KR20100051061A

KR20100051061A - 신규 지방산 조성을 갖는 지방산 조성물

Info

Publication number: KR20100051061A
Application number: KR1020107002907A
Authority: KR
Inventors: 미사 오치아이
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2007-07-23
Filing date: 2008-07-23
Publication date: 2010-05-14
Also published as: DK2182071T3; EP2182071A1; AU2008280929B2; CA2707372A1; RU2496881C2; BRPI0813547A2; JPWO2009014140A1; CN101578372B; KR101519680B1; CA2707372C; US8551744B2; WO2009014140A1; AU2008280929A1; EP2182071A4; CN101578372A; EP2182071B1; JP5346290B2; US20100323085A1; RU2010106157A

Abstract

본 발명의 목적은, 종래와는 다른 지방산 조성인 지방산 조성물을 제공하는 것이다. 상기 과제는, 본 발명의 서열 번호 1의 염기 서열 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 또는 이들과 동등한 기능을 갖는 변이체를 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼v):
i) 올레산 함유량
ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,
iii) 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율
iv) 팔미트산 함유량 및 팔미톨레산의 합계 함유량에 대한 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율, 및
v) n-6계 지방산 함유량
중 적어도 하나 이상이, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물에 의해 해결된다.

Description

신규 지방산 조성을 갖는 지방산 조성물{FATTY ACID COMPOSITIONS HAVING NOVEL FATTY ACID RATE}

본 명세서는, 2007년 7월 23일에 출원된 일본 특허 출원 제2007-190680호에 기초하는 우선권을 주장한다.

본 발명은, 본 발명의 서열 번호 1의 염기 서열 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 또는 이들과 동등한 기능을 갖는 변이체를 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼v):

i) 올레산 함유량,

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

iii) 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

iv) 팔미트산 함유량 및 팔미톨레산의 합계 함유량에 대한 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율, 및

v) n-6계 지방산 함유량

중 적어도 하나 이상이, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물에 관한 것이다.

지방산은, 인지질이나 트리아실글리세롤 등 지질을 구성하는 중요한 성분이다. 그 중, 불포화 결합을 2곳 이상 함유하는 고도 불포화 지방산(PUFA)인 아라키돈산이나 디호모-γ-리놀렌산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 등은 다양한 생리 활성이 보고되어 있다(비특허 문헌 1). 이 고도 불포화 지방산은 다양한 분야에서의 이용이 기대되고 있고, 그 지방산을 효율적으로 취득하기 위해, 다양한 미생물을 배양하여 고도 불포화 지방산을 획득하는 방법이 개발되어 왔다. 또, 식물에서 고도 불포화 지방산을 생성하는 시도도 이루어지고 있다. 이와 같은 경우, 고도 불포화 지방산은, 예를 들어 트리아실글리세롤 등의 저장 지질의 구성 성분으로서, 미생물의 균체내 또는 식물 종자 중에 축적되는 것이 알려져 있다.

이 트리아실글리세롤은, 생체내에서, 글리세롤-3-인산을 출발 물질로 하여, 리소포스파티드산으로부터, 포스파티드산, 디아실글리세롤을 거쳐 생성된다.

상기와 같이, 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid: 이하, 본 명세서에서 「LPA」 또는 「1-아실글리세롤-3-인산」으로 기재하는 경우도 있다)이 아실화되어 포스파티드산(phosphatidic acid: 이하, 본 명세서에서 「PA」 또는 「1,2-디아실-sn-글리세롤-3-인산」로 기재하는 경우도 있다)을 생성하는 반응에는, 리소포스파티드산아실기 전이 효소(이하, 「LPAAT」로 기재하는 경우도 있다)가 개재하는 것이 알려져 있다.

이 LPAAT는, 1-아실글리세롤-3-인산아실 트랜스퍼라아제(E.C. 2.3.1.51)로서도 알려져 있고, 그 유전자는 지금까지 몇 가지 생물에서 보고되어 있다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 유래의 LPAAT 유전자로서 plsC 유전자가 클론화되어 있고(비특허 문헌 2), 진균에서는, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 SLC1 유전자가 클론화되어 있다(비특허 문헌 3). 또, 동물이나 식물로부터도 클론화되어 있다(특허 문헌 1).

지질 생산균인 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)(이하, 「엠. 알피나(M. alpina)」로 기재하는 경우도 있다)의 LPAAT 유전자로는, 2종류의 호몰로그가 보고되어 있다(특허 문헌 2 및 특허 문헌 3).

그 중, 특허 문헌 2에는 엠. 알피나 유래의, CDS의 염기수가 1254개인 서열 번호 16으로 표시된 염기 서열로 이루어진 유전자인 LPAAT 호몰로그(LPAAT1)를 클로닝한 것이 기재되어 있다. 또, 본 문헌에는, 이 LPAAT1을 효모에서 Δ6 불포화화 효소 및 Δ6쇄장 연장 효소와 함께 발현시켜, 특정한 지방산을 첨가한 배지에서 배양한 결과, 첨가한 지방산보다 쇄길이가 긴 지방산이나 불포화도가 높은 지방산이 LPAAT1을 발현시키지 않은 주에 비하여 많이 생성된 것이 보고되어 있다(특허 문헌 2).

국제특허출원팜플렛WO2004/076617호 미국특허출원공개제2006/174376호 미국특허출원공개제2006/0094090호

Lipids, 39, 1147 (2004) Mol. Gen. Genet., 232, 295-303, 1992 J.B.C., 268, 22156-22163, 1993 Biochemical Society Transactions, 28, 707-709, 2000 J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998 J. Bacteriology, 173, 2026-2034, 1991

그러나, 지금까지 보고되어 있는 LPAAT 유전자는, 숙주 세포에 도입하여 발현시키더라도, 그 기질 특이성에 의해, 숙주가 생성하는 지방산 조성물은 한정되어 있다. 따라서, 지금까지와는 다른 조성의 지방산 조성물을 생성할 수 있는 유전자를 확인하는 것이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은, 유지나 식품 등을 제조하기에 유용한 지방산 조성을 갖는 지방산 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구하였다. 우선, 지질 생성균 모르티에렐라 알피나 유래의 LPAAT1-long이라는 유전자를 단리하고, 효모 등의 고증식능을 갖는 숙주 세포에 도입하여 지방산 조성물을 생성해서, 공지의 LPAAT와는 상이한 지방산 조성물을 생성하는 것에 성공하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 이하의 (a)∼(e):

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;

(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;

(c) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;

(d) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물:

i) 올레산 함유량,

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

iii) 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

v) n-6계 지방산 함유량.

또, 본원 발명의 지방산 조성물은, 이하의 (a)∼(e):

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열;

(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 염기 서열;

(c) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어진 염기 서열;

(d) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열;

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 염기 서열

중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물이어도 된다.

(2) 상기 핵산이, 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 것인 (1)에 기재된 지방산 조성물:

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;

(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 1×SSC, 60℃의 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;

(c) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열.

(3) 상기 핵산이 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 염기 서열을 포함하는 것인 (1)에 기재된 지방산 조성물:

(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열;

(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열.

(4) n-6계 지방산이 리놀산, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산(DGLA) 및 아라키돈산으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 지방산인 (1)에 기재된 지방산 조성물.

(5) 이하의 (a)∼(e):

중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물로부터, 이하의 i)∼v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 하는 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물의 제조 방법:

i) 올레산 함유량,

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

iii) 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

v) n-6계 지방산 함유량.

(6) n-6계 지방산이 리놀산, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산 및 아라키돈산으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 지방산인 (5)에 기재된 제조 방법.

(7) 상기 핵산이 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 것인 (5) 또는 (6)에 기재된 제조 방법:

(8) (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 지방산 조성물을 제조하기 위한 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 것인 핵산의 용도:

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열.

(9) 상기 핵산이 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 것인 (8)에 기재된 용도:

(10) (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 지방산 조성물을 포함하는 식품.

본 발명의 LPAAT1-long은, 공지의 LPAAT1과는 기질 특이성이 상이하고, 공지의 LPAAT1가 발현된 숙주가 생성하는 지방산 조성물과는 조성이 상이한 지방산 조성물을 숙주 중에 생성할 수 있다. 이것에 의해, 원하는 특성이나 효과를 갖는 지질을 제공할 수 있기 때문에, 식품, 화장료, 의약품, 비누 등에 적용할 수 있는 것으로서 유용하다.

본 발명의 LPAAT1-long이 발현된 숙주 세포내의 아라키돈산 함유율은, 본 발명의 LPAAT1-long이 발현되지 않은 숙주 세포내의 아라키돈산 함유율보다 높고, 그 세포의 배양물로부터 얻어지는 지방산 조성물은, 영양학적으로도 보다 높은 효과를 기대할 수 있기 때문에 바람직하다.

또, 본 발명의 LPAAT는 지방산이나 저장 지질의 생성능의 향상을 도모할 수 있기 때문에, 미생물이나 식물 중에서의 고도 불포화 지방산의 생산성을 향상시키는 것으로서 바람직하다.

도 1은, 본 발명의 LPAAT1-long 및 LPAAT1-short 및 LPAAT1의 CDS의 염기 서열을 비교한 도면이다.
도 2는, 본 발명의 LPAAT1-long 및 LPAAT1-short 및 LPAAT1의 CDS의 아미노산 서열을 비교한 도면이다.

본 발명은, 신규 지방산 조성물, 그 지방산 조성물의 제조 방법, 그 지방산 조성물을 포함하는 식품에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은, 상기 신규 지방산 조성물을 생성하는 것을 특징으로 하는 모르티에렐라(Mortierella)속 유래의 리소포스파티드산아실기 전이 효소(LPAAT) 유전자를 이용하는 것으로, 구체적으로는 발명자들이 단리한 서열 번호 1로 표시되는 LPAAT1-long이라는 핵산 등을 이용하는 것이다. 리소포스파티드산아실기 전이 효소는, 리소포스파티드산을 아실화하여 포스파티드산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 본 명세서에서 「LPAAT1-long」「LPAAT1-short」의 경우는, 균주를 나타내는 경우, 유전자를 나타내는 경우, 단백질을 나타내는 경우에 더하여, 상기 LPAAT1-long 유전자나 LPAAT1-short 유전자를 발현 벡터에 삽입하여 적당한 숙주에 형질전환한 형질전환체를 배양하여 얻어진 균체를 나타내는 경우가 있다.

리소포스파티드산아실기 전이 효소(LPAAT) 1의 호몰로그

본 발명의 LPAAT1-long에 관련된 서열로는, LPAAT1-long의 ORF의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 1, LPAAT1-long의 아미노산 서열인 서열 번호 2, LPAAT1-long의 cDNA의 염기 서열인 서열 번호 3, 그 CDS의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 4를 들 수 있다. 그 중, 서열 번호 1은 서열 번호 3의 제115∼1557번째 염기 서열에 해당한다.

본 발명의 발명자들은, LPAAT1-long 외에, LPAAT1-long의 유전자의 염기 서열의 전체 길이 중 86.8% 및 아미노산 서열의 전체 길이 중 86.7%에 해당하는 LPAAT1 유전자(이하, LPAAT1-short라고 하는 경우도 있다)도 단리했다. LPAAT1-short에 관련된 서열로는, LPAAT1-short의 ORF의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 8, LPAAT1-short의 아미노산 서열인 서열 번호 10, LPAAT1-short의 cDNA의 염기 서열인 서열 번호 9를 들 수 있다. 서열 번호 9 중 제36∼1286번째 염기 서열이 서열 번호 8에 나타내는 ORF에 해당한다. LPAAT1-long과 LPAAT1-short의 관계는 이하의 표 1과 같다.

즉, 본 발명의 LPAAT1-long의 ORF의 염기 서열 중 5' 말단이 결실된 염기 서열이 LPAAT1-short에 해당한다. 상세하게는, 본 발명의 LPAAT1-long의 ORF의 염기 서열(서열 번호 1) 1443 염기 중, 전체의 86.8%에 해당하는 제193∼제1443번째 염기까지의 영역의 염기가 LPAAT1-short의 ORF의 염기 서열(서열 번호 8)에 해당한다. 즉, LPAAT1-long은 LPAAT1-short보다 5' 영역이 192 염기 긴 서열이다. 또, 아미노산 서열은, 본 발명의 LPAAT1-long의 아미노산 서열(서열 번호 2) 481 잔기 중, 전체의 86.7%에 해당하는, 제65∼481번째까지의 영역의 잔기가 LPAAT1-short의 아미노산 서열(서열 번호 8)에 해당한다. 즉, LPAAT1-long은 LPAAT1-short보다 N 말단이 64 아미노산 잔기(서열 번호 중의 아미노산 잔기 1∼64) 긴 서열이다.

엠. 알피나 유래의 LPAAT로서 상기 특허 문헌 2에 개시되어 있는 공지의 LPAAT(이하, LPAAT1로 한다)가 있다. 이 LPAAT1의 ORF의 염기수는 1251 염기이고, LPAAT1-short의 ORF의 염기수와 일치하며, ORF간의 염기 서열의 동일성도 89%로 높아, LPAAT1-short는 LPAAT1과 동종의 알릴이라고 생각되었다. 이 LPAAT1-long, LPAAT1-short 및 LPAAT1의 염기 서열의 얼라인먼트를 도 1에, 아미노산 서열의 얼라인먼트를 도 2에 각각 나타낸다(도 1 및 도 2).

따라서, 발명자들은, 본 발명의 LPAAT1-long의 활성을 검토함에 있어서, 비교예로서 LPAAT1-short를 공지의 LPAAT1의 모델로서 이용했다. 구체적으로는, LPAAT1-long 및 LPAAT1-short를 효모에서 발현시켜, 그 지방산 조성물의 지방산 조성을 비교했다. 그 결과, 이하에 상세하게 설명하는 바와 같이, 본 발명의 LPAAT1-long 유전자가 발현된 숙주가 생성하는 지방산 조성물의 지방산의 조성은, LPAAT1-short가 발현된 숙주가 생성하는 지방산 조성물의 지방산의 조성과 전혀 달랐다. 즉, 본 발명의 LPAAT1-long은 공지의 LPAAT1가 생성하는 지방산 조성물의 지방산의 조성과는 전혀 다른 지방산 조성물을 생성할 수 있다는 것이 나타났다.

구체적으로는, 본 발명의 지방산 조성물의 특징 중 하나로는, 아라키돈산 함유율이 높다는 것을 들 수 있다. 아라키돈산은, 화학식 C₂₀H₃₂O₂로 표시되는 분자량 304.47의 물질이고, 4개의 이중 결합을 포함하는 20개의 탄소쇄로 이루어진 카르복실산([20:4(n-6)])이며, (n-6)계로 분류된다. 아라키돈산은, 동물의 세포막 중의 중요한 인지질(특히 포스파티딜에탄올아민ㆍ포스파티딜콜린ㆍ포스파티딜이노시톨)로서 존재하며, 뇌에 많이 포함된다. 또한 아라키돈산은, 아라키돈산 캐스케이드에 의해 생성되는 프로스타그란딘ㆍ트롬복산ㆍ류코트리엔 등 일련의 에이코사노이드의 출발 물질이며, 세포간 시그널 전달의 2차 메신저로서도 중요하다. 한편, 아라키돈산은, 동물에서는 리놀산을 원료로 하여 체내에서 합성된다. 그러나, 동물의 종 또는 연령 등에 따라서는, 그 기능이 충분하지 않아 필요한 양을 생성할 수 없거나, 또는 생성하는 기능이 전혀 없기 때문에, 음식물로부터 아라키돈산을 섭취해야 하므로, 아라키돈산은 필수 지방산이라고 할 수 있다.

본 발명의 지방산 조성물 중의 아라키돈산 함유율은, 예를 들어, 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 본 발명의 LPAAT1-long의 플라스미드를, 예를 들어, 실시예 8 및 9에 기재된 방법으로 pDuraSC나 pDura5MCS 등의 벡터에 삽입하여, 엠. 알피나 주에 의해 형질전환하여 얻어진 형질전환체를 발현시키고, 실시예 10에 기재된 배양 방법 등에 따라서 얻어진 배양 균체를 이용하여 균체내의 지방산 조성이나 아라키돈산의 함유량 등을 측정하는 방법이다. 아라키돈산의 함유량 등의 분석 방법으로는, 예를 들어, 얻어진 배양 균체의 지방산을 염산메탄올법으로 지방산메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하고 헥산을 증류 제거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석하는 방법을 들 수 있다. 이것에 의하면, 본 발명의 LPAAT1-long을 엠. 알피나에 의해 형질전환시킨 경우는, 균체내의 지방산 함유율 중의 아라키돈산 함유율이 높다는 것이 나타났다. 이와 같이, 아라키돈산 함유율이 높은 본 발명의 지방산 조성물은, 아라키돈산을 효율적으로 섭취할 수 있기 때문에 바람직하다.

이와 같이, 본 발명의 LPAAT1-long은 공지의 LPAAT1과는 전혀 다른 활성을 갖고 있다. 이러한 신규 활성을 얻을 수 있는 근거의 하나로서, 본 발명의 LPAAT1-long과 공지의 LPAAT1의 유전자/단백질 구조의 차이도 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 LPAAT1-long과 매우 가까운 염기 서열/아미노산 서열을 가지며, 동일한 기능을 갖는 변이체는 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 이하의 것이 포함된다.

i) 본 발명의 특정한 LPAAT1-long의 염기 서열/아미노산 서열로부터 90% 정도(염기수 144개 정도, 아미노산 잔기수 48개 정도; 이들의 염기/잔기가 결실, 치환 또는 부가된 변이체도 포함)의 동일성의 범위내의 염기 서열/아미노산 서열인 것; 및,

ii)본 발명의 LPAAT1-long의 염기 서열/아미노산 서열에 대하여 매우 엄격한 조건으로 하이브리드화하는 염기 서열/아미노산 서열인 것.

상세한 것은, 이하의 「본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소를 코드하는 핵산」의 항목에 기재된 바와 같다.

본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소(LPAAT)를 코드하는 핵산

본 발명은, 서열 번호 1(LPAAT1-long) 등의 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 신규 지방산 조성을 갖는 지방산 조성물, 그 제조 방법 등에 관한 것이다. 따라서, 우선 상기 지방산 조성물을 제조하기 위해 사용하는 핵산에 관해 설명한다.

상기와 같이, 본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소(LPAAT)에는, LPAAT1-long이 포함된다. 본 발명의 LPAAT1-long에 관련된 서열은 「리소포스파티드산아실기 전이 효소(LPAAT) 1의 호몰로그」의 항목에서도 설명한 바와 같이, LPAAT1-long의 ORF의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 1, LPAAT1-long의 아미노산 서열인 서열 번호 2, LPAAT1-long의 cDNA의 염기 서열인 서열 번호 3, 그 CDS의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 4를 들 수 있다.

본 발명의 핵산은, 단일쇄 및 이중쇄의 DNA 외에, 그 RNA 상보체도 포함하며, 천연 유래인 것이어도 되고, 인공적으로 제작한 것이어도 된다. DNA에는, 예를 들어, 게놈 DNA나, 상기 게놈 DNA에 대응하는 cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA 및 이들의 조합이나, DNA와 RNA의 하이브리드를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 핵산의 바람직한 형태로는, (a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열, (b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열 등을 들 수 있다.

상기 염기 서열을 얻기 위해서는, LPAAT 활성을 갖는 생물의 EST나 게놈 DNA의 염기 서열 데이터로부터, 기지의 LPAAT 활성을 갖는 단백질과 동일성이 높은 단백질을 코드하는 염기 서열을 탐색할 수도 있다. LPAAT 활성을 갖는 생물로는, 지질 생산균이 바람직하고, 지질 생산균으로는 엠. 알피나를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

EST 해석을 행하는 경우에는, 우선 cDNA 라이브러리를 제작한다. cDNA 라이브러리의 제작 방법에 관해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))를 참조할 수 있다. 또, 시판하는 cDNA 라이브러리 제작 키트를 이용해도 된다. 본 발명에 적합한 cDNA 라이브러리의 제작 방법으로는, 예를 들어 이하와 같은 방법을 들 수 있다. 즉, 지질 생산균인 엠. 알피나의 적당한 주를 적당한 배지에 식균하여 적당 기간 전(前)배양한다. 이 전배양에 적합한 배양 조건으로는, 예를 들어, 배지 조성으로는, 1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0을 들 수 있고, 배양 기간은 3일간, 배양 온도는 28℃인 조건을 들 수 있다. 그 후, 전배양물을 적당한 조건으로 본 배양에 사용한다. 본 배양에 적합한 배지 조성으로는, 예를 들어, 1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데칸올, 0.3% KH₂PO₄, 0.1% Na₂SO₄, 0.05% CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.05% MgCl₂ㆍ6H₂O, pH 6.0을 들 수 있다. 본 배양에 적합한 배양 조건으로는, 예를 들어, 300 rpm, 1 vvm, 26℃에서 8일간 통기 교반 배양하는 조건을 들 수 있다. 배양 기간 중에 적당량의 글루코오스를 첨가해도 된다. 본 배양 중에 적시에 배양물을 채취하고, 거기에서 균체를 회수하여, 전체 RNA를 조제한다. 전체 RNA의 조제에는, 염산구아니딘/CsCl법 등의 공지의 방법을 이용할 수 있다. 얻어진 전체 RNA로부터 시판하는 키트를 이용하여 poly(A)⁺RNA를 정제할 수 있다. 또한, 시판하는 키트를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다. 그 후, 제작한 cDNA 라이브러리의 임의의 클론의 염기 서열을, 벡터 상에 인서트 부분의 염기 서열을 결정할 수 있도록 설계된 프라이머를 이용하여 결정하여, EST를 얻을 수 있다. 예를 들어, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)로 cDNA 라이브러리를 제작한 경우는, 다이렉셔널 클로닝을 행할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열(「본 발명의 염기 서열」로 기재하는 경우도 있다) 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열(「본 발명의 아미노산 서열」로 기재하는 경우도 있다)로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산을 포함한다. 「동등한 기능을 갖는다」란, 본 발명의 염기 서열이 코드하는 단백질 및 본 발명의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 LPAAT 활성을 갖는 것을 의미한다. 또, 이 LPAAT 활성에 더해, 본 발명의 염기 서열이 코드하는 단백질, 또는 본 발명의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, 이하의

i) 올레산 함유량,

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

iii) 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

v) n-6계 지방산 함유량

중 적어도 하나 이상이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 값인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질(이하, 「본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질」이라고 하는 경우도 있다)인 경우도 포함된다.

구체적으로는, 상기 본 발명의 염기 서열 등을 발현 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)에 삽입한 것을, 효모 Saccharomyces cerevisiae EH13-15주(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)를 숙주로서 형질전환시켜, 얻어진 형질전환체를 배양하여 회수한 균체를, 이하의 실시예 6에 기재된 방법으로 지방산 해석을 한 경우의 상기 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성이, 구체적으로, 이하의

i) 올레산 함유량이 47% 이상;

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율이 6.7 이상, 및/또는

iii) 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율이 10 이상,

iv) 팔미트산 함유량 및 팔미톨레산의 합계 함유량에 대한 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율이 1.1 이상

의 수치인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 염기 서열 등은, LPAAT 활성 및 상기 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산이다.

본 발명의 LPAAT1-long과 LPAAT1-short에 관해, 실시예 6에 기재된 방법으로 지방산 해석을 한 경우의 결과는, 이하의 표 3에 기재한 바와 같이, 본 발명의 LPAAT1-long의 올레산 함유량은 54% 정도로, 42% 정도였던 LPAAT1-short보다 높았다. 또, 본 발명의 팔미트산 함유량은 7.6% 정도로 대조군과 동등하고, 13.5% 정도였던 LPAAT1-short보다 낮았다. 또한, 본 발명의 LPAAT1-long의 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율은, LPAAT1-short보다 1.8배∼2.5배 높았다. 그리고, 본 발명의 LPAAT1-long의 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율은, LPAAT1-short보다 1.5배∼1.8배 정도 높다는 결과를 얻을 수 있었다.

또한, 상기에서는, 본 발명의 염기 서열이 코드하는 단백질, 또는, 본 발명의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 발현되어 있는 숙주의 지방산 조성에서, n-6계 지방산 함유량이, 상기 단백질이 발현되지 않은 숙주의 지방산 조성보다 높은 값인 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질(이하, 상기와 마찬가지로 「본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질」이라고 하는 경우도 있다)인 경우도 포함된다. n-6계 지방산으로는 리놀산, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 7,10,13,16-도코사테트라엔산 및 4,7,10,13,16-도코사펜타엔산을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 엠. 알피나의 경우에는, 바람직하게는, 리놀산, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산 및 아라키돈산을 들 수 있다.

구체적으로는, 상기 본 발명의 염기 서열 등을 발현 벡터 pYE22m 등에 삽입한 것을, 아라키돈산을 생성할 수 있도록 육종한 사카로마이세스 세레비시아 또는 모르티에렐라속 등의 아라키돈산을 생성할 수 있는 효모나 사상균 등의 진균을 숙주로 하여 형질전환시키고, 얻어진 형질전환체를 배양하여 회수한 균체를, 이하의 실시예 7∼10에 기재된 방법으로 지방산 해석을 한 경우의 상기 본 발명의 LPAAT1-long의 n-6계 지방산이 이하의 표 5에 기재한 바와 같이 고함유량인 단백질을 코드하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산이다.

본 발명의 LPAAT1-long과 LPAAT1-short를, 아라키돈산을 생성할 수 있도록 육종한 효모에서 발현시킨 경우에 관해, 실시예 7에 기재된 방법으로 지방산 해석을 한 결과는, 이하의 표 4에 기재한 바와 같다. 즉, 본 발명의 LPAAT1-long의 리놀산 함유량은 대조군이나 LPAAT1-short보다 높다. 또, 본 발명의 LPAAT1-long의γ-리놀렌산 함유량도 대조군이나 LPAAT1-short보다 높다. 또한, 본 발명의 LPAAT1-long의 DGLA 함유량은 대조군보다 높아, LPAAT1-short와 동일한 정도이다. 그리고, 본 발명의 LPAAT1-long의 아라키돈산 함유량은, 대조군이나 LPAAT1-short보다 높다.

또, 본 발명의 LPAAT1-long과 LPAAT1-short를 엠. 알피나에서 발현시킨 경우에 관해, 실시예 8∼10에 기재된 방법으로 지방산 해석을 한 결과는, 이하의 표 5에 기재한 바와 같다. 즉, 본 발명의 LPAAT1-long의 아라키돈산, DGLA의 함유량은 대조군이나 LPAAT1-short보다 높다.

따라서, 본 발명의 LPAAT1-long은, 이하에 설명하는 바와 같이, 다른 LPAAT이 발현된 숙주가 생성하는 지방산 조성물과는 전혀 다른 조성의 지방산 조성물을 숙주 중에 생성할 수 있는 종래 기술에서는 예기할 수 없는 전혀 새로운 기능을 갖는다.

이러한 본 발명의 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산으로는, 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산(이하, 「(동등한 기능을 갖는) 본 발명의 변이체」라고 하는 경우도 있다)을 들 수 있다. 이하에 드는 염기 서열의 기재에서 「본 발명의 상기 활성」이란, 상기 「LPAAT 활성 및/또는 상기 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성」을 의미한다.

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

구체적으로는, 「리소포스파티드산아실기 전이 효소(LPAAT) 1의 호몰로그」의 항목에서 설명한 바와 같이,

(i) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어, 1∼48개, 1∼32개, 1∼24개, 1∼20개, 1∼16개, 1∼12개, 1∼10개, 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼4개))의 아미노산이 결실된 아미노산 서열,

(ii) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어 1∼48개, 1∼32개, 1∼24개, 1∼20개, 1∼16개, 1∼12개, 1∼10개, 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼4개))의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열,

(iii) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어 1∼48개, 1∼32개, 1∼24개, 1∼20개, 1∼16개, 1∼12개, 1∼10개, 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼4개))의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 서열, 또는

(iv) 상기 (i)∼(iii)을 조합한 아미노산 서열로 이루어진 단백질이며, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

상기 중, 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 특정 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특징을 갖는 잔기로 치환하는 것이지만, 원래의 서열 구조에 관한 특징을 실질적으로 변화시키지 않는다면 어떠한 치환이어도 되며, 예를 들어, 치환 아미노산이, 원래의 서열에 존재하는 나선을 파괴하거나, 원래의 서열을 특징짓는 다른 종류의 2차 구조를 파괴하지 않는다면 어떠한 치환이어도 된다.

보존적 치환은, 일반적으로는, 생물학적 합성계나 화학적 펩티드 합성에 의해 도입되지만, 화학적 펩티드 합성에 의한 것이 바람직하다. 이 경우, 치환기에는, 비천연 아미노산 잔기가 포함되어 있어도 되고, 펩티드 모방체나, 아미노산 서열 중, 치환되어 있지 않은 영역이 역전되어 있는 역전형 또는 동영역이 반전되어 있는 반전형도 포함된다.

이하에, 아미노산 잔기를 치환 가능한 잔기별로 분류하여 예시하지만, 치환 가능한 아미노산 잔기는 이하에 기재되어 있는 것에 한정되지 않는다.

A군: 루신, 아이소루신, 노르루신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌 및 시클로헥실알라닌

B군: 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산 및 2-아미노수베린산

C군: 아스파라긴 및 글루타민

D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산 및 2,3-디아미노프로피온산

E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린 및 4-히드록시프롤린

F군: 세린, 트레오닌 및 호모세린

G군: 페닐알라닌 및 티로신

비보존적 치환의 경우는, 상기 종류 중 어떤 하나의 멤버와 다른 종류의 멤버를 교환할 수 있지만, 이 경우는, 본 발명의 단백질의 생물학적 기능을 유지하기 위해, 아미노산의 수치요법 지수(수치요법 아미노산 지수)를 고려하는 것이 바람직하다(Kyte 등, J.Mol.Biol., 157: 105-131(1982)).

또, 비보존적 치환의 경우는, 친수성에 기초하여 아미노산의 치환을 행할 수 있다.

본 명세서 및 도면에서, 염기나 아미노산 및 그 약어는, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature에 따르거나, 또는, 예를 들어 Immunology--A Synthesis(제2판, E.S.Golub 및 D.R.Gren 감수, Sinauer Associates, 매사추세츠주 선더랜드(1991)) 등에 기재되어 있는 당업계에서 관용되고 있는 약어에 기초한다. 또, 아미노산에 관하여 광학 이성체가 있을 수 있는 경우는, 특별히 명시하지 않으면 L체를 나타낸다.

D-아미노산 등의 상기 아미노산의 입체 이성체, α,α-2치환 아미노산 등의 비천연 아미노산, N-알킬아미노산, 젖산 및 그 밖의 비관용적인 아미노산도 또한 본 발명의 단백질을 구성하는 요소가 될 수 있다.

본 명세서에서 이용하는 단백질의 표기법은, 표준적 용법 및 당업계에서 관용되고 있는 표기법에 기초하며, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카르복시 말단 방향이다.

마찬가지로, 일반적으로는 특별히 언급하지 않는 한, 단일쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌단(左端)은 5'단이고, 이중쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향을 5' 방향으로 한다.

당업자라면, 당업계에서 공지의 기술을 이용하여, 본 명세서에 기재한 단백질의 적당한 변이체를 설계하여 제작할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 그다지 중요하지 않다고 생각되는 영역을 타게팅함으로써, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성을 손상하지 않고 그 구조를 변화시킬 수 있는 단백질 분자 중의 적절한 영역을 확인할 수 있다. 또, 유사 단백질 사이에 보존되어 있는 분자의 잔기 및 영역을 확인할 수도 있다. 또한, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하다고 생각되는 영역 중에, 생물학적 활성을 손상하지 않고, 또한 단백질의 폴리펩티드 구조에 악영향을 미치지 않고, 보존적 아미노산 치환을 도입할 수도 있다. 특히, 본 발명에서는, 본 발명의 LPAAT의 아미노산 서열 중의 제208∼213 잔기에, 보존 모티브인 「HXXXXD(HX₄D)」가 존재한다. 이 모티브는, 글리세롤인지질 아실기 전이 효소(Glycerolipid acyltransferase)에 필수인 모티브이며(J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998), 본 발명의 LPAAT에 있어서도 중요한 모티브이다. 따라서, 본 발명의 변이체는 상기 보존 모티브가 보존되고, 본 발명의 상기 활성이 손상되지 않는 한 어떠한 변이체이어도 된다. 상기 보존 모티브 중에서, X는 어떠한 아미노산 잔기이어도 되는 것을 나타내고 있다.

당업자라면, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하고, 동단백질의 펩티드와 유사한 펩티드의 잔기를 확인하여, 이 2개의 펩티드의 아미노산 잔기를 비교하여, 본 발명의 단백질과 유사한 단백질의 어느 잔기가, 생물학적 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기인지를 예측하는, 소위 구조-기능 연구를 할 수 있다. 또한, 이와 같이 예측한 아미노산 잔기의 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택함으로써, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성이 유지되어 있는 변이체를 선택할 수도 있다. 또, 당업자라면, 본 단백질의 변이체의 삼차원 구조 및 아미노산 서열을 해석할 수도 있다. 또한, 얻어진 해석 결과로부터, 단백질의 삼차원 구조에 관한, 아미노산 잔기의 얼라인먼트를 예측할 수도 있다. 단백질 표면 상에 있다고 예측되는 아미노산 잔기는, 다른 분자와의 중요한 상호 작용에 관여할 가능성이 있지만, 당업자라면, 상기와 같은 해석 결과에 기초하여, 이러한 단백질 표면 상에 있다고 예측되는 아미노산 잔기를 변화시키지 않는 변이체를 제작할 수 있다. 또한, 당업자라면, 본 발명의 단백질을 구성하는 각각의 아미노산 잔기 중, 하나의 아미노산 잔기만을 치환하는 변이체를 제작할 수도 있다. 이러한 변이체를 공지의 분석 방법으로 스크리닝하여, 개개의 변이체의 정보를 수집할 수 있다. 이것에 의해, 어떤 특정한 아미노산 잔기가 치환된 변이체의 생물학적 활성이, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 비하여 저하되는 경우, 그와 같은 생물학적 활성을 나타내지 않는 경우, 또는, 본 단백질의 생물학적 활성을 저해하는 부적절한 활성이 발생하는 경우를 비교함으로써, 본 발명의 단백질을 구성하는 개개의 아미노산 잔기의 유용성을 평가할 수 있다. 또, 당업자라면, 이러한 일상적인 실험에서 수집한 정보에 기초하여, 단독으로, 또는 다른 돌연 변이와 조합하여, 본 발명의 단백질의 변이체로서는 바람직하지 않은 아미노산 치환을 용이하게 해석할 수 있다.

상기와 같이, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)), 『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6) 등에 기재된 부위 특이적 변이 유발법 등의 방법에 따라서 조제할 수 있다. 이러한 아미노산의 결실, 치환 또는 부가 등의 변이가 이루어진 변이체의 제작은, 예를 들어, Kunkel법이나 Gapped duplex법 등의 공지의 방법으로, 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라타진사 제조), GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System(인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등: 다카라바이오사 제조) 등을 이용하여 행할 수 있다.

단백질의 아미노산 서열에, 그 활성을 유지하면서 하나 또는 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 도입하는 방법으로는, 상기 부위 특이적 변이 유발 외에도, 유전자를 변이원에서 처리하는 방법, 및 유전자를 선택적으로 개열하여 선택된 뉴클레오티드를 제거, 치환 또는 부가한 후에 연결하는 방법을 들 수 있다.

본 발명은, 더욱 바람직하게는, 서열 번호 2에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질이다.

본 발명의 단백질의 아미노산의 변이 또는 수식의 수, 또는 변이 또는 수식의 부위는, LPAAT 활성, 또는 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성이 유지되는 한 제한은 없다.

본 발명의 LPAAT 활성, 또는 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성은, 공지의 방법을 이용하여 측정하는 것이 가능하다. 예를 들어, 이하의 문헌: J.B.C., 265, 17215-17221, 1990을 참조할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 「LPAAT 활성」은 이하와 같이 측정해도 된다. 본 발명의 LPAAT를 발현시킨 효모로부터, J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)에 기재된 방법 등으로 마이크로솜 분획을 조제한다. 그리고, 반응액인 0.44 mM LPA, 0.36 mM 아실-CoA, 0.5 mM DTT, 1 mg/㎖ BSA, 2 mM MgCl₂, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)에 상기 마이크로솜 분획을 첨가하여, 28℃에서 적당 시간 반응시켜, 클로로포름:메탄올을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 지질을 추출하고, 얻어진 지질을 박층 크로마토그래피 등에 의해 분획하여, 생성된 PA량을 정량할 수 있다.

또, 본 발명의 「LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성」은, 예를 들어 이하와 같이 측정해도 된다. 본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법으로 얻어진 동결 건조시킨 균체에, 적당한 비율로 조정한 클로로포름:메탄올을 첨가하여 교반한 후, 적당 시간 가열 처리를 한다. 또한 원심 분리에 의해 균체를 분리하고, 용매를 회수하는 것을 수회 반복한다. 그 후, 적당한 방법을 이용하여 지질을 건고시키고 나서, 클로로포름 등의 용매를 첨가하여 지질을 용해한다. 이 시료를 적당량 취하여, 염산메탄올법으로 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후에, 헥산으로 추출하고 헥산을 증류 제거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석한다.

(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 「리소포스파티드산아실기 전이 효소(LPAAT) 1의 호몰로그」의 항목에서 설명한 바와 같이, 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 서열 번호 1 및 본 발명의 상기 활성은 상기와 같다.

상기 염기 서열은, 당업자에게 공지인 방법으로 적당한 단편을 이용하여 프로브를 제작하고, 이 프로브를 이용하여 콜로니 하이브리드화, 플라크 하이브리드화, 서던 블롯 등의 공지의 하이브리드화법으로, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리 등으로부터 얻을 수 있다.

하이브리드화법의 상세한 순서에 관해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001); 특히 Section 6-7), 『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997); 특히 Section6.3-6.4), 『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995); 하이브리드화 조건에 관해서는 특히 Section2.10) 등을 참조할 수 있다.

하이브리드화 조건의 강도는, 주로 하이브리드화 조건, 보다 바람직하게는, 하이브리드화 조건 및 세정 조건에 의해 결정된다. 엄격한 조건(고도로 엄격한 조건)으로는, 예를 들어, 하이브리드화 조건으로서, 0.1×SSC∼2×SSC, 55℃∼65℃의 조건, 보다 바람직하게는, 0.1×SSC∼1×SSC, 60℃∼65℃의 조건, 가장 바람직하게는, 0.2×SSC, 63℃의 조건을 들 수 있다. 하이브리드화 용액 중에, 예를 들어, 약 50%의 포름아미드를 포함하는 경우에는, 상기 온도보다 5℃∼15℃ 낮은 온도를 채택한다. 세정 조건으로서, 0.2×SSC∼2×SSC, 50℃∼68℃, 보다 바람직하게는, 0.2×SSC, 60℃∼65℃를 들 수 있다. 하이브리드화 및 세정시에는, 일반적으로 0.05%∼0.2%, 바람직하게는 약 0.1% SDS를 첨가해도 된다.

본 발명에 포함되는 염기 서열로는, 바람직하게는, 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 1×SSC, 60℃의 조건하에서 하이브리드화하고, LPAAT 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

또, 프로브에 방사성 물질을 사용하지 않는 시판하는 하이브리드화 키트를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, DIG 핵산 검출 키트(로슈ㆍ다이어그노스틱스사), ECL direct labeling & detection system(Amersham사 제조)을 사용한 하이브리드화 등을 들 수 있다.

(c) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 「리소포스파티드산아실기 전이 효소(LPAAT) 1의 호몰로그」의 항목에서 설명한 바와 같이, 서열 번호 1로 표시되는 핵산 서열에 대하여 적어도 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

본 발명은, 서열 번호 1로 표시되는 핵산 서열에 대하여 적어도 90% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 더욱 바람직하게는 95%(예를 들어, 95%, 한층 더 바람직하게는 96%, 나아가 97%, 98% 또는 99%) 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산으로, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

2개의 핵산 서열의 동일성%는, 시각적 검사나 수학적 계산에 의해 결정할 수 있지만, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 핵산의 서열 정보를 비교함으로써 결정하는 것이 바람직하다. 서열 비교 컴퓨터 프로그램으로는, 예를 들어, 미국 국립 의학 라이브러리의 웹사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html에서 이용할 수 있는 BLASTN 프로그램(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10): 버젼 2.2.7 또는 WU-BLAST2.0 알고리즘 등을 들 수 있다. WU-BLAST2.0에 관한 표준적인 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷사이트: http://blast.wustl.edu에 기재되어 있는 것을 이용할 수 있다.

(d) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은 「리소포스파티드산아실기 전이 효소(LPAAT) 1의 호몰로그」의 항목에서 설명한 바와 같이, 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

본 발명은, 구체적으로는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 더욱 바람직하게는 95%(예를 들어, 95%, 한층 더 바람직하게는 96%, 나아가 97%, 98% 또는 99%) 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 등을 코드하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 바람직하게는, 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다. 더욱 바람직하게는, 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

2개의 아미노산 서열의 동일성 퍼센트는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수 있다. 또, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 동일성 퍼센트를 결정할 수도 있다. 그와 같은 컴퓨터 프로그램으로는, 예를 들어, BLAST, FASTA(Altschul 등, J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)) 및 ClustalW 등을 들 수 있다. 특히, BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종 조건(파라미터)은, Altschul 등(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재된 것으로, 미국 바이오테크놀로지 정보 센터(NCBI)나 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹사이트에서 공적으로 입수할 수 있다(BLAST 메뉴얼, Altschul 등 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul 등). 또, 유전 정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스), DINASIS Pro(히타치소프트), Vector NTI(Infomax) 등의 프로그램을 이용하여 결정할 수도 있다.

복수의 아미노산 서열을 병렬시키는 특정한 얼라인먼트 스킴은, 서열 중 특정한 짧은 영역의 매칭도 나타낼 수 있기 때문에, 이용한 서열의 전체 길이 서열 사이에 유의한 관계가 없는 경우라 하더라도, 그와 같은 영역에서, 특정한 서열 동일성이 매우 높은 영역을 검출할 수도 있다. 또한, BLAST 알고리즘은, BLOSUM62 아미노산 스코어를 매긴 매트릭스를 이용할 수 있지만, 선택 파라미터로는, 이하의 것을 이용할 수 있다: (A) 낮은 조성 복잡성을 갖는 쿼리 서열의 세그먼트(Wootton 및 Federhen의 SEG 프로그램(Computers and Chemistry, 1993)에 의해 결정된다 ; Wootton 및 Federhen, 1996 「서열 데이터베이스의 조성 편중 영역의 해석(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」 Methods Enzymol., 266: 544-71도 참조하기 바람) 또는 단주기성의 내부 리피트로 이루어진 세그먼트(Claverie 및 States(Computers and Chemistry, 1993)의 XNU 프로그램에 의해 결정된다)를 마스크하기 위한 필터를 포함하는 것 및 (B) 데이터베이스 서열에 대한 적합을 보고하기 위한 통계학적 유의성의 임계값, 또는 E-스코어(Karlin 및 Altschul, 1990)의 통계학적 모델에 따라서, 단순히 우연에 의해 발견되는 적합의 기대 확률; 어떤 적합에 기인하는 통계학적 유의차가 E-스코어 임계값보다 큰 경우, 이 적합은 보고되지 않는다.

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 「리소포스파티드산아실기 전이 효소(LPAAT) 1의 호몰로그」의 항목에서 설명한 바와 같이, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 및 하이브리드화의 조건은 상기와 같다. 본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열로는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

또, 본 발명의 핵산에는, 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에서 하나 또는 복수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산도 포함된다. 구체적으로는,

(i) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어, 1∼144개, 1∼96개, 1∼72개, 1∼48개, 1∼30개, 1∼24개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개))의 염기가 결실된 염기 서열,

(ii) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어 1∼144개, 1∼96개, 1∼72개, 1∼48개, 1∼30개, 1∼24개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개))의 염기가 다른 염기로 치환된 염기 서열,

(iii) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에서 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 몇개(예를 들어 1∼144개, 1∼96개, 1∼72개, 1∼48개, 1∼30개, 1∼24개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개))의 다른 염기가 부가된 염기 서열, 또는

(iv) 상기 (i)∼(iii)을 조합한 염기 서열이며, 또한 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산을 이용할 수도 있다.

또, 본 발명은, 더욱 바람직하게는, 서열 번호 1에서 1∼수십개, 보다 바람직하게는 1∼10개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질이다.

본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소 단백질

본 발명의 LPAAT1-long은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 및 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 포함하며, 천연 유래인 것이어도 되고, 인공적으로 제작한 것이어도 된다. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 상기와 같다. 「동등한 기능을 갖는 단백질」이란, 상기 『본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 바와 같이 「본 발명의 상기 활성」을 갖는 단백질을 의미한다.

본 발명에서, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질로는, 이하의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 단백질이며 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 즉,

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질;

(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열에 의해 코드되는 단백질;

(c) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열에 의해 코드되는 단백질;

(d) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질; 및

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열에 의해 코드되는 단백질

이다.

상기 중, 서열 번호 2에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열은, 상기 『본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 바와 같다. 또, 상기 「본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질」은, 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하는 핵산에 의해 코드되는 단백질의 변이체 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가 등의 많은 종류의 수식에 의해 변이한 단백질, 또는 아미노산 측쇄 등이 수식되어 있는 수식 단백질, 다른 단백질과의 융합 단백질이며, LPAAT 활성을 갖는 단백질 및/또는 본 발명의 LPAAT의 지방산 조성을 형성할 수 있는 활성을 갖는 단백질도 포함된다. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질로는, 보다 바람직하게는, 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 단백질이고, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질이다.

또, 본 발명의 LPAAT1-long은, 인공적으로 제작한 것이어도 되고, 그 경우는, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법으로도 제조할 수 있다. 또, 어드밴스드켐텍사 제조, 퍼킨엘마사 제조, 파마시아사 제조, 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트사 제조, 신세셀-베가사 제조, 퍼셉티브사 제조, 시마즈제작소사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

LPAAT의 핵산의 클로닝

본 발명의 LPAAT1-long의 특정한 서열을 갖는 핵산 및 그 변이체는, 예를 들어, 적절한 프로브를 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝함으로써, 클로닝할 수 있다. 또, 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 반응에 의해 증폭시켜, 적절한 벡터에 연결함으로써 클로닝할 수 있다. 또한, 별도의 벡터에 서브 클로닝할 수도 있다. 이하에, LPAAT1-long의 핵산을 이용한 경우를 예시하여 설명한다.

예를 들어, pBlue-Script^TM SK(+)(Stratagene), pGEM-T(Promega), pAmp(TM: Gibco-BRL), p-Direct(Clontech), pCR2.1-TOPO(Invitrogene) 등의 시판하는 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다. 또, PCR 반응에 의해 증폭시키는 경우, 프라이머는, 상기 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열의 어느 부분이라도 이용할 수 있지만, 예를 들어, 서열 번호 1에 대해서는,

상류측 프라이머로서, 프라이머 955-1: GGACGTGTCAAGGAAAAGGA (서열 번호 6),

하류측 프라이머로서, 프라이머 955-2: TCCTTCAGATGAGCCTCCTG (서열 번호 7)

등을 이용할 수 있다. 그리고, 엠. 알피나 균체로부터 조제한 cDNA에, 상기 프라이머 및 내열성 DNA 폴리머라아제 등을 작용시켜 PCR 반응을 행한다. 상기 방법은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)) 등에 따라서, 당업자라면 용이하게 행할 수 있지만, 본 발명의 PCR 반응의 조건으로는, 예를 들어 이하의 조건을 들 수 있다.

변성 온도: 90∼95℃

어닐링 온도: 40∼60℃

신장 온도: 60∼75℃

사이클수: 10회 이상

얻어진 PCR 산물의 정제에는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, GENECLEAN(프나코시), QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN), ExoSAP-IT(GE 헬스케어 바이오사이언스) 등의 키트를 이용하는 방법, DEAE-셀룰로오스 여과지를 이용하는 방법, 투석 튜브를 이용하는 방법 등이 있다. 아가로스겔을 이용하는 경우에는, 아가로스겔 전기 영동을 행하고, 염기 서열 단편을 아가로스겔로부터 잘라내어, GENECLEAN(프나코시), QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN), 프리즈&스퀴즈법 등으로 정제할 수 있다.

클로닝한 핵산의 염기 서열은, 염기 서열 시퀀서를 이용하여 결정할 수 있다.

LPAAT 발현용 벡터 구축 및 형질전환체의 제작

본 발명의 LPAAT1-long을 코드하는 핵산 및 그 변이체를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체는 이하와 같이 하여 얻을 수 있다. 이하, LPAAT1-long의 핵산을 이용한 경우를 예시하여 설명한다. 즉, 본 발명의 LPAAT1-long을 코드하는 핵산을 갖는 플라스미드를 제한 효소를 이용하여 소화한다. 이용하는 제한 효소로는, 예를 들어, EcoRI, KpnI, BamHI 및 SalI 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 말단을 T4 폴리머라아제 처리함으로써 평활화해도 된다. 소화후의 염기 서열 단편을 아가로스겔 전기 영동에 의해 정제한다. 이 염기 서열 단편을, 발현용 벡터에 공지의 방법을 이용하여 삽입함으로써, LPAAT1-long 발현용 벡터를 얻을 수 있다. 이 발현 벡터를 숙주에 도입하여 형질전환체를 제작하여, 목적으로 하는 단백질의 발현에 이용한다.

이 때, 발현 벡터 및 숙주는, 목적으로 하는 단백질을 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 숙주로서, 진균이나 세균, 식물, 동물 또는 그들의 세포 등을 들 수 있다. 진균으로서, 지질 생산균인 엠. 알피나 등의 사상균, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모 등을 들 수 있다. 또 세균으로서, 대장균(Escherichia coli)이나 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 또한 식물로는, 유채씨, 대두, 목화, 홍화, 아마 등의 유량(油糧) 식물을 들 수 있다.

지질 생산균으로는, 예를 들어, MYCOTAXON, Vol.XLIV, NO.2, pp.257-265(1992)에 기재되어 있는 균주를 사용할 수 있고, 구체적으로는, 모티에렐라속에 속하는 미생물, 예를 들어 모티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 모티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 모티에렐라 알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS 219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 모티에렐라아속(subgenus Mortierella)에 속하는 미생물, 또는 모티에렐라 이사벨리나(Mortierella isabellina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, 모티에렐라 나나(Mortierella nana) IFO8190, 모티에렐라ㆍ라마니아나(Mortierella ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, 모티에렐라 비나세아(Mortierella vinacea) CBS236.82 등의 마이크로뮤코아속(subgenus Micromucor)에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 특히, 모티에렐라 알피나(Mortierella alpina)가 바람직하다.

진균류를 숙주로서 이용하는 경우는, 본 발명의 핵산이 숙주 중에서 자립 복제 가능하거나, 또는 그 균의 염색체 상에 삽입될 수 있는 구조인 것이 바람직하다. 그리고 동시에, 프로모터, 터미네이터를 포함하는 구성인 것이 바람직하다. 숙주로서 엠. 알피나를 사용하는 경우, 발현 벡터로서, 예를 들어, pD4, pDuraSC, pDura5 등을 들 수 있다. 프로모터로는, 숙주 중에서 발현시킬 수 있는 것이라면 어떠한 프로모터를 이용해도 되고, 예를 들어, histonH4.1 유전자 프로모터, GAPDH(글리세르알데히드3-인산디히드로게나아제) 유전자 프로모터, TEF(Translation elongation factor) 유전자 프로모터와 같은 엠. 알피나에 유래하는 프로모터가 이용된다.

엠. 알피나 등의 사상균을 재조합 벡터에 도입하는 방법으로는, 예를 들어, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 파티클딜리버리법 및 핵내에 대한 DNA의 직접 마이크로인젝션 등을 들 수 있다. 영양 요구성의 숙주를 이용하는 경우는, 그 영양소가 결여된 선택 배지 상에서 생육하는 주를 선택함으로써, 형질전환주를 취득할 수 있다. 또, 형질전환에 약제 내성 마커 유전자를 이용하는 경우에는, 그 약제를 포함하는 선택 배지에서 배양하여, 약제 내성을 나타내는 세포 콜로니를 얻을 수 있다.

효모를 숙주로서 이용하는 경우는, 발현 벡터로서, 예를 들어, pYE22m 등을 들 수 있다. 또, pYES(Invitrogen), pESC(STRATAGENE) 등의 시판하는 효모 발현용 벡터를 이용해도 된다. 또 본 발명에 적합한 숙주로는, 사카로마이세스 세레비시아 EH13-15주(trp1, MATα) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 프로모터로는, 예를 들어, GAPDH 프로모터, gal1 프로모터, gal10 프로모터 등의 효모 등에 유래하는 프로모터가 이용된다.

효모에 재조합 벡터를 도입하는 방법으로는, 예를 들어, 아세트산리튬법, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 덱스트란 중개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 중개 트랜스펙션, 프로토플라스트 융합, 리포솜 중의 폴리뉴클레오티드(단수 또는 복수)의 피포 및 핵내에 대한 DNA의 직접 마이크로인젝션 등을 들 수 있다.

대장균 등의 세균을 숙주로서 이용하는 경우는, 발현 벡터로는, 예를 들어 파마시아사의 pGEX, pUC18 등을 들 수 있다. 프로모터로는, 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의 대장균이나 파아지 등에 유래하는 프로모터가 이용된다. 세균에 재조합 벡터를 도입하는 방법으로는, 예를 들어 일렉트로포레이션법이나 염화칼슘법을 이용할 수 있다.

본 발명의 지방산 조성물

본 발명은, 상기 LPAAT1-long 등을 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명의 지방산 조성물은, 본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소를 코드하는 핵산(즉, 서열 번호 1의 염기 서열 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 또는, 이들과 동등한 기능을 갖는 변이체)을 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼v):

i) 올레산 함유량,

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

iii) 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

v) n-6계 지방산 함유량

중 적어도 하나 이상이, 본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 한다. 여기서, 「본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주」란, 예를 들어, 본 명세서 중의 「본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소를 코드하는 핵산」의 항목에서 기재한 핵산이 삽입되지 않은 벡터(공벡터)에 의해 형질전환된 숙주다.

본 발명에 포함되는 지방산은, 유리 지방산이어도 되고, 트리글리세리드, 인지질 등이어도 된다.

또, 본 발명의 지방산 조성물에 포함되는 지방산으로는, 장쇄 탄수화물의 쇄형 또는 분기형의 모노카르복실산을 말하며, 예를 들어, 미리스틴산(테트라데칸산)(14:0), 미리스트레인산(테트라데센산)(14:1), 팔미트산(헥사데칸산)(16:0), 팔미톨레산(9-헥사데센산)(16:1), 스테아르산(옥타데칸산)(18:0), 올레산(cis-9-옥타데센산)(18:1(9)), 박센산(11-옥타데센산)(18:1(11)), 리놀산(cis, cis-9,12 옥타데카디엔산)(18:2(9,12)), α-리놀렌산(9,12,15-옥타데칸트리엔산)(18:3(9,12,15)), γ-리놀렌산(6,9,12-옥타데칸트리엔산)(18:3(6,9,12)), 스테아리돈산(6,9,12,15-옥타데칸테트리엔산)(18:4(6,9,12,15)), 아라키딘산(이코산산)(20:0), (8,11-이코사디엔산)(20:2(8,11)), 미드산(5,8,11-이코사트리엔산)(20:3(5,8,11)), 디호모-γ-리놀렌산(8,11,14-이코사트리엔산)(20:3(8,11,14)), 아라키돈산(5,8,11,14-이코사테트라엔산)(20:4(5,8,11,14)), 에이코사테트라엔산(5,11,14,17-이코사테트라엔산)(20:4(5,11,14,17), 에이코사펜타엔산(5,8,11,14,17-이코사펜타엔산)(20:5(5,8,11,14,17)), 베헨산(도코산산)(22:0), (7,10,13,16-도코사테트라엔산)(22:4(7,10,13,16)), (4,7,13,16,19-도코사펜타엔산)(22:5(4,7,13,16,19)), (4,7,10,13,16-도코사펜타엔산)(22:5(4,7,10,13,16)), (4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산)(22:6(4,7,10, 13,16,19)), 리노글리세린산(테트라도코산산)(24:0), 네르본산(cis-15-테트라도코산산)(24:1), 세로틴산(헥사도코산산)(26:0) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 상기 물질명은 IUPAC 생화학 명명법으로 정의된 관용명이며, 조직명 및, 탄소수와 이중 결합의 위치를 나타내는 수치를, 괄호내에 기재했다.

이와 같은 본 발명의 지방산 조성물이 얻어진 것, 즉 본 발명의 LPAAT1-long이 발현된 것의 확인은, 공지의 일반적인 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 효모에서 LPAAT1-long을 발현시킨 경우는, 지방산 조성의 변화로서 확인할 수 있다. 즉, 상기 본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법으로 얻어진 동결 건조시킨 균체에, 적당한 비율로 조정한 클로로포름:메탄올을 첨가하여 교반한 후, 적당 시간 가열 처리를 한다. 또한 원심 분리에 의해 균체를 분리하여 용매를 회수하는 것을 수회 반복한다. 그 후, 적당한 방법을 이용하여 지질을 건고시키고 나서, 클로로포름 등의 용매를 첨가하여 지질을 용해한다. 이 시료를 적당량 취하여, 염산메탄올법으로 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후에, 헥산으로 추출하고 헥산을 증류 제거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석한다.

그 결과, 상기 지방산 조성을 갖는 지방산 조성물이 얻어진 경우는, 본 발명의 지방산 조성물이 얻어졌다고 판단할 수 있다. 본 발명의 LPAAT1-long은, 상기와 같이, 공지의 LPAAT1의 지방산 조성물과는 지방산 조성이 상이하다. 즉, 본 발명의 LPAAT1-long과 공지의 LPAAT1의 모델로서 이용한 LPAAT1-short에 관해 지방산 해석을 하면, 본 발명의 LPAAT1-long의 올레산 함량은 54% 정도로, 42% 정도였던 LPAAT1-short보다 높고, 본 발명의 LPAAT1-long의 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율은, LPAAT1-short보다 1.8배∼2.5배 높고, 본 발명의 LPAAT1-long의 팔미트산 함유량에 대한 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율은, LPAAT1-short보다 1.8배∼2.3배 정도 높다. 또, 마찬가지로, n-6계 지방산은, LPAAT1-long은 LPAAT1-short보다 고함유량이며, 구체적으로는, LPAAT1-long은 LPAAT1-short보다 리놀산 함유량, γ-리놀렌산 함유량 및 아라키돈산 함유량이 높다.

이것으로부터, 본 발명의 LPAAT1-long은 공지의 LPAAT와 기질 특이성이 상이하다는 것이 나타난다.

본 발명은, 상기 『본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소를 코드하는 핵산』의 항목에 기재한, 본 발명의 서열 번호 1의 염기 서열 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 또는 이들과 동등한 기능을 갖는 변이체를 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양함으로써, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다, 장쇄인 지방산의 함유 비율이나 n-6계 지방산 함유량이 높은 지방산 조성물도 제공한다. 장쇄란, 지방산을 구성하는 탄소수의 길이가 긴 것을 말한다. 예를 들어, 탄소수 16의 팔미트산이나 팔미톨레산보다 탄소수 18의 스테아르산이나 올레산이 장쇄이다. n-6계 지방산은, 상기 『본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소를 코드하는 핵산』에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 지방산 조성물은, LPAAT1-long을 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물에 비하여, 올레산 함유량이나, 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율이 높아, 장쇄인 지방산의 함유 비율이 높은 지방산 조성물 또는 n-6계 지방산 함유량이 높은 지방산 조성물이라고 할 수 있다. 게다가, 본 발명의 지방산 조성물을 제조하는 방법에서 선택하는 숙주에 따라서는, 보다 장쇄인 지방산의 함유 비율이 높은 지방산 조성물이나 n-6계 지방산 함유량이 높은 지방산 조성물을 제조할 수도 있다. 이러한 숙주로는, 진균이나 식물, 동물 또는 이들의 세포 등을 들 수 있다. 진균으로서, 지질 생산균인 엠. 알피나 등의 사상균, 사카로마이세스 세레비시아 등의 효모 등을 들 수 있다. 또한 식물로는, 유채씨, 대두, 목화, 홍화, 아마 등의 유량 식물을 들 수 있다. 이 경우에, 본 발명의 핵산이 포함되는 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물 중의 지방산보다 함유율이 높은 장쇄의 지방산으로는, 올레산, 리놀산, γ-리놀렌산, DGLA, α-리놀렌산, 스테아리돈산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사펜타엔산, 도코사헥사엔산을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. n-6계 지방산으로는, 리놀산, γ-리놀렌산, DGLA 및 아라키돈산을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 이와 같은 보다 장쇄인 지방산의 함유 비율이 높은 지방산 조성물은, 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 유아용 조제유, 미숙아용 조제유, 노인용 식품 등에 적합하게 이용할 수 있기 때문에 바람직하다.

본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법

본 발명은 또한, 상기 지방산 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법은, 상기 LPAAT1-long을 이용하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 본 발명의 서열 번호 1의 염기 서열 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, 또는 이들과 동등한 기능을 갖는 변이체를 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물로부터, 이하의 i)∼v):

i) 올레산 함유량,

ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

iii) 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,

v) n-6계 지방산 함유량

중 적어도 하나 이상이, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 하는 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 그 지방산 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

LPAAT1-long을 발현시킨 생물의 배양에 이용하는 배지는, 적당한 pH 및 침투압을 가지며, 각 숙주의 증식에 필요한 영양소, 미량 성분, 혈청이나 항생 물질 등의 생물 재료를 포함하고 있는 배양액(배지)이라면, 어떠한 배양액도 이용할 수 있다. 예를 들어, 효모를 형질전환하여 LPAAT1-long을 발현시킨 경우는, SC-Trp 배지, YPD 배지, YPD5 배지 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적인 배지의 조성으로서 SC-Trp 배지를 예시한다: 1 ℓ당, 아미노산이 없는 효모 질소 염기(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 분말(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 루신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 유라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g).

배양 조건은, 숙주의 증식에 적합하며, 생성된 효소가 안정적으로 유지되기에 적당한 조건이라면 어떠한 조건이어도 되지만, 구체적으로는, 혐기도, 배양 시간, 온도, 습도, 정치 배양 또는 진탕 배양 등의 개개의 조건을 조절할 수 있다. 배양 방법은, 동일 조건에서의 배양(1단계 배양)이어도 되고, 2 이상의 상이한 배양 조건을 이용하는, 소위 2단계 배양 또는 3단계 배양이어도 되지만, 대량 배양을 하는 경우에는, 배양 효율이 좋은 2단계 배양 등이 바람직하다.

이하에, 본 발명의 지방산 조성물의 구체적인 제조 방법으로서, 숙주로서 효모를 이용하여 2단계 배양을 행한 경우를 예시하여 설명한다. 즉, 전배양으로서, 상기에서 얻어진 콜로니를, 예를 들어 상기 SC-Trp 배지 등에 식균하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행한다. 그 후, 본 배양으로서, YPD5(2% 효모 엑기스, 1% 폴리펩톤, 5% 글루코오스) 배지 10 ㎖에 전배양액을 500 ㎕ 첨가하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행하는 방법이다.

본 발명의 핵산의 사용

본 발명은 또한, 본 발명의 지방산 조성물을 제조하기 위한 상기 LPAAT1-long의 사용을 제공한다.

구체적으로는, 본 발명의 지방산 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 LPAAT1-long을 코드하는 핵산의 사용을 제공한다.

상기 핵산을 이용하면, 본 발명의 지방산 조성물을 제조하는 것 뿐만 아니라, 이하의 「본 발명의 지방산 조성물을 포함하는 식품」의 항에서 설명하는 바와 같은 미리 정해진 목적을 달성하는 그 지방산 조성물을 포함하는 식품 등을 제조할 수 있으므로, 바람직하다.

본 발명의 지방산 조성물을 포함하는 식품 등

본 발명은 또한 상기 지방산 조성물을 포함하는 식품을 제공한다. 본 발명의 지방산 조성물은, 통상의 방법에 따라서, 예를 들어, 유지를 포함하는 식품, 공업 원료(화장료, 의약(예를 들어, 피부외용약), 비누 등의 원료)의 제조 등의 용도로 사용할 수 있다. 화장료(조성물) 또는 의약(조성물)의 제형으로는, 용액형, 페이스트형, 겔형, 고체형, 분말형 등 임의의 제형을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 식품의 형태로는, 캡슐 등의 의약 제제의 형태, 또는 단백질, 당류, 지방, 미량 원소, 비타민류, 유화제, 향료 등에 본 발명의 지방산 조성물이 배합된 자연 유동식, 반소화형태 영양식 및 성분 영양식, 드링크제, 경장 영양제 등의 가공 형태를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 식품의 예로는, 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 유아용 조제유, 미숙아용 조제유, 노인용 식품 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 명세서에서는, 식품이란, 고체, 유동체 및 액체, 그리고 이들의 혼합물로서, 섭식 가능한 것의 총칭이다.

영양 보조 식품이란, 특정한 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 건강 식품이란, 건강적인 또는 건강에 좋다고 여겨지는 식품을 말하며, 영양 보조 식품, 자연 식품, 다이어트 식품 등이 포함된다. 기능성 식품이란, 몸의 조절 기능을 하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하며, 특정 보건 용도 식품과 동일한 의미이다. 유아용 식품이란, 약 6세까지의 아이를 위한 식품을 말한다. 노인용 식품이란, 비처리 식품에 비하여 소화 및 흡수가 용이하도록 처리된 식품을 말한다. 유아용 조제유란, 약 1세까지의 아이를 위한 조제유를 말한다. 미숙아용 조제유란, 미숙아가 생후 약 6개월이 될 때까지 주기 위한 조제유를 말한다.

이러한 식품으로는, 고기, 생선, 너츠 등의 천연 식품(유지로 처리한 것); 중화요리, 라면, 스프 등의 조리시에 유지를 첨가하는 식품; 튀김, 후라이, 유부, 볶음밥, 도너츠, 튀긴 과자 등의 열매체로서 유지를 사용한 식품; 버터, 마가린, 마요네즈, 드레싱, 쵸콜렛, 즉석 라면, 캬라멜, 비스킷, 쿠키, 케이크, 아이스크림 등의 유지 식품 또는 가공시에 유지를 첨가한 가공 식품; 카키모찌(살짝 구운 짭짤한 과자), 하드비스킷, 팥빵 등의 가공 마무리시에 유지를 분무 또는 도포한 식품 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 식품은, 유지를 포함하는 식품에 한정되지 않고, 예를 들어, 빵, 면류, 밥, 과자류(캔디, 츄잉껌, 젤리, 정과, 화과자), 두부 및 그 가공품 등의 농산 식품; 청주, 약용주, 맛술, 식초, 간장, 된장 등의 발효 식품; 요구르트, 햄, 베이컨, 소시지 등의 축산 식품; 찐 어묵, 튀긴 어묵, 한펜(상어살 어묵) 등의 수산 식품; 과즙 음료, 청량 음료, 스포츠 음료, 알콜 음료, 차 등을 들 수 있다.

본 발명에 관한 핵산 또는 단백질을 이용한 균주의 평가ㆍ선택 방법

본 발명은 또, 본 발명에 관한 핵산 또는 단백질을 이용하여 지질 생산균의 평가나 선택을 하는 방법을 제공한다. 구체적으로는 이하와 같다.

(1) 평가 방법

본 발명의 한 형태로서, 본 발명의 LPAAT1-long을 코드하는 핵산 또는 LPAAT1-long 단백질을 이용하여, 지질 생산균을 평가하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 평가 방법으로는, 우선 본 발명의 염기 서열에 기초하여 설계한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 피검 균주인 지질 생성 균주의 본 발명의 상기 활성에 관해 평가하는 방법을 들 수 있다. 이러한 평가 방법의 일반적 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 국제 특허 출원 팜플렛 WO 01/040514호, 일본 특허 공개 평 8-205900호 공보 등에 기재되어 있다. 이하, 그 평가 방법에 관해 간단히 설명한다.

우선 피검 균주의 게놈을 조제한다. 조제 방법은, Hereford법이나 아세트산칼륨법 등, 공지의 어떠한 방법이라도 이용할 수 있다(예를 들어, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p.130 (1990) 참조).

본 발명의 염기 서열, 바람직하게는, 서열 번호 1에 기초하여 프라이머 또는 프로브를 설계한다. 상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 염기 서열 중 어느 부분이라도 이용할 수 있고, 또 그 설계는 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다. 프라이머로서 이용하는 폴리뉴클레오티드의 염기수는, 통상 10 염기 이상이며, 15∼25 염기인 것이 바람직하다. 또, 삽입하는 부분의 염기수는, 통상 300∼2000 염기가 적당하다.

상기에서 제작한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 상기 피검 균주의 게놈 중에 본 발명의 염기 서열과 특이적인 서열이 존재하는지의 여부를 조사한다. 본 발명의 염기 서열과 특이적인 서열의 검출은, 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 염기 서열에 특이적 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로서 이용하고, 또 하나의 프라이머로서 이 서열보다 상류 또는 하류의 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용하며, 예를 들어, PCR법 등으로 피검 균주의 핵산을 증폭시켜, 증폭물의 유무, 증폭물의 분자량의 크기 등을 측정할 수 있다.

본 발명의 방법에 적합한 PCR법의 반응 조건은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 이하의 조건을 들 수 있다.

변성 온도: 90∼95℃

어닐링 온도: 40∼60℃

신장 온도: 60∼75℃

사이클수: 10회 이상

등의 조건이다. 얻어진 반응 생성물은 아가로스겔 등을 이용한 전기 영동법 등으로 분리하여, 증폭 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 이에 따라, 증폭 산물의 분자량이 본 발명의 염기 서열과 특이적인 영역에 해당하는 핵산 분자를 포함하는 크기인지의 여부를 확인함으로써, 피검 균주의 본 발명의 상기 활성을 예측 또는 평가할 수 있다. 또, 상기 증폭 산물의 염기 서열을 상기 방법 등으로 해석함으로써, 본 발명의 상기 활성을 보다 정확하게 예측 또는 평가할 수 있다. 본 발명의 상기 활성의 평가 방법은 상기와 같다.

또, 본 발명의 상기 평가 방법으로는, 피검 균주를 배양하여, 서열 번호 1 등의 본 발명의 염기 서열이 코드하는 LPAAT1-long의 발현량을 측정함으로써, 피검 균주의 본 발명의 상기 활성을 평가할 수도 있다. LPAAT1-long의 발현량은, 피검 균주를 적당한 조건으로 배양하여, LPAAT1-long의 mRNA 또는 단백질을 정량함으로써 측정할 수 있다. mRNA 또는 단백질의 정량은, 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다. mRNA의 정량은, 예를 들어, 노던 하이브리드화나 정량적 RT-PCR에 의해, 단백질의 정량은, 예를 들어, 웨스턴 블로팅에 의해 행할 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003). 또, 상기 활성의 평가 방법으로서, 본 발명의 LPAAT1-long이 생성하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수도 있다. 지방산 조성물의 조성의 측정 방법은 상기와 같다.

(2) 선택 방법

본 발명의 다른 형태로서, 본 발명의 LPAAT1-long을 코드하는 핵산 또는 LPAAT1-long 단백질을 이용하여, 지질 생산균을 선택하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 선택 방법으로는, 피검 균주를 배양하여, 서열 번호 1 등의 본 발명의 염기 서열이 코드하는 LPAAT1-long의 발현량을 측정하고, 목적으로 하는 발현량의 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 또, 기준이 되는 균주를 설정하여, 이 기준 균주와 피검 균주를 각각 배양하고, 각 균주의 상기 발현량을 측정하여, 기준 균주와 피검 균주의 발현량을 비교하여, 원하는 균주를 선택할 수도 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 기준 균주 및 피검 균주를 적당한 조건으로 배양하고, 각 균주의 발현량을 측정하여, 기준 균주보다 피검 균주가 고발현 또는 저발현인 피검 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 원하는 활성에는, 상기와 같이, LPAAT1-long의 발현량 및 LPAAT1-long이 생성하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수 있다.

또, 본 발명의 상기 선택 방법으로는, 피검 균주를 배양하여, 본 발명의 상기 활성이 높거나 낮은 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 피검 균주를 선택할 수도 있다. 원하는 활성에는, 상기와 같이, LPAAT1-long의 발현량 및 LPAAT1-long이 생성하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수 있다.

피검 균주 또는 기준 균주로는, 예를 들어, 상기 본 발명의 벡터를 도입한 균주, 상기 본 발명의 핵산의 발현이 억제된 균주, 돌연 변이 처리가 실시된 균주, 자연 변이된 균주 등을 이용할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 LPAAT1-long 활성 및 LPAAT1-long의 지방산 조성물을 형성할 수 있는 활성은, 예를 들어 본 명세서 중의 「본 발명의 리소포스파티드산아실기 전이 효소를 코드하는 핵산」, 「본 발명의 지방산 조성물」의 항목에서 기재한 방법으로 측정하는 것이 가능하다. 돌연 변이 처리로는, 예를 들어, 자외선 조사나 방사선 조사 등의 물리적 방법, EMS(에틸메탄술포네이트), N-메틸-N-니트로소구아니딘 등의 약제 처리에 의한 화학적 방법 등을 들 수 있지만(예를 들어, 오오시마 야스히로 편저, 생물화학 실험법 39 효모 분자 유전학 실험법, p.67-75, 학회출판센터 등 참조), 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 기준 균주, 피검 균주로서 이용하는 균주로는, 상기 지질 생산균 또는 효모 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 기준 균주, 피검 균주는, 상이한 속이나 종에 속하는 어떠한 균주를 조합하여 이용해도 되고, 피검 균주는 하나 또는 그 이상의 균주를 동시에 이용해도 된다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1

(1) EST 해석

엠. 알피나 1S-4주를 100 mL의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0)에 식균하여, 3일간 28℃에서 전배양했다. 10 ℓ 배양조(Able Co., 도꾜)에 5 ℓ의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데칸올, 0.3% KH₂PO₄, 0.1% Na₂SO₄, 0.05% CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.05% MgCl₂ㆍ6H₂O, pH 6.0)를 넣고, 전배양물을 전량 식균하여, 300 rpm, 1 vvm, 26℃의 조건으로 8일간 통기 교반 배양했다. 배양 1, 2 및 3일째에 각각 2%, 2% 및 1.5% 상당의 글루코오스를 첨가했다. 배양 1, 2, 3, 6 및 8일째의 각 스테이지에 균체를 회수하여, 염산구아니딘/CsCl법으로 total RNA를 조제했다. Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(다카라바이오)를 이용하여, total RNA로부터 poly(A)⁺RNA를 정제했다. 각 스테이지의 cDNA 라이브러리를, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)를 이용하여 제작하고, cDNA의 5'측으로부터의 원패스 시퀀스 해석(8000 클론×5 스테이지)을 행했다. 얻어진 서열을 클러스터링했다. 그 결과, 약 5000의 서열을 얻었다.

(2) LPAAT 유전자 호몰로그의 탐색

EST 해석으로 얻어진 염기 서열을 GENEBANK에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 상동성 검색 프로그램인 BLASTX로 검색하여, LPAAT 유전자의 호몰로그를 추출하고, LPAAT의 호몰로그의 서열(서열 번호 5)을 발견했다. 서열 번호 5는 Neurospora crassa 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산아실트랜스퍼라아제형의 추정 단백질(GB accession No.EAA28956)과 가장 동일성이 높았다.

특허 문헌 2의 명세서 중에 기재되어 있는 엠. 알피나의 LPAAT 호몰로그(LPAAT1)의 서열과 상기에서 얻어진 서열을 비교하면, 서열 번호 5는 LPAAT1의 동종의 알릴의 부분 서열이었다.

상기 서열에 관해, 유래하는 라이브러리와 그 EST는 표 2와 같다. 표 2에는 몇일째의 배양에서 얻어진 cDNA 라이브러리 유래의 클론인지를 나타내고 있다.

실시예 2

(1) LPAAT 호몰로그의 클로닝

서열 번호 5에는, LPAAT 호몰로그를 코드한다고 생각되는 CDS가 존재하지 않았기 때문에, 이들의 유전자의 전체 길이를 코드하는 cDNA를 클론화하기 위해 각각의 서열에 기초하여, 이하와 같이 프라이머를 제작했다.

서열 번호 5에 기초하여 설계한 프라이머:

프라이머 955-1: GGACGTGTCAAGGAAAAGGA (서열 번호 6)

프라이머 955-2: TCCTTCAGATGAGCCTCCTG (서열 번호 7)

이들 프라이머를 이용하여, 서열 번호 5를 구성하는 EST를 포함하는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, ExTaq(다카라바이오)를 이용하여 PCR 반응을 행했다. 얻어진 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit(INVITROGEN CORPORATION)를 이용하여 TA-클로닝을 행하여 인서트 부분의 염기 서열을 결정했다.

그 결과, 서열 번호 5의 제20∼518번째를 포함하는 DNA 단편이 클론화된 것을 확인하여, 이 플라스미드를 pCR-955-P로 했다. 다음으로, 이 플라스미드를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 행했다. 반응에는, ExTaq(다카라바이오)를 이용했지만, 첨부하는 dNTP 믹스 대신 PCR 라벨링 믹스(로슈ㆍ다이어그노스틱스사)를 이용하고, 증폭되는 DNA를 디곡시게닌(DIG) 라벨링하여, cDNA 라이브러리를 스크리닝에 이용하는 프로브를 제작했다. 이 프로브를 이용하여, EST 해석에서 상기 서열을 구성하는 EST를 얻은 cDNA 라이브러리를 스크리닝했다.

하이브리드화의 조건은 다음과 같다.

버퍼: 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50% 포름아미드;

온도: 42℃(하룻밤);

세정: 0.2×SSC, 0.1% SDS 용액 중(65℃)에서 20분간×3회;

검출은, DIG 핵산 검출 키트(로슈ㆍ다이어그노스틱스사)를 이용하여 행했다. 스크리닝에 의해 얻어진 파아지 클론으로부터, in vivo 엑시젼에 의해 플라스미드를 잘라내어 플라스미드 DNA를 얻었다.

서열 번호 5를 포함하는 cDNA를 스크리닝하여 얻어진, 인서트가 가장 긴 클론의 인서트의 염기 서열을 서열 번호 3에 나타낸다. 서열 번호 3에는, 제116∼1557번째까지의 1443bp로 이루어진 코드 영역이 포함되어 있고, LPAAT 호몰로그의 전체 길이를 코드하고 있는 서열을 얻을 수 있다고 생각되었다. 이 유전자에 의해 코드되는 단백질의 추정 아미노산 서열을 서열 번호 2에 나타냈다.

서열 번호 5를 포함하는 cDNA를 스크리닝하여, 상기 서열 번호 3보다 짧은 인서트인 클론도 얻어졌다. 얻어진 클론의 인서트의 염기 서열을 서열 번호 9에 나타낸다. 서열 번호 9에는, 제36∼1286번째까지의 1251bp로 이루어진 ORF가 포함되어 있고, 이 서열은, 상기 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열 중 5' 말단의 제193∼1443 염기까지와 동일하다는 것을 알았다. 즉, 서열 번호 9로 표시되는 염기 서열은 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열보다 5' 영역이 192 염기 짧은 염기 서열이었다. 이 유전자에 의해 코드되는 단백질의 추정 아미노산 서열을 서열 번호 10에 나타냈다.

서열 번호 3을 포함하는 플라스미드를 pB-LPAAT1-long으로 하고, 서열 번호 9를 포함하는 플라스미드를 pB-LPAAT1-short로 했다. 또, 서열 번호 3에 관한 유전자를 LPAAT1-long 유전자로 하고, 서열 번호 9에 관한 유전자를 LPAAT1-short 유전자로 했다.

(2) 서열 해석

상기와 같이 하여 얻어진 엠. 알피나 유래의 LPAAT 호몰로그의 cDNA 서열을 GENEBANK에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 BLASTX를 이용하여 상동성 해석을 했다. 그 결과, 각 서열에 대하여 가장 E-value가 낮았던, 즉 동일성이 높았던 아미노산 서열은 이하와 같다. 각 서열의 ORF와, 가장 동일성이 높았던 서열에 관한 염기 서열의 동일성, 및 아미노산 서열의 동일성을 clustalW로 구하여, 이하에 함께 기재했다.

서열 번호 3은, Aspergillus nidulans 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산아실트랜스퍼라아제형의 추정 단백질(GB accession No.EAA60126)이 해당하는 부분만을 비교한 경우, 염기 서열 51%, 아미노산 서열 32.1%였다.

서열 번호 9는, Aspergillus nidulans 유래의 1-아실-sn-글리세롤-3-인산아실트랜스퍼라아제형의 추정 단백질(GB accession No.EAA60126)이 해당하는 부분만을 비교한 경우, 염기 서열 51%, 아미노산 서열 32.1%였다.

또, 서열 번호 3과 서열 번호 9에 관해, 각각 엠. 알피나 유래의 기지의 LPAAT 호몰로그인 LPAAT1 유전자(특허 문헌 2) 및 이들의 코드하는 추정 아미노산 서열로 비교했다. 상기 문헌에 개시되어 있는 서열과 엠. 알피나 1S-4주로부터 취득한 서열을 각각이 해당하는 영역에서 비교하면, LPAAT1-long 및 LPAAT1-short 모두, 염기 서열 89%, 아미노산 서열 91%의 동일성인 것이 확인되었다.

실시예 3

효모 발현 벡터의 구축

LPAAT1-long, LPAAT1-short를 효모에서 발현시키기 위해, 이하와 같이 효모 발현용 벡터를 구축했다.

플라스미드 pB-LPAAT1-long을 제한 효소 EcoRI과 KpnI으로 소화하여 얻어진 약 1.7 kb의 DNA 단편을 효모용 발현 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)의 EcoRI-KpnI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pYE-MALPAA1-long을 구축했다.

LPAAT1-short를 효모에서 발현시키기 위해, 이하와 같이 효모 발현 벡터를 구축했다. 즉, 플라스미드 pB-LPAAT1-short를 주형으로 하여, 이하의 프라이머 LPAAT1-6F(서열 번호 11)와 LPAAT1-R1(서열 번호 12)를 이용하여 ExTaq(다카라바이오)에 의해, PCR 반응을 행했다.

LPAAT1-6F: TCTGAGATGGATGAATCCACCACCACCAC (서열 번호 11)

LPAAT1-R1: GTCGACTCAACCAGACGATACTTGCTGCAGAG (서열 번호 12)

얻어진 DNA 단편에 관해, TOPO-TA cloning Kit(INVITROGEN)를 이용하여, TA-클로닝을 행하고, 인서트 부분의 염기 서열을 확인하여, 올바른 염기 서열을 갖는 플라스미드를 pCR-LPAAT1-short로 했다. 이 플라스미드를 제한 효소 EcoRI과 SalI으로 소화하여 얻어진 약 1.3 kb의 DNA 단편을, 효모 발현용 벡터 pYE22m의 EcoRI-SalI 부위에 삽입하여, 플라스미드 pYE-MALPAAT1-short를 구축했다.

실시예 4

효모의 형질전환

플라스미드 pYE22m, pYE-MALPAAT1-long 또는 pYE-MALPAAT1-short를 이용하여 아세트산리튬법으로, 효모 Saccharomyces cerevisiae EH13-15주(trp1, MATα)(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)를 형질전환했다. 형질전환주는, SC-Trp(1 ℓ당, 아미노산이 없는 효모 질소 염기(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 분말(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 루신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 유라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다.

실시예 5

효모의 배양

각각의 벡터에서의 형질전환주 중 임의의 2주씩(c-1주, c-2주, LPAAT1-long-1주, LPAAT1-long-2주, LPAAT1-short-1주, LPAAT1-short-2주)을 선택하여, 이하의 조건으로 배양했다.

즉, 전배양으로서, SC-Trp 배지 10 ㎖에 효모를 플레이트로부터 1 백금이 식균하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행했다. 본 배양은, YPD5(효모 엑기스 2%, 폴리펩톤 1%, 글루코오스 5%) 배지 10 ㎖에 전배양액을 500 ㎕ 첨가하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행했다.

실시예 6

효모의 지방산 분석

효모의 배양액을 원심 분리함으로써 균체를 회수했다. 10 ㎖의 멸균수로 세정하고, 원심 분리에 의해 다시 균체를 회수하여 동결 건조시켰다. 동결 건조 균체에 클로로포름:메탄올(2:1)을 4 ㎖ 첨가하여 격렬하게 교반한 후, 70℃에서 1시간 처리했다. 원심 분리에 의해 균체를 분리하고 용매를 회수했다. 남은 균체에 다시 클로로포름:메탄올(2:1)을 4 ㎖ 첨가하고, 마찬가지로 용매를 회수했다. 스피드백으로 지질을 건고시킨 후, 2 ㎖의 클로로포름을 첨가하여 지질을 용해했다. 이 시료 중 200 ㎕를 취하여, 염산메탄올법으로 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하고 헥산을 증류 제거하여, 가스 크로마토그래피에 의해 분석했다.

그 결과를 표 3에 나타낸다.

엠. 알피나 유래의 2개의 LPAAT 호몰로그를 도입한 효모와, 대조군의 효모의 지방산 조성을 비교했다. LPAAT1-short를 도입한 효모의 지방산 조성은, 팔미트산의 비율이 대조군주에 비하여 상승하는 한편, 팔미톨레산 함량의 비율은 감소했다. 따라서, 팔미트산 함유량에 대한 팔미톨레산 함유량의 비율은 대조군주에 비하여 낮아졌다. 스테아르산 및 올레산의 함량은 대조군주와 동일한 정도였다.

이에 비해, LPAAT1-long을 도입한 효모에서는 올레산의 비율이 대조군주에 비해 1할 이상 상승한 한편, 팔미톨레산, 스테아르산의 비율이 감소하였다. 따라서, 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율 및 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율이 대조군주보다 높았다. 또, 팔미트산 함유량 및 팔미톨레산의 합계 함유량에 대한 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율도 대조군주보다 높았다.

이상의 결과로부터, 엠. 알피나 유래의 2개의 LPAAT 호몰로그는, 그 기질의 아실기의 특이성이 상이하기 때문에 이들의 유전자를 도입한 효모에서는 각각의 호몰로그에서 지방산 조성이 전혀 다르다는 것이 나타났다. 또, 상기 호몰로그를 적시에 적절하게 사용함으로써, 목적으로 하는 지방산 조성의 생물을 육종할 수 있다는 것이 나타났다.

실시예 7

(1) 아라키돈산 생성 효모의 육종

아라키돈산 생성 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 육종하기 위해, 이하의 플라스미드를 구축했다.

우선, 엠. 알피나 1S-4주로부터 조제한 cDNA를 주형으로 하여, Δ12-f와 Δ12-r, Δ6-f와 Δ6-r, GLELO-f와 GLELO-r 또는Δ5-f와 Δ5-r와 같은 프라이머의 조합으로 ExTaq를 이용하여 PCR을 행하고, 엠. 알피나 1S-4주의 Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6 지방산 불포화화 효소 유전자, GLELO 지방산 쇄장 연장 효소 유전자 및 Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자를 증폭시켰다.

Δ12-f: TCTAGAatggcacctcccaacactattg (서열 번호 13)

Δ12-r: AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC (서열 번호 14)

Δ6-f: TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag (서열 번호 15)

Δ6-r: AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG (서열 번호 16)

GLELO-f: TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc (서열 번호 17)

GLELO-r: GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC (서열 번호 18)

Δ5-f: TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc (서열 번호 19)

Δ5-r: AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC (서열 번호 20)

이들을 TOPO-TA-cloning Kit에 의해 클론화했다. 염기 서열을 확인하여, 서열 번호 21-24의 염기 서열을 포함하는 클론을 각각 플라스미드 pCR-MAΔ12DS(서열 번호 21의 염기 서열을 포함), pCR-MAΔ6DS(서열 번호 22의 염기 서열을 포함), pCR-MAGLELO(서열 번호 23의 염기 서열을 포함), pCR-MAΔ5DS(서열 번호 24의 염기 서열을 포함)로 했다.

다음으로, 플라스미드 pCR-MAΔ12DS를 제한 효소 HindIII로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한 효소 XbaI으로 소화하여 얻어진 약 1.2 kbp의 DNA 단편과, 벡터 pESC-URA(STRATAGENE)를 제한 효소 SacI으로 소화한 후 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 SpeI으로 소화한 약 6.6 kbp의 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pESC-U-Δ12를 얻었다. 플라스미드 pCR-MAΔ6DS를 제한 효소 XbaI으로 소화한 후 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.6 kbp의 DNA 단편과, 플라스미드 pESC-U-Δ12를 제한 효소 SalI으로 소화한 후 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII로 소화한 약 8 kbp의 DNA 단편과 연결하여, 플라스미드 pESC-U-Δ12:Δ6을 얻었다. 이것을 제한 효소 PvuII로 부분 소화하여 얻어진 약 4.2 kb의 단편을 pUC-URA3의 SmaI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6을 얻었다.

또, 플라스미드 pCR-MAGLELO를 제한 효소 XbaI과 SacI으로 소화하여 얻어진 약 0.95 kbp의 DNA 단편과, 벡터 pESC-LEU(STRATAGENE)를 제한 효소 XbaI과 SacI으로 소화하여 얻어진 약 7.7 kbp의 DNA 단편과 연결하여, 플라스미드 pESC-L-GLELO를 얻었다. 플라스미드 pCR-MAΔ5DS를 제한 효소 XbaI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.3 kbp의 DNA 단편과, 플라스미드 pESC-L-GLELO를 제한 효소 ApaI으로 소화한 후 말단을 평활화한 것을, 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 8.7 kbp의 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pESC-L-GLELO:Δ5를 얻었다. 이것을 제한 효소 PvuII로 소화하여 얻어진 약 3.2 kb 단편을 pUC-LEU2의 SmaI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5를 얻었다.

사카로마이세스 세레비시아 YPH499주(STRATAGENE)를 플라스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6과 플라스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5로 동시 형질전환을 행했다. 형질전환주는, SC-Leu, Ura(1 ℓ당, 아미노산이 없는 효모 질소 염기(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 분말(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다. 이렇게 하여 얻어진 주 중 임의의 1주를 ARA3-1주로 했다.

(2) 아라키돈산 생성 효모의 형질전환주의 취득과 해석

ARA3-1주를 플라스미드 pYE22m, pYE-MALPAAT1-long, pYE-MALPAAT1-short에서 각각 형질전환했다. 형질전환주는, SC-Trp, Leu, Ura(1 ℓ당, 아미노산이 없는 효모 질소 염기(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 분말(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다. 각 플라스미드를 도입한 주에서, 각각 임의의 4주를 선택했다.

이들 주를 상기 SC-Trp, Leu, Ura 액체 배지 10 ㎖에서 30℃, 1일간 배양하고, 그 중 1 ㎖을 SG-Trp, Leu, Ura(1 ℓ당, 아미노산이 없는 효모 질소 염기(DIFCO) 6.7 g, 갈락토오스 20 g, 아미노산 분말(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 액체 배지 10 ㎖에서 15℃, 7일간 배양하여, 균체의 지방산 분석을 했다. 균체의 지방산 조성을 표 4에 나타냈다.

이와 같이, 아라키돈산을 생성할 수 있도록 육종한 효모에서 LPAAT1-long을 고발현시키면, 벡터만을 도입한 대조군주에 비하여, 총 지방산에서 차지하는 n-6계 PUFA의 비율이 높아졌다. 또, LPAAT1-short를 고발현시킨 경우에 비하더라도 리놀산, γ-리놀렌산, 아라키돈산의 비율이 높아졌다.

실시예 8

엠. 알피나 발현용 벡터의 구축

엠. 알피나 발현용 벡터로서, GAPDH 프로모터로부터 목적 유전자를 발현시키는 pDuraSC를 이용했다.

LPAAT1-long과 LPAAT1-short를 엠. 알피나에서 발현시키기 위해, 이하와 같이 벡터를 구축했다. 즉, 플라스미드 pB-LPAAT1-long을 제한 효소 EcoRI과 SalI으로 소화하여 얻어진 DNA 단편 중 약 1.5 kb인 것을 잘라내고, 벡터 pDuraSC의 멀티 클로닝 사이트의 EcoRI-XhoI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pDuraSC-LPAAT1-long으로 했다. 또, 플라스미드 pCR-LPAAT1-short를 EcoRI과 SalI으로 소화하여 얻어진 DNA 단편 중 약 1.3 kb를 잘라내고, 벡터 pDuraSC의 멀티 클로닝 사이트의 EcoRI-XhoI 사이트에 삽입하여 pDura5SC-LPAAT1-short로 했다.

실시예 9

엠. 알피나 형질전환주의 취득

이들 플라스미드로, 엠. 알피나로부터 특허 문헌(WO 2005/019437 「지질 생산균의 육종 방법」) 방법에 따라 유도한 유라실 요구성 주 Δura-3를 숙주로 하여 파티클 딜리버리법으로 형질전환을 행했다. 형질전환주의 선택에는, SC 한천 배지(황산암모늄 및 아미노산이 없는 효모 질소 염기(Difco) 0.5%, 황산암모늄 0.17%, 글루코오스 2%, 아데닌 0.002%, 티로신 0.003%, 메티오닌 0.0001%, 아르기닌 0.0002%, 히스티딘 0.0002%, 리신 0.0004%, 트립토판 0.0004%, 트레오닌 0.0005%, 아이소루신 0.0006%, 루신 0.0006%, 페닐알라닌 0.0006%, 한천 2%)를 이용했다.

실시예 10

형질전환 엠. 알피나의 평가

얻어진 형질전환주를, GY 배지(글루코오스 2%, 효모 엑기스 1%) 4 ㎖에 식균하여, 28℃에서 3일간 또는 4일간 진탕 배양을 행했다. 균체를 여과에 의해 회수하여, RNeasy plant kit(QIAGEN)를 이용하여 RNA를 추출했다. 슈퍼스크립트 퍼스트 스트랜드 시스템 for RT-PCR(인비트로젠)에 의해 cDNA를 합성했다. 도입한 컨스트럭트로부터의 각 유전자의 발현과, 토털의 각 유전자의 발현을 확인하기 위해, 이하의 프라이머의 조합으로 RT-PCR을 행했다.

도입 컨스트럭트로부터의 발현 확인에 이용한 프라이머

MaGAPDHpfw: CACACCACACATTCAACATC (서열 번호 25)

LPAAT1-r: GCCTTCGTCCTTGGTACACCTTGAC (서열 번호 26)

토털의 LPAAT1의 발현 확인에 이용한 프라이머

LPAAT1-2F: TCGGCTCGGTCCCAAGATGAAC (서열 번호 27)

프라이머 LPAAT1-2R: GCGTCTGTCATGTGCCCAGTCA (서열 번호 28)

상기 RT-PCR의 결과로부터, 각 유전자의 도입 컨스트럭트로부터의 발현 및 토털의 발현이 높았던 것으로서, 플라스미드 pDuraSC-LPAAT1-long 도입주로부터 Gp-LPAAT1-long-5주를, 플라스미드 pDuraSC-LPAAT1-short 도입주로부터 Gp-LPAAT1-short-6주를 각각 선발했다.

이들 주를, GY 배지 4 ㎖에 식균하여, 28℃, 125 rpm으로 진탕 배양했다. 배양 6일째에 균체의 전량을 여과에 의해 회수하여, 동결 건조시켰다. 건조 균체의 일부(약 10∼20 mg 정도)를 취하여, 염산메탄올법으로 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하고 헥산을 증류 제거하여, 가스 크로마토그래피에 의해 분석했다. 균체의 지방산 조성을 표 5에 나타냈다.

이와 같이, 엠. 알피나에서 LPAAT1-long 또는 LPAAT1-short를 고발현시킨 형질전환주에서는, 야생주인 1S-4주에 비해 DGLA 및 아라키돈산의 비율이 높아졌다. 또, LPAAT1-long을 고발현시킨 주와 LPAAT1-short를 고발현시킨 주를 비교하면, 전자가 이 경향이 강했다.

서열 번호 6: 프라이머

서열 번호 7: 프라이머

서열 번호 11: 프라이머

서열 번호 12: 프라이머

서열 번호 13: 프라이머

서열 번호 14: 프라이머

서열 번호 15: 프라이머

서열 번호 16: 프라이머

서열 번호 17: 프라이머

서열 번호 18: 프라이머

서열 번호 19: 프라이머

서열 번호 20: 프라이머

서열 번호 25: 프라이머

서열 번호 26: 프라이머

서열 번호 27: 프라이머

서열 번호 28: 프라이머

SEQUENCE LISTING <110> SUNTORY LIMITED. <120> Fatty Acid composition having novel fatty acid rate <130> FA0038-08064 <140> PCT/JP2008/063191 <141> 2008-07-23 <150> JP2007-190680 <151> 2007-07-23 <160> 28 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1443 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> CDS <222> (1)..(1443) <400> 1 atg act gtc gca aag ctg gac cct gga acc acc agt cct atc tca ccc 48 Met Thr Val Ala Lys Leu Asp Pro Gly Thr Thr Ser Pro Ile Ser Pro 1 5 10 15 tcg gcc tcg gcc tcg ttt tcg ccc ccg acc acc cct ctc tcg cag aag 96 Ser Ala Ser Ala Ser Phe Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Ser Gln Lys 20 25 30 aag ggt atc tac tcg gcg act acc act tct acc act acc acc acc act 144 Lys Gly Ile Tyr Ser Ala Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr 35 40 45 acc acc acc aaa atc tcg agc tct agc aac tct tct agc gca acg ctc 192 Thr Thr Thr Lys Ile Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ala Thr Leu 50 55 60 atg gat gaa tcc acc acc acc acc cac cac aca gag acc agc agc aag 240 Met Asp Glu Ser Thr Thr Thr Thr His His Thr Glu Thr Ser Ser Lys 65 70 75 80 acg tcc tcg cac ccc cgt cgg ctc ggt ccc aag atg aac ccc atc tac 288 Thr Ser Ser His Pro Arg Arg Leu Gly Pro Lys Met Asn Pro Ile Tyr 85 90 95 aag ggt ctg cga gcc ttt gtc tgg gcc ttg tac ttc aac cta gga gca 336 Lys Gly Leu Arg Ala Phe Val Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Leu Gly Ala 100 105 110 tct ctc ata tcg ata acc caa gtc ctg tcg ttg cct ctg gcg ttg atc 384 Ser Leu Ile Ser Ile Thr Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Ala Leu Ile 115 120 125 gct cca aaa gtt tac cag tgg cac atc act aaa acc cag ggt cac ttt 432 Ala Pro Lys Val Tyr Gln Trp His Ile Thr Lys Thr Gln Gly His Phe 130 135 140 ggg gct ttc ctg ctc aag atg aac cag cta ttt gcg ccc tca gat atc 480 Gly Ala Phe Leu Leu Lys Met Asn Gln Leu Phe Ala Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 gtc ttg acg gga gat gaa agt gtc agg gga atc gtc aag gtg tac caa 528 Val Leu Thr Gly Asp Glu Ser Val Arg Gly Ile Val Lys Val Tyr Gln 165 170 175 gga cga agg ctg aag gac act ggt gag gcg tac agc ggt cat gga gag 576 Gly Arg Arg Leu Lys Asp Thr Gly Glu Ala Tyr Ser Gly His Gly Glu 180 185 190 gac att att ctg gat atg ccc gag agg atg gtt ttc atc gcg aac cac 624 Asp Ile Ile Leu Asp Met Pro Glu Arg Met Val Phe Ile Ala Asn His 195 200 205 cag atc tat tct gac tgg atg tac ctc tgg tgc ttc tcc tat ttc gca 672 Gln Ile Tyr Ser Asp Trp Met Tyr Leu Trp Cys Phe Ser Tyr Phe Ala 210 215 220 gag agg cac agg gca ctg aag att att ctt cgg ggc gac ctg acc tgg 720 Glu Arg His Arg Ala Leu Lys Ile Ile Leu Arg Gly Asp Leu Thr Trp 225 230 235 240 atc cct gtc ttt ggc tgg ggt atg cgg ttc ttt gac ttt atc ttt ttg 768 Ile Pro Val Phe Gly Trp Gly Met Arg Phe Phe Asp Phe Ile Phe Leu 245 250 255 aaa cgt aat gac tgg gca cat gac aga cgc gcc att gag gag aac ctg 816 Lys Arg Asn Asp Trp Ala His Asp Arg Arg Ala Ile Glu Glu Asn Leu 260 265 270 gga cgt gtc aag gaa aag gat cca ctc tgg ctg gta gtc ttc cct gaa 864 Gly Arg Val Lys Glu Lys Asp Pro Leu Trp Leu Val Val Phe Pro Glu 275 280 285 gga aca gtc gtc tcc aag gaa acg cgt ttg cga tct gtt gcc ttt tca 912 Gly Thr Val Val Ser Lys Glu Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Phe Ser 290 295 300 aag aag gct ggt ctt tcg gat cac cgc cat gtg ttg ctt cca aga acc 960 Lys Lys Ala Gly Leu Ser Asp His Arg His Val Leu Leu Pro Arg Thr 305 310 315 320 agc ggc ctc ttt gtt tgc atc aac aag ttg cgt gga tcc gtc gaa tac 1008 Ser Gly Leu Phe Val Cys Ile Asn Lys Leu Arg Gly Ser Val Glu Tyr 325 330 335 tta tac gac gcg aca gtt ggc tac tcg aac gtt gaa tat gga gag att 1056 Leu Tyr Asp Ala Thr Val Gly Tyr Ser Asn Val Glu Tyr Gly Glu Ile 340 345 350 cca cag gag ctt tac cct ttg cca ggg cta tat atc aac aag gcg cag 1104 Pro Gln Glu Leu Tyr Pro Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Gln 355 360 365 ccc aag gag atc aac atg cac ctg cgg cgg ttt gct atc aag gat atc 1152 Pro Lys Glu Ile Asn Met His Leu Arg Arg Phe Ala Ile Lys Asp Ile 370 375 380 ccc acg tca gaa ccc gag ttt gtg gag tgg gtc cga gcg cgg tgg gta 1200 Pro Thr Ser Glu Pro Glu Phe Val Glu Trp Val Arg Ala Arg Trp Val 385 390 395 400 gag aag gat gag ctg atg gag gag ttt tat acc aag ggc cga ttc cca 1248 Glu Lys Asp Glu Leu Met Glu Glu Phe Tyr Thr Lys Gly Arg Phe Pro 405 410 415 tcg cag ctg acg gct gag gac att ggc gag aag gag acc aac aag gca 1296 Ser Gln Leu Thr Ala Glu Asp Ile Gly Glu Lys Glu Thr Asn Lys Ala 420 425 430 gga ggc tca tct gaa gga cag agt gtc aga atc ccg ctc aaa tcg cga 1344 Gly Gly Ser Ser Glu Gly Gln Ser Val Arg Ile Pro Leu Lys Ser Arg 435 440 445 ggc atg atg gac tac ctc atg cct tcg gcc att aac ctg gtt gcg ctg 1392 Gly Met Met Asp Tyr Leu Met Pro Ser Ala Ile Asn Leu Val Ala Leu 450 455 460 cca gta ctg gct ttt gcg atg aga tat gct ctg cag caa gta tcg tct 1440 Pro Val Leu Ala Phe Ala Met Arg Tyr Ala Leu Gln Gln Val Ser Ser 465 470 475 480 ggt 1443 Gly <210> 2 <211> 481 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 2 Met Thr Val Ala Lys Leu Asp Pro Gly Thr Thr Ser Pro Ile Ser Pro 1 5 10 15 Ser Ala Ser Ala Ser Phe Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Ser Gln Lys 20 25 30 Lys Gly Ile Tyr Ser Ala Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr 35 40 45 Thr Thr Thr Lys Ile Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ala Thr Leu 50 55 60 Met Asp Glu Ser Thr Thr Thr Thr His His Thr Glu Thr Ser Ser Lys 65 70 75 80 Thr Ser Ser His Pro Arg Arg Leu Gly Pro Lys Met Asn Pro Ile Tyr 85 90 95 Lys Gly Leu Arg Ala Phe Val Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Leu Gly Ala 100 105 110 Ser Leu Ile Ser Ile Thr Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Ala Leu Ile 115 120 125 Ala Pro Lys Val Tyr Gln Trp His Ile Thr Lys Thr Gln Gly His Phe 130 135 140 Gly Ala Phe Leu Leu Lys Met Asn Gln Leu Phe Ala Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Val Leu Thr Gly Asp Glu Ser Val Arg Gly Ile Val Lys Val Tyr Gln 165 170 175 Gly Arg Arg Leu Lys Asp Thr Gly Glu Ala Tyr Ser Gly His Gly Glu 180 185 190 Asp Ile Ile Leu Asp Met Pro Glu Arg Met Val Phe Ile Ala Asn His 195 200 205 Gln Ile Tyr Ser Asp Trp Met Tyr Leu Trp Cys Phe Ser Tyr Phe Ala 210 215 220 Glu Arg His Arg Ala Leu Lys Ile Ile Leu Arg Gly Asp Leu Thr Trp 225 230 235 240 Ile Pro Val Phe Gly Trp Gly Met Arg Phe Phe Asp Phe Ile Phe Leu 245 250 255 Lys Arg Asn Asp Trp Ala His Asp Arg Arg Ala Ile Glu Glu Asn Leu 260 265 270 Gly Arg Val Lys Glu Lys Asp Pro Leu Trp Leu Val Val Phe Pro Glu 275 280 285 Gly Thr Val Val Ser Lys Glu Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Phe Ser 290 295 300 Lys Lys Ala Gly Leu Ser Asp His Arg His Val Leu Leu Pro Arg Thr 305 310 315 320 Ser Gly Leu Phe Val Cys Ile Asn Lys Leu Arg Gly Ser Val Glu Tyr 325 330 335 Leu Tyr Asp Ala Thr Val Gly Tyr Ser Asn Val Glu Tyr Gly Glu Ile 340 345 350 Pro Gln Glu Leu Tyr Pro Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Gln 355 360 365 Pro Lys Glu Ile Asn Met His Leu Arg Arg Phe Ala Ile Lys Asp Ile 370 375 380 Pro Thr Ser Glu Pro Glu Phe Val Glu Trp Val Arg Ala Arg Trp Val 385 390 395 400 Glu Lys Asp Glu Leu Met Glu Glu Phe Tyr Thr Lys Gly Arg Phe Pro 405 410 415 Ser Gln Leu Thr Ala Glu Asp Ile Gly Glu Lys Glu Thr Asn Lys Ala 420 425 430 Gly Gly Ser Ser Glu Gly Gln Ser Val Arg Ile Pro Leu Lys Ser Arg 435 440 445 Gly Met Met Asp Tyr Leu Met Pro Ser Ala Ile Asn Leu Val Ala Leu 450 455 460 Pro Val Leu Ala Phe Ala Met Arg Tyr Ala Leu Gln Gln 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780 acagggcact gaagattatt cttcggggcg acctgacctg gatccctgtc tttggctggg 840 gtatgcggtt ctttgacttt atctttttga aacgtaatga ctgggcacat gacagacgcg 900 ccattgagga gaacctggga cgtgtcaagg aaaaggatcc actctggctg gtagtcttcc 960 ctgaaggaac agtcgtctcc aaggaaacgc gtttgcgatc tgttgccttt tcaaagaagg 1020 ctggtctttc ggatcaccgc catgtgttgc ttccaagaac cagcggcctc tttgtttgca 1080 tcaacaagtt gcgtggatcc gtcgaatact tatacgacgc gacagttggc tactcgaacg 1140 ttgaatatgg agagattcca caggagcttt accctttgcc agggctatat atcaacaagg 1200 cgcagcccaa ggagatcaac atgcacctgc ggcggtttgc tatcaaggat atccccacgt 1260 cagaacccga gtttgtggag tgggtccgag cgcggtgggt agagaaggat gagctgatgg 1320 aggagtttta taccaagggc cgattcccat cgcagctgac ggctgaggac attggcgaga 1380 aggagaccaa caaggcagga ggctcatctg aaggacagag tgtcagaatc ccgctcaaat 1440 cgcgaggcat gatggactac ctcatgcctt cggccattaa cctggttgcg ctgccagtac 1500 tggcttttgc gatgagatat gctctgcagc aagtatcgtc tggttgattt attttttgtt 1560 agacgctgcc gtagttgtaa atttgatgag tgctatttag agcaaacgaa agaagagact 1620 taaacgc 1627 <210> 4 <211> 1446 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 4 atgactgtcg caaagctgga ccctggaacc accagtccta tctcaccctc ggcctcggcc 60 tcgttttcgc ccccgaccac ccctctctcg cagaagaagg gtatctactc ggcgactacc 120 acttctacca ctaccaccac cactaccacc accaaaatct cgagctctag caactcttct 180 agcgcaacgc tcatggatga atccaccacc accacccacc acacagagac cagcagcaag 240 acgtcctcgc acccccgtcg gctcggtccc aagatgaacc ccatctacaa gggtctgcga 300 gcctttgtct gggccttgta cttcaaccta ggagcatctc tcatatcgat aacccaagtc 360 ctgtcgttgc ctctggcgtt gatcgctcca aaagtttacc agtggcacat cactaaaacc 420 cagggtcact ttggggcttt cctgctcaag atgaaccagc tatttgcgcc ctcagatatc 480 gtcttgacgg gagatgaaag tgtcagggga atcgtcaagg tgtaccaagg acgaaggctg 540 aaggacactg gtgaggcgta cagcggtcat ggagaggaca ttattctgga tatgcccgag 600 aggatggttt tcatcgcgaa ccaccagatc tattctgact ggatgtacct ctggtgcttc 660 tcctatttcg cagagaggca cagggcactg aagattattc ttcggggcga cctgacctgg 720 atccctgtct ttggctgggg tatgcggttc tttgacttta tctttttgaa acgtaatgac 780 tgggcacatg acagacgcgc cattgaggag aacctgggac gtgtcaagga aaaggatcca 840 ctctggctgg tagtcttccc tgaaggaaca gtcgtctcca aggaaacgcg tttgcgatct 900 gttgcctttt caaagaaggc tggtctttcg gatcaccgcc atgtgttgct tccaagaacc 960 agcggcctct ttgtttgcat caacaagttg cgtggatccg tcgaatactt atacgacgcg 1020 acagttggct actcgaacgt tgaatatgga gagattccac aggagcttta ccctttgcca 1080 gggctatata tcaacaaggc gcagcccaag gagatcaaca tgcacctgcg gcggtttgct 1140 atcaaggata tccccacgtc agaacccgag tttgtggagt gggtccgagc gcggtgggta 1200 gagaaggatg agctgatgga ggagttttat accaagggcc gattcccatc gcagctgacg 1260 gctgaggaca ttggcgagaa ggagaccaac aaggcaggag gctcatctga aggacagagt 1320 gtcagaatcc cgctcaaatc gcgaggcatg atggactacc tcatgccttc ggccattaac 1380 ctggttgcgc tgccagtact ggcttttgcg atgagatatg ctctgcagca agtatcgtct 1440 ggttga 1446 <210> 5 <211> 843 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> misc_feature <222> (793)..(793) <223> n means any bases <400> 5 gcgccattga ggagaacctg ggacgtgtca aggaaaagga tccactctgg ctggtagtct 60 tccctgaagg aacagtcgtc tccaaggaaa cgcgtttgcg atctgttgcc ttttcaaaga 120 aggctggtct ttcggatcac cgccatgtgt tgcttccaag aaccagcggc ctctttgttt 180 gcatcaacaa gttgcgtgga tccgtcgaat acttatacga cgcgacagtt ggctactcga 240 acgttgaata tggagagatt ccacaggagc tttacccttt gccagggcta tatatcaaca 300 aggcgcagcc caaggagatc aacatgcacc tgcggcggtt tgctatcaag gatatcccca 360 cgtcagaacc cgagtttgtg gagtgggtcc gagcgcggtg ggtagagaag gatgagctga 420 tggaggagtt ttataccaag ggccgattcc catcgcagct gacggctgag gacattggcg 480 agaaggagac caacaaggca ggaggctcat ctgaaggaca gagtgtcaga atcccgctca 540 aatcgcgagg catgatggac tacctcatgc cttcggccat taacctggtt gcgctgccag 600 tactggcttt tgcgatgaga tatgctctgc agcaagtatc gtctggttga tttatttttt 660 gttagacgct gccgtagttg taaatttgat gagtgctatt tagagcaaac gaaagaagag 720 acttaaacgc atggatgtgt gtaatttcat aacagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aacctgcagc ccngggggat ccactagttc tagagcgccg ccaccgcggt ggagctcagc 840 gtt 843 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 6 ggacgtgtca aggaaaagga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 7 tccttcagat gagcctcctg 20 <210> 8 <211> 1251 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 8 atggatgaat ccaccaccac cacccaccac acagagacca gcagcaagac gtcctcgcac 60 ccccgtcggc tcggtcccaa gatgaacccc atctacaagg gtctgcgagc ctttgtctgg 120 gccttgtact tcaacctagg agcatctctc atatcgataa cccaagtcct gtcgttgcct 180 ctggcgttga tcgctccaaa agtttaccag tggcacatca ctaaaaccca gggtcacttt 240 ggggctttcc tgctcaagat gaaccagcta tttgcgccct cagatatcgt cttgacggga 300 gatgaaagtg tcaggggaat cgtcaaggtg taccaaggac gaaggctgaa ggacactggt 360 gaggcgtaca gcggtcatgg agaggacatt attctggata tgcccgagag gatggttttc 420 atcgcgaacc accagatcta ttctgactgg atgtacctct ggtgcttctc ctatttcgca 480 gagaggcaca gggcactgaa gattattctt cggggcgacc tgacctggat ccctgtcttt 540 ggctggggta tgcggttctt tgactttatc tttttgaaac gtaatgactg ggcacatgac 600 agacgcgcca ttgaggagaa cctgggacgt gtcaaggaaa aggatccact ctggctggta 660 gtcttccctg aaggaacagt cgtctccaag gaaacgcgtt tgcgatctgt tgccttttca 720 aagaaggctg gtctttcgga tcaccgccat gtgttgcttc caagaaccag cggcctcttt 780 gtttgcatca acaagttgcg tggatccgtc gaatacttat acgacgcgac agttggctac 840 tcgaacgttg aatatggaga gattccacag gagctttacc ctttgccagg gctatatatc 900 aacaaggcgc agcccaagga gatcaacatg cacctgcggc ggtttgctat caaggatatc 960 cccacgtcag aacccgagtt tgtggagtgg gtccgagcgc ggtgggtaga gaaggatgag 1020 ctgatggagg agttttatac caagggccga ttcccatcgc agctgacggc tgaggacatt 1080 ggcgagaagg agaccaacaa ggcaggaggc tcatctgaag gacagagtgt cagaatcccg 1140 ctcaaatcgc gaggcatgat ggactacctc atgccttcgg ccattaacct ggttgcgctg 1200 ccagtactgg cttttgcgat gagatatgct ctgcagcaag tatcgtctgg t 1251 <210> 9 <211> 1369 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> CDS <222> (36)..(1289) <400> 9 tctcgagctc tagcaactct tctagcgcaa cgctc atg gat gaa tcc acc acc 53 Met Asp Glu Ser Thr Thr 1 5 acc acc cac cac aca gag acc agc agc aag acg tcc tcg cac ccc cgt 101 Thr Thr His His Thr Glu Thr Ser Ser Lys Thr Ser Ser His Pro Arg 10 15 20 cgg ctc ggt ccc aag atg aac ccc atc tac aag ggt ctg cga gcc ttt 149 Arg Leu Gly Pro Lys Met Asn Pro Ile Tyr Lys Gly Leu Arg Ala Phe 25 30 35 gtc tgg gcc ttg tac ttc aac cta gga gca tct ctc ata tcg ata acc 197 Val Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Leu Gly Ala Ser Leu Ile Ser Ile Thr 40 45 50 caa gtc ctg tcg ttg cct ctg gcg ttg atc gct cca aaa gtt tac cag 245 Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Ala Leu Ile Ala Pro Lys Val Tyr Gln 55 60 65 70 tgg cac atc act aaa acc cag ggt cac ttt ggg gct ttc ctg ctc aag 293 Trp His Ile Thr Lys Thr Gln Gly His Phe Gly Ala Phe Leu Leu Lys 75 80 85 atg aac cag cta ttt gcg ccc tca gat atc gtc ttg acg gga gat gaa 341 Met Asn Gln Leu Phe Ala Pro Ser Asp Ile Val Leu Thr Gly Asp Glu 90 95 100 agt gtc agg gga atc gtc aag gtg tac caa gga cga agg ctg aag gac 389 Ser Val Arg Gly Ile Val Lys Val Tyr Gln Gly Arg Arg Leu Lys Asp 105 110 115 act ggt gag gcg tac agc ggt cat gga gag gac att att ctg gat atg 437 Thr Gly Glu Ala Tyr Ser Gly His Gly Glu Asp Ile Ile Leu Asp Met 120 125 130 ccc gag agg atg gtt ttc atc gcg aac cac cag atc tat tct gac tgg 485 Pro Glu Arg Met Val Phe Ile Ala Asn His Gln Ile Tyr Ser Asp Trp 135 140 145 150 atg tac ctc tgg tgc ttc tcc tat ttc gca gag agg cac agg gca ctg 533 Met Tyr Leu Trp Cys Phe Ser Tyr Phe Ala Glu Arg His Arg Ala Leu 155 160 165 aag att att ctt cgg ggc gac ctg acc tgg atc cct gtc ttt ggc tgg 581 Lys Ile Ile Leu Arg Gly Asp Leu Thr Trp Ile Pro Val Phe Gly Trp 170 175 180 ggt atg cgg ttc ttt gac ttt atc ttt ttg aaa cgt aat gac tgg gca 629 Gly Met Arg Phe Phe Asp Phe Ile Phe Leu Lys Arg Asn Asp Trp Ala 185 190 195 cat gac aga cgc gcc att gag gag aac ctg gga cgt gtc aag gaa aag 677 His Asp Arg Arg Ala Ile Glu Glu Asn Leu Gly Arg Val Lys Glu Lys 200 205 210 gat cca ctc tgg ctg gta gtc ttc cct gaa gga aca gtc gtc tcc aag 725 Asp Pro Leu Trp Leu Val Val Phe Pro Glu Gly Thr Val Val Ser Lys 215 220 225 230 gaa acg cgt ttg cga tct gtt gcc ttt tca aag aag gct ggt ctt tcg 773 Glu Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Phe Ser Lys Lys Ala Gly Leu Ser 235 240 245 gat cac cgc cat gtg ttg ctt cca aga acc agc ggc ctc ttt gtt tgc 821 Asp His Arg His Val Leu Leu Pro Arg Thr Ser Gly Leu Phe Val Cys 250 255 260 atc aac aag ttg cgt gga tcc gtc gaa tac tta tac gac gcg aca gtt 869 Ile Asn Lys Leu Arg Gly Ser Val Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Thr Val 265 270 275 ggc tac tcg aac gtt gaa tat gga gag att cca cag gag ctt tac cct 917 Gly Tyr Ser Asn Val Glu Tyr Gly Glu Ile Pro Gln Glu Leu Tyr Pro 280 285 290 ttg cca ggg cta tat atc aac aag gcg cag ccc aag gag atc aac atg 965 Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Gln Pro Lys Glu Ile Asn Met 295 300 305 310 cac ctg cgg cgg ttt gct atc aag gat atc ccc acg tca gaa ccc gag 1013 His Leu Arg Arg Phe Ala Ile Lys Asp Ile Pro Thr Ser Glu Pro Glu 315 320 325 ttt gtg gag tgg gtc cga gcg cgg tgg gta gag aag gat gag ctg atg 1061 Phe Val Glu Trp Val Arg Ala Arg Trp Val Glu Lys Asp Glu Leu Met 330 335 340 gag gag ttt tat acc aag ggc cga ttc cca tcg cag ctg acg gct gag 1109 Glu Glu Phe Tyr Thr Lys Gly Arg Phe Pro Ser Gln Leu Thr Ala Glu 345 350 355 gac att ggc gag aag gag acc aac aag gca gga ggc tca tct gaa gga 1157 Asp Ile Gly Glu Lys Glu Thr Asn Lys Ala Gly Gly Ser Ser Glu Gly 360 365 370 cag agt gtc aga atc ccg ctc aaa tcg cga ggc atg atg gac tac ctc 1205 Gln Ser Val Arg Ile Pro Leu Lys Ser Arg Gly Met Met Asp Tyr Leu 375 380 385 390 atg cct tcg gcc att aac ctg gtt gcg ctg cca gta ctg gct ttt gcg 1253 Met Pro Ser Ala Ile Asn Leu Val Ala Leu Pro Val Leu Ala Phe Ala 395 400 405 atg aga tat gct ctg cag caa gta tcg tct ggt tga tttatttttt 1299 Met Arg Tyr Ala Leu Gln Gln Val Ser Ser Gly 410 415 gttagacgct gccgtagttg taaatttgat gagtgctatt tagagcaaac gaaagaagag 1359 acttaaacgc 1369 <210> 10 <211> 417 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 10 Met Asp Glu Ser Thr Thr Thr Thr His His Thr Glu Thr Ser Ser Lys 1 5 10 15 Thr Ser Ser His Pro Arg Arg Leu Gly Pro Lys Met Asn Pro Ile Tyr 20 25 30 Lys Gly Leu Arg Ala Phe Val Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Leu Gly Ala 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Ile Thr Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Ala Leu Ile 50 55 60 Ala Pro Lys Val Tyr Gln Trp His Ile Thr Lys Thr Gln Gly His Phe 65 70 75 80 Gly Ala Phe Leu Leu Lys Met Asn Gln Leu Phe Ala Pro Ser Asp Ile 85 90 95 Val Leu Thr Gly Asp Glu Ser Val Arg Gly Ile Val Lys Val Tyr Gln 100 105 110 Gly Arg Arg Leu Lys Asp Thr Gly Glu Ala Tyr Ser Gly His Gly Glu 115 120 125 Asp Ile Ile Leu Asp Met Pro Glu Arg Met Val Phe Ile Ala Asn His 130 135 140 Gln Ile Tyr Ser Asp Trp Met Tyr Leu Trp Cys Phe Ser Tyr Phe Ala 145 150 155 160 Glu Arg His Arg Ala Leu Lys Ile Ile Leu Arg Gly Asp Leu Thr Trp 165 170 175 Ile Pro Val Phe Gly Trp Gly Met Arg Phe Phe Asp Phe Ile Phe Leu 180 185 190 Lys Arg Asn Asp Trp Ala His Asp Arg Arg Ala Ile Glu Glu Asn Leu 195 200 205 Gly Arg Val Lys Glu Lys Asp Pro Leu Trp Leu Val Val Phe Pro Glu 210 215 220 Gly Thr Val Val Ser Lys Glu Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Phe Ser 225 230 235 240 Lys Lys Ala Gly Leu Ser Asp His Arg His Val Leu Leu Pro Arg Thr 245 250 255 Ser Gly Leu Phe Val Cys Ile Asn Lys Leu Arg Gly Ser Val Glu Tyr 260 265 270 Leu Tyr Asp Ala Thr Val Gly Tyr Ser Asn Val Glu Tyr Gly Glu Ile 275 280 285 Pro Gln Glu Leu Tyr Pro Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Gln 290 295 300 Pro Lys Glu Ile Asn Met His Leu Arg Arg Phe Ala Ile Lys Asp Ile 305 310 315 320 Pro Thr Ser Glu Pro Glu Phe Val Glu Trp Val Arg Ala Arg Trp Val 325 330 335 Glu Lys Asp Glu Leu Met Glu Glu Phe Tyr Thr Lys Gly Arg Phe Pro 340 345 350 Ser Gln Leu Thr Ala Glu Asp Ile Gly Glu Lys Glu Thr Asn Lys Ala 355 360 365 Gly Gly Ser Ser Glu Gly Gln Ser Val Arg Ile Pro Leu Lys Ser Arg 370 375 380 Gly Met Met Asp Tyr Leu Met Pro Ser Ala Ile Asn Leu Val Ala Leu 385 390 395 400 Pro Val Leu Ala Phe Ala Met Arg Tyr Ala Leu Gln Gln Val Ser Ser 405 410 415 Gly <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 11 tctgagatgg atgaatccac caccaccac 29 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> primer <400> 12 gtcgactcaa ccagacgata cttgctgcag ag 32 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 13 tctagaatgg cacctcccaa cactattg 28 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 14 aagcttttac ttcttgaaaa agaccacgtc 30 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 15 tctagaatgg ctgctgctcc cagtgtgag 29 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 16 aagcttttac tgtgccttgc ccatcttgg 29 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 17 tctagaatgg agtcgattgc gcaattcc 28 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 18 gagctcttac tgcaacttcc ttgccttctc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 19 tctagaatgg gtgcggacac aggaaaaacc 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 20 aagcttttac tcttccttgg gacgaagacc 30 <210> 21 <211> 1203 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 21 atggcacctc ccaacactat tgatgccggt ttgacccagc gccatatcag cacctcggcc 60 gccccaacct ctgccaagcc cgccttcgag cgcaactacc agctccctga gttcaccatc 120 aaggagatcc gtgagtgcat ccctgcacac tgctttgagc gctccggtct ccgtggtctt 180 tgccacgttg ctattgatct gacctgggcc tcgctcttgt tcctggctgc gacccagatc 240 gacaagttcg agaacccttt gatccgctac ttggcctggc ctgcgtattg gatcatgcag 300 ggtattgttt gcaccggtat ctgggtattg gcacacgaat gtggtcatca gtccttctcg 360 acctccaaga cccttaacaa cactgtcggc tggatcttgc actcgatgct cttggtccct 420 taccactcct ggagaatctc gcactcgaag caccacaagg ccactggcca catgaccaag 480 gaccaggtct ttgttcccaa gacccgctct caggttggct tgccccccaa ggagaatgtt 540 gcagttgccg ttcaggagga ggatatgtcc gtgcacctgg atgaggaggc ccccattgtg 600 actttgttct ggatggtgat tcagttcctg ttcggatggc ctgcgtacct tattatgaac 660 gcctctggtc aagactatgg ccgctggacc tcgcacttcc acacctactc tcctatcttt 720 gagccccgca actttttcga cattatcatt tcggatctcg gtgtgttggc tgctcttggt 780 accttgatct acgcctccat gcagctctcg ctcttgaccg tgaccaagta ctacattgtc 840 ccctacttgt ttgtcaactt ctggttggtc ctgatcacct tcttgcagca caccgaccct 900 aagctgcccc attaccgtga gggtgcctgg aacttccagc gtggagccct ctgcaccgtt 960 gaccgctcgt tcggcaagtt cttggaccat atgttccacg gcattgtcca tacccatgta 1020 gcccatcact tgttctcgca gatgccgttc taccatgctg aggaagccac ccatcatctc 1080 aagaaactgc tgggagagta ctacgtctat gacccatcgc cgattgttgt tgcggtctgg 1140 aggtcgttcc gtgaatgccg attcgtggaa gaccatggag acgtggtctt tttcaagaag 1200 taa 1203 <210> 22 <211> 1374 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 22 atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg agattttgaa tgccgaggcc 60 ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca ccctttctga tgatcattga caacaaggtg 120 tacgatgtcc gcgagtttgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct cacgcacgtt 180 ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact ttccaccccg aggctgcttg ggagactctt 240 gccaactttt acgttggtga tattgatgag agcgatcgtg ccatcaagaa tgatgacttt 300 gcggccgagg ttcgcaagct gcgcaccttg ttccagtccc ttggctacta cgactcgtcc 360 aaggcatact atgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggctt gtcgactttc 420 attgttgcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc tgcgctcttg 480 ggtctcttct ggcagcagtg cggatggttg gcgcacgact ttttgcacca ccaggtcttc 540 caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg ccagggtttc 600 tcgtcctcct ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ctgctcccaa cgtccacggc 660 gaggatcccg acattgacac tcaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc tctggagatg 720 ttctcggatg ttcctgacga ggagctgacc cgtatgtggt cgcgcttcat ggtcctcaac 780 cagacctggt tctacttccc cattctctcg tttgcccgtc tgtcctggtg cctccagtcc 840 attatgcttg ttctgcccaa cggtcaggcc cacaagccct ctggagcgcg tgtgcccatt 900 tcgttggtcg agcagctgtc tctggctatg cactggacct ggtacctcgc caccatgttc 960 ctgttcatta aggatcccgt caacatgatt gtgtactttt tggtgtcgca ggctgtttgc 1020 ggcaacttgt tggcgattgt gttctcgctc aaccacaacg gcatgcctgt gatctccaag 1080 gaggaagcgg tcgatatgga cttcttcacc aagcagatca tcacgggtcg tgatgttcac 1140 cctggtctgt ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact accagattga gcaccacttg 1200 ttcccttcga tgccccgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga gactttgtgc 1260 aaaaagtacg gtgtccgata ccataccact ggtatgatcg agggaactgc agaggtcttt 1320 agccgtttga acgaggtctc caaggcggcc tccaagatgg gcaaggcaca gtaa 1374 <210> 23 <211> 1341 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 23 atgggtgcgg acacaggaaa aaccttcacc tggcaagaac tcgcggcgca taacaccgag 60 gacagcctcc ttttggctat ccgtggcaat gtatacgatg tcacaaagtt cttgagccgt 120 catcctggtg gaacggatac tctcttgctc ggagctggcc gagatgtcac tccggttttt 180 gagatgtacc acgagtttgg agctgcagag gctatcatga agaagtacta tgttggcaca 240 ctggtctcaa atgagttgcc catcttccca gagccaacgg tgttccataa gaccatcaag 300 ggcagagttg aggcatactt taaggaccgg aacatggatt ccaagaacag accagagatc 360 tggggacgat atgctctcat ctttggatcc ttgatcgcct cttactacgc gcagctcttt 420 gtaccgttcg tggtcgaacg tacatggctc caggtggtgt ttgctatcat catgggattt 480 gcgtgcgcgc aagtcggatt gaaccctctt cacgatgcct cccacttttc agtgacccac 540 aaccccaccg tttggaagat tctcggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtat 600 ctcgtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcatccct ataccaacat tgctggagct 660 gatcccgatg tgtcgacctc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg 720 ttcgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc 780 aaggtgcgca tccaggacat caacatcttg tactttgtca agaccaatga cgccattcgt 840 gtcaacccca tctcgacttg gcacaccgtc atgttctggg gcggaaaggc cttctttgtc 900 tggtaccgct tgatcgttcc tatgcagtat ctgcccctga gcaaggtgtt gctcttgttt 960 accgtcgcag acatggtctc ttcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt 1020 gttgaggagg ttcagtggcc attgcctgat gagaatggaa tcatccaaaa ggattgggca 1080 gccatgcagg tcgagactac tcaggattac gcccacgatt cgcacctctg gaccagcatc 1140 acgggcagct tgaactacca agccgttcat catctgttcc cgaacgtttc ccagcatcac 1200 taccctgata tcctggctat catcaaggac acctgcagcg agtacaaggt gccatacctc 1260 gtcaaggata ccttttggca agcgtttgct tcacatttgg agcacttgcg tgtgcttggt 1320 cttcgtccca aggaagagta a 1341 <210> 24 <211> 1341 <212> DNA <213> mortierella alpina <400> 24 atgggtgcgg acacaggaaa aaccttcacc tggcaagaac tcgcggcgca taacaccgag 60 gacagcctcc ttttggctat ccgtggcaat gtatacgatg tcacaaagtt cttgagccgt 120 catcctggtg gaacggatac tctcttgctc ggagctggcc gagatgtcac tccggttttt 180 gagatgtacc acgagtttgg agctgcagag gctatcatga agaagtacta tgttggcaca 240 ctggtctcaa atgagttgcc catcttccca gagccaacgg tgttccataa gaccatcaag 300 ggcagagttg aggcatactt taaggaccgg aacatggatt ccaagaacag accagagatc 360 tggggacgat atgctctcat ctttggatcc ttgatcgcct cttactacgc gcagctcttt 420 gtaccgttcg tggtcgaacg tacatggctc caggtggtgt ttgctatcat catgggattt 480 gcgtgcgcgc aagtcggatt gaaccctctt cacgatgcct cccacttttc agtgacccac 540 aaccccaccg tttggaagat tctcggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtat 600 ctcgtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcatccct ataccaacat tgctggagct 660 gatcccgatg tgtcgacctc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg 720 ttcgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc 780 aaggtgcgca tccaggacat caacatcttg tactttgtca agaccaatga cgccattcgt 840 gtcaacccca tctcgacttg gcacaccgtc atgttctggg gcggaaaggc cttctttgtc 900 tggtaccgct tgatcgttcc tatgcagtat ctgcccctga gcaaggtgtt gctcttgttt 960 accgtcgcag acatggtctc ttcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt 1020 gttgaggagg ttcagtggcc attgcctgat gagaatggaa tcatccaaaa ggattgggca 1080 gccatgcagg tcgagactac tcaggattac gcccacgatt cgcacctctg gaccagcatc 1140 acgggcagct tgaactacca agccgttcat catctgttcc cgaacgtttc ccagcatcac 1200 taccctgata tcctggctat catcaaggac acctgcagcg agtacaaggt gccatacctc 1260 gtcaaggata ccttttggca agcgtttgct tcacatttgg agcacttgcg tgtgcttggt 1320 cttcgtccca aggaagagta a 1341 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 25 cacaccacac attcaacatc 20 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> primer <400> 26 gccttcgtcc ttggtacacc ttgac 25 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 27 tcggctcggt cccaagatga ac 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 28 gcgtctgtca tgtgcccagt ca 22

Claims

이하의 (a)∼(e):
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(d) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열
중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 상기 지방산 조성물의 지방산 조성에서, 이하의 i)∼v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물:
i) 올레산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,
iii) 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량 및 팔미톨레산의 합계 함유량에 대한 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율, 및
v) n-6계 지방산 함유량.
제1항에 있어서, 상기 핵산이 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 것인 지방산 조성물:
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 1×SSC, 60℃의 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열.
제1항에 있어서, 상기 핵산이 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 염기 서열을 포함하는 것인 지방산 조성물:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열;
(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열.
제1항에 있어서, n-6계 지방산이 리놀산, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산(DGLA) 및 아라키돈산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 지방산인 지방산 조성물.
이하의 (a)∼(e):
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(d) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열
중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물로부터, 이하의 i)∼v) 중 적어도 하나 이상이, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주를 배양하여 얻어지는 배양물보다 높은 것을 특징으로 하는 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물의 제조 방법:
i) 올레산 함유량,
ii) 팔미트산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,
iii) 스테아르산 함유량에 대한 올레산 함유량의 비율,
iv) 팔미트산 함유량 및 팔미톨레산의 합계 함유량에 대한 스테아르산 및 올레산의 합계 함유량의 비율, 및
v) n-6계 지방산 함유량.
제5항에 있어서, n-6계 지방산이 리놀산, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산 및 아라키돈산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 지방산인 제조 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 핵산이 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 것인 제조 방법:
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 1×SSC, 60℃의 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 지방산 조성물을 제조하기 위한 이하의 (a)∼(e) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산의 용도:
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(d) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열.
제8항에 있어서, 상기 핵산이 이하의 (a)∼(c) 중 어느 하나인 염기 서열을 포함하는 것인 용도:
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(b) 서열 번호 1로 이루어진 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산과 1×SSC, 60℃의 조건하에서 하이브리드화하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;
(c) 서열 번호 2로 이루어진 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 코드하고, 리소포스파티드산아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 지방산 조성물을 포함하는 식품.