棕榈酸和蛋白质的生物质的方法
<130> 095523-1065939-019WO1
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1770
<212> DNA
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gaagttcgag gcaataacag gtcngtgatg cccttagatg ntctgggccg cacgcgcgct 1440
acactgatgg gttcatcggg ttttnattnn anttnntgga attgagtgct tggtcggaag 1500
gcctggctaa tccttggaac gctcatcgng ctggggctag attttngcaa ttattaatct 1560
ccnacgagga attcctagta aacgcaagtc atcagcttgc attgaatacg tccctgccct 1620
ttgtacacan cgcccgtcgc acctaccgat tgaacggtcc gatgaaacca tgggatgntt 1680
ntgtttggat tnatttttng acanaggcag aactcgggtg aatcttattg tttagaggaa 1740
ggtgaagtcg taacaaggtt tccgtagtga 1770
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 2
caacctggtt gatcctgcca gta 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 3
tcactacgga aaccttgtta cgac 24
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 4
caggaaacag ctatgac 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 5
taatacgact cactataggg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 6
gtctggtgcc agcagccgcg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 7
cttaaaggaa ttgacggaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 8
agctttttaa ctgcaacaac 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 9
ggccatgcac caccaccc 18
<210> 10
<211> 1761
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 10
caacctggtt gatcctgcca gtagtcatat gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg 60
taagtataag cgattgtact gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt aataatttct 120
tcggtagttt cttttatatg gatacctgca gtaattctgg aaataataca tgctgtaaga 180
gccctgtatg gggctgcact tattagattg aagccgattt tattggtgaa tcatgataat 240
tgagcagatt gactttttag tcgatgaatc gtttgagttt ctgccccatc agttgtcgac 300
ggtagtgtat tggactacgg tgactataac gggtgacgga gagttagggc tcgactccgg 360
agagggagcc tgagagacgg ctaccatatc caaggatagc agcaggcgcg taaattaccc 420
actgtggact ccacgaggta gtgacgagaa atatcgatgc gaagcgtgta tgcgttttgc 480
tatcggaatg agagcaatgt aaaaccctca tcgaggatca actggagggc aagtctggtg 540
ccagcagccg cggtaattcc agctccagaa gcatatgcta aagttgttgc agttaaaaag 600
ctcgtagttg aatttctggc atgggcgacc ggtgctttcc ctgaatgggg attgattgtc 660
tgtgttgcct tggccatctt tttcttttct ttattgatga gaaatctttc actgtaatca 720
aagcagagtg ttccaagcag gtcgtatgac cggtatgttt attatgggat gataagatag 780
gacttgggtg ctattttgtt ggtttgcacg cctgagtaat ggttaatagg aacagttggg 840
ggtattcgta tttaggagct agaggtgaaa ttcttggatt tccgaaagac gaactagagc 900
gaaggcattt accaagcatg ttttcattaa tcaagaacga aagtctgggg atcgaagatg 960
attagatacc atcgtagtct agaccgtaaa cgatgccaac ttgcgattgt tgggtgcttt 1020
tttatgggcc tcagcagcag cacatgagaa atcaaagtct ttgggttccg gggggagtat 1080
ggtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga cggaagggca ccaccaggag tggagcctgc 1140
ggcttaattt gactcaacac gggaaaactt accaggtcca gacataggta ggattgacag 1200
attgagagct ctttcatgat tctatgggtg gtggtgcatg gccgttctta gttggtggag 1260
tgatttgtct ggttaattcc gttaacgaac gagacctcgg cctactaaat agtgcgtggt 1320
atggcaacat agtacgtttt aacttcttag agggacatgt ccggtttacg ggcaggaagt 1380
tcgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgctctg ggccgcacgc gcgctacact 1440
gatgggttca tcgggtttta atttcattat tggaattgag tgcttggtcg gaaggcctgg 1500
ctaatccttg gaacgctcat cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg 1560
aggaattcct agtaaacgca agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac 1620
acaccgcccg tcgcacctac cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gtttgtgttt 1680
ggattcattt ttggacatag gcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa 1740
gtcgtaacaa ggtttccgta g 1761
<210> 11
<211> 1764
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 11
aacctggttg atcctgccag tagtcatatg ctcgtctcaa agattaagcc atgcatgtgt 60
aagtataagc gattgtactg tgagactgcg aacggctcat tatatcagta ataatttctt 120
cggtagtttc ttttatatgg atacctgcag taattctgga aataatacat gctgtaagag 180
ccctgtatgg ggctgcactt attagattga agccgatttt attggtgaat catgataatt 240
gagcagattg actttttagt cgatgaatcg tttgagtttc tgccccatca gttgtcgacg 300
gtagtgtatt ggactacggt gactataacg ggtgacggag agttagggct cgactccgga 360
gagggagcct gagagacggc taccatatcc aaggatagca gcaggcgcgt aaattaccca 420
ctgtggactc cacgaggtag tgacgagaaa tatcgatgcg aagcgtgtat gcgttttgct 480
atcggaatga gagcaatgta aaaccctcat cgaggatcaa ctggagggca agtctggtgc 540
cagcagccgc ggtaattcca gctccagaag catatgctaa agttgttgca gttaaaaagc 600
tcgtagttga atttctggca tgggcgaccg gtgctttccc tgaatgggga tagattgtct 660
gtgttgcctt ggccatcttt ttcttttctt tttaggggag aaatctttca ctgtaatcaa 720
agcagagtgt tccaagcagg tcgtatgacc ggtatgttta ttatgggatg ataagatagg 780
acttgggtgc tattttgtcg gtttgcacgc ctgagtaatg gttaatagga acagttgggg 840
gtattcgtat ttaggagcta gaggtgaaat tcttggattt ccgaaagacg aactagagcg 900
aaggcattta ccaagcatgt tttcattaat caagaacgaa agtctgggga tcgaagatga 960
ttagatacca tcgtagtcta gaccgtaaac gatgccgact tgcgattgtt gggtgctttt 1020
ttatgggcct cagcagcagc acatgagaaa tcaaagtctt tgggttccgg ggggagtatg 1080
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gcttaatttg actcaacacg ggaaaactta ccaggtccag acataggtag gattgacaga 1200
ttgagagctc tttcatgatt ctatgggtgg tagtgcatgg ccgttcttag ttggtggagt 1260
gatttgtctg gttaattccg ttaacgaacg agacctcggc ctactaaata gtgcgtggta 1320
tggcaacata gtacgttttt acttcttaga gggacatgtc cggtttacgg gcaggaagtt 1380
cgaggcaata acaggtctgt gatgccctta gatgttctgg gccgcacgcg cgctacactg 1440
atgggttcat cgggttttga ttctatttta tggaattgag tgcttggtcg gaaggcctgg 1500
ctaatccttg gaacgctcat cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg 1560
aggaattcct agtaaacgca agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac 1620
acaccgcccg tcgcacctac cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gattctgttt 1680
ggattaattt ttggacagag gcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa 1740
gtcgtaacaa ggtttccgta gtga 1764
<210> 12
<211> 1765
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 12
caacctggtt gatcctgcca gtagtcatat gctcgtctca aagattaagc cgtgcatgtg 60
taagtataag cgattgtact gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt aataatttct 120
tcggtagctt cttttatatg gatacctgca gtaattctgg aaataataca tgctgtaaga 180
gccctgtatg gggctgcact tattagattg aagccgattt tattggtgaa tcatgataat 240
tgagcagatt gactattttt ggtcgatgaa tcgtttgagt ttctgcccca tcagttgtcg 300
acggtagtgt attggactac ggtgactata acgggtgacg gagagttagg gctcgactcc 360
ggagagggag cctgagagac ggctaccata tccaaggata gcagcaggcg cgtaaattac 420
ccactgtgga ctccacgagg tagtgacgag aaatatcgat gcgaagcgtg tatgcgtttt 480
gctatcggaa tgagagcaat gtaaaaccct catcgaggat caactggagg gcaagtctgg 540
tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccag aagcatatgc taaagttgtt gcagttaaaa 600
agctcgtagt tgaatttctg gcatgggcga ccggtgcttt ccctgaatgg ggattgattg 660
tctgtgttgc cttggccatc tttctcatgc tattttggta tgagatcttt cactgtaatc 720
aaagcagagt gttccaagca ggtcgtatga ccggtatgtt tattatggga tgataagata 780
ggacttgggt gctattttgt tggtttgcac gcctgagtaa tggttaatag gaacagttgg 840
gggtattcgt atttaggagc tagaggtgaa attcttggat ttccgaaaga cgaactagag 900
cgaaggcatt tacaaagcat gttttcatta atcaagaacg aaagtctggg gatcgaagat 960
gattagatac catcgtagtc tagaccgtaa acgatgccga cttgcgattg ttgggtgctt 1020
tttttatggg cctcagcagc ggcacatgag aaatcaaagt ctttgggttc cggggggagt 1080
atggtcgcaa ggctgaaact tgaaggaatt gacggaaggg cacaccagga gtggagcctg 1140
cggcttaatt tgactcaaca cgggaaaact taccaggtcc agacataggt aggattgaca 1200
gattgagagc tctttcatga ttctatgggt ggtggtgcat ggccgttctt agttggtgga 1260
gtgatttgtc tggttaattc cgttaacgaa cgagacctcg gcctactaaa tagtgcgtgg 1320
tatggcaaca tagtacgttt taacttctta gagggacatg tccggtttac gggcaggaag 1380
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tgatgggttc atcgggtttt aattctattt ttggaattga gtgcttggtc ggaaggcctg 1500
gctaatcctt ggaacgctca tcgtgctggg gctagatttt tgcaattatt aatctccaac 1560
gaggaattcc tagtaaacgc aagtcatcag cttgcattga atacgtccct gccctttgta 1620
cacatcgccc gtcgcaccta ccgattgaac ggtccgatga aaccatggga tgtttgtgtt 1680
tggattaatt tttggacaga ggcagaactc gggtgaatct tattgtttag aggaaggtga 1740
agtcgtaaca aggtttccgt agtga 1765
<210> 13
<211> 1767
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 13
caacctggtt gatcctgcca gtagtcatat gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg 60
taagtataag cgattgtact gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt aataatttct 120
tcggtagttt cttttatatg gatacctgca gtaattctgg aaataataca tgctgtaaga 180
gccctgtatg gggctgcact tattagattg aagccgattt tattggtgaa tcatgataat 240
tgagcagatt gactattttt gtcgatgaat cgtttgagtt tctgccccat cagttgtcga 300
cggtagtgta ttggactacg gtgactataa cgggtgacgg agagttaggg ctcgactccg 360
gagagggagc ctgagagacg gctaccatat ccaaggatag cagcaggcgc gtaaattacc 420
cactgtggac tccacgaggt agtgacgaga agtatcgatg cgaagcgtgt atgcgttttg 480
ctatcggaat gagagcaatg taaaaccctc atcgaggatc aactggaggg caagtctggt 540
gccagcagcc gcggtaattc cagctccgga agcatatgct aaagttgttg cagttaaaaa 600
gctcgtagtt gaatttctgg catgggcgac cggtgctttc cctgaatggg gatagattgt 660
ctgtgttgcc ttggccatct ttttcttttc tttattgatg agaaatcttt cactgtaatc 720
aaagcagagt gttccaagca ggtcgtatga ccggtatgtt tattatggga tgataagata 780
ggacttgggt gctattttgt tggtttgcac gcctgagtaa tggttaatag gaacagttgg 840
gggtattcgt atttaggagc tagaggtgaa attcttggat ttccgaaaga cgaactagag 900
cgaaggcatt taccaagcat gttctcatta atcaagaacg aaagtctggg gatcgaagat 960
gattagatac catcgtagtc tagaccgtaa acgatgccga cttgcgattg ttgggtgctt 1020
tattatatgg gcctcagcag cagcacatga gaaatcaaag tctttgggtt ccggggggag 1080
tatggtcgca aggctgaaac ttaaaggaat tgacggaagg gcaccaccag gagtggagcc 1140
tgcggcttaa tttgactcaa cacgggaaaa cttaccaggt ccagacatag gtaggattga 1200
cagattgaga gctctttcat gattctatgg gtggtggtgc atggcctttc ttagttggtg 1260
gagtgatttg tctggttaat tccgttaacg aacgagacct cggcctacta aatagtgcgt 1320
ggtatggcaa catagtgcgt ttttacttct tagagggaca tgtccggttt acgggcagga 1380
agttcgaggc aataacaggt ctgtgatgcc cttagatgtt ctgggccgca cgcgcgctac 1440
actgatgggt tcatcgggtt ttaatttcat ttttggaatt gagtgcttgg tcggaaggcc 1500
tggctaatcc ttggaacgct catcgtgctg gggctagatt ttcgcaatta ttaatctcca 1560
acgaggaatt cctagtaaac gcaagtcatc agcttgcatt gaatacgtcc ctgccctttg 1620
tacacaccgc ccgtcgcacc taccgattga acggtccgat gaaaccatgg gatgtttctg 1680
tttggattga tttttcgaca gaggcagaac tcgggtgaat cttattgttt agaggaaggt 1740
gaagtcgtaa caaggtttcc gtagtga 1767
<210> 14
<211> 1761
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifcial Sequence)
<400> 14
caacctggtt gatcctgcca gtagtcatat gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg 60
taagtataag cgattgtact gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt aataatttct 120
tcggtagttt cttttatatg gatacctgca gtaattctgg aaataataca tgctgtaaga 180
gccctgtatg gggctgcact tattagattg aagccgattt tattggtgaa tcatgataat 240
tgagcagatt gactttttag tcgatgaatc gtttgagttt ctgccccatc agttgtcgac 300
ggtagtgtat tggactacgg tgactataac gggtgacgga gagttagggc tcgactccgg 360
agagggagcc tgagagacgg ctaccatatc caaggatagc agcaggcgcg taaattaccc 420
actgtggact ccacgaggta gtgacgagaa atatcgatgc gaagcgtgta tgcgttttgc 480
tatcggaatg agagcaatgt aaaaccctca tcgaggatca actggagggc aagtctggtg 540
ccagcagccg cggtaattcc agctccagaa gcatatgcta aagttgttgc agttaaaaag 600
ctcgtagttg aatttctggc atgggcgacc ggtgctttcc ctgaatgggg attgattgtc 660
tgtgttgcct tggccatctt tttcttttct ttattgatga gaaatctttc actgtaatca 720
aagcagagtg ttccaagcag gtcgtatgac cggtatgttt attatgggat gataagatag 780
gacttgggtg ctattttgtt ggtttgcacg cctgagtaat ggttaatagg aacagttggg 840
ggtattcgta tttaggagct agaggtgaaa ttcttggatt tccgaaagac gaactagagc 900
gaaggcattt accaagcatg ttttcattaa tcaagaacga aagtctgggg atcgaagatg 960
attagatacc atcgtagtct agaccgtaaa cgatgccaac ttgcgattgt tgggtgcttt 1020
tttatgggcc tcagcagcag cacatgagaa atcaaagtct ttgggttccg gggggagtat 1080
ggtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga cggaagggca ccaccaggag tggagcctgc 1140
ggcttaattt gactcaacac gggaaaactt accaggtcca gacataggta ggattgacag 1200
attgagagct ctttcatgat tctatgggtg gtggtgcatg gccgttctta gttggtggag 1260
tgatttgtct ggttaattcc gttaacgaac gagacctcgg cctactaaat agtgcgtggt 1320
atggcaacat agtacgtttt aacttcttag agggacatgt ccggtttacg ggcaggaagt 1380
tcgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgctctg ggccgcacgc gcgctacact 1440
gatgggttca tcgggtttta atttcattat tggaattgag tgcttggtcg gaaggcctgg 1500
ctaatccttg gaacgctcat cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg 1560
aggaattcct agtaaacgca agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac 1620
acaccgcccg tcgcacctac cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gtttgtgttt 1680
ggattcattt ttggacatag gcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa 1740
gtcgtaacaa ggtttccgta g 1761
<210> 15
<211> 1767
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 15
caacctggtt gatccgccag tagtcatatg ctcgtctcaa agattaagcc atgcatgtgt 60
aagtataagc gattgtactg tgagactgcg aacggctcat tatatcagta ataatttctt 120
cggtaatttc ttttatatgg atacctgcag taattctgga aataatacat gctgtaagag 180
ccctgtatgg ggctgcactt attagattga agccgatttt attggtgaat catgataatt 240
gagcagattg acttttttgg tcgatgaatc gtttgagttt ctgccccatc agttgtcgac 300
ggtagtgtat tggactacgg tgactataac gggtgacgga gagttagggc tcgactccgg 360
agagggagcc tgagagacgg ctaccatatc caaggatagc agcaggcgcg taaattaccc 420
actgtggact ccacgaggta gtgacgagaa acatcgatgc gaagcgtgta tgcgttttgc 480
tatcggaatg agaacaatgt aaaaccctca tcgaggatca actggagggc aagtctggtg 540
ccagcagccg cggtaattcc agctccagaa gcatatgcta aagttgttgc agttaaaaag 600
ctcgtagttg aatttctggc atgggcgacc ggtgctttcc ctgaatgggg attgattgtc 660
tgtgttgcct tggccatctt tctcatgctg ttattggtat gagatctttc actgtaatca 720
aagcagagtg ttccaagcag gtcgtatgac cggtatgttt attatgggat gataagatag 780
gacttgggtg ctattttgtt ggtttgcacg cctgagtaat ggttaatagg aacagttggg 840
ggtattcgta tttaggagct agaggtgaaa ttcttggatt tccgaaagac gaactagagc 900
gaaggcattt accaagcatg ttttcattaa tcaagaacga aagtctgggg atcgaagatg 960
attagatacc atcgtagtct agaccgtaaa cgatgccgac ttgcgattgt tgggtgcttt 1020
tttgtatggg cctcagcagc agcacatgag aaatcaaagt ctttgggttc cggggggagt 1080
atggtcgcaa ggctgaaact taaaggaatt gacggaaggg caccaccagg agtggagcct 1140
gcggcttaat ttgactcaac acgggaaaac ttaccaggtc cagacatagg taggattgac 1200
agattgagag ctctttcatg attctatggg tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg 1260
agtgatttgt ctggttaatt ccgttaacga acgagacctc ggcctactaa atagtgcgtg 1320
gtatggcaac atagtacgtt ttaacttctt agagggacat gtccggttta cgggcaggaa 1380
gttcgaggca ataacaggtc tgtgatgccc ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca 1440
ctgatgggtt catcgggttt taattctaat ttttggaatt gagtgcttgg tcggaaggcc 1500
tggctaatcc ttggaacgct catcgcgctg gggctagatt tttgcaatta ttaatctcca 1560
acgaggaatt cctagtaaac gcaagtcatc agcttgcatt gaatacgtcc ctgccctttg 1620
tacacaccgc ccgtcgcacc taccgattga acggtccgat gaaaccatgg gatgtttctg 1680
tttggattca tttttggaca gaggcagaac tcgggtgaat cttattgttt agaggaaggt 1740
gaagtcgtaa caaggtttcc gtagtga 1767
<210> 16
<211> 1765
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 16
caacctggtt gatcctgcca gtagtcatat gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg 60
taagtataag cgattgtact gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt aataatttct 120
tcggtagttt cttttatatg gatacctgca gtaattctgg aaataataca tgctgtaaga 180
gccctatatg gggctgcact tattagattg aagccgattt tattggtgaa tcatgataat 240
tgagcagatt gactttttag tcgatgaatc gtttgagttt ctgccccatc agttgtcgac 300
ggtagtgtat tggactacgg tgactataac gggtgacgga gagttagggc tcgactccgg 360
agagggagcc tgagagacgg ctaccatatc caaggatagc agcaggcgcg taaattaccc 420
actgtggact ccacgaggta gtgacgagaa atatcgatgc gaagcgtgta tgcgttttgc 480
tatcggaatg agagcaatgt aaaaccctca tcgaggatca actggagggc aagtctggtg 540
ccagcagccg cggtaattcc agctccagaa gcatatgcta aagttgttgc agttaaaaag 600
ctcgtagttg aatttctggc atgggcgacc ggtgctttcc ctgaatgggg attgattgtc 660
tgtgttgcct tggccatctt tttcttttct ttttagggga gaaatctttc actgtaatca 720
aagcagagtg ttccaagcag gtcgtatgac cggtatgttt attatgggat gataagatag 780
gacttgggtg ctattttgtt ggtttgcacg cctgagtaat ggttaatagg aacagttggg 840
ggtattcgta tttaggagct agaggtgaaa ttcttggatt tccgaaagac gaactagagc 900
gaaggcattt accaagcatg ttttcattaa tcaagaacga aagtctgggg atcgaagatg 960
attagatacc atcgtagtct agaccgtaaa cgatgccgac ttgcgattgt tgggtgcttt 1020
tttatgggcc tcagcagcag cacatgagag atcaaagtct ttgggttccg gggggagtat 1080
ggtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga cggaagggca ccaccaggag tggagcctgc 1140
ggcttaattt gactcaacac gggaaaactt accaggtcca gacataggta ggattgacag 1200
attgagagct ctttcatgat tctatgggtg gtggtgcatg gccgttctta gttggtggag 1260
tgatttgtct ggttaattcc gttaacgaac gagacctcgg cctactaaat agtgcgtggt 1320
atggcaacat agtacgtttt tacttcttag agggacatgt ccggtttacg ggcaggaagt 1380
tcgaggcaat aacaggtccg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc gcgctacact 1440
gatgggttca tcgggttttg attctatttt atggaattga gtgcttggtc ggaaggcctg 1500
gctaatcctt ggaacgctca tcgtgctggg gctagatttt tgcaattatt aatctccaac 1560
gaggaattcc tagtaaacgc aagtcatcag cttgcattga atacgtccct gccctttgta 1620
cacaccgccc gtcgcaccta ccgattgaac ggtccgatga aaccatggga tgtttctgtt 1680
tggattaatt tttggacaga ggcagaactc gggtgaatct tattgtttag aggaaggtga 1740
agtcgtaaca aggtttccgt agtga 1765
<210> 17
<211> 1765
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 17
caacctggtt gatcctgcca gtagtcatat gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg 60
taagtataag cgattgtact gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt aataatttct 120
tcggtagttt cttttatatg gatacctgca gtaattctgg aaataataca tgctgtaaga 180
gccctatatg gggctgcact tattagattg aagccgattt tattggtgaa tcatgataat 240
tgagcagatt gactttttag tcgatgaatc gtttgagttt ctgccccatc agttgtcgac 300
ggtagtgtat tggactacgg tgactataac gggtgacgga gagttagggc tcgactccgg 360
agagggagcc tgagagacgg ctaccatatc caaggatagc agcaggcgcg taaattaccc 420
actgtggact ccacgaggta gtgacgagaa atatcgatgc gaagcgtgta tgcgttttgc 480
tatcggaatg agagcaatgt aaaaccctca tcgaggatca actggagggc aagtctggtg 540
ccagcagccg cggtaattcc agctccagaa gcatatgcta aagttgttgc agttaaaaag 600
ctcgtagttg aatttctggc atgggcgacc ggtgctttcc ctgaatgggg attgattgtc 660
tgtgttgcct tggccatctt tttcttttct ttttagggga gaaatctttc actgtaatca 720
aagcagagtg ttccaagcag gtcgtatgac cggtatgttt attatgggat gataagatag 780
gacttgggtg ctattttgtt ggtttgcacg cctgagtaat ggttaatagg aacagttggg 840
ggtattcgta tttaggagct agaggtgaaa ttcttggatt tccgaaagac gaactagagc 900
gaaggcattt accaagcatg ttttcattaa tcaagaacga aagtctgggg atcgaagatg 960
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tgatttgtct ggttaattcc gttaacgaac gagacctcgg cctactaaat agtgcgtggt 1320
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agtcgtaaca aggtttccgt agtga 1765
<210> 18
<211> 1767
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 18
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<210> 19
<211> 1769
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成构建体
<400> 19
caacctggtt gatcctgcca gtagtcatat gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg 60
taagtataag cgattgtact gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt aataattact 120
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gtgaagtcgt aacaaggttt ccgtagtga 1769

Claims (36)

1.一种培养物，其包含：
(a)具有18S序列的产生脂质的真核微生物，其中所述18S序列与SEQ ID NO:1中列出的序列具有至少98％同一性，以及
(b)异养培养基，所述异养培养基产生具有包含长链脂肪酸(LCFA)的简单脂质分布的产生脂质的真核微生物。
2.如权利要求1所述的培养物，其中所述简单脂质分布包含甘油三酯，并且其中大于95％的所述甘油三酯由肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、二十二碳五烯酸n-6(C22:5n-6，DPAn6)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3，DHA))组成。
3.如权利要求1或2所述的培养物，其中所述简单脂质分布包含少于3％的月桂酸(C12:0)、十五烷酸(C15:0)、棕榈油酸(C16:1)、十七烷酸(C17:0)、硬脂酸(C18:0)、异油酸(C18:1n-7)、油酸(C18:1n-9)、γ-亚麻酸(C18:3n-6)、α-亚麻酸(C18:3n-3)、十八碳四烯酸(C18:4)、花生酸(C20:0)、二高-γ-亚麻酸(C20:3n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6，ARA)、二十碳五烯酸(C20:5n-3，EPA)、山嵛酸(C22:0)、二十二碳四烯酸(C22:4)、二十二碳五烯酸n3(C22:5n-3，DPAn3)以及二十四烷酸(C24:0)中的每种。
4.如权利要求1-3中任一项所述的培养物，其中所述简单脂质分布包含少于0.02％的短链脂肪酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的培养物，其中所述简单脂质分布在总脂肪酸中的所述甘油三酯中包含至少35％的C22:6n-3(DHA)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的培养物，其中所述异养培养基使得在整个藻类生物质中产生至少20％的蛋白质。
7.如权利要求6所述的培养物，其中所述异养培养基使得产生所述生物质的至少20％至40％的蛋白质。
8.如权利要求7所述的培养物，其中所述异养培养基使得产生至少约40％的蛋白质。
9.如权利要求7所述的培养物，其中所述异养培养基进一步使得产生至少约10％C22:6n-3(DHA)。
10.如权利要求1-9中任一项所述的培养物，其中所述异养培养基使得产生至少30％棕榈酸。
11.如权利要求10所述的培养物，其中所述异养培养基使得产生至少40％棕榈酸。
12.如权利要求1-9中任一项所述的培养物，其中所述异养培养基使得产生一种或多种类胡萝卜素。
13.如权利要求12所述的培养物，其中所述一种或多种类胡萝卜素包括β-胡萝卜素，并且其中所述β-胡萝卜素占总类胡萝卜素的至少95％。
14.一种真核微生物，其在异养培养基中具有包含长链脂肪酸(LCFA)的简单脂质分布。
15.如权利要求14所述的真核微生物，其中所述简单脂质分布包含大于3％的肉豆蔻酸酯(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、二十二碳五烯酸n-6(C22:5n-6，DPAn6)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3，DHA)中的每种。
16.如权利要求14或15所述的真核微生物，其中所述简单脂质分布包含少于3％的月桂酸(C12:0)、十五烷酸(C15:0)、棕榈油酸(C16:1)、十七烷酸(C17:0)、硬脂酸(C18:0)、异油酸(C18:1n-7)、油酸(C18:1n-9)、γ-亚麻酸(C18:3n-6)、α-亚麻酸(C18:3n-3)、十八碳四烯酸(C18:4)、花生酸(C20:0)、二高-γ-亚麻酸(C20:3n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6，ARA)、二十碳五烯酸(C20:5n-3，EPA)、山嵛酸(C22:0)、二十二碳四烯酸(C22:4)、二十二碳五烯酸n3(C22:5n-3，DPAn3)以及二十四烷酸(C24:0)中的每种。
17.如权利要求14-16中任一项所述的真核微生物，其中所述简单脂质分布包含少于0.02％的短链脂肪酸。
18.如权利要求15-17中任一项所述的真核微生物，其中所述简单脂质分布在总脂肪酸中的所述甘油三酯中包含至少35％的C22:6n-3(DHA)。
19.如权利要求15-18中任一项所述的真核微生物，其中所述真核微生物产生至少20％蛋白质的生物质。
20.如权利要求19所述的真核微生物，其中所述生物质是至少20％至40％的蛋白质。
21.如权利要求20所述的真核微生物，其中所述生物质是至少约40％的蛋白质。
22.如权利要求21所述的真核微生物，其中所述真核微生物在所述总脂肪酸的所述甘油三酯中产生至少约10％的C22:6n-3(DHA)。
23.如权利要求14-22中任一项所述的真核微生物，其中所述真核微生物在所述总脂肪酸的所述甘油三酯中产生至少30％的棕榈酸。
24.如权利要求23所述的真核微生物，其中所述真核微生物在所述总脂肪酸的所述甘油三酯中产生至少40％的棕榈酸。
25.如权利要求14-24中任一项所述的真核微生物，其中所述真核微生物产生一种或多种类胡萝卜素。
26.如权利要求25所述的真核微生物，其中所述一种或多种类胡萝卜素包括β-胡萝卜素，并且其中所述β-胡萝卜素占所述类胡萝卜素的至少95％。
27.一种真核微生物，其具有IDAC登录号220716-01。
28.一种制备脂质组合物的方法，所述方法包括：
(a)在异养培养基中培养如权利要求14-27中任一项所述的真核微生物以产生至少35％的DHA，
(b)以及分离所述脂质组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述异养培养基含有少于3.75g/L的氯化物。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述培养的微生物的生物质生产率大于0.65g/L/h。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述培养的微生物的甘油三酯生产率大于0.3g/L/h。
32.一种使用如权利要求28所述的脂质组合物的方法，所述方法包括将所述脂质组合物掺入食品中。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述食品是宠物食品、牲畜饲料或水产养殖饲料。
34.一种制备富含蛋白质的生物质的方法，所述方法包括：
(a)在异养培养基中培养如权利要求14至27中任一项所述的微生物，以及
(b)分离所述富含蛋白质的生物质。
35.如权利要求34所述的方法，其还包括将所述富含蛋白质的生物质掺入食品中。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述食品是宠物食品、牲畜饲料或水产养殖饲料。
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