CN102844431B - 二酰甘油酰基转移酶基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及二酰甘油酰基转移酶、编码该酶的多核苷酸等。本发明提供例如含有序列号1或4的碱基序列的多核苷酸、编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体及转化体、使用该转化体的脂质或脂肪酸的制造方法或含有通过该制造方法制造的脂质或脂肪酸的食品等。

Description

二酰甘油酰基转移酶基因及其用途

技术领域

本发明涉及编码新型二酰甘油酰基转移酶的多核苷酸及其利用方法。

背景技术

作为贮藏脂质的三酰甘油通过向二酰甘油转移酰基而生成。向二酰甘油转移酰基的酶被称为二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase：DGAT)，已知将酰基CoA作为酰基供体(酰基给予体)的类型的酰基CoA:二酰甘油酰基转移酶(acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase)(EC：2.3.1.20)，将磷脂作为酰基供体的类型的磷脂:二酰甘油酰基转移酶(phospholipids:diacylglycerolacyltransferase:磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT))(EC：2.3.1.158)。

将酰基CoA作为酰基供体的DGAT由于一级结构不同，可分为DGAT1和DGAT2的2个家族。(非专利文献1及2)。此外，有关磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)基因，已知从酵母及植物等中克隆(专利文献1、非专利文献3及4)，其中，有关来自拟南芥的磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)，已知有可将磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等各种磷脂作为酰基给予体，且可转移C₁₀-C₂₂的酰基等(非专利文献5)。

菌类中研究较多的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作为编码DGAT的基因，已知有属于DGAT2家族的DGA1(YOR245C)(非专利文献6)及作为磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)的LRO1(YNR008W)。虽然由于由此2个基因编码的酶占据了酵母的DGAT活性的大部分，但即使同时破坏这些基因，DGAT活性也不会完全丧失。已知有关该残留DGAT活性，由作为酰基CoA:甾醇酰基转移酶基因的ARE1基因和ARE2基因编码的酶的DGAT活性决定(非专利文献7)。

作为脂质生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina:M.alpina)中，至今为止 已报道的有将酰基CoA作为酰基供体的4种DGAT及其基因(2种DGAT1家族基因和2种DGAT2家族基因)(专利文献2及3、非专利文献8)。

但在高山被孢霉(M.alpina)中，将磷脂作为酰基供体的磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)的同源物还不为人所知。已知Δ5脂肪酸去饱和酶为氧化二高-γ-亚麻酸(DGLA)并催化花生四烯酸(ARA)生成的酶，但在高山被孢霉(M.alpina)中，因为主要作用于作为磷脂酰胆碱的酰基而存在的二高-γ-亚麻酸(DGLA)，所以，花生四烯酸作为磷脂酰胆碱的酰基而生成(非专利文献9)。因此，为了促进高山被孢霉(M.alpina)中含有花生四烯酸的三酰甘油的生成，需要从作为磷脂酰胆碱等磷脂的酰基而存在的花生四烯酸中生成含有花生四烯酸的三酰甘油的酶。

现有技术文献

专利文献

专利文献1日本特表2002-541783公报

专利文献2美国专利申请公开第2006/0094086号说明书

专利文献3美国专利申请公开第2006/0091087号说明书

非专利文献

非专利文献1 Proc.Natul.Acad.Sci.USA，95，13018-13023，1998

非专利文献2 J.B.C.，276(42)，38862-38869，2001

非专利文献3 J.B.C.，275(21)，15609-15612，2000

非专利文献4 Proc.Natl.Acd.Sci.USA，97(12)，6487-6492

非专利文献5 Plant Physiology，135，1324-1335

非专利文献6 J.Bacteriol.，184，519-524，2002

非专利文献7 J.B.C.，277(8)，6478-6482，2002

非专利文献8 日本2003年农艺化学会大会要旨集

非专利文献9 J.B.C.，278(37)，35115-35126，2003

发明内容

在如上所述的情况下，为了在高山被孢霉(M.alpina)中生成含有花生四 烯酸的三酰甘油，期望有用的新型的酶。

本发明者深入研究的结果，成功地克隆了编码作为脂质生产菌高山被孢霉(M.alpina)的磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)的同源物(MaLRO1)的基因，从而完成了本发明。即本发明提供以下多核苷酸、蛋白质、表达载体、转化体、使用该转化体的脂质或脂肪酸组合物及食品等的制造方法以及根据该制造方法制造的食品等。

即本发明如下。

[1]一种多核苷酸，其特征在于，为选自以下(a)～(e)中任一项所述的多核苷酸：

(a)多核苷酸，其含有序列号1或4的碱基序列；

(b)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中1～100个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质；

(d)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质；及

(e)多核苷酸，其为与由序列号1或4的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸，且编码具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质。

[2]根据上述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，为以下(f)或(g)中任一项所述的多核苷酸：

(f)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中1～10个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质；及

(g)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有75％以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质。

[3]根据上述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，含有序列号1或4的碱基序列。

[4]根据上述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质。

[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，为DNA。

[6]一种蛋白质，其特征在于，由上述[1]～[5]中任一项所述的多核苷酸编码。

[7]一种载体，其特征在于，含有上述[1]～[5]中任一项所述的多核苷酸。

[8]一种非人转化体，其特征在于，导入了上述[1]～[5]中任一项所述的多核苷酸。

[9]一种非人转化体，其特征在于，导入了上述[7]中所述的载体。

[10]根据上述[8]或[9]中所述的转化体，其特征在于，所述转化体为脂质生产菌。

[11]根据上述[10]中所述的转化体，其特征在于，所述脂质生产菌为高山被孢霉(Mortierella alpina)。

[12]一种脂质或脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从上述[8]～[11]中任一项所述的转化体的培养物中提取脂质或脂肪酸组合物。

[13]上述[12]中所述的方法，其特征在于，所述脂质为三酰甘油。

[14]根据上述[12]中所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸为花生四烯酸或二高-γ-亚麻酸。

[15]一种食品、医药品、化妆品或肥皂，其特征在于，含有通过上述[12]中所述的制造方法提取的脂质或脂肪酸组合物。

本发明的多核苷酸可用于脂质生产菌(例如高山被孢霉(M.alpina))、酵母、植物等的转化。即将本发明的多核苷酸导入适合的宿主细胞内，制成转化体，通过在该转化体内表达所述多核苷酸，可高效生成大量含有二高-γ-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的三酰甘油。如此得到的转化体(转化脂质生产菌、转化酵母或转化植物等)可用于制造脂肪酸组合物、食品、化妆品、医药、肥皂等。

更加具体地说，本发明的转化体生产脂质及脂肪酸的效率极高。因此，本发明可有效用于制造需要大量脂质或脂肪酸的医药品或健康食品。

附图说明

图1A是表示MaLRO1的基因组序列和CDS序列的比对图。

图1B是接续图1A表示MaLRO1的基因组序列和CDS序列的比对图。

图2A是表示MaLRO1的CDS序列和推定氨基酸序列的图。

图2B是接续图2A表示MaLRO1的CDS序列和推定氨基酸序列的图。

图3是表示来自各种菌类的磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)同源物蛋白质的氨基酸序列的比对图。磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)活性中重要的氨基酸残基(*印)超越菌种被保留下来。

图4是表示从酵母菌体中提取的脂质组分中的脂肪酸量的图。

图5是表示从酵母菌体中提取的脂质组分中的脂肪酸组成的图。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，并不意味着将本发明只局限于该实施方式。本发明在不脱离其主旨的前提下，可以以各种方式实施。

另外，在本说明书中引用的所有文献以及公开公报、专利公报等其他专利文献，均作为参照列入本说明书中。且本说明书包含2009年12月21日申请的作为本申请优先权主张的基础的日本国专利申请(日本特愿2009-289287号)的说明书和附图中记载的内容。

本发明者如后述实施例中所详细记载，首次成功地克隆了来自作为脂质生产菌高山被孢霉(M.alpina)的磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)同源物的基因(MaLRO1)的全长cDNA。且本发明者鉴定了来自高山被孢霉(M.alpina)的MaLRO1的基因组DNA的碱基序列及推定氨基酸序列。MaLRO1的ORF 序列、MaLRO1的推定氨基酸序列、MaLRO1的CDS序列、MaLRO1的cDNA序列及MaLRO1的基因组序列分别为序列号1、序列号2、序列号3、序列号4及序列号5。这些多核苷酸及酶可通过后述实施例中所述的方法、公知的基因工程的方法、公知的合成方法等获得。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供一种多核苷酸，其特征在于，为选自以下(a)～(e)中任一项所述的多核苷酸：

(a)多核苷酸，其含有序列号1或4的碱基序列；

(b)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中1～100个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质；

(d)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质；及

(e)多核苷酸，其为与由序列号1或4的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸，且编码具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质。

本说明书中，“多核苷酸”是指DNA或RNA。

本说明书中，“在严谨条件下杂交的多核苷酸”是指，例如将由序列号1或4的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸、或由编码序列号2的氨基酸序列的碱基序列组成的多核苷酸的全部或一部分作为探针，采用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸。关于杂交的方法，例如可以利用在“Sambrook & Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold Spring Harbor，Laboratory Press 2001”以及“Ausubel，Current Protoco ls in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997”等中记载的方法。

本说明书中，“严谨条件”可以是低严谨条件、中严谨条件以及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SD S、50％甲酰胺、42℃或5×SSC、1％SDS、50mM Tris-HCL(pH7.5)、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃或0.2×SSC、0.1％SDS、65℃的条件。在这些条件中，温度越高越能期待高效地得到具有高同一性的DNA。但是，作为影响杂交的严谨度的因素，有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员可以通过适当选择这些因素来实现同样的严谨度。

另外，当杂交使用市售的试剂盒时，例如可以使用Alkphos Direct Labell ing and Detection System(GE Healthcare)。此时，按照试剂盒中附带的操作指南，与标记的探针孵育过夜后，在55℃的条件下使用含有0.1％(w/v)SDS的最初的洗涤缓冲液将膜洗涤后，即可检测出杂交的DNA。或基于序列号1或4的碱基序列的互补碱基序列、或编码序列号2的氨基酸序列的碱基序列的全部或一部分制备探针时，使用市售的试剂(例如，PCR标记混合物(Roche Diagnostics公司)等)将该探针进行地高辛(DIG)标记的情况下，可使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)来检测杂交。

作为上述以外可进行杂交的多核苷酸，可以列举通过FASTA、BLAST等同源性检索软件，使用默认参数计算时，与序列号1或4的DNA或者编码序列号2的氨基酸序列的DNA有50％以上、51％以上、52％以上、53％以上、54％以上、55％以上、56％以上、57％以上、58％以上、59％以上、60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上同一性的DNA。

另外，氨基酸序列、碱基序列的同一性，可以用FASTA(Science 227(4693)：1435-1441，(1985))、Karlin-Altschul的算法BLAST(Basic Local Alignme nt Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873，1993)来确定。开发出了基于BLAST算法的被称为blastn、blastx、blastp、tblastn和tblastx的程序(Altschul SF，et al：J Mol Biol 215：403，1990)。使用blastn分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。此外使用blastp分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。

上述本发明的多核苷酸可以通过公知的基因工程的方法或公知的合成方法获得。

2.本发明的蛋白质

本发明提供如下所示的蛋白质。

(i)由上述(a)～(e)中任一项的多核苷酸编码的蛋白质。

(ii)含有序列号2的氨基酸序列的蛋白质。

(iii)含有序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加后的氨基酸序列，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质。

(iv)具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质。

上述(iii)或(iv)所述的蛋白质，代表性的有天然存在的序列号2的蛋白质的突变体，但也包括可使用例如“Sambrook & Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”“Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997”、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中记载的定点突变法来人工获得的蛋白质。

本说明书中，作为“由序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加后的氨基酸序列组成，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质”，可以列举由序列号2的氨基酸序列中例如1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38 个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个(1～数个)、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加后的氨基酸序列组成，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或附加的数量通常越少越好。

且作为此种蛋白质，还可以列举具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质。上述同一性的数值通常越大越好。且二酰甘油酰基转移酶活性可根据Stahl et al.，Plant Physiology，135，1324-1335(2004)中所述的方法测定。

此外，作为确认二酰甘油酰基转移酶活性的方法，可以列举使用了三酰甘油的生成量显著降低的酵母的Δdga1、Δlro1株的实验。使编码该酶的多核苷酸在Δdga1、Δlro1株中表达时，如三酰甘油生成量增加，则由该多核苷酸编码的蛋白质或肽可具有二酰甘油酰基转移酶活性。本发明者在实施例中，使用薄层色谱法将脂质分离成三酰甘油(TG)组分和磷脂(PL)组分，可确认出三酰甘油生成量增大，但未发现磷脂生成量的变化(图4)。

本发明中，二酰甘油酰基转移酶活性可以为酰基CoA:二酰甘油酰基转移酶活性或磷脂:二酰甘油酰基转移酶活性中的任一种，优选为磷脂:二酰甘油酰基转移酶活性。

本发明的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加，是指在同一序列中的任意且1个或多个氨基酸序列中的位置上有1个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或附加，缺失、取代、插入及附加中的2种以上也可同时发生。

以下所示为能相互取代的氨基酸残基的例子。在同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

另外，本发明的蛋白质还可以通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成方法来制造。此外，也可以利用Advanced Automation Peptide Protein Technologies公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Protein Technologies公司制、PerSeptive公司制、Applied Biosystems公司制、SHIMADZU公司等制的多肽合成仪进行化学合成。

3.本发明的载体和导入了该载体的转化体

本发明还在另一实施方式中提供含有本发明的多核苷酸的表达载体。

本发明的载体通常包含如下表达盒而构成，该表达盒包含

(i)可在宿主细胞内转录的启动子；

(ii)与该启动子连接的上述(a)～(g)中任一项所述的多核苷酸；以及

(iii)与RNA分子的转录终止和多聚腺苷酸化相关、在宿主细胞内起作用的信号作为构成要素。

如此构建的载体被导入宿主细胞。作为本发明中使用的适合的宿主细胞的例子，可以列举脂质生产菌、酵母等。

作为脂质生产菌，例如可以使用在MYCOTAXON，Vol.XLIV，No.2，pp.257-265(1992)中记载的菌株，具体而言可以列举属于被孢霉属(Mortierell a)的微生物、例如长孢被孢霉(Mortierella elongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierella exigua)IFO8571、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO5941、高山被孢霉(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物、或深黄被孢霉(Mortierella isabellina)CBS 194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、矮被孢霉(Mortierella nana)IFO8190、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)CBS236.82等Micromucor亚属(subgenus Micromucor)的微生物等。特别优选高山被孢霉(Mortierella alpina)。

此外，作为酵母的例子，还可以列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。

且在酵母内导入本发明的载体，分析该载体编码的蛋白质的二酰甘油酰基转移酶活性时，若作为宿主细胞使用的酵母的二酰甘油酰基转移酶基因(DGA1及LRO1)缺损，则可以只评价该蛋白质的酶活性。因此，在本发明的一个方式中，作为宿主细胞的酵母优选缺损DGA1基因及LRO1基因。

由本发明的载体转化后的这些宿主细胞，与未由本发明的载体转化的宿主细胞相比，生成更多的脂质，优选为三酰甘油(也被称为“甘油三酯”)，更优选为含有花生四烯酸或二高-γ-亚麻酸(DGLA)的三酰甘油，最优选为含有花生四烯酸的三酰甘油。

作为在脂质生产菌中导入时使用的载体，例如可以利用pDura5(Appl.Microbiol.Biotechnol.，65，419-425，(2004))，但不限于此。

作为在酵母中导入时使用的载体，只要是具有在酵母细胞内表达插入片段的活性的载体即可，无特别限定，作为例子，可以列举pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)。作为在高山被孢霉中导入时使用的载体，只要是具有在高山被孢霉细胞内表达插入片段的活性的载体，无特别限定， 作为例子，可列举高山被孢霉(M.alpina)表达用载体pDuraMCS。

作为调节宿主细胞中的基因表达的启动子/终止子，只要在宿主细胞中起作用即可，可以是任意的组合。例如，在脂质生产菌中利用时，可以利用histon H4.1基因的启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子等。

作为转化时使用的选择性标记，可以利用营养缺陷型标记(ura5、niaD)、抗药性标记(潮霉素、Zeocin)、Geneticin抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，3371984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别来自猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussain et et al.，gene，101，149，1991)等。

作为宿主细胞的转化方法，可以利用常用的公知方法。例如为脂质生产菌时，可以利用电穿孔法(Mackenxie D.A.et al.Appl.Environ.Microbiol.，66，4655-4661，2000)、粒子轰击(Particle Delivery)法(日本特开2005-287403“脂质生产菌的育种方法”(日语原名：脂質生産菌の育種方法)中记载的方法)。另外，为酵母时，可以采用电穿孔法、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978))、醋酸锂法(J.Bacteriology，153，p163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中记载的方法来实施，但不限于这些。

此外，有关通常的克隆技术，可参照“Sambrook & Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。

4.本发明的脂质或脂肪酸组合物的制造方法

本发明还在另一实施方式中提供使用上述转化脂质生产菌或酵母的脂质或脂肪酸组合物的制造方法。

本说明书中，“脂质”是指包括由脂肪酸和醇通过酯键形成的化合物(例如甘油酯)或其类似物(例如胆固醇酯)等的单纯脂质、在单纯脂质的一部分上进一步结合磷酸、氨基酸、糖等而得到的复合脂质以及脂质的水解产物中不溶 于水的衍生脂质。

本说明书中，“油脂”是指甘油和脂肪酸的酯(甘油酯)。

本说明书中，“脂肪酸”是指由通式RCOOH(R为烷基)表示的脂肪族一元羧酸(具有1个羧基、碳原子呈链状连接的羧酸)。脂肪酸包括烃链中不含双键的饱和脂肪酸和含有双键的不饱和脂肪酸。

本发明的脂质或脂肪酸组合物，可以从根据本发明进行了转化的细胞中按以下操作来提取。对于生物(例如脂质生产菌或酵母)的转化株，培养结束后，可以按照离心分离法、过滤等常用方法得到培养细胞。将细胞充分水洗，优选进行干燥。干燥可以通过冷冻干燥、风干等来进行。将干燥细胞根据需要采用Dyno Mill或超声波等破碎后，优选在氮气流下使用有机溶剂进行提取处理。作为有机溶剂，可以使用醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚等，或者通过甲醇和石油醚的交替提取或使用了氯仿-甲醇-水的单相溶剂的提取，也能得到良好的结果。通过在减压下从提取物中馏去有机溶剂，可以得到含有脂肪酸的脂质。提取的脂肪酸也可以采用盐酸甲醇法等进行甲酯化。

另外，关于从上述含有脂肪酸的脂质中分离脂肪酸，可以在混合脂肪酸或混合脂肪酸酯的状态下，采用常用方法(例如尿素附加法、冷却分离法、柱色谱法等)浓缩分离来进行。

通过本发明的方法制造的脂质优选为三酰甘油，更优选为含有花生四烯酸或二高-γ-亚麻酸的三酰甘油，最优选为含有花生四烯酸的三酰甘油。

此外，通过本发明的方法制造的脂肪酸优选为花生四烯酸或二高-γ-亚麻酸，最优选为花生四烯酸。且通过本发明的方法生产的脂质及该脂质中含有的脂肪酸的组成可根据上述脂质的提取方法、脂肪酸的分离方法或这些的组合确认。

使用本发明的制造方法得到的脂质或脂肪酸组合物，可以按照常用方法用于例如含有油脂的食品、医药品、工业原料(化妆品、肥皂等的原料)的制造等用途。

本发明还在另一实施方式中提供使用本发明的转化脂质生产菌或转化酵母的食品、化妆品、医药、肥皂等的制造方法。该方法包含使用本发明的转化 脂质生产菌或转化酵母来生成脂质或脂肪酸的工序。含有生成的脂质或脂肪酸的食品、化妆品、医药、肥皂等的制备采用常用方法。如上所述，使用本发明的制造方法制造的食品、化妆品、医药、肥皂等，含有使用本发明的转化脂质生产菌或转化酵母所生成的脂质或脂肪酸。本发明还提供使用上述方法制造的食品、化妆品、医药、肥皂等。

本发明的化妆品(组合物)或医药品(组合物)的剂型无特别限定，可以采用溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型。另外，本发明的化妆品组合物或医药组合物不仅可以用于油、化妆水、乳霜、乳液、凝胶、洗发液、润丝、护发素、指甲油、粉底、口红、香粉、面膜、软膏、香水、粉饼、花露水、牙膏、肥皂、气雾剂、洁面膏等化妆品或皮肤外用药，还可以用于皮肤老化防止改善剂、皮肤炎症防止改善剂、沐浴用剂、生发剂、皮肤美容液、防晒剂或因外伤、皲裂、龟裂等引起的皮肤粗糙的防止改善剂等。

本发明的化妆品组合物还可以根据需要进一步适当配合其他油脂及/或色素、香料、防腐剂、表面活性剂、颜料、抗氧化剂等。关于它们的配合比例，本领域技术人员可以根据目的适当决定(例如油脂，在组合物中可以含有1～99.99重量％，优选为5～99.99重量％，进一步优选为10～99.95重量％)。此外，本发明的药品组合物也可以根据需要进一步含有其他医药活性成分(例如消炎成分)或辅助成分(例如润滑成分、载体成分)。例如，作为化妆品或皮肤外用药中的其他常用成分，可以列举粉刺用药、头屑·瘙痒防止剂、止汗防臭剂、烫伤用药、防螨·虱剂、角质软化剂、干皮症用药、抗病毒剂、经皮吸收促进剂等。

作为本发明的食品的例子，可以列举营养辅助食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方奶、早产儿用配方奶、老人用食品等。在本说明书中，食品是固体、流体、液体以及它们的混合物，是可摄取食用的物质的总称。

营养辅助食品是指强化了特定营养成分的食品。保健食品是指被认为是健康的或对健康有益的食品，包括营养辅助食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充具有身体调节功能的营养成分的食品，与特定保健用食品 同义。幼儿用食品是指供给约6岁以下的儿童用的食品。老人用食品是指处理成比未处理食品易消化和吸收的食品。婴儿用配方奶是指供给约1岁以下的儿童用的配方奶。早产儿用配方奶是指供给早产儿出生后到约6个月为止所用的配方奶。

作为这些食品的形态的例子，可以列举肉、鱼、坚果等天然食品(用油脂处理过的食品)、中国菜、拉面、汤等在制作时加入油脂的食品、天妇罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、甜甜圈、花林糖等用油脂作为热介质的食品、黄油、人造黄油、蛋黄酱、调味汁、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇凌等油脂食品或在加工时添加了油脂的加工食品、(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等在加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，并不限于含有油脂的食品，例如还可以是面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、豆腐及其加工品等农产品、清酒、药酒、甜料酒、食醋、酱油、黄酱等发酵食品、酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品、鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品、果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。

本发明的食品还可以是胶囊等医药制剂的形态，或是在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合了本发明的油脂得到的自然流食、半酶切态营养食品以及成分营养食品、保健饮料、经肠营养剂等加工形态。

如上所述，通过使本发明的二酰甘油酰基转移酶基因在宿主细胞内表达，能高效地生成脂质，特别是三酰甘油。

而且，还可以将该基因的表达量作为指标，应用于高效地进行脂质、特别是三酰甘油的生产的培养条件的探讨、培养管理等。

实施例

以下用实施例来更具体地说明本发明，但本发明的范围并不限于这些实施例。

高山被孢霉(M.alpina)的基因组分析

将M.alpina 1S-4株接种到100ml的GY2∶1培养基(2％葡萄糖、1％酵母膏pH6.0)中，在28℃下振荡培养2天。通过过滤收集菌体，使用DNeasy(QIAGEN)制备基因组DNA。

使用Roche 454GS FLX Standard来确定上述基因组DNA的碱基序列。此时，片段文库的碱基序列的确定进行2个run，末端配对文库的碱基序列的确定进行3个run。通过将得到的碱基序列拼接，得到300个超级重叠群(supercontig)。

来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的LRO1(ScLRO1)同源物的探索

将来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)基因(ScLRO1)编码的推定氨基酸序列(GenBank accession No.P40345)作为查询序列，相对于M.alpina 1S-4株的基因组碱基序列进行tblastn检索的结果，包含序列号5所示的序列的超级重叠群(supercontig)匹配(hit)。将具有序列号5的碱基序列的基因作为MaLRO1，如下克隆cDNA。

cDNA文库的构建

将M.alpina 1S-4株接种到100ml的培养基(1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0)中，在28℃下预培养3天。在10L培养槽(Abl e Co.，东京)中加入5L培养基(1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％增稠剂(ADEKANOL)、0.3％KH₂PO₄、0.1％Na₂SO₄、O.05％CaCl₂.2H₂O、0.05％MgCl₂.6H₂O、pH6.0)，接种全部预培养物，在300rpm、1vvm、26℃的条件下通气搅拌培养8天。培养第1、2及3天时，分别添加相当于2％、2％及1.5％的葡萄糖。培养第1、2、3、6及8天时，回收各阶段的菌体，用盐酸胍/CsCl法制备total RNA。使用Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa Bio)从total RNA中进行poly(A)⁺RNA的纯化。使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(STRATAGENE)制备各阶段的cDNA文库。

cDNA克降

为克隆MaLRO1的cDNA，基于序列号5制备以下引物。

MaLRO1-1F：5’-CCTGGAATCGTATCAACTGGCCTTG-3’(序列号6)

MaLRO1-3R：5’-CAGGTCCGCCCGCTCCCGCCTCG-3’(序列号7)

以上述构建的cDNA文库为模板，使用引物MaLRO1-1F和引物MaLRO1-3R、ExTaq(TaKaRa Bio)，用以下循环进行PCR扩增。

[94℃2分钟]×1循环，

[94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟]×30循环

[72℃10分钟]×1循环

纯化经过扩增的约0.7kb的DNA片段，通过TOPO-TA克隆试剂盒(invitrogen)进行克隆。

将插入片段的碱基序列通过DNA测序仪确认，将具有序列号4的第814-第1485位的碱基序列的质粒作为pCR-MaLRO1-P。而后以该质粒为模板，使用上述引物进行PCR。在PCR反应中，使用ExTaq(TaKaRa Bio)，替换附带的dNTP混合物，使用PCR标记混合物(Roche Diagnostics公司)，制备将经过扩增的DNA进行地高辛(DIG)标记的探针。

使用上述探针，筛选cDNA文库。

杂交的条件如下。

缓冲液：5x SSC，1％SDS，50mM Tris-HCl(pH7.5)，50％甲酰胺；

温度：42℃(一夜)；

洗涤条件：在0.2x SSC，0.1％SDS溶液中(65℃)中，20分钟×3次；

使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)进行检测。从通过筛选得到的噬菌体克隆中，使用体内切割技术切割质粒，得到各质粒DNA。将筛选后得到的质粒中插入片段长度最长的作为质粒pB-MaLRO1-P1。

将质粒pB-MaLRO1-P1的插入片段的序列与基因组序列比较。图1朝上的箭头所示之处为质粒pB-MaLRO1-P1的插入片段的5′末端。将基因组序列中朝上的箭头处的5′侧的序列从MaLRO1-P1的插入片段序列开始往回分析时，在与推定为编码MaLRO1的开放阅读框(frame)相同的开放阅读框(frame)上，与最初出现的终止密码子相比，3’侧存在2个起始密码子ATG。因此，制备包含5’侧的起始密码子的5’引物MaLRO1-6F，进而作为3’引物也制备MaLRO1-5R。

MaLRO1-5R：5’-CTCTCCTGGATAGAACTCTTCCTCGG-3’(序列号8)

MaLRO1-6F：5’-ATGGCTTGGCGAGGGCAACTCAC-3’(序列号9)

以由M.alpina 1S-4株制备的cDNA为模板，使用ExTaq(TaKaRa Bio)通过引物MaLRO1-6F和MaLRO1-5R进行PCR。将所得到的约0.75kbp的DNA片段使用TOPO-TA克隆试剂盒进行克隆，以确定插入片段的碱基序列。插入片段包含序列号4的第1-第762位的碱基序列。即示意出序列号4的第1位的起始密码子ATG已被转录。连接如此得到的碱基序列和质粒pB-MaLRO1-P1的插入片段的碱基序列时形成序列号4的碱基序列，认为该碱基序列为MaLRO1的cDNA的碱基序列。

序列分析

序列号4的序列具有第1-第2400位的碱基序列的CDS(序列号3)、第1位-第2397位的碱基序列的ORF(序列号1)。由序列号1推出的氨基酸序列如图2及序列号2所示。比较MaLRO1的基因组序列(序列号5)和MaLRO1的cDNA序列(序列号4)(图1)。其结果，表明MaLRO1基因的基因组序列包含5个内含子，由6个外显子构成。

将序列号2所示的MaLRO1的氨基酸序列相对于GenBank中注册的氨基酸序列进行blastp检索的结果，表示与来自菌类的LRO1同源物有一定的同源性。同源性最高的是来自作为担子菌的玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)的功能未知的推定蛋白质(EAK81307)，同一性为35.7％。且表示了MaLRO1与来自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的LRO1(XP_504038)有31.7％的同源性，与来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的LRO1有28.9％的同源性。比较序列号2与来自上述菌类的LRO1同源物的氨基酸序列(图3)。认为构成活性中心的3个氨基酸残基在任一同源物中均被保留。

表达载体的构建

构建具有用于使来自高山被孢霉(M.alpina)的LRO1基因在酿酒酵母(S.cerevisiae)中高表达的构成的表达载体。

首先制备引物Bam-MaLRO1-F。

Bam-MaLRO1-F：5’-GGATCCATGGCTTGGCGAGGGCAACTCAC-3’(序列号10)

以由M.alpina 1S-4株制备的cDNA为模板，使用KOD-plus(东洋纺)通过引物Bam-MaLRO1-F和MaLRO1-5R进行PCR。将所得到的约0.75kbp的DNA片段用Zero Blunt TOPO-克隆试剂盒(invitrogen)克隆，确认碱基序列。将与MaLRO1的cDNA序列比较具有重复的碱基序列部分的质粒作为pCR-MaLRO1-5’。将用限制性内切酶BamHI和PstI酶切该质粒pCR-MaLRO1-5’而得到的约0.35kbp的DNA片段、和用限制性内切酶PstI和XhoI酶切质粒pB-MaLRO1-P1而得到的约2.05kbp的DNA片段、与用限制性内切酶BamHI和SalI酶切酵母表达用载体pYE22m而得到的约8.3kbp的DNA片段使用快速连接试剂盒(Quick ligation Kit)(NEW ENGLAND BioLabs)连接，将所得到的质粒作为pYEMaLRO1。

在酵母S.cerevisiaeΔdga1、Δlro1株中的表达

(1)酵母S.cerevisiaeΔdga1、Δlro1株的制备

(1-1)来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的DGA1基因和LRO1基因的克隆

为了克隆来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的DGA1基因(YOR245C，以下记为ScDGA1)和LRO1基因(YNR008W，以下记为ScLRO1)的全长，制备了以下引物。

ScDGA1-F1：5’-GAATTCatgtcaggaacattcaatgatata-3’(序列号11)

ScDGA1-R1：5’-GTCGACTTACCCAACTATCTTCAATTCTGC-3’(序列号12)

ScLRO1-F1：5’-GAATTCatgggcacactgtttcgaagaaat-3’(序列号13)

ScLRO1-R1：5’-GTCGACTTACATTGGGAAGGGCATCTGAGA-3’(序列号14)

将1白金耳酵母S.cerevisiae S288C株接种到10ml YPD(DIFCO)液体培养基中，30℃下振荡培养1天。通过离心分离集菌，使用Dr.GenTLE-酵母用(TaKaRa Bio)提取DNA。

以该DNA为模板，通过引物ScDGA1-F1和引物ScDGA1-R1的组合或引物ScLRO1-F1和引物ScLRO1-R1的组合使用ExTaq(TaKaRa Bio)进行PCR。将各组合中得到的约1.3kbp的DNA片段和约2kbp的DNA片段使用TA克隆试剂盒(TA-cloning Kit)(invitrogen)进行克隆，确认碱基序列。将具有正 确的碱基序列的质粒分别作为质粒pCR-ScDGA1和质粒pCR-ScLRO1。

(1-2)质粒pCR-Δdga1:URA3-1的构建

将用限制性内切酶HpaI和AatI酶切质粒pCR-ScDGA1而得到的约4.5kbp的DNA片段、和用限制性内切酶HindIII酶切质粒pURA34(日本特开2001-120276)后通过DNA Blunting Kit(TaKaRa Bio)进行末端平滑化而得到的约1.2kbp的DNA片段通过Ligation high(东洋纺)连接，将URA3基因与ScDGA1基因同向插入的质粒作为pCR-Δdga1:URA3-1。

(1-3)质粒pUC-Δlro1:LEU2-1的构建

将用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切质粒pCR-ScLRO1而得到的约2kbp的DNA片段、和用相同限制性内切酶酶切pUC18后的产物通过Ligation high(东洋纺)连接，得到质粒pUC-ScLRO1。将用限制性内切酶XbaI和ApaI酶切该质粒后并通过DNA Blunting Kit(TaKaRa Bio)进行末端平滑化而得到的约3.8kbp的DNA片段、和用限制性内切酶SalI和XhoI酶切质粒YEp13(GenBank accession No.U03498)后并通过DNA Blunting Kit(TaKaRa Bio)进行末端平滑化而得到的约2.2kbp的DNA片段通过Ligation high(东洋纺)连接，将LEU2基因与ScLRO1基因同向插入的质粒作为pUC-Δlro1:LEU2-1。

(1-4)转化株的获得

将S.cerevisiae YPH499株(ura3-52lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63his3-Δ200leu2-Δ1a)(STARATAGENE)作为宿主如下制备转化株。即以质粒pCR-Δdga1:URA3-1为模板，使用将用引物ScDGA1-F1和引物ScDGA1-R1的组合通过PCR扩增的DNA片段、和以质粒pUC-Δlro1:LEU2-1为模板用引物ScLRO1-F1和引物ScLRO1-R1的组合通过PCR扩增的DNA片段，通过醋酸锂法进行共转化(co-transformation)。转化株以在SC-Leu，Ura(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)中生长繁殖为标准进行筛选。在所得到的转化株中，从任意2株 菌体中使用Dr.GenTLE-酵母用(TaKaRa Bio)提取DNA。以这些DNA为模板，使用以下(1)～(4)引物的组合进行PCR。

(1)ScDGA1-F1和ScDGA1-R1

(2)ScDGA1-F1和ScDGA1-R2

(3)ScLRO1-F1和ScLRO1-R1

(4)ScLRO1-F1和ScLRO1-R2

ScDGA1-R2：5’-GACCAGTGTCATCAGAGAAATAGG-3’(序列号15)

ScLRO1-R2：5’-GAGCTGGAACTGCCTTTGGAGC-3’(序列号16)

其结果，在任一菌株中，(1)的组合中有1.8kbp的DNA片段被扩增，(3)的组合中有3.3kbp的DNA片段被扩增，(2)、(4)的组合中DNA片段未被扩增。由此可确认，这些菌株是Δdga1、Δlro1株。将其中的任意1株作为以下转化的宿主使用。

(2)向酵母S.cerevisiaeΔdga1、Δlro1株的基因导入和分析

(2-1)转化株的获得

将Δdga1、Δlro1株作为宿主，用质粒pYE22m、pYE-MaLRO1分别通过醋酸锂法转化。转化株以在SC-Trp，Leu，Ura(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)中生长繁殖为标准进行筛选。从各个质粒导入株中，将任意的2株用于以下的培养实验。即用pYE22m转化的菌株为C/ΔDG#1、2，用pYE-MaLRO1转化的菌株为MaLRO1/ΔDG#1、2。

(2-2)转化株的培养

将1白金耳C/ΔDG#1，2、MaLRO1/ΔDG#1，2的4株分别接种到SC-Trp，Leu，Ura液体培养基10ml中，30℃下整夜振荡培养。将所得到的培养液1ml接种到YPDA(酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％，腺嘌呤硫酸盐(1-adenine hemisulfate salt)0.0075％)液体培养基10ml中，30℃下振荡培养24小时。通过离心分离收集菌体，水洗后冷冻干燥。将冷冻干燥菌体用玻璃珠破 碎，用8ml的氯仿∶甲醇2∶1提取脂质。在硅胶60板(Merck)、展开溶剂己烷∶乙醚∶醋酸70∶30∶1的条件下进行薄层色谱(TLC)，分离脂质。喷雾0.015％樱草灵、80％丙酮水溶液(樱草灵溶液)，通过UV照射使脂质可视化，用铅笔在三酰甘油(TG)组分及磷脂(PL)组分处做标记，将硅胶分别刮取并收集到试管中。用盐酸甲醇法将脂肪酸衍生为甲酯，通过气相色谱法进行脂肪酸分析。即加入二氯甲烷1ml、10％盐酸甲醇2ml，50℃下反应3小时，将脂肪酸衍生为甲酯。而后添加己烷4ml、水1ml，剧烈搅拌后，离心分离，分取上层。用离心浓缩仪(Speed Vac)馏去溶剂，溶解于乙腈中后用于气相色谱，进行脂肪酸分析。且在进行上述甲基化反应时，添加二十三烷酸作为内标，对脂肪酸量进行定量。结果如图4所示。

使来自高山被孢霉(M.alpina)的作为磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)的同源物的MaLRO1表达的MaLRO1/ΔDG#1、2株与作为对照的C/ΔDG#1、2株相比，三酰甘油(TG)量为约10倍，示意出MaLRO1具有三酰甘油(TG)合成活性。

在花生四烯酸生产酵母中的表达

(1)花生四烯酸酵母的育种

为了将花生四烯酸生产酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae))育种，构建以下质粒。

首先，以由M.alpina 1S-4株制备的cDNA为模板，通过Δ12-f和Δ12-r、Δ6-f和Δ6-r、GLELO-f和GLELO-r或Δ5-f和Δ5-r的引物的组合，使用ExTaq进行PCR，扩增M.alpina 1S-4株的Δ12脂肪酸去饱和酶基因(GenBank accession No.AB020033)、Δ6脂肪酸去饱和酶基因(GenBank accession No.AB020032)、GLELO脂肪酸链延长酶基因(GenBank accession No.AB 193123)及Δ5脂肪酸去饱和基因(GenBank accession No.AB188307)。

Δ12-f：TCTAGAatggcacctcccaacactattg(序列号17)

Δ12-r：AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC(序列号18)

Δ6-f：TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag(序列号19)

Δ6-r：AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(序列号20)

GLELO-f：TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc(序列号21)

GLELO-r：GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(序列号22)

Δ5-f：TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc(序列号23)

Δ5-r：AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC(序列号24)

将这些使用TOPO-TA-克隆试剂盒(TOPO-TA-cloning Kit)克隆。确认碱基序列，将包含Δ12基因、Δ6基因、GLELO基因及Δ5基因的碱基序列的克隆分别作为质粒pCR-MAΔ12DS(包含Δ12基因的碱基序列)、pCR-MAΔ6DS

(包含Δ6基因的碱基序列)、pCR-MAGLELO(包含GLELO基因的碱基序列)、pCR-MAΔ5DS(包含Δ5基因的碱基序列)。

另一方面，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pURA34(日本特开2001-120276)而得到的约1.2kb的DNA片段插入到用限制性内切酶EcoRI和Sph

I酶切载体pUC18后进行末端平滑化并进行自我连接而得到的载体的HindIII位点，将载体的EcoRI位点侧为URA3的5’侧的克隆作为pUC-URA3。此外，将用限制性内切酶SalI和XhoI酶切YEp13而得到的约2.2kb的DNA片段插入到载体pUC18的SalI位点，将载体的EcoRI侧为LUE2的5’侧的克隆作为pUC-LEU2。

而后，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pCR-MAΔ12DS后进行末端平滑化再用限制性内切酶XbaI酶切而得到的约1.2kbp的DNA片段、和用限制性内切酶SacI酶切载体pESC-URA(STRATAGENE)后进行末端平滑化再用限制性内切酶SpeI酶切的约6.6kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-U-Δ1

2。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ6DS后进行末端平滑化再用限制性内切酶HindIII酶切而得到的约1.6kbp的DNA片段、和用限制性内切酶SalI酶切质粒pESC-U-Δ12后进行末端平滑化再用限制性内切酶HindIII酶切的约8kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-U-Δ12:Δ6。将用限制性内切酶PvuII部分酶切该质粒而得到的约4.2kb的片段插入pUC-URA3的SmaI位点，得到质粒pUC-URA-Δ12:Δ6。

另外，将用限制性内切酶XbaI和SacI酶切质粒pCR-MAGLELO而得到的约0.95kbp的DNA片段、和用限制性内切酶XbaI和SacI酶切载体pESC- LEU(STRATAGENE)而得到的约7.7kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-L-GLELO。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ5DS后进行末端平滑化再用限制性内切酶HindIII酶切而得到的约1.3kbp的DNA片段和用限制性内切酶ApaI酶切质粒pESC-L-GLELO后进行末端平滑化再用限制性内切酶HindIII酶切而得到的约8.7kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-L-GLELO:Δ5。将用限制性内切酶PvuII酶切该质粒而得到的约3.2kbp片段插入pUC-LEU2的SmaI位点，得到质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5。将Saccharomyces cerevisiae YPH499株(STRATAGENE)用质粒pUC-URA-Δ12:Δ6和质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5进行共转化(co-transformation)。转化株以在SC-Leu，Ura琼脂培养基中生长繁殖为标准进行筛选。如此得到的菌株中，将任意一株作为ARA3-1株。该菌株通过在含有半乳糖的培养基中培养，可从GAL1/10启动子开始表达Δ12脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因、GLELO基因、Δ5脂肪酸去饱和酶基因。

(2)向花生四烯酸生产酵母中的转化和分析

将ARA3-1株用质粒pYE22m，pYE-MaLRO1分别转化。转化株用在SC-Trp，Leu，Ura(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)中生长繁殖为标准进行筛选。从各个质粒导入株中任选4株用于以下的培养实验。

将这些菌株在上述SC-Trp，Leu，Ura液体培养基10ml中30℃下培养1天，将其中1ml在添加了50μg/ml的γ亚麻酸的SG-Trp，Leu，Ura(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、半乳糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)1.3g)液体培养基10ml中用2管在15℃下培养6天。集菌，水洗后冷冻干燥。在干燥菌体中添加4ml的氯仿∶甲醇2∶ 1，70℃下保持1小时后，离心分离回收上清。进而在残留的菌体中再加入4ml的氯仿∶甲醇(2∶1)，将离心分离的上清与之前回收的上清一同回收。使用离心浓缩仪(SpeedVac)馏去溶剂，将残渣溶于少量氯仿中。在硅胶60板(Merck)、展开溶剂己烷∶乙醚∶醋酸70∶30∶1的条件下进行薄层色谱，分离脂质。通过喷雾樱草灵溶液、照射紫外线来检测脂质。将三酰甘油(TG)组分和磷脂(PL)组分分别刮取并收集到试管中，用盐酸甲醇法将脂肪酸衍生为甲酯，通过气相色谱法进行脂肪酸分析。

三酰甘油(TG)组分和磷脂(PL)组分的多不饱和脂肪酸(PUFA)的组成比分别如图5所示。在MaLRO1表达株中，三酰甘油(TG)的二高-γ-亚麻酸(DGLA)和花生四烯酸(ARA)的组成比与对照相比提高了(图5A)。上述实施例中使用的酵母可以说通过导入来自高山被孢霉(M.alpina)的Δ12脂肪酸去饱和酶、Δ6脂肪酸去饱和酶、GLELO及Δ5脂肪酸去饱和酶的基因而赋予了花生四烯酸生产能力，具有与高山被孢霉(M.alpina)同样的花生四烯酸生成体系。在高山被孢霉(M.alpina)中，由GLELO与CoA结合的γ亚麻酸(GLA)生成二高-γ-亚麻酸(DGLA)，其后，二高-γ-亚麻酸(DGLA)掺入脂质，接着Δ5脂肪酸去饱和酶作用于主要作为磷脂酰胆碱的酰基而存在的二高-γ-亚麻酸(DGLA)，生成花生四烯酸(ARA)。因此，认为在上述实施例中使用的酵母的细胞内，除了与高山被孢霉(M.alpina)同样，二高-γ-亚麻酸(DGLA)以与CoA结合的状态存在或存在于其他脂质中，还作为磷脂酰胆碱的酰基而存在。此外，还认为花生四烯酸(ARA)主要作为磷脂酰胆碱的酰基而生成。因此，认为MaLRO1基因编码以磷脂为底物的“磷脂:二酰甘油基转移酶”。

另一方面，观察磷脂的脂肪酸组成比时，二高-γ-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的比率在对照和MaLRO1表达株中无变化(图5B)。

由上可示意出如下可能性，MaLRO1相对于二高-γ-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的特异性高，通过使用MaLRO1，可高效生成大量含有二高-γ-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的三酰甘油(TG)。

高山被孢霉(M.alpina)表达用载体的构建

作为高山被孢霉(M.alpina)表达用载体，使用从组蛋白启动子开始表达目的基因的pDuraMCS。

为使MaLRO1基因在高山被孢霉(M.alpina)中表达，如下构建了载体。将用限制性内切酶BamHI和PstI酶切质粒pCR-MaLRO1-5’而得到的约0.35kbp的DNA片段、和用限制性内切酶PstI和XhoI酶切质粒pB-MaLRO1-P1而得到的约2.05kbp的DNA片段、和用限制性内切酶BamHI和SalI酶切高山被孢霉(M.alpina)表达用载体pDuraMCS而得到的约8.3kbp的DNA片段使用快速连接试剂盒(Quick ligation Kit)(NEW ENGLAND BioLabs)连接，将所得到的质粒作为pDuraMCS-MaLRO1。

高山被孢霉(M.alpina)转化株的获得

使用该质粒，将从M.alpina 1S-4株中根据国际公开公报WO 2005019437中所记载的“脂质生产菌的育种方法”诱变的尿嘧啶缺陷型株Δura-3作为宿主，使用粒子轰击法进行转化。转化株的选择中，使用SC琼脂培养基(无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)and Ammonium Sulfate(Difco)0.5％、硫酸铵0.17％、葡萄糖2％、腺嘌呤0.002％、酪氨酸0.003％、蛋氨酸0.0001％、精氨酸0.0002％、组氨酸0.0002％、赖氨酸0.0004％、色氨酸0.0004％、苏氨酸0.0005％、异亮氨酸0.0006％、亮氨酸0.0006％、苯丙氨酸0.0006％、琼脂2％)。

转化高山被孢霉(M.alpina)的评价

将所得到的转化13株接种到GY培养基(葡萄糖2％、酵母膏1％)10ml中，28℃、300rpm培养10天，筛选花生四烯酸的生产率高的菌株，作为LRO1-1株。

将LRO1-1株接种到GY培养基4ml中，28℃下进行2天振荡培养。通过过滤回收菌体，使用RNeasy plant kit(QIAGEN)提取RNA。通过用于RT-PCR的第一链合成试剂盒(Super Script First-Strand Synthesis System for RT-PCR)(invitrogen)合成cDNA。为确认导入的构建物中MaLRO1基因的表达，通过以下引物的组合进行RT-PCR，确认导入的构建物中MaLRO1基因的表达。

引物PD4P：5’-CGCATCCCGCAAACACACAC-3’(序列号25)

引物MaLRO1-5R：5’-CTCTCCTGGATAGAACTCTTCCTCGG-3’(序列号8)

为了确认合计内源性的MaLRO1基因和导入构建物的MaLRO1基因的MaLRO1基因的表达，通过以下引物MaLRO1-1F和MaLRO1-3R、MaLRO1-2F和MaLRO1-4R的组合进行PCR，确认通过琼脂糖凝胶电泳扩增的DNA片段。PCR的循环为20循环时，用LRO1-1株扩增的DNA片段的扩增带的深度明显比对照株深。由此可确认，LRO1-1株与对照株相比MaLRO1基因的表达量增加了。

MaLRO1-1F：5’-CCTGGAATCGTATCAACTGGCCTTG-3’(序列号6)

MaLRO1-3R：5’-CAGGTCCGCCCGCTCCCGCCTCG-3’(序列号7)

MaLRO1-2F：5’-GGCGGACCCAACTGGGTGAACGAC-3’(序列号26)

MaLRO1-4R：5’-TCACAAGTCGACCTTGGCAGAGTAC-3’(序列号27)

脂肪酸分析

将作为转化株的LRO1-1株和M.alpina 1S-4株(对照)接种到GY培养基4ml中(n＝3)，28℃、125rpm振荡培养。培养第9天时，将菌体的总量通过过滤回收，冷冻干燥。分取干燥菌体的一部分(约10-20mg左右)，通过盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，将馏去己烷后的产物用气相色谱法进行分析，分析菌体内总脂肪酸中所占的花生四烯酸比率(表1中的“ARA(％)”)。

表1

表1：菌体内总脂肪酸中所占的花生四烯酸的比率

平均±SD

如表1所示，使MaLRO1基因高表达的高山被孢霉(M.alpina)中，总脂肪酸中的花生四烯酸比率增加了。

此外，在干燥菌体的一部分(约10-20mg左右)中添加4ml的氯仿∶甲醇2∶1，70℃下保持1小时后，离心分离回收上清。进而在残留的菌体中再加入4ml的氯仿∶甲醇(2∶1)，将离心分离的上清与之前回收的上清一同回收。使用离心浓缩仪(SpeedVac)馏去溶剂，将残渣溶于少量的氯仿中。在硅胶60板(Merck)、展开溶剂己烷∶乙醚∶醋酸70∶30∶1的条件下进行薄层色谱，分离脂质。通过喷雾樱草灵溶液、照射紫外线来检测脂质。

刮取三酰甘油(TG)组分并收集到试管中，用盐酸甲醇法将脂肪酸衍生为甲酯，通过气相色谱法进行脂肪酸分析。

表2

表2：TG中的总脂肪酸中所占的花生四烯酸的比率

平均±SD

如表2所示，在使MaLRO1基因高表达的高山被孢霉(M.alpina)中，甘油三酯中的花生四烯酸比率增加了。

通过使本发明的多核苷酸在适合的宿主细胞内表达，可高效生成大量含有二高-γ-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的三酰甘油。通过本发明而在宿主细胞内中生成的脂肪酸可用于食品、化妆品、医药、肥皂等的制造中。

序列表部分的自由文字内容(Sequence Listing Free Text)

序列号6：合成DNA

序列号7：合成DNA

序列号8：合成DNA

序列号9：合成DNA

序列号10：合成DNA

序列号11：合成DNA

序列号12：合成DNA

序列号13：合成DNA

序列号14：合成DNA

序列号15：合成DNA

序列号16：合成DNA

序列号17：合成DNA

序列号18：合成DNA

序列号19：合成DNA

序列号20：合成DNA

序列号21：合成DNA

序列号22：合成DNA

序列号23：合成DNA

序列号24：合成DNA

序列号25：合成DNA

序列号24：合成DNA

序列号25：合成DNA

Claims (11)

1.一种多核苷酸，其特征在于，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸由序列号1或4的碱基序列构成。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，为DNA。

4.一种蛋白质，其特征在于，由权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸编码。

5.一种载体，其特征在于，含有权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸。

6.一种非人转化细胞，其特征在于，导入了权利要求5中所述的载体。

7.根据权利要求6所述的非人转化细胞，其特征在于，所述转化细胞为脂质生产菌。

8.根据权利要求7中所述的非人转化细胞，其特征在于，所述脂质生产菌为高山被孢霉。

9.一种脂质或脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从权利要求6～8中任一项所述的非人转化细胞的培养物中提取脂质或脂肪酸组合物。

10.根据权利要求9中所述的方法，其特征在于，所述脂质为三酰甘油。

11.根据权利要求9中所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸为花生四烯酸或二高-γ-亚麻酸。